第十單元課時練54基因工程的基本工具和基本操作程序(含DNA的粗提取)選擇題1～2題，每小題7分，3～6題，每小題8分，共46分。一、選擇題1．(2024·湖南，5)某同學將質粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是()A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調整反應條件如溫度和酶的用量等C．質粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶2．(2024·石家莊調研)圖1為某種質粒簡圖，圖2表示某外源DNA上的目的基因，小箭頭所指分別為限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ的酶切位點。下列有關敘述錯誤的是()A．在基因工程中若只用一種限制酶完成對質粒和外源DNA的切割，則可選EcoRⅠB．如果將一個外源DNA分子和一個質粒分別用EcoRⅠ酶切后，再用DNA連接酶連接，形成一個含有目的基因的重組DNA，此重組DNA中EcoRⅠ切割位點有1個C．為了防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒和目的基因D．一個如圖1所示的質粒分子經(jīng)EcoRⅠ切割后，含有2個游離的磷酸基團3．(2022·山東，13)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法錯誤的是()A．過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B．離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C．在一定溫度下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D．粗提取的DNA中可能含有蛋白質4．(2023·廣東，11)“DNA的粗提取與鑒定”實驗的基本過程：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是()A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質等C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色5．(2025·黃石模擬)如圖所示，研究人員將雪花蓮凝集素基因(GNA)和尾穗莧凝集素基因(ACA)與載體(pBI121)結合，然后導入棉花細胞。下列操作不符合實驗目的是()A．用PCR技術可檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞中B．將棉花細胞接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉基因細胞C．用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA—ACA融合基因D．與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確6．(2025·十堰調研)當蘋果削好皮或切開后放置一會兒，切口面的顏色就會由淺變深，最后變成深褐色。發(fā)生色變反應主要是因為這些植物體內存在著酚類化合物。酚類化合物易被氧化成醌類化合物，即發(fā)生變色反應變成黃色，隨著反應的量的增加顏色就逐漸加深，最后變成深褐色。氧化反應的發(fā)生是由于與空氣中的氧接觸和細胞中酚氧化酶的釋放。如圖是培育抗褐變的轉基因蘋果的過程，下列敘述不正確的是()A．要想獲得抗褐變的轉基因蘋果，目的基因可選擇抑制酚氧化酶表達的基因B．實施步驟①是需要限制性內切核酸酶和DNA聚合酶的參與C．步驟④階段使用的MS培養(yǎng)基中要加入植物激素和卡那霉素等物質D．為了評估目的基因抑制蘋果褐變的效果，可與導入含pBI121質粒的植株作對照二、非選擇題7．(16分)(2024·重慶，19)大豆是重要的糧油作物，提高大豆產(chǎn)量是我國農業(yè)領域的重要任務。我國研究人員發(fā)現(xiàn)，基因S在大豆品種DN(種子較大)中的表達量高于品種TL(種子較小)，然后克隆了該基因(兩品種中基因S序列無差異)及其上游的啟動子序列，并開展相關研究。(1)基因S啟動子的基本組成單位是____________。(2)通過基因工程方法，將DN克隆的“啟動子D＋基因S”序列導入無基因S的優(yōu)質大豆品種YZ。根據(jù)題圖所示信息(不考慮未標明序列)判斷構建重組表達載體時，為保證目標序列的完整性，不宜使用的限制酶是____________；此外，不宜同時選用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________________________________________。(3)為驗證“啟動子D＋基因S”是否連接在表達載體上，可用限制酶對重組表達載體酶切后進行電泳。電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應有________________________________________________________________________。經(jīng)驗證的重組表達載體需轉入農桿菌，檢測轉入是否成功的技術是______________。(4)用檢測后的農桿菌轉化品種YZ所得再生植株YZ－1的種子變大。同時將從TL克隆的“啟動子T＋基因S”序列成功導入YZ，所得再生植株YZ－2的種子也變大，但小于YZ－1。綜合分析，大豆品種DN較TL種子大的原因是___________________________________________________________________________________________________________。8．(20分)(2024·貴州，21)研究者用以蔗糖為唯一碳源的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)真菌A的野生型(含NV基因)、突變體(NV基因突變)和轉基因菌株(轉入NV基因)，檢測三種菌株NV酶的生成與培養(yǎng)液中的葡萄糖含量，結果如表所示(表中“＋”表示有，“－”表示無)。檢測用菌株蔗糖NV酶葡萄糖(培養(yǎng)液中)野生型＋＋＋野生型－－－突變體＋－－轉基因菌株＋＋＋回答下列問題：(1)據(jù)表可推測__________誘導了NV基因表達。NV酶的作用是____________________。檢測NV酶活性時，需測定的指標是_______________________________________________________________________________________________________________(答出1點即可)。(2)表中突變體由T－DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得。從野生型與突變體中分別提取基因組DNA作為模板，用與__________(填“T－DNA”或“NV基因”)配對的引物進行PCR擴增。若突變體擴增片段長度__________(填“>”“＝”或“<”)野生型擴增片段長度，則表明突變體構建成功，從基因序列分析其原因是______________________________________________________________________________________________________。(3)為進一步驗證NV基因的功能，表中的轉基因菌株是將NV基因導入__________細胞獲得的。在構建NV基因表達載體時，需要添加新的標記基因，原因是_______________________________________________________________________________________________。9．(18分)(2024·衡水模擬)研究人員從分解纖維素的細菌(A菌)中提取出一種纖維素酶基因(CBHⅡ)并進行PCR擴增，然后與高效表達載體pUT質粒(圖1)連接構建成重組質粒并導入A菌，從而獲得分解纖維素能力更強的工程菌(B菌)。請回答下列問題：幾種限制酶識別序列及酶切位點限制酶識別序列及酶切位點BglⅡ5′－A↓GATCT－3′BstEⅡ5′－G↓GTNACC－3′(N為任意堿基)SacⅠ5′－GAGCT↓C－3′MspⅠ5′－C↓CGG－3′BamHⅠ5′－G↓GATCC－3′(1)構建成重組質粒時，應選擇限制酶__________________對pUT質粒進行酶切，經(jīng)酶切后形成了兩個DNA片段(X和Y)，X兩端的黏性末端分別為－CTAG和－CAATG，則Y兩端的黏性末端分別為－CTAG和______________。(2)CBHⅡ基因中無上述限制酶的酶切位點，兩端需添加相關酶切位點才能在酶切后與pUT質粒連接，PCR擴增過程中，最早經(jīng)過________輪循環(huán)后，便可獲得兩端均攜帶限制酶識別序列的所需雙鏈目的基因。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。為了能在波長為300nm紫外燈下檢測出DNA分子，需要在瓊脂糖溶液中加入適量的____________。(3)為鑒定重組質粒是否構建成功以及是否成功導入A菌，將其接種在含抗生素________(填“M”或“N”)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將3個不同菌落擴大培養(yǎng)后提取質粒分別進行雙酶切并進行電泳，結果如圖3所示(片段過小時檢測不到條帶)。據(jù)圖分析，菌落________中成功導入了重組質粒。(4)為檢測B菌的纖維素分解能力，將含有20%纖維素的培養(yǎng)基均分為三組，進行不同處理后，在相同條件下培養(yǎng)一段時間，測定培養(yǎng)基中纖維素含量，結果如圖4所示，對照組2的處理為接種________，說明_____________________________________________________________________________________________________________________________________。答案精析1．B[限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；在酶切條件不合適時，可能會出現(xiàn)DNA完全沒有被酶切的情況，需要調整反應條件如溫度、pH等，但調整酶的用量沒有作用，B錯誤；質粒DNA突變可能會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質粒DNA，C正確；質粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。]2．B[圖中目的基因兩側都有EcoRⅠ酶切位點，質粒上也存在EcoRⅠ酶切位點，若只用一種限制酶完成對質粒和外源DNA的切割，可選EcoRⅠ，A正確；EcoRⅠ切割外源DNA分子和質粒，再用DNA連接酶連接，形成的含目的基因的重組DNA分子中，EcoRⅠ酶切割位點有2個，B錯誤；為了防止質粒和含目的基因的外源DNA片段自身環(huán)化，酶切時可使用BamHⅠ和HindⅢ兩種限制酶同時處理質粒和目的基因，C正確；該質粒分子經(jīng)EcoRⅠ切割后，產(chǎn)生兩個黏性末端，含有2個游離的磷酸基團，D正確。]3．B[離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀，B錯誤；在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色，C正確。]4．D[裂解是使細胞破裂釋放出DNA等物質，針對不同的實驗材料，可選擇不同的方法破壞細胞，如植物細胞可選擇研磨的方法，而動物細胞可選擇吸水漲破的方法，A正確；DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質等與DNA分離，B正確；DNA不溶于酒精，而某些蛋白質溶于酒精，可以反復多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA的純度，C正確；將DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺試劑，沸水浴加熱5分鐘，待冷卻后，溶液能呈現(xiàn)藍色，D錯誤。]5．B[根據(jù)GNA－ACA融合基因的兩端序列設計合適的引物，可以利用PCR技術檢測GNA和ACA基因是否導入棉花細胞的染色體DNA上，A正確；由于重組質粒含有卡那霉素抗性基因，故將棉花細胞接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基上可篩選出轉基因細胞，B錯誤；GNA和ACA基因均有BsaBⅠ酶切位點，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA連接酶處理兩種基因可獲得GNA－ACA融合基因，C正確；圖中質粒與GNA－ACA融合基因上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位點，與只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ處理融合基因和載體可保證基因轉錄方向正確，D正確。]6．B[褐變是細胞中的酚氧化酶催化酚類化合物變成黃色所致，故要想獲得抗褐變的轉基因蘋果，可選擇抑制酚氧化酶表達的基因作為目的基因，A正確；步驟①是目的基因表達載體的構建，該過程中需要限制性內切核酸酶和DNA連接酶的參與，B錯誤；步驟④是脫分化階段，該階段使用的MS培養(yǎng)基中要加入植物激素(影響細胞的發(fā)育方向)和卡那霉素(將含有目的基因的細胞篩選出來)，C正確；為了評估目的基因抑制蘋果褐變的效果，可與導入不含目的基因質粒的植株作對照，本實驗設計的目的是排除質粒本身對實驗結果的影響，同時也能檢測導入目的基因的效果，D正確。]7．(1)脫氧核糖核苷酸(脫氧核苷酸)(2)EcoRⅠ酶切后形成的片段黏性末端相同，易自我環(huán)化；不能保證目標片段與載體定向鏈接(反向鏈接)(3)酶切后的空載體片段，啟動子D＋基因S片段PCR(4)品種DN的基因S上游啟動子效應比TL強，使得基因S表達量更高，種子更大解析(1)啟動子是RNA聚合酶識別和結合的部位，用于驅動基因轉錄，是一段有特殊序列結構的DNA片段，其基本組成單位是四種脫氧核糖核苷酸。(2)根據(jù)圖示信息可知，“啟動子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的識別序列，若使用限制酶EcoRⅠ，會使目的基因序列被破壞；根據(jù)圖中限制酶的識別序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端相同，若用這兩種限制酶切割，形成的DNA片段在構建基因表達載體時，容易出現(xiàn)自我環(huán)化，以及無法保證目的基因片段與載體片段單向連接，影響目的基因在受體細胞中的表達。(3)DNA電泳可以分離不同大小的DNA片段，用限制酶對重組表達載體酶切后的產(chǎn)物不僅有“啟動子D＋基因S”片段，還有酶切后的空載體片段，因此電泳時，對照樣品除指示分子大小的標準參照物外，還應有酶切后的空載體片段和“啟動子D＋基因S”片段；在分子水平上檢測目的基因是否轉入成功可通過PCR等技術檢測受體細胞的染色體DNA上是否插入目的基因或目的基因是否轉錄出mRNA。(4)根據(jù)(4)題目信息可知，再生植株YZ－1導入的目的基因為取自品種DN的“啟動子D＋基因S”序列，再生植株YZ－2導入的目的基因為取自品種TL的“啟動子T＋基因S”序列，結合題干信息“兩品種中基因S序列無差異”可推測：品種DN的基因S上游的啟動子D的效應強于品種TL的啟動子T，啟動子D使基因S表達量更高，因而種子更大。8．(1)蔗糖參與蔗糖分解代謝，將蔗糖分解成葡萄糖單位時間內葡萄糖的生成量(或蔗糖的減少量等)(2)NV基因＞突變體NV基因中插入了T－DNA序列，使基因中堿基對增加而發(fā)生突變(3)突變體便于篩選出成功導入NV基因的細胞解析(1)根據(jù)表格可知，野生型菌株在加入蔗糖的培養(yǎng)基中會合成NV酶，不加蔗糖不會合成NV酶，推測蔗糖誘導了NV基因表達。分析表格可知，有NV酶時，菌株就能將蔗糖分解成葡萄糖，因此NV酶可能參與蔗糖的分解代謝過程。檢測NV酶活性時，需測定單位時間內葡萄糖的生成量或蔗糖的減少量等。(2)從題目中可知，突變體是由T－DNA隨機插入野生型菌株基因組DNA篩選獲得的。在進行PCR擴增時，使用的引物需要與特定的DNA序列互補配對，才能啟動DNA的擴增。野生型菌株的基因組DNA中沒有T－DNA的插入，所以只有用與NV基因配對的引物進行擴增時，才可以擴增出兩種菌株的基因片段。突變體中的NV基因中插入了T－DNA序列，導致其堿基對增加，因此若突變體擴增片段長度＞野生型擴增片段長度，則表明突變體構建成功。(3)為進一步驗證NV基因的功能，表中的轉基因菌株是將NV基因導入突變