Box–Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選甜蕎多糖顆粒劑的制備工藝及質(zhì)量檢查摘要：目的運(yùn)用Box–Behnken響應(yīng)面法優(yōu)選出甜蕎多糖顆粒的最佳制備工藝。方法提取甜蕎多糖，采用單因素試驗考察乙醇濃度、多糖與乳糖的比例、多糖與可溶性淀粉的比例對多糖顆粒品質(zhì)的影響，以成型率（25%）、堆密度（25%）、休止角（25%）、吸濕性（25%）作為評價顆粒劑綜合質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，Box–Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化出甜蕎多糖顆粒的最佳制備工藝；用紫外分光光度法測定多糖。結(jié)果優(yōu)化甜蕎顆粒劑最佳制備工藝條件：乙醇濃度為55%、多糖:乳糖:可溶性淀粉=1:2.5:0.25。結(jié)論本實驗確立的甜蕎多糖顆粒制備工藝穩(wěn)定可行，所制顆粒符合《中國藥典》相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)鍵詞：甜蕎多糖；顆粒劑；Box–Behnken響應(yīng)面法；制備工藝；質(zhì)量檢查甜蕎屬于蓼科（Polygonaceae)蕎麥屬（Fagopyrum）。主要分布在我國西北、華北和西南地區(qū)[1]?？汕謇砟c道廢物、殺菌消炎，故又稱凈腸草、消炎糧食[2]。蕎麥富含蛋白質(zhì)、維生素、蘆丁、多糖和微量元素，有研究顯示，蕎麥多糖具有改善鉛中毒造成的損傷[3]、抗氧化[4]、清除自由基[5]、增強(qiáng)免疫力[6]、發(fā)揮減肥因子的作用[7]。多糖在保健和藥用發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但多糖多具有吸濕性，需要制成一定的劑型來克服此缺點(diǎn)，其中顆粒劑型使用方便、藥效迅速，質(zhì)量穩(wěn)定。本實驗旨在于優(yōu)化多糖顆粒制劑的最佳制粒工藝，選擇最佳的輔料比，并對顆粒進(jìn)行多糖成分質(zhì)量分析及檢查。1.實驗儀器、材料與試劑1.1實驗儀器表1儀器及型號序號名稱生產(chǎn)廠家型號1粉碎機(jī)上海菲力博實業(yè)公司LFP-500A2電子天平慈溪市天東衡器廠HX502T3循環(huán)水多用真空泵鄭州杜甫儀器廠3SHB-34離心機(jī)湖南可成儀器設(shè)備有限公司L2-5K5鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司DHG-9123A6電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司HH-S47紫外分光光度計日本島津公司UC-2401PC1.2實驗試劑表2主要試劑序號名稱生產(chǎn)廠家產(chǎn)地級別1葡萄糖對照品成都普思生物科技有限公司成都HPLC≥98%2無水乙醇天津市大茂化學(xué)試劑廠天津分析純3苯酚天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所天津分析純4可溶性淀粉天津市大茂化學(xué)試劑廠天津分析純5乳糖天津市大茂化學(xué)試劑廠天津分析純6氯化鈉天津市大茂化學(xué)試劑廠天津分析純1.3實驗材料蕎麥（FagopyrumesculentumMoench.），來源于蓼科植物蕎麥的干燥成熟種子。本研究所用蕎麥采自陜西定邊，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為正品。2實驗方法2.1甜蕎多糖的提取2.2甜蕎多糖顆粒的制備2.2.1輔料選擇多糖粉具有吸濕性，可使顆粒結(jié)塊，在制粒過程中應(yīng)選擇合適的輔料，本實驗通過考慮成本、抗吸濕性和成型性因素后，選用乳糖和可溶性淀粉為輔料進(jìn)行制粒，選用乙醇作潤濕劑。2.2.2顆粒制備工藝2.3顆粒制備工藝優(yōu)化2.3.1單因素實驗設(shè)計影響多糖制粒工藝的主要因素：乙醇濃度、多糖與乳糖的比例、多糖與可溶性淀粉的比例，本實驗對以上三個因素進(jìn)行考察，測定不同輔料制成的蕎麥多糖顆粒劑的成型率、堆密度、休止角、吸濕性的數(shù)值，按照以下公式計算不同樣品的分值：分值=（25/最大成型率）×成型率+（25/最大堆密度）×堆密度+（最小休止角×25）/休止角+（最小吸濕率×25）/吸濕率。表3單因素試驗設(shè)計表多糖質(zhì)量/g乙醇濃度（A）多糖:乳糖（B）多糖:可溶性淀粉（C）460%1:11:0.5470%1:21:1480%1:31:1.5方法取多糖：乳糖：可溶性淀粉為1：1：1與乙醇制備軟材，用14目網(wǎng)篩制粒，60℃烘干,整粒。確定乙醇的最佳濃度取A中最佳乙醇濃度，同法操作，得多糖與乳糖的最佳比例。取A、B中最佳乙醇濃度、乳糖比重，同法操作得多糖與可溶性淀粉的最佳比例。2.3.1.1成型率的測定將顆粒用雙篩分法過篩取得合格顆粒（能過1號篩但不能過5號篩），將合格顆粒稱重，計算成型率（計算公式：成型率（%）=實際成型/顆粒劑重量×100%）。2.3.1.2吸濕率的測定[8]稱取3g顆粒置于稱量瓶中干燥至恒重后精密稱取質(zhì)量，打開瓶蓋，將稱量瓶放置于玻璃干燥器中（盛有相對濕度75%的過飽和氯化鈉溶液）在室溫下放置24h，稱量并計算吸濕率（根據(jù)公式計算：吸濕率（%）=(吸濕后顆粒重量—吸濕前顆粒重量)/吸濕前顆粒劑重量×100%）。2.3.1.3休止角的測定[9]將漏斗固定水平置于坐標(biāo)紙上方適宜高度，漏斗下端離繪圖紙的高度為H，將顆粒劑緩緩從頂端漏斗倒入底部顆粒劑形成圓錐體，測得圓錐體的直徑為2R計算休止角（根據(jù)公式計算，tanα=H/R,求出休止角α）。2.3.1.4堆密度的測定取3g顆粒置于量筒中，待量筒中顆粒上平面水平后讀取體積，計算堆密度（計算公式：堆密度=M/V）。2.3.2響應(yīng)面實驗設(shè)計依據(jù)單因素試驗的結(jié)果及優(yōu)選出的相應(yīng)條件，將對顆粒制劑影響的3個因素：乙醇濃度、多糖與乳糖的比例、多糖與可溶性淀粉的比例進(jìn)行質(zhì)量評價，選用Box–Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化試驗。表4響應(yīng)面試驗因素水平表水平因素乙醇濃度多糖:乳糖多糖:可溶性淀粉-155%1:1.51:0.25060%1:21:0.5+165%1:2.51:0.752.4顆粒劑中多糖含量的測定[10]2.4.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備與最大波長的確定精確稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.010g,置50mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻備用。精確吸取上述溶液0.2mL,置于10mL的容量瓶中,加入5%苯酚1.5mL,混勻,再加入濃硫酸7.5mL,加水至刻度,混合均勻,水浴60℃加熱20min,取出流水冷卻,在紫外分光光度計中400nm-600nm的范圍內(nèi)掃描，得到最大吸收波長為490nm。2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL置于10mL的容量瓶中,加入5%苯酚1.5mL,混勻,再加入濃硫酸7.5mL,混合均勻,水浴60℃加熱20min,取出流水冷卻,加水至刻度,以取0mL標(biāo)準(zhǔn)溶液管為空白對照組，用1cm的比色皿，在490nm處測定吸光度，以吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖1所示）得回歸方程y=66.601x-0.0536，R2=0.998,線性關(guān)系良好，可用于多糖含量測定。圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線2.4.3顆粒劑中多糖的測定多糖顆粒由甜蕎多糖與輔料混合制粒而得，輔料乳糖為單糖，可利用多糖與單糖在水與乙醇中溶解度的不同除去乳糖，輔料可溶性淀粉不溶于冷水的特征，從顆粒中取得多糖。取多糖顆粒3g，加入適量蒸餾水至完全溶解，加入適量無水乙醇（少量多次，慢加快攪），至冰箱冷卻24小時，抽濾后取沉淀，然后用乙醇洗滌，干燥，得多糖。取多糖粉末用無水乙醇洗滌后干燥，取粉末用適量蒸餾水溶解后移至250ml容量瓶稀釋至刻度，搖勻后精密量取0.1ml溶液于試管中，加水至2ml，精密加入5%苯酚溶液1ml，搖勻后迅速精密加入硫酸5ml，搖勻放置10min后置40℃水浴鍋中保溫15min，取出冷卻至室溫，將所配溶液加入比色皿中，在490nm處測定吸光度，計算多糖。2.5顆粒質(zhì)量評價[11]2.5.1外觀性狀顆粒劑應(yīng)干燥，顆粒均勻，色澤一致，無吸潮、軟化結(jié)塊、潮解等現(xiàn)象。2.5.2粒度《中國藥典》中，照粒度和粒度分布測定法，不能通過一號篩與能通過五號篩的總和不超過15%。2.5.3水分《中國藥典》中，中藥顆粒劑照水分測定法（通則0832）測定，除另有規(guī)定外，水分不得超過8.0%。干燥并恒重扁形稱量瓶,取供試品2g置稱量瓶中,精密稱定后置于105℃烘箱內(nèi)干燥5小時，將瓶蓋蓋好移置干燥器中放冷30分鐘，精密稱定后再在105℃烘箱干燥1小時，放冷稱重（直至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止），計算含水量。2.5.4溶化性《中國藥典》中，可溶顆粒檢查法，顆粒溶于水后應(yīng)全部溶化或輕微渾濁。取顆粒10g加熱水200ml攪拌5min觀察溶液。3結(jié)果3.1單因素試驗結(jié)果3.1.1不同乙醇濃度、多糖與乳糖的不同比例、多糖與可溶性淀粉的不同比例對多糖制粒工藝的影響如圖2、圖3、圖4所示圖2不同乙醇濃度對多糖顆粒成型率、堆密度、休止角、吸濕性的影響圖2不同乙醇濃度對多糖顆粒成型率、堆密度、休止角、吸濕性的影響圖3乳糖與多糖的不同比例圖3乳糖與多糖的不同比例對多糖顆粒成型率、堆密度、休止角、吸濕性的影響圖4可溶性淀粉與多糖的不同比例圖4可溶性淀粉與多糖的不同比例對多糖顆粒成型率、堆密度、休止角、吸濕性的影響3.1.2單因素試驗結(jié)果分析通過方法2.3.1所設(shè)計的單因素實驗中，對所制顆粒的成型率、休止角、堆密度、吸濕性等評價指標(biāo)進(jìn)行綜合性評分后，通過圖1可以得出制粒的最佳濃度的60%乙醇，通過圖2可以得出制粒中多糖:乳糖的最佳比例為1:2，通過圖3可以得出制粒中多糖:可溶性淀粉的最佳比例為1:0.5。3.2響應(yīng)面法優(yōu)化甜蕎多糖顆粒最佳制備工藝在預(yù)試驗2.3.1的基礎(chǔ)上，選定乙醇濃度、多糖與乳糖的比例、多糖與可溶性淀粉的比例三個因素，經(jīng)Designexpert軟件分析，依據(jù)Box–Behnken響應(yīng)面組合設(shè)計原理，設(shè)計3因素3水平以成型率和溶化率作為響應(yīng)值的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，通過實驗方法2.3.2所得結(jié)果如表5和圖5-9所示。表5響應(yīng)面數(shù)據(jù)評價表Response1率顆粒成品ANOVAforResponseSurfaceLinearModelAnalysisofvariancetable[Partialsumofsquares-TypeIII]SumofMeanFp-valueSourceSquaresdfSquareValueProb>FModel 49.26316.423.650.0417significantA-A乙醇濃度7.0317.031.560.2335B-B多糖:乳糖1.2811.280.280.6030C-C多糖:可溶性淀粉40.95140.959.090.0099Residual58.56134.50LackofFit25.7892.860.350.9123notsignificantPureError32.7848.20CorTotal107.8216注：P值＜0.01，有顯著意義；P值＞0.05無顯著意義圖5乙醇濃度和乳糖比重對顆粒成品率影響的等高線圖圖5乙醇濃度和乳糖比重對顆粒成品率影響的等高線圖圖6乙醇濃度和乳糖比重對顆粒成品率影響的響應(yīng)面3D圖圖6乙醇濃度和乳糖比重對顆粒成品率影響的響應(yīng)面3D圖圖8乙醇濃度和乳糖比重對顆粒溶化率影響的響應(yīng)面3D圖圖7乙醇濃度和乳糖比重對顆粒溶化率影響的等高線圖圖8乙醇濃度和乳糖比重對顆粒溶化率影響的響應(yīng)面3D圖圖7乙醇濃度和乳糖比重對顆粒溶化率影響的等高線圖圖9乙醇濃度和可溶性淀粉比重對顆粒溶化率影響的響應(yīng)面3D圖圖9乙醇濃度和可溶性淀粉比重對顆粒溶化率影響的響應(yīng)面3D圖由表5可知，模型P值＜0.01，表明該模型具有顯著意義；失擬項P值＞0.05不顯著，表明該模型擬合度和可信度有效，誤差較小，可用該模型優(yōu)化制備工藝。使用Designexpert軟件，利用其中的Box–Behnken響應(yīng)面組合設(shè)計方法得出優(yōu)化甜蕎多糖顆粒的制備工藝，根據(jù)響應(yīng)面實驗結(jié)果，分析得出以下結(jié)論：蕎麥多糖顆粒制備最佳工藝條件為60%乙醇，多糖：乳糖：可溶性淀粉=1:2.5:0.25。3.3甜蕎顆粒劑中多糖含量的測定結(jié)果通過實驗方法2.4可得，紫外分光光度計測得最大吸收波長為490nm,得到多糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=66.601x-0.0536，通過苯酚-硫酸法測定得到稀釋后多糖溶液的平均吸光度為0.3339，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得x=0.0058mg/ml,甜蕎多糖顆粒中多糖的含量為38.7mg/g.3.4顆粒質(zhì)量評價結(jié)果3.4.1外觀性狀通過觀察顆粒的外觀性狀，顆粒干燥均勻，色澤一致，無吸潮、軟化結(jié)塊、潮解等現(xiàn)象，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。3.4.2粒度通過方法2.5.2對所制顆粒進(jìn)行處理，計算所得成型率為96.1%，依據(jù)不能通過一號篩與能通過五號篩的總和不超過15%的規(guī)定，所制顆粒符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。3.4.3水分通過方法2.5.3對制得的顆粒進(jìn)行水分檢查，計算所得顆粒含水量為3.20%，其水分不得超過8.0%，制得的顆粒符合藥典顆粒劑的標(biāo)準(zhǔn)。3.4.4溶化性通過方法2.5.4，將顆粒溶于水后有輕微渾濁現(xiàn)象，所制顆粒符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。4結(jié)論與討論通過實驗研究，蕎麥多糖顆粒最佳制備工藝條件55%乙醇，多糖：乳糖：可溶性淀粉=1:2.5:0.25。將多糖顆粒通過苯酚-硫酸法測得多糖含量為38.7mg/g。所制得的顆粒表面干燥，顆粒均勻，色澤一致，無吸潮、軟化結(jié)塊、潮解等現(xiàn)象，水分、粒度、溶化性均符合《中國藥典》相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)。甜蕎多糖具有豐富的營養(yǎng)，在保健品和藥品發(fā)展方向具有較好的前景，但甜蕎多糖還未能較好地開發(fā)，與之相關(guān)的產(chǎn)品甚少。因此，將甜蕎多糖制成顆粒能更好地對多糖進(jìn)行利用且為開發(fā)其他劑型奠定基礎(chǔ)。甜蕎多糖具有粘性大、吸濕性強(qiáng)的特性，因此不易直接制備成顆粒，通過文獻(xiàn)查詢，在考慮成本、成型率和抗吸濕性等因素的條件下，選取乳糖和可溶性淀粉為輔料來制備顆粒。甜蕎多糖粉在制粒中有結(jié)塊現(xiàn)象，加入可溶性淀粉后該現(xiàn)象有所改善，可使得所制顆粒大小均一；乳糖粉自身口感細(xì)膩，加入后可改善顆粒劑粒度，使其更加均勻。制粒工藝中對制粒產(chǎn)生影響的因素分別為乙醇濃度、多糖粉與乳糖、可溶性淀粉的比例，通過Box–Behnken響應(yīng)面組合設(shè)計方法制粒，對顆粒的成型率和溶化率進(jìn)行考察，經(jīng)Design

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