大慶油田生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選、鑒定與特性研究：開啟微生物采油新篇章一、引言1.1研究背景與意義石油作為一種重要的能源資源，在全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色。隨著全球經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，對石油的需求持續(xù)增長，然而，傳統(tǒng)的石油開采技術(shù)面臨著諸多挑戰(zhàn)，如開采效率低下、環(huán)境污染等問題。據(jù)統(tǒng)計，經(jīng)過一次、二次常規(guī)采油之后，遺留在地層的殘余油仍然占石油總量的60%-70%，如何最大限度地開采出地下剩余的原油，已經(jīng)成為石油工業(yè)的重要任務(wù)。微生物采油技術(shù)（MicrobialEnhancedOilRecovery，MEOR）作為一種新興的采油技術(shù)，具有成本低、效果好、工序簡單、易于控制、應(yīng)用范圍廣和環(huán)境友好等優(yōu)勢，受到了廣泛的關(guān)注。該技術(shù)是利用微生物在油藏中的生長代謝活動或其代謝產(chǎn)物，來提高原油采收率的綜合性技術(shù)。微生物在油藏中生長繁殖時，能夠產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如生物表面活性劑、生物聚合物、氣體等，這些代謝產(chǎn)物可以通過降低原油的表面張力、改善原油的流動性、增加油藏的壓力等方式，提高原油的采收率。據(jù)調(diào)查，中國適合微生物采油技術(shù)的地質(zhì)儲量約為68億噸，占可開采儲量的25%，在目前國際油價持續(xù)波動，石油開采面臨降低成本的巨大壓力下，微生物采油技術(shù)的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義和應(yīng)用價值。生物表面活性劑是微生物采油技術(shù)的主要研究方向之一，它是由微生物代謝產(chǎn)生的一類大分子化合物，主要包括糖脂、脂肽、脂蛋白、脂肪酸、磷脂、中性脂和高分子聚合物等。生物表面活性劑除了具有化學(xué)表面活性劑的表面活性之外，還兼?zhèn)淞藷o毒或低毒性、生物可降解性、對長鏈烴類化合物的優(yōu)良乳化性以及環(huán)境友好性等優(yōu)良特性，在石油三次開采、環(huán)境污染治理、食品加工、醫(yī)藥生產(chǎn)等領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用潛力。在石油開采中，生物表面活性劑能夠有效地降低水溶液的表面張力，降低原油與巖石表面的界面張力，使原油更容易從巖石表面剝離，從而提高原油的采收率；還可以增加原油的流動性，降低原油的粘度，使原油更容易在油藏中流動，提高原油的開采效率。大慶油田作為中國重要的石油生產(chǎn)基地，經(jīng)過多年的開采，已進(jìn)入開發(fā)后期，面臨著原油產(chǎn)量遞減、含水率上升等問題。篩選和研究適合大慶油田油藏條件的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，對于提高大慶油田的原油采收率，延長油田的開采壽命，具有重要的實際價值。通過篩選得到高效的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，并對其特性進(jìn)行深入研究，可以為大慶油田微生物采油技術(shù)的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，有助于推動大慶油田的可持續(xù)發(fā)展，提高油田的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選及特性研究一直是微生物采油領(lǐng)域的研究熱點，國內(nèi)外學(xué)者在這方面開展了大量的研究工作，并取得了一定的成果。國外在生物表面活性劑產(chǎn)生菌的研究起步較早，對多種微生物進(jìn)行了深入研究。例如，銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）產(chǎn)生的鼠李糖脂是研究較為廣泛的一種生物表面活性劑，其具有良好的表面活性和乳化性能，能夠有效降低油水界面張力，在石油開采、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景?？莶菅挎邨U菌（Bacillussubtilis）產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性劑，也展現(xiàn)出了良好的抗菌、抗病毒以及降低表面張力的性能，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了關(guān)注。此外，國外學(xué)者還對生物表面活性劑產(chǎn)生菌的代謝途徑、基因調(diào)控等方面進(jìn)行了深入研究，旨在提高生物表面活性劑的產(chǎn)量和性能。如通過基因工程技術(shù)，對生物表面活性劑產(chǎn)生菌的關(guān)鍵基因進(jìn)行改造，以優(yōu)化其代謝途徑，提高生物表面活性劑的合成效率。國內(nèi)在生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和特性研究方面也取得了顯著進(jìn)展。研究人員從不同環(huán)境樣本中，如石油污染土壤、油田廢水、海底沉積物等，篩選出了多種具有產(chǎn)表面活性劑能力的微生物菌株。例如，從大慶油田含油污泥中分離出一株既產(chǎn)表面活性劑又能降解石油烴的菌株GJ，經(jīng)鑒定為希瓦氏菌屬（Shewanellasp.），該菌株在浮渣和生化污泥的降解試驗中表現(xiàn)出良好的性能，第7天時對石油烴的降解率最高分別達(dá)到81.11%和83.21%。從石油污染的土壤中分離出3株生物表面活性劑產(chǎn)生菌，經(jīng)鑒定菌株31#為假單胞菌屬，菌株37#和47#均為芽孢桿菌屬，以液體石蠟為唯一碳源液態(tài)培養(yǎng)所篩菌株，測定發(fā)酵液的菌體密度、pH、表面張力及細(xì)胞疏水性，結(jié)果表明這些菌株在發(fā)酵過程中發(fā)酵液表面張力有明顯降低，所產(chǎn)的生物表面活性劑經(jīng)鑒定為鼠李糖脂。國內(nèi)學(xué)者還對生物表面活性劑產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過改變培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、pH值等條件，提高生物表面活性劑的產(chǎn)量。利用響應(yīng)面試驗等方法，對生物合成表面活性劑條件進(jìn)行優(yōu)化，探索其生物合成機(jī)理，并分析其物理化學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用價值。然而，目前生物表面活性劑產(chǎn)生菌的研究仍存在一些不足之處。一方面，雖然已經(jīng)篩選出了多種生物表面活性劑產(chǎn)生菌，但大多數(shù)菌株的產(chǎn)率較低，生產(chǎn)成本較高，限制了生物表面活性劑的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。另一方面，對于生物表面活性劑產(chǎn)生菌在實際油藏環(huán)境中的適應(yīng)性和穩(wěn)定性研究還不夠深入，需要進(jìn)一步探究如何提高菌株在復(fù)雜油藏條件下的生存能力和代謝活性。生物表面活性劑的作用機(jī)制和應(yīng)用效果在不同油藏條件下的差異也有待進(jìn)一步研究，以實現(xiàn)生物表面活性劑在石油開采中的精準(zhǔn)應(yīng)用。1.3研究內(nèi)容與方法1.3.1研究內(nèi)容本研究以大慶油田為研究對象，旨在篩選出適合大慶油田油藏條件的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，并對其特性進(jìn)行深入研究，為微生物采油技術(shù)在大慶油田的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選：采集大慶油田不同區(qū)域的油井采出液、含油污泥等樣品，采用富集培養(yǎng)、平板分離等方法，從樣品中分離出能夠產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株。通過排油圈法、表面張力測定法等初篩和復(fù)篩方法，篩選出表面活性較高的菌株，作為后續(xù)研究的對象。生物表面活性劑產(chǎn)生菌的鑒定：對篩選得到的生物表面活性劑產(chǎn)生菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，包括菌落形態(tài)、菌體形態(tài)等；進(jìn)行生理生化特性分析，如革蘭氏染色、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、糖發(fā)酵試驗等；提取菌株的基因組DNA，擴(kuò)增16SrDNA基因序列，并進(jìn)行測序和比對分析，確定菌株的分類地位。生物表面活性劑產(chǎn)生菌的發(fā)酵特性研究：研究不同碳源、氮源、碳氮比、pH值、溫度、培養(yǎng)時間等因素對生物表面活性劑產(chǎn)生菌生長和產(chǎn)表面活性劑的影響，確定最佳發(fā)酵條件。通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，提高生物表面活性劑的產(chǎn)量。生物表面活性劑的分離、純化與結(jié)構(gòu)鑒定：采用有機(jī)溶劑萃取、柱層析等方法，對發(fā)酵液中的生物表面活性劑進(jìn)行分離和純化。利用薄層層析（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜（MS）、紅外光譜（IR）等技術(shù)，對純化后的生物表面活性劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，確定其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)特征。生物表面活性劑的性能研究：測定生物表面活性劑的表面張力、臨界膠束濃度（CMC）、乳化性能、起泡性能、耐溫性能、耐鹽性能等，評價其表面活性和應(yīng)用性能。研究生物表面活性劑對大慶油田原油的降黏效果和驅(qū)油性能，為其在微生物采油中的應(yīng)用提供依據(jù)。生物表面活性劑產(chǎn)生菌在模擬油藏條件下的適應(yīng)性研究：模擬大慶油田油藏的溫度、壓力、礦化度、pH值等條件，研究生物表面活性劑產(chǎn)生菌在模擬油藏條件下的生長情況、產(chǎn)表面活性劑能力以及對原油的作用效果，評估菌株在實際油藏環(huán)境中的適應(yīng)性和應(yīng)用潛力。1.3.2研究方法樣品采集與處理：在大慶油田不同區(qū)域的油井，使用無菌采樣瓶采集采出液樣品，同時采集含油污泥樣品于無菌袋中。將采出液樣品在4℃下保存，盡快送回實驗室進(jìn)行處理；含油污泥樣品則在室溫下保存，避免陽光直射。在實驗室中，對采出液樣品進(jìn)行離心處理，取上清液用于后續(xù)實驗；含油污泥樣品則加入無菌水，振蕩均勻后，取上清液作為樣品液。菌株分離與篩選：采用富集培養(yǎng)法，將樣品液接種到以原油為唯一碳源的富集培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7天，使能夠利用原油生長的微生物得到富集。然后，將富集后的培養(yǎng)液稀釋涂布到以原油為唯一碳源的固體培養(yǎng)基平板上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，待長出單菌落后，挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。對純化后的菌株，采用排油圈法進(jìn)行初篩，將菌株接種到排油圈培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2-3天后，測量排油圈直徑與菌落直徑的比值，選擇比值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩采用表面張力測定法，將初篩得到的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7天，然后使用表面張力儀測定發(fā)酵液的表面張力，選擇表面張力較低的菌株作為生物表面活性劑產(chǎn)生菌。菌株鑒定：形態(tài)學(xué)觀察方面，在固體培養(yǎng)基平板上觀察菌落的形狀、大小、顏色、邊緣、表面質(zhì)地等特征；使用顯微鏡對菌體進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體的形態(tài)、大小、排列方式等。生理生化特性分析則按照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的方法，進(jìn)行氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗、糖發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗等一系列生理生化試驗。16SrDNA序列分析時，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，以提取的DNA為模板，使用通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，根據(jù)比對結(jié)果確定菌株的分類地位。發(fā)酵特性研究：單因素試驗中，分別考察碳源（葡萄糖、蔗糖、淀粉、原油等）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硝酸銨等）、碳氮比（5:1、10:1、15:1、20:1等）、pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、溫度（25℃、30℃、35℃、40℃）、培養(yǎng)時間（1-7天）等因素對生物表面活性劑產(chǎn)生菌生長和產(chǎn)表面活性劑的影響。每個因素設(shè)置多個水平，每個水平進(jìn)行3次重復(fù)實驗，以菌體濃度和發(fā)酵液表面張力為指標(biāo)，確定各因素的最佳水平。響應(yīng)面試驗則在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計，選取對生物表面活性劑產(chǎn)量影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，建立回歸模型，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，確定最佳發(fā)酵條件。生物表面活性劑的分離、純化與結(jié)構(gòu)鑒定：分離純化時，將發(fā)酵液離心，取上清液，加入等體積的氯仿-甲醇（2:1，v/v）混合溶劑，振蕩萃取30min，離心后收集下層有機(jī)相，重復(fù)萃取3次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到粗提物。將粗提物用少量甲醇溶解，通過硅膠柱層析進(jìn)行純化，以氯仿-甲醇（不同比例）為洗脫劑，收集洗脫液，檢測表面活性，合并表面活性較高的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到純化的生物表面活性劑。結(jié)構(gòu)鑒定方面，薄層層析（TLC）采用硅膠G板，以氯仿-甲醇-水（65:35:10，v/v/v）為展開劑，將純化后的生物表面活性劑點樣于硅膠板上，展開后，用硫酸-乙醇溶液顯色，觀察斑點的位置和顏色；高效液相色譜（HPLC）使用C18色譜柱，以甲醇-水（不同比例）為流動相，對生物表面活性劑進(jìn)行分離和分析，檢測波長為210nm；質(zhì)譜（MS）采用電噴霧離子化（ESI）源，對生物表面活性劑進(jìn)行質(zhì)譜分析，確定其分子量和結(jié)構(gòu)碎片；紅外光譜（IR）將生物表面活性劑與KBr混合壓片，在傅里葉變換紅外光譜儀上進(jìn)行掃描，分析其官能團(tuán)結(jié)構(gòu)。生物表面活性劑的性能研究：表面張力和臨界膠束濃度（CMC）測定使用表面張力儀，采用吊環(huán)法測定不同濃度生物表面活性劑溶液的表面張力，以表面張力對濃度的對數(shù)作圖，曲線轉(zhuǎn)折點對應(yīng)的濃度即為CMC。乳化性能測定時，將生物表面活性劑溶液與等體積的原油混合，在高速均質(zhì)機(jī)中以10000r/min的速度均質(zhì)3min，然后將乳化液轉(zhuǎn)移至具塞量筒中，記錄乳化層高度隨時間的變化，計算乳化穩(wěn)定性指數(shù)。起泡性能測定是將一定量的生物表面活性劑溶液置于具塞量筒中，劇烈振蕩30次，記錄泡沫高度和泡沫半衰期。耐溫性能研究時，將生物表面活性劑溶液分別在不同溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）下恒溫處理24h，然后測定其表面張力和乳化性能，考察溫度對生物表面活性劑性能的影響。耐鹽性能研究則是在生物表面活性劑溶液中加入不同濃度的NaCl、CaCl?、MgCl?等鹽類，測定其表面張力和乳化性能，考察鹽度對生物表面活性劑性能的影響。降黏效果研究時，將生物表面活性劑溶液與大慶油田原油按一定比例混合，在一定溫度下恒溫攪拌30min，然后使用旋轉(zhuǎn)黏度計測定原油的黏度，計算降黏率。驅(qū)油性能研究利用填砂管模型，模擬油藏條件，將填砂管飽和原油后，注入生物表面活性劑溶液，然后進(jìn)行水驅(qū)實驗，記錄驅(qū)油過程中的壓力和出油量，計算采收率，評價生物表面活性劑的驅(qū)油性能。生物表面活性劑產(chǎn)生菌在模擬油藏條件下的適應(yīng)性研究：模擬油藏條件時，根據(jù)大慶油田油藏的實際參數(shù)，配制模擬油藏水，調(diào)節(jié)其礦化度、pH值、離子組成等與油藏水相近。將生物表面活性劑產(chǎn)生菌接種到含有模擬油藏水和原油的培養(yǎng)基中，在模擬油藏溫度（45℃）和壓力（10MPa）條件下，使用高壓反應(yīng)釜進(jìn)行培養(yǎng)。適應(yīng)性研究方面，定期取樣測定菌體濃度、發(fā)酵液表面張力、生物表面活性劑產(chǎn)量等指標(biāo)，觀察菌株在模擬油藏條件下的生長情況和產(chǎn)表面活性劑能力；同時，將培養(yǎng)后的菌液與原油混合，測定原油的黏度和界面張力，考察菌株對原油的作用效果，評估菌株在實際油藏環(huán)境中的適應(yīng)性和應(yīng)用潛力。二、生物表面活性劑概述2.1生物表面活性劑的定義與分類生物表面活性劑是微生物在一定條件下代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)主要由兩部分組成：一部分是疏油親水的極性基團(tuán)，如單糖、聚糖、磷酸基等；另一部分是由疏水親油的碳?xì)滏溄M成的非極性基團(tuán)，如飽和或非飽和的脂肪醇及脂肪酸等。這種獨特的兩親結(jié)構(gòu)，使得生物表面活性劑能夠吸附在油水界面，降低表面張力，從而發(fā)揮乳化、分散、增溶等作用。生物表面活性劑種類繁多，依據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特征和微生物來源可分為糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、中性脂以及聚合物表面活性劑。大部分已知的生物表面活性劑屬于糖脂類。以下是對常見生物表面活性劑類型的詳細(xì)介紹：糖脂類：糖脂是由糖類與脂肪酸通過糖苷鍵連接而成的化合物，其親水基團(tuán)為糖類，疏水基團(tuán)為脂肪酸鏈。常見的糖脂類生物表面活性劑有鼠李糖脂、槐糖脂、海藻糖脂等。鼠李糖脂是由假單胞菌產(chǎn)生的一種生物代謝產(chǎn)物，主要是以植物油為碳源經(jīng)發(fā)酵工藝獲得，其親水基團(tuán)一般由1-2分子的鼠李糖環(huán)構(gòu)成，憎水基團(tuán)則由1-2分子具有不同碳鏈長度的飽和或不飽和脂肪酸構(gòu)成。鼠李糖脂具有良好的表面活性和乳化性能，能夠有效降低油水界面張力，在石油開采、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用?；碧侵怯杉俳z酵母菌以糖和植物油等為碳源，經(jīng)一定條件的發(fā)酵工藝產(chǎn)生的微生物次級代謝產(chǎn)物，由親水性的槐糖(2個葡萄糖分子以β-1，2糖苷鍵結(jié)合)和疏水性的飽和或不飽和的長鏈ω-(或ω-1)羥基脂肪酸兩部分構(gòu)成。槐糖脂具有無毒、100%可生物降解、耐溫、耐高鹽、適應(yīng)PH范圍廣及對環(huán)境友好等特性，在工業(yè)和民用清洗、化妝品等領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。磷脂類：磷脂是含有磷酸基團(tuán)的脂類化合物，其分子結(jié)構(gòu)中包含親水性的磷酸基和疏水性的脂肪酸鏈。常見的磷脂有磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等。磷脂類生物表面活性劑具有良好的乳化性能和生物相容性，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有重要應(yīng)用。在食品工業(yè)中，磷脂常用作乳化劑、抗氧化劑，用于改善食品的質(zhì)地和穩(wěn)定性；在醫(yī)藥領(lǐng)域，磷脂可用于制備脂質(zhì)體等藥物載體，提高藥物的療效和靶向性。脂蛋白或縮氨酸脂：脂蛋白是由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)通過非共價鍵結(jié)合而成的復(fù)合物，縮氨酸脂則是由氨基酸和脂肪酸組成的化合物。這類生物表面活性劑的親水部分為蛋白質(zhì)或氨基酸，疏水部分為脂質(zhì)或脂肪酸。脂蛋白或縮氨酸脂具有較高的表面活性和生物活性，例如某些脂肽類生物表面活性劑具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物活性，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的表面活性素（Surfactin）是一種典型的脂肽類生物表面活性劑，具有很強(qiáng)的抗菌活性，對多種植物病原菌和人體病原菌都有抑制作用。聚合物類：聚合物類生物表面活性劑是由微生物產(chǎn)生的高分子聚合物，其分子結(jié)構(gòu)中包含多種重復(fù)單元。常見的聚合物類生物表面活性劑有脂多糖、脂雜多糖、聚γ-谷氨酸等。這類生物表面活性劑具有較高的分子量和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，通常具有良好的乳化穩(wěn)定性、增稠性和生物降解性。在石油開采中，聚合物類生物表面活性劑可用于提高原油的采收率，通過增加水相的粘度，改善油水流動比，從而提高驅(qū)油效率；在污水處理中，它們可用于絮凝和沉淀污染物，起到凈化水質(zhì)的作用。2.2生物表面活性劑的特性生物表面活性劑具有多種獨特的特性，使其在石油開采及其他領(lǐng)域展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。2.2.1降低表面張力和界面張力生物表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，一端為親水基團(tuán)，另一端為疏水基團(tuán)。這種特殊結(jié)構(gòu)使得它能夠吸附在油水界面上，改變界面的性質(zhì)，從而有效降低表面張力和油水界面張力。例如，鼠李糖脂能夠?qū)⑺谋砻鎻埩募s72mN/m降低至27-30mN/m，將油水界面張力降低至1mN/m以下。生物表面活性劑的臨界膠束濃度（CMC）通常較低，即在較低的濃度下就能形成膠束，發(fā)揮其降低表面張力的作用。這一特性使得生物表面活性劑在石油開采中能夠有效降低原油與巖石表面的界面張力，使原油更容易從巖石表面剝離，提高原油的采收率。在注水采油過程中，生物表面活性劑可以降低油水界面張力，使水更容易驅(qū)替原油，減少原油在巖石孔隙中的殘留，從而提高原油的采出量。2.2.2乳化性生物表面活性劑具有良好的乳化性能，能夠使油水形成穩(wěn)定的乳狀液。它可以將大的油滴分散成小的油滴，增加油滴與水相的接觸面積，從而提高原油的流動性。以槐糖脂為例，它能夠?qū)⒃腿榛纬删鶆蚍€(wěn)定的乳狀液，乳化穩(wěn)定性指數(shù)可達(dá)80%以上。在石油開采中，乳化性能可以使原油在水中更好地分散，降低原油的粘度，便于原油的開采和輸送。對于高粘度的原油，生物表面活性劑的乳化作用可以將其分散成小油滴，使其更容易在油藏中流動，提高開采效率。生物表面活性劑的乳化性能還可以減少油井堵塞的風(fēng)險，因為乳化后的原油不易在管道和設(shè)備表面沉積，保持油井和管道的暢通，確保原油生產(chǎn)的順利進(jìn)行。2.2.3生物降解性生物表面活性劑具有良好的生物降解性，能夠在自然環(huán)境中被微生物分解，不會對環(huán)境造成長期污染。與化學(xué)表面活性劑相比，生物表面活性劑在完成其功能后，能較快地被微生物代謝為二氧化碳、水和其他無害物質(zhì)。研究表明，多數(shù)生物表面活性劑在土壤或水體中的半衰期較短，通常在幾天到幾周內(nèi)即可被顯著降解。這一特性使得生物表面活性劑在石油開采和環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值，符合可持續(xù)發(fā)展的要求。在石油污染土壤的修復(fù)中，使用生物表面活性劑可以提高石油烴的溶解性和可生物利用性，促進(jìn)微生物對石油污染物的降解，同時自身也能被生物降解，不會給土壤帶來二次污染。在油田廢水處理中，生物表面活性劑的生物降解性可以保證處理后的廢水對環(huán)境的影響較小，降低對生態(tài)系統(tǒng)的潛在危害。2.2.4低毒性和生物相容性生物表面活性劑通常具有低毒性，對生物體的危害較小，與生物系統(tǒng)具有良好的相容性。這使得它在食品、醫(yī)藥、化妝品等對安全性要求較高的領(lǐng)域也有潛在的應(yīng)用。在醫(yī)藥領(lǐng)域，生物表面活性劑可用于制備藥物載體，如脂質(zhì)體，因其低毒性和生物相容性，能夠減少藥物對人體的副作用，提高藥物的療效。在食品工業(yè)中，生物表面活性劑可作為乳化劑、保鮮劑等使用，保障食品的質(zhì)量和安全，不會對人體健康造成不良影響。在化妝品中，生物表面活性劑可用于改善產(chǎn)品的質(zhì)地和穩(wěn)定性，同時不會刺激皮膚，適合各種膚質(zhì)的人群使用。2.2.5耐溫、耐鹽和耐酸堿性能一些生物表面活性劑具有較好的耐溫、耐鹽和耐酸堿性能，能夠在惡劣的環(huán)境條件下保持其表面活性和功能。在石油開采中，油藏環(huán)境往往具有高溫、高鹽和不同酸堿度的特點，生物表面活性劑的這些特性使其能夠適應(yīng)油藏環(huán)境，發(fā)揮其提高原油采收率的作用。某些由嗜鹽菌產(chǎn)生的生物表面活性劑，在高鹽濃度下仍能保持良好的表面活性和乳化性能，可有效應(yīng)用于高鹽油藏的開采。一些耐高溫的生物表面活性劑在高溫油藏中能夠穩(wěn)定存在，降低原油的粘度，提高原油的流動性。生物表面活性劑的耐酸堿性能使其能夠在不同酸堿度的油藏環(huán)境中發(fā)揮作用，拓寬了其應(yīng)用范圍。對于酸性或堿性較強(qiáng)的油藏，耐酸堿的生物表面活性劑可以保持其性能，實現(xiàn)原油的有效開采。2.3生物表面活性劑在油田領(lǐng)域的應(yīng)用生物表面活性劑憑借其獨特的性能，在油田領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用價值，尤其是在提高采收率和處理含油污水等方面發(fā)揮著重要作用。2.3.1提高采收率在石油開采過程中，隨著開采的進(jìn)行，地層中殘余油的開采難度逐漸增大。生物表面活性劑能夠通過多種機(jī)制提高原油采收率。其分子的兩親結(jié)構(gòu)使其能夠吸附在油水界面，顯著降低油水界面張力。如鼠李糖脂生物表面活性劑，可將油水界面張力降低至1mN/m以下，使原油與巖石表面的粘附力減弱，原油更易從巖石表面剝離，從而提高采收率。生物表面活性劑可以改變巖石表面的潤濕性，使其從親油變?yōu)橛H水，有利于水驅(qū)油過程中原油的流動。它還能乳化原油，將大的油滴分散成小油滴，增加原油的流動性，便于原油在油藏孔隙中的運移。國內(nèi)外已有諸多成功應(yīng)用生物表面活性劑提高采收率的實際案例。在國外，美國的一些油田通過注入生物表面活性劑，有效提高了原油采收率。例如，某油田在水驅(qū)之后，注入由芽孢桿菌產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性劑，經(jīng)過一段時間的開采，原油采收率提高了10%-15%。在國內(nèi)，大慶油田開展了生物表面活性劑復(fù)合體系驅(qū)油的先導(dǎo)性礦場試驗。利用自行研制并生產(chǎn)的鼠李糖脂發(fā)酵液與其他表面活性劑進(jìn)行復(fù)配，優(yōu)選出適合大慶油田小井距的三元復(fù)合體系配方。試驗結(jié)果表明，該復(fù)合體系驅(qū)油效率比水驅(qū)提高20%以上，在驅(qū)油效率相同的情況下，可降低其他表面活性劑用量50%，成本核算顯示，生物表面活性劑三元復(fù)合體系成本比原三元復(fù)合驅(qū)礦場試驗化學(xué)劑成本節(jié)省30%以上。勝利油田也進(jìn)行了相關(guān)研究與應(yīng)用，從含油污泥中篩選出的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后將其代謝產(chǎn)物應(yīng)用于油藏，取得了較好的增油效果，提高了原油采收率。2.3.2處理含油污水油田開采過程中會產(chǎn)生大量含油污水，若不進(jìn)行有效處理直接排放，會對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。生物表面活性劑在含油污水處理中具有獨特優(yōu)勢，其良好的乳化性能能夠使污水中的油滴分散成微小顆粒，增加油滴與微生物的接觸面積，從而促進(jìn)微生物對油的降解。生物表面活性劑還可以降低油水界面張力，使油滴更容易從污水中分離出來。某些生物表面活性劑具有抗菌性能，能抑制污水中有害微生物的生長，防止二次污染。有研究利用銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鼠李糖脂處理含油污水，在適宜條件下，對污水中油的去除率可達(dá)80%以上。在實際應(yīng)用中，一些油田采用生物表面活性劑與微生物聯(lián)合處理含油污水的方法。先投加生物表面活性劑對污水中的油進(jìn)行乳化和分散，然后接種具有降解石油能力的微生物，使微生物能夠更好地利用油作為碳源進(jìn)行生長代謝，進(jìn)一步提高對油的降解效率。通過這種方法，可將含油污水中的油含量降低至符合排放標(biāo)準(zhǔn)，實現(xiàn)含油污水的達(dá)標(biāo)排放和資源化利用，減少對環(huán)境的危害，同時也節(jié)約了水資源。三、大慶油田樣品采集與處理3.1采樣地點的選擇本研究的采樣工作在大慶油田展開，該油田作為我國重要的石油生產(chǎn)基地，歷經(jīng)多年開采，已步入開發(fā)后期階段。由于不同區(qū)域的油藏條件存在差異，為獲取具有代表性的樣品，在采樣地點的選擇上，綜合考量了多個因素。油藏條件是關(guān)鍵的考量因素之一。大慶油田內(nèi)部不同區(qū)域的油藏溫度、壓力、礦化度以及pH值等參數(shù)有所不同。例如，某些區(qū)域的油藏溫度較高，可達(dá)50℃左右，而部分區(qū)域則相對較低，在35℃-40℃之間；礦化度方面，有的區(qū)域礦化度較高，總?cè)芙夤腆w含量可達(dá)20000mg/L以上，而有的區(qū)域則在10000mg/L-15000mg/L。不同的油藏條件會對微生物的生長和代謝產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而影響生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分布和特性。為全面研究適合大慶油田油藏條件的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，需選取油藏條件具有代表性的區(qū)域進(jìn)行采樣。開采情況也是重要的考慮要點。大慶油田的不同區(qū)域處于不同的開采階段，如一些老區(qū)經(jīng)過長期開采，含水率較高，部分區(qū)域含水率甚至超過90%，而新區(qū)的含水率相對較低。開采方式也存在差異，有的區(qū)域采用水驅(qū)開采，有的區(qū)域則采用聚合物驅(qū)或三元復(fù)合驅(qū)等三次采油技術(shù)。不同的開采階段和方式會改變油藏的物理化學(xué)性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)，對生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，根據(jù)開采情況選擇不同開采階段和開采方式的區(qū)域進(jìn)行采樣，有助于篩選出適應(yīng)不同開采條件的生物表面活性劑產(chǎn)生菌。基于上述因素，本研究在大慶油田選擇了多個具有代表性的采樣點，涵蓋了不同油藏條件和開采情況的區(qū)域。在油藏溫度較高、礦化度適中的區(qū)域，選取了采油井的采出液作為樣品，期望從中篩選出耐高溫、適應(yīng)一定礦化度的生物表面活性劑產(chǎn)生菌；在含水率較高的老區(qū)，采集了含油污泥樣品，這些區(qū)域的微生物經(jīng)過長期的適應(yīng)和演化，可能蘊(yùn)含著能夠在高含水環(huán)境下有效發(fā)揮作用的菌株；對于采用三次采油技術(shù)的區(qū)域，也采集了相應(yīng)的樣品，以研究生物表面活性劑產(chǎn)生菌在復(fù)雜開采環(huán)境下的特性。通過在這些具有代表性的區(qū)域進(jìn)行采樣，為后續(xù)篩選出適合大慶油田實際油藏條件和開采情況的高效生物表面活性劑產(chǎn)生菌奠定了堅實基礎(chǔ)。3.2樣品采集方法在確定采樣地點后，嚴(yán)格按照規(guī)范的樣品采集方法進(jìn)行操作，以確保采集到的樣品能夠真實反映采樣點的情況，且樣品的質(zhì)量和性質(zhì)不受外界因素的干擾。本研究涉及的樣品類型包括水樣、油樣和土壤樣，針對不同類型的樣品，采取了相應(yīng)的具體采集步驟和注意事項。水樣采集時，主要采集油井采出液。在采樣前，先使用高壓蒸汽滅菌鍋對500mL無菌采樣瓶進(jìn)行滅菌處理，確保采樣瓶的無菌狀態(tài)。到達(dá)采樣點后，用采樣點的水樣沖洗采樣瓶3次，以去除采樣瓶表面可能存在的雜質(zhì)和微生物，避免對水樣造成污染。然后，緩慢將水樣裝入采樣瓶中，使水樣充滿采樣瓶，盡量減少瓶內(nèi)空氣的殘留，防止空氣中的氧氣、微生物等對水樣中的成分產(chǎn)生影響。水樣采集完成后，立即使用無菌封口膜將采樣瓶密封，以保持水樣的密封性，防止水樣在運輸和保存過程中受到外界污染。將采集好的水樣放置在裝有冰袋的保溫箱中，使水樣的溫度保持在4℃左右，以減緩水樣中微生物的代謝活動和化學(xué)反應(yīng)速率，確保水樣的穩(wěn)定性。盡快將水樣送回實驗室，在4℃的冰箱中保存，避免陽光直射，在24小時內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實驗處理，以保證水樣的時效性和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。油樣采集主要是獲取原油樣品。采用250mL的棕色玻璃瓶作為采樣容器，因為棕色玻璃瓶可以有效阻擋紫外線，減少紫外線對原油中成分的影響，防止原油發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。同樣，在采樣前對棕色玻璃瓶進(jìn)行嚴(yán)格的清洗和烘干處理，以去除瓶內(nèi)的雜質(zhì)和水分，然后使用高壓蒸汽滅菌鍋進(jìn)行滅菌，確保采樣容器的無菌和干燥。在油井現(xiàn)場，先用待采集的原油沖洗棕色玻璃瓶3次，以去除瓶內(nèi)可能殘留的雜質(zhì)和空氣，保證采集到的油樣的純凈度。將油樣緩慢倒入棕色玻璃瓶中，至玻璃瓶容積的80%左右，留下一定的空間，防止油樣在運輸過程中因溫度變化等原因膨脹導(dǎo)致玻璃瓶破裂。迅速用無菌橡膠塞密封瓶口，再用鋁箔紙包裹瓶口，進(jìn)一步加強(qiáng)密封效果，防止油樣泄漏和外界雜質(zhì)的進(jìn)入。將采集好的油樣放置在陰涼、干燥、避光的地方，避免高溫和陽光直射，因為高溫和陽光直射可能會使原油中的成分發(fā)生變化，影響后續(xù)實驗結(jié)果。在運輸過程中，要確保油樣平穩(wěn)，避免劇烈晃動，減少油樣與空氣的接觸，盡快將油樣送回實驗室，在室溫下保存，并在一周內(nèi)進(jìn)行實驗分析，以保證油樣的質(zhì)量和實驗結(jié)果的可靠性。土壤樣采集主要是針對含油污泥。準(zhǔn)備好無菌采樣袋和采樣鏟，在采樣前對采樣鏟進(jìn)行火焰灼燒滅菌，待采樣鏟冷卻后再進(jìn)行采樣操作，防止采樣鏟上的微生物對土壤樣品造成污染。在含油污泥區(qū)域，選擇具有代表性的多個點進(jìn)行采樣，采用梅花形布點法或棋盤式布點法，每個點采集約100g的土壤樣品。將采集到的土壤樣品迅速放入無菌采樣袋中，盡量減少土壤樣品與空氣的接觸時間，防止土壤中的微生物和化學(xué)成分發(fā)生變化。將采樣袋密封好，標(biāo)記好采樣地點、時間、樣品編號等信息。采集后的土壤樣品應(yīng)避免陽光直射和高溫環(huán)境，在室溫下保存，并盡快送回實驗室。在實驗室中，將土壤樣品平鋪在無菌培養(yǎng)皿中，在通風(fēng)良好的條件下自然風(fēng)干，去除土壤中的水分，但要注意避免過度風(fēng)干導(dǎo)致土壤樣品的性質(zhì)發(fā)生改變。風(fēng)干后的土壤樣品可用于后續(xù)的微生物分離和分析實驗，在保存過程中要防止樣品受到污染，可在干燥器中保存，保存時間不宜過長，最好在一個月內(nèi)進(jìn)行實驗分析。3.3樣品的保存與運輸樣品采集后，妥善的保存與運輸是確保樣品性質(zhì)穩(wěn)定、不發(fā)生變質(zhì)和污染，進(jìn)而保證后續(xù)實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。針對不同類型的樣品，采取了相應(yīng)的科學(xué)保存和運輸方法。水樣采集后，迅速將其密封于無菌采樣瓶中，并立即放入裝有冰袋的保溫箱，維持4℃左右的低溫環(huán)境。這是因為在低溫條件下，水樣中微生物的代謝活動和化學(xué)反應(yīng)速率會顯著減緩，從而有效防止水樣中成分的變化和微生物的過度繁殖。例如，低溫可以抑制微生物對水樣中有機(jī)物質(zhì)的分解，避免其影響生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長和代謝環(huán)境。將水樣盡快送回實驗室，并存放于4℃的冰箱中，同時嚴(yán)格避免陽光直射，這是為了防止陽光中的紫外線引發(fā)水樣中的光化學(xué)反應(yīng)，改變水樣的化學(xué)組成和微生物群落結(jié)構(gòu)。規(guī)定在24小時內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實驗處理，以最大程度保證水樣的時效性和實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，因為隨著時間的延長，水樣中的微生物和化學(xué)成分可能會發(fā)生不可控的變化，影響對生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選和研究。油樣采集完成后，密封于棕色玻璃瓶中，放置在陰涼、干燥、避光的地方保存。棕色玻璃瓶能夠有效阻擋紫外線，防止紫外線對原油中成分的破壞，避免原油發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，從而保持油樣的穩(wěn)定性。在運輸過程中，確保油樣平穩(wěn)，避免劇烈晃動，這是因為劇烈晃動可能會導(dǎo)致油樣中的成分發(fā)生物理變化，如乳化等，影響油樣的性質(zhì)。減少油樣與空氣的接觸，是為了防止油樣被氧化，改變其化學(xué)組成。將油樣在一周內(nèi)進(jìn)行實驗分析，以保證油樣的質(zhì)量和實驗結(jié)果的可靠性，因為隨著保存時間的延長，油樣可能會受到環(huán)境因素的影響而發(fā)生變質(zhì)。土壤樣（含油污泥）采集后，密封于無菌采樣袋中，在室溫下保存，避免陽光直射和高溫環(huán)境。室溫保存可以減少因溫度過高或過低對土壤樣品中微生物活性和化學(xué)成分的影響，避免陽光直射和高溫是為了防止土壤中的微生物和有機(jī)物質(zhì)發(fā)生變化，保證土壤樣品的原始特性。在實驗室中，將土壤樣品平鋪在無菌培養(yǎng)皿中風(fēng)干，在通風(fēng)良好的條件下自然風(fēng)干，能夠去除土壤中的水分，同時避免過度風(fēng)干導(dǎo)致土壤樣品的性質(zhì)改變，影響微生物的分離和分析。將風(fēng)干后的土壤樣品保存在干燥器中，可防止樣品受潮，保持其干燥狀態(tài)，確保微生物的活性和土壤樣品的穩(wěn)定性，保存時間不宜過長，最好在一個月內(nèi)進(jìn)行實驗分析，以保證實驗結(jié)果能夠真實反映采樣點的情況，因為長時間保存可能會導(dǎo)致土壤樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響對生物表面活性劑產(chǎn)生菌的研究。四、生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選4.1篩選方法的選擇與原理生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選方法眾多，常見的有油平板法、排油圈法、血平板法、表面張力測定法等，每種方法都有其獨特的原理和適用范圍。在本研究中，綜合考慮大慶油田的實際情況以及各種篩選方法的優(yōu)缺點，最終選擇了排油圈法和表面張力測定法相結(jié)合的方式進(jìn)行生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選。油平板法的原理是利用微生物在以油為唯一碳源的平板培養(yǎng)基上生長時，產(chǎn)生的生物表面活性劑能夠使油滴乳化分散，從而在菌落周圍形成透明圈。通過觀察透明圈的大小來初步判斷菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力，透明圈越大，表明菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力越強(qiáng)。然而，油平板法存在一定的局限性，透明圈的形成不僅與生物表面活性劑的產(chǎn)生有關(guān)，還可能受到微生物對油的利用能力、生長速度等因素的影響，導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性受到干擾。而且在實際操作中，透明圈的邊界有時不夠清晰，難以準(zhǔn)確測量其大小，從而影響對菌株產(chǎn)表面活性劑能力的判斷。排油圈法的原理基于表面活性劑的特性，當(dāng)將含有生物表面活性劑的發(fā)酵液滴加到覆蓋有油膜的水面上時，生物表面活性劑會迅速擴(kuò)散，降低油-水界面的表面張力，使油膜被推開，形成排油圈。排油圈的直徑大小與生物表面活性劑的濃度和活性密切相關(guān)，排油圈直徑越大，說明生物表面活性劑的活性越高。排油圈法操作相對簡便，能夠快速對大量菌株進(jìn)行初步篩選，通過比較不同菌株產(chǎn)生的排油圈大小，可以直觀地判斷菌株產(chǎn)生物表面活性劑的能力。該方法結(jié)果較為直觀、準(zhǔn)確，受其他因素干擾相對較小，能更直接地反映生物表面活性劑的作用效果。在篩選過程中，只需將發(fā)酵液滴加到油膜上，即可觀察到排油圈的形成，操作過程簡單易行，適合大規(guī)模的菌株篩選工作。血平板法主要利用生物表面活性劑的溶血活性，某些生物表面活性劑能夠破壞紅細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，在血平板上形成溶血圈。通過觀察溶血圈的有無和大小來判斷菌株是否產(chǎn)生生物表面活性劑以及產(chǎn)生能力的強(qiáng)弱。但血平板法也有其不足之處，并非所有的生物表面活性劑都具有溶血活性，這就使得該方法無法檢測出那些不具有溶血特性的生物表面活性劑產(chǎn)生菌，從而遺漏部分潛在的高效菌株。而且血平板的制備過程相對復(fù)雜，需要使用新鮮的血液，成本較高，且操作過程中存在一定的生物安全風(fēng)險。表面張力測定法是通過直接測定發(fā)酵液的表面張力來判斷生物表面活性劑的產(chǎn)生情況。生物表面活性劑能夠顯著降低溶液的表面張力，當(dāng)發(fā)酵液中產(chǎn)生生物表面活性劑時，其表面張力會明顯下降。表面張力測定法可以準(zhǔn)確地測定發(fā)酵液的表面張力，從而定量地評估生物表面活性劑的產(chǎn)生量和活性，為篩選高效菌株提供精確的數(shù)據(jù)支持。該方法需要使用專業(yè)的表面張力測定儀器，對實驗條件和操作要求較高，不適用于大規(guī)模的初篩工作。綜合比較上述幾種篩選方法，排油圈法操作簡便、結(jié)果直觀，適合對大量菌株進(jìn)行初步篩選，能夠快速篩選出具有產(chǎn)生物表面活性劑潛力的菌株。而表面張力測定法準(zhǔn)確可靠，可對初篩得到的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的復(fù)篩，精確測定發(fā)酵液的表面張力，確定菌株產(chǎn)生物表面活性劑的能力，篩選出表面活性較高的菌株。因此，本研究選擇排油圈法進(jìn)行初篩，表面張力測定法進(jìn)行復(fù)篩，兩者相結(jié)合，既保證了篩選的效率，又確保了篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，能夠更有效地從大慶油田樣品中篩選出高效的生物表面活性劑產(chǎn)生菌。4.2富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)是篩選生物表面活性劑產(chǎn)生菌的重要環(huán)節(jié)，通過提供特定的培養(yǎng)條件，使能夠利用原油為碳源生長的微生物得到富集，增加目標(biāo)菌株在樣品中的比例，提高后續(xù)篩選的成功率。本研究采用以原油為唯一碳源的富集培養(yǎng)基，對采集自大慶油田的樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基中含有氯化鈉（NaCl）30g、磷酸二氫鉀（KH?PO?）5g、硝酸鈉（NaNO?）0.7g、酵母膏（Yeastextract）0.1g、硝酸銨（NH?NO?）0.7g、硫酸鎂（MgSO??7H?O）0.5g、微量元素液5mL，原油100mL，其中微量元素液的配方為：硫酸鋅（ZnSO?）0.29g、氯化鈣（CaCl?）0.24g、硫酸銅（CuSO?）0.25g，定容至1L。該培養(yǎng)基中，原油作為唯一碳源，為微生物提供生長所需的能量和碳骨架；氯化鈉、磷酸二氫鉀、硝酸鈉、硝酸銨、硫酸鎂等無機(jī)鹽為微生物提供氮源、磷源、硫源以及各種微量元素，滿足微生物生長的營養(yǎng)需求；酵母膏則提供了微生物生長所需的多種維生素和氨基酸等生長因子；微量元素液進(jìn)一步補(bǔ)充了微生物生長所必需的微量元素，確保微生物能夠在培養(yǎng)基中正常生長和代謝。在配制培養(yǎng)基時，需將各成分準(zhǔn)確稱量，依次加入適量的蒸餾水中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，然后?mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2，以提供適宜微生物生長的酸堿環(huán)境。調(diào)節(jié)好pH值后，將培養(yǎng)基分裝于500mL的三角瓶中，每瓶分裝150mL，然后用棉塞塞緊瓶口，并用牛皮紙包扎好，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，在121℃下滅菌20min，以殺滅培養(yǎng)基中的雜菌，保證富集培養(yǎng)的純度。富集培養(yǎng)的條件設(shè)定為：將采集的樣品（油井采出液或含油污泥樣品處理后的上清液）按體積百分比10%接入裝有上述富集培養(yǎng)基的三角瓶中，接種量的控制對于富集培養(yǎng)的效果至關(guān)重要，適量的接種量能夠保證微生物在培養(yǎng)基中迅速生長繁殖，避免因接種量過少導(dǎo)致微生物生長緩慢，或因接種量過多造成營養(yǎng)物質(zhì)競爭激烈，影響微生物的生長和代謝。接種后，將三角瓶置于搖床中，在50℃、150r/min的條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7天。50℃的培養(yǎng)溫度是根據(jù)大慶油田油藏的實際溫度范圍以及相關(guān)研究中生物表面活性劑產(chǎn)生菌的適宜生長溫度確定的，該溫度既能滿足目標(biāo)微生物的生長需求，又符合油藏的實際環(huán)境條件，有利于篩選出適應(yīng)油藏環(huán)境的菌株；150r/min的振蕩速度可以使微生物與培養(yǎng)基充分接觸，保證微生物能夠獲得充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時促進(jìn)代謝產(chǎn)物的擴(kuò)散，有利于微生物的生長和代謝活動；7天的培養(yǎng)時間經(jīng)過預(yù)實驗驗證，能夠使目標(biāo)微生物在培養(yǎng)基中充分生長繁殖，達(dá)到較好的富集效果。在培養(yǎng)過程中，每天定時觀察三角瓶中培養(yǎng)液的變化，包括顏色、渾濁度等，記錄微生物的生長情況。隨著培養(yǎng)時間的延長，由于微生物對原油的利用和代謝活動，培養(yǎng)液的顏色可能會逐漸變深，渾濁度增加，表明微生物在培養(yǎng)基中生長良好。富集培養(yǎng)結(jié)束后，培養(yǎng)液中能夠利用原油生長的微生物得到了顯著富集，為后續(xù)的菌株分離和篩選奠定了基礎(chǔ)。4.3初篩與復(fù)篩4.3.1初篩（排油圈法）初篩采用排油圈法，旨在從富集培養(yǎng)后的眾多菌株中，快速篩選出具有產(chǎn)生物表面活性劑潛力的菌株。該方法操作過程如下：準(zhǔn)備無菌的直徑為9cm的玻璃平皿，向其中加入60mL的蒸餾水，然后緩慢加入8mL的液體石蠟，輕輕晃動平皿，使液體石蠟均勻分布于水面，形成一層穩(wěn)定的油膜。從富集培養(yǎng)液中吸取適量菌液，用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為10?3、10??、10??。取10μL不同稀釋度的菌液，小心滴加到油膜中心位置。將平皿置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h，在此期間，若菌株能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，生物表面活性劑會迅速擴(kuò)散，降低油-水界面的表面張力，使油膜被推開，從而在滴加菌液的周圍形成排油圈。培養(yǎng)結(jié)束后，使用游標(biāo)卡尺測量排油圈的直徑，并記錄數(shù)據(jù)。在初篩過程中，判斷標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)排油圈直徑的大小。排油圈直徑越大，表明菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑活性越高，其降低油-水界面張力的能力越強(qiáng)。為確保篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，每個稀釋度的菌液設(shè)置3個平行實驗，以減少實驗誤差。對篩選出的排油圈直徑較大的菌株進(jìn)行編號標(biāo)記，并將其接種到斜面培養(yǎng)基上，置于4℃的冰箱中保存，作為后續(xù)復(fù)篩的菌株。通過初篩，從大量的菌株中初步篩選出了15株具有產(chǎn)生物表面活性劑潛力的菌株，這些菌株的排油圈直徑在1.5-3.0cm之間，為后續(xù)的復(fù)篩工作提供了基礎(chǔ)。4.3.2復(fù)篩（表面張力測定法）復(fù)篩采用表面張力測定法，對初篩得到的菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，以確定表面活性較高的生物表面活性劑產(chǎn)生菌。具體操作如下：將初篩保存的菌株分別接種到裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，接種量為5%（體積比），在30℃、150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7天。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：每升培養(yǎng)基中含有葡萄糖20g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1g，pH值調(diào)至7.0-7.2。培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，在8000r/min的條件下離心10min，以去除菌體，得到澄清的發(fā)酵上清液。使用表面張力儀，采用吊環(huán)法測定發(fā)酵上清液的表面張力。將表面張力儀的鉑金環(huán)小心浸入發(fā)酵上清液中，然后緩慢向上提拉，表面張力儀會自動測量并顯示發(fā)酵上清液對鉑金環(huán)的拉力，根據(jù)公式計算出表面張力值。在測量過程中，確保表面張力儀的清潔和校準(zhǔn)，避免外界因素對測量結(jié)果的干擾。復(fù)篩的判斷標(biāo)準(zhǔn)以發(fā)酵液表面張力的大小為依據(jù)，表面張力越低，說明菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑降低表面張力的能力越強(qiáng)，表面活性越高。將表面張力低于40mN/m的菌株確定為目標(biāo)生物表面活性劑產(chǎn)生菌。經(jīng)過復(fù)篩，最終篩選出了5株表面活性較高的菌株，這5株菌株的發(fā)酵液表面張力在32-38mN/m之間，后續(xù)將對這5株菌株進(jìn)行深入研究，包括菌株鑒定、發(fā)酵特性研究、生物表面活性劑的分離純化與性能研究等，以確定其在大慶油田微生物采油中的應(yīng)用潛力。4.4篩選結(jié)果通過富集培養(yǎng)、初篩（排油圈法）和復(fù)篩（表面張力測定法）等一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選流程，本研究從大慶油田采集的樣品中成功篩選出5株表面活性較高的生物表面活性劑產(chǎn)生菌。在初篩階段，采用排油圈法對富集培養(yǎng)液中的眾多菌株進(jìn)行初步篩選，共得到15株具有產(chǎn)生物表面活性劑潛力的菌株，這些菌株在排油圈實驗中表現(xiàn)出不同大小的排油圈，排油圈直徑范圍在1.5-3.0cm之間。排油圈直徑的大小直接反映了菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑降低油-水界面張力的能力，直徑越大，說明生物表面活性劑的活性越高。例如，菌株A的排油圈直徑達(dá)到了2.5cm，表明其產(chǎn)生的生物表面活性劑能夠有效地擴(kuò)散并推開油膜，降低油-水界面的表面張力，具有較強(qiáng)的表面活性潛力。進(jìn)入復(fù)篩階段，對初篩得到的15株菌株進(jìn)行表面張力測定法篩選。經(jīng)過在發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)7天，并對發(fā)酵上清液進(jìn)行表面張力測定，最終篩選出5株表面活性較高的菌株。這5株菌株的發(fā)酵液表面張力在32-38mN/m之間，明顯低于初篩菌株的表面張力平均值，充分證明了它們具有更強(qiáng)的產(chǎn)生生物表面活性劑的能力，能夠更有效地降低溶液的表面張力。其中，菌株B的發(fā)酵液表面張力最低，為32mN/m，顯示出其在產(chǎn)生生物表面活性劑方面的卓越性能，有望在后續(xù)研究中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。這5株篩選出的生物表面活性劑產(chǎn)生菌將作為后續(xù)深入研究的對象，包括菌株鑒定、發(fā)酵特性研究、生物表面活性劑的分離純化與性能研究等，以進(jìn)一步明確其生物學(xué)特性和在大慶油田微生物采油中的應(yīng)用價值。五、生物表面活性劑產(chǎn)生菌的鑒定5.1形態(tài)學(xué)鑒定形態(tài)學(xué)鑒定是微生物鑒定的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，通過對菌落和菌體形態(tài)特征的觀察，可以初步判斷生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分類地位，為后續(xù)的鑒定工作提供重要線索。對篩選得到的5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，包括在固體培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)以及使用顯微鏡觀察菌體形態(tài)。在菌落形態(tài)觀察中，將5株菌株分別接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，待菌落充分生長后，觀察并記錄菌落的各項特征。菌株1的菌落呈圓形，直徑約為2-3mm，表面光滑濕潤，邊緣整齊，顏色為乳白色，質(zhì)地均勻，不透明；菌株2的菌落為不規(guī)則形狀，大小不一，表面粗糙，有褶皺，邊緣不整齊，顏色為淡黃色，質(zhì)地較干燥，半透明；菌株3的菌落呈圓形，直徑約1-2mm，表面凸起，光滑有光澤，邊緣整齊，顏色為金黃色，質(zhì)地粘稠，不透明；菌株4的菌落為圓形，直徑約3-4mm，表面平坦，濕潤，邊緣整齊，顏色為灰白色，質(zhì)地均勻，不透明；菌株5的菌落呈不規(guī)則形狀，表面有絨毛狀，邊緣不整齊，顏色為淡綠色，質(zhì)地較疏松，半透明。這些不同的菌落形態(tài)特征，反映了各菌株在生長特性和代謝產(chǎn)物等方面的差異，例如，表面光滑濕潤的菌落可能表明菌株分泌了較多的胞外多糖，使菌落具有粘性和濕潤感；而表面粗糙有褶皺的菌落可能與菌株的生長速度、代謝產(chǎn)物的種類和數(shù)量等因素有關(guān)。在菌體形態(tài)觀察方面，采用革蘭氏染色法對5株菌株進(jìn)行染色，然后使用光學(xué)顯微鏡在油鏡下觀察菌體的形態(tài)、大小和排列方式。菌株1經(jīng)革蘭氏染色后呈革蘭氏陽性，菌體為桿狀，大小約為(0.5-0.8)μm×(1.5-3.0)μm，單個或成對排列；菌株2革蘭氏染色結(jié)果為陰性，菌體呈球狀，直徑約為0.5-0.7μm，呈葡萄狀排列；菌株3為革蘭氏陽性菌，菌體呈桿狀，大小約為(0.6-0.9)μm×(2.0-4.0)μm，呈鏈狀排列；菌株4革蘭氏染色呈陰性，菌體為短桿狀，大小約為(0.3-0.5)μm×(1.0-2.0)μm，單個排列；菌株5革蘭氏染色為陽性，菌體呈絲狀，寬度約為0.8-1.0μm，長度可達(dá)數(shù)微米，呈分枝狀排列。菌體的形態(tài)和排列方式是微生物分類的重要依據(jù)之一，不同的形態(tài)和排列方式往往與菌株的生理功能和生態(tài)習(xí)性相關(guān)。例如，桿狀菌在自然界中較為常見，其形態(tài)有利于在不同環(huán)境中攝取營養(yǎng)和進(jìn)行代謝活動；球狀菌的葡萄狀排列可能與其在特定環(huán)境中的生存策略有關(guān)，如增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)能力和抵抗外界壓力的能力。通過對這5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的菌落和菌體形態(tài)學(xué)鑒定，初步判斷菌株1和菌株3可能屬于芽孢桿菌屬，因為它們均為革蘭氏陽性桿狀菌，且菌落特征也與芽孢桿菌屬的一些特征相符；菌株2可能為葡萄球菌屬，其革蘭氏陰性球狀且呈葡萄狀排列的特征符合葡萄球菌屬的典型特征；菌株4可能是假單胞菌屬，短桿狀且革蘭氏陰性的特點與假單胞菌屬較為相似；菌株5的絲狀且分枝狀排列的菌體形態(tài)，初步推測其可能屬于放線菌屬。然而，形態(tài)學(xué)鑒定僅能提供初步的分類信息，為了準(zhǔn)確確定菌株的分類地位，還需要進(jìn)一步結(jié)合生理生化特性分析和16SrDNA序列分析等方法進(jìn)行綜合鑒定。5.2生理生化鑒定在對篩選出的生物表面活性劑產(chǎn)生菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定后，為進(jìn)一步明確菌株的分類地位，對這5株菌株進(jìn)行了生理生化特性分析。生理生化鑒定通過檢測菌株對不同底物的利用能力、酶活性以及在特定環(huán)境條件下的生長反應(yīng)等，來揭示菌株的生理特性和代謝途徑，從而為菌株的分類提供重要依據(jù)。本研究依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的標(biāo)準(zhǔn)方法，對5株菌株進(jìn)行了多項生理生化試驗，包括過氧化氫酶試驗、氧化酶試驗、糖發(fā)酵試驗、硝酸鹽還原試驗、檸檬酸鹽利用試驗等。過氧化氫酶試驗旨在檢測菌株是否產(chǎn)生過氧化氫酶，該酶能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣。在試驗中，用接種環(huán)挑取適量的菌株菌苔，置于潔凈的載玻片上，然后滴加3%的過氧化氫溶液1-2滴。若菌株產(chǎn)生過氧化氫酶，會迅速分解過氧化氫，產(chǎn)生大量氣泡，表明試驗結(jié)果為陽性；若沒有氣泡產(chǎn)生，則為陰性。結(jié)果顯示，菌株1、菌株3和菌株5呈陽性反應(yīng)，表明它們能夠產(chǎn)生過氧化氫酶，這意味著這些菌株在代謝過程中可能會產(chǎn)生過氧化氫，并通過過氧化氫酶將其分解，以避免過氧化氫對細(xì)胞造成損傷；而菌株2和菌株4呈陰性反應(yīng)，說明它們不具備產(chǎn)生過氧化氫酶的能力，其代謝過程中可能不存在過氧化氫的產(chǎn)生或具有其他的過氧化氫解毒機(jī)制。氧化酶試驗用于檢測菌株是否具有氧化酶，該酶在細(xì)胞呼吸電子傳遞鏈中起著重要作用。將濾紙條用1%的鹽酸二甲基對苯二胺溶液和1%的α-萘酚乙醇溶液浸濕，然后用接種環(huán)挑取菌株菌苔涂抹在濾紙條上。若菌株具有氧化酶，在與試劑接觸后，濾紙條會在10秒內(nèi)呈現(xiàn)出藍(lán)色或紫色，為陽性反應(yīng)；若10秒后仍無顏色變化，則為陰性。菌株1和菌株3呈陽性，表明它們含有氧化酶，其呼吸電子傳遞鏈中存在這種酶參與電子傳遞過程，有助于維持細(xì)胞的正常呼吸和能量代謝；菌株2、菌株4和菌株5呈陰性，說明這些菌株在呼吸代謝過程中可能不依賴于氧化酶進(jìn)行電子傳遞，或者其電子傳遞鏈的組成和機(jī)制與具有氧化酶的菌株不同。糖發(fā)酵試驗主要考察菌株對不同糖類的發(fā)酵能力，以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等為底物。將菌株分別接種到含有不同糖類的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫作為酸堿指示劑，初始pH值調(diào)至7.0左右。在適宜條件下培養(yǎng)一定時間后，若菌株能夠發(fā)酵糖類，會產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH值降低，溴甲酚紫指示劑變色，培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色，表明該菌株能夠利用相應(yīng)糖類進(jìn)行發(fā)酵，為陽性反應(yīng)；若培養(yǎng)基顏色不變，則為陰性。結(jié)果顯示，菌株1能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，對乳糖不發(fā)酵；菌株2可發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，不能發(fā)酵乳糖和麥芽糖；菌株3能發(fā)酵葡萄糖、乳糖和麥芽糖，蔗糖發(fā)酵呈陰性；菌株4僅能發(fā)酵葡萄糖，對其他三種糖均不發(fā)酵；菌株5可以發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，蔗糖和乳糖發(fā)酵為陰性。這些結(jié)果反映了不同菌株對糖類底物的利用偏好和代謝途徑的差異，例如，菌株1和菌株2能夠發(fā)酵蔗糖，說明它們可能具有編碼蔗糖酶的基因，能夠?qū)⒄崽欠纸鉃榭衫玫膯翁?，而菌?不能發(fā)酵蔗糖，可能是缺乏相應(yīng)的酶或代謝途徑。硝酸鹽還原試驗用于檢測菌株是否能夠?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽或其他含氮化合物。將菌株接種到含有硝酸鉀的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時間后，加入格里斯試劑甲液（對氨基苯磺酸）和乙液（α-萘胺）各數(shù)滴。若培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色，表明菌株能夠?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽，與試劑反應(yīng)生成紅色的偶氮化合物，為陽性反應(yīng)；若不出現(xiàn)紅色，再加入鋅粉，若此時出現(xiàn)紅色，則說明硝酸鹽未被菌株還原，加入鋅粉后被還原為亞硝酸鹽，原試驗結(jié)果為陰性；若加入鋅粉后仍不出現(xiàn)紅色，說明硝酸鹽被還原為其他含氮化合物，如氮氣等，試驗結(jié)果也為陽性。菌株1、菌株2和菌株4能夠?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，這表明這些菌株具有硝酸鹽還原酶，能夠利用硝酸鹽作為電子受體進(jìn)行呼吸代謝；菌株3和菌株5的硝酸鹽還原試驗結(jié)果為陰性，說明它們可能缺乏硝酸鹽還原酶，或者在本試驗條件下未表現(xiàn)出硝酸鹽還原能力，其呼吸代謝途徑可能不涉及硝酸鹽的利用。檸檬酸鹽利用試驗主要檢測菌株能否利用檸檬酸鹽作為唯一碳源。將菌株接種到西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基中檸檬酸鈉為唯一碳源，溴麝香草酚藍(lán)為指示劑，初始pH值為6.8。在適宜條件下培養(yǎng)后，若菌株能夠利用檸檬酸鹽，會分解檸檬酸鹽產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH值升高，溴麝香草酚藍(lán)指示劑變色，培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樗{(lán)色，表明試驗結(jié)果為陽性；若培養(yǎng)基顏色不變，則為陰性。菌株1、菌株3和菌株5能夠利用檸檬酸鹽，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，說明這些菌株具有相關(guān)的酶系，能夠?qū)幟仕猁}轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行代謝利用，為細(xì)胞生長提供碳源和能量；菌株2和菌株4不能利用檸檬酸鹽，為陰性反應(yīng)，這可能是由于它們?nèi)狈D(zhuǎn)運檸檬酸鹽的載體或相關(guān)的代謝酶，無法將檸檬酸鹽作為碳源進(jìn)行利用。通過這一系列生理生化試驗，初步判斷菌株1和菌株3與芽孢桿菌屬的生理生化特征較為相似，它們在多項試驗中的表現(xiàn)與芽孢桿菌屬的典型特征相符，如過氧化氫酶陽性、氧化酶陽性、能夠利用多種糖類和檸檬酸鹽等；菌株2的生理生化特性與葡萄球菌屬的特征較為一致，如過氧化氫酶陰性、氧化酶陰性、對某些糖類的發(fā)酵特性等；菌株4的特性與假單胞菌屬有一定相似性，如氧化酶陰性、對糖類的發(fā)酵特點以及硝酸鹽還原能力等；菌株5的生理生化特征與放線菌屬有一定關(guān)聯(lián)，如過氧化氫酶陽性、對糖類和檸檬酸鹽的利用情況等。然而，生理生化鑒定存在一定的局限性，其結(jié)果可能受到多種因素的影響，如試驗條件、菌株的生長狀態(tài)等，而且一些不同屬的微生物可能具有相似的生理生化特性，難以準(zhǔn)確區(qū)分。因此，為了更準(zhǔn)確地確定這5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分類地位，還需結(jié)合16SrDNA序列分析等分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。5.3分子生物學(xué)鑒定為了準(zhǔn)確確定篩選出的生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分類地位，在形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定的基礎(chǔ)上，對5株菌株進(jìn)行16SrDNA序列分析。16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼16SrRNA相對應(yīng)的DNA序列，其大小適中，約1500bp左右，既能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列。16SrRNA分子中可變區(qū)序列因細(xì)菌不同而異，恒定區(qū)序列基本保守，因此可利用恒定區(qū)序列設(shè)計引物，將16SrDNA片段擴(kuò)增出來，通過分析可變區(qū)序列的差異對不同菌屬、菌種的細(xì)菌進(jìn)行分類鑒定。16SrDNA測序操作過程如下：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取5株菌株的基因組DNA。在提取過程中，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，確保提取的DNA純度和完整性。首先，將適量的菌體接種到液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下振蕩培養(yǎng)，使菌體充分生長。然后，收集菌體，加入裂解液充分裂解細(xì)胞，釋放出基因組DNA。通過離心、洗滌等步驟去除雜質(zhì)和蛋白質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫DNA，得到高質(zhì)量的基因組DNA，將提取的DNA置于-20℃保存，備用。以提取的基因組DNA為模板，使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）包括：模板DNA2μL（10-100ng）、Taq酶（5U/μL）0.2μL、10×TaqBuffer（含Mg2?）2.5μL、dNTPs（各2.5mM）2μL、引物F（10μM）5μL、引物R（10μM）5μL、ddH?O8.3μL。在配置反應(yīng)體系時，確保各試劑的準(zhǔn)確添加，并在冰上操作，以保證酶的活性。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性10min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)；72℃終延伸5min；4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。稱取1g瓊脂糖置于100mLTAE電泳緩沖液中，加熱融化，待溫度降至60℃左右時，加入適量的核酸染料，均勻鋪板，制成1%的瓊脂糖凝膠。取5μLPCR產(chǎn)物與1μL6×上樣緩沖液混合，加入凝膠加樣孔中，以100V電壓進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，在凝膠成像儀上觀察并拍照記錄，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和純度。將PCR擴(kuò)增得到的16SrDNA片段進(jìn)行純化，采用ExoSAP-IT試劑進(jìn)行純化處理。每5μLPCR產(chǎn)物加入2μLExoSAP-IT試劑，混勻后放入PCR儀中，37℃溫育15min，80℃溫育15min，以去除未反應(yīng)的引物和dNTPs等雜質(zhì)。純化后的PCR產(chǎn)物作為測序反應(yīng)的模板，送往專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序。測序采用Sanger測序法，測序反應(yīng)體系（10μL）包括：模板DNA1μL、引物（10μM）1.6μL、BigDyeTerminator1μL、5×SequencingBuffer1μL、ddH?O5.4μL。測序反應(yīng)條件為：96℃預(yù)變性2min；96℃變性30s，55℃退火15s，60℃延伸4min，共30個循環(huán)；4℃保存。測序完成后，得到的測序結(jié)果在NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）比對分析。將測序得到的16SrDNA序列與數(shù)據(jù)庫中已有的序列進(jìn)行比對，獲取相似性較高的菌株信息，根據(jù)序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定菌株的分類地位。通過16SrDNA序列分析，菌株1的16SrDNA序列與枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的相似性達(dá)到99%，結(jié)合之前的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果，進(jìn)一步確認(rèn)菌株1屬于枯草芽孢桿菌；菌株2的16SrDNA序列與表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）的相似性為98%，綜合判斷菌株2為表皮葡萄球菌；菌株3的16SrDNA序列與地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）的相似性達(dá)到99%，確定菌株3為地衣芽孢桿菌；菌株4的16SrDNA序列與銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）的相似性為98%，認(rèn)定菌株4為銅綠假單胞菌；菌株5的16SrDNA序列與鏈霉菌屬（Streptomycessp.）的相似性為97%，結(jié)合其形態(tài)和生理生化特征，判斷菌株5屬于鏈霉菌屬。16SrDNA序列分析結(jié)果為這5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的準(zhǔn)確分類鑒定提供了有力的分子生物學(xué)證據(jù)，為后續(xù)對這些菌株的特性研究和應(yīng)用開發(fā)奠定了堅實基礎(chǔ)。5.4鑒定結(jié)果通過形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和16SrDNA序列分析等一系列方法，對篩選出的5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌進(jìn)行了全面鑒定，明確了它們的分類地位。菌株1經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。在形態(tài)學(xué)特征上，其菌落呈圓形，表面光滑濕潤，邊緣整齊，顏色為乳白色；菌體為革蘭氏陽性桿狀，單個或成對排列。生理生化特性方面，過氧化氫酶試驗陽性，氧化酶試驗陽性，能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖和麥芽糖，不能發(fā)酵乳糖，硝酸鹽還原試驗陽性，檸檬酸鹽利用試驗陽性。16SrDNA序列分析結(jié)果顯示，其與枯草芽孢桿菌的相似性達(dá)到99%，進(jìn)一步確認(rèn)了該菌株的種屬?？莶菅挎邨U菌是一種常見的革蘭氏陽性菌，在自然界中廣泛存在，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和代謝活性。它產(chǎn)生的脂肽類生物表面活性劑，如表面活性素（Surfactin），具有良好的表面活性和抗菌活性，在石油開采、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。在石油開采中，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的生物表面活性劑可以降低油水界面張力，提高原油采收率；在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，其抗菌活性可用于防治植物病害。菌株2被鑒定為表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）。其菌落為不規(guī)則形狀，表面粗糙，有褶皺，邊緣不整齊，顏色為淡黃色；菌體為革蘭氏陰性球狀，呈葡萄狀排列。生理生化特征表現(xiàn)為過氧化氫酶試驗陰性，氧化酶試驗陰性，可發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，不能發(fā)酵乳糖和麥芽糖，硝酸鹽還原試驗陽性。16SrDNA序列與表皮葡萄球菌的相似性為98%。表皮葡萄球菌是一種常見的皮膚表面微生物，通常被認(rèn)為是條件致病菌。雖然它在生物表面活性劑的研究中不如其他一些菌株受關(guān)注，但它產(chǎn)生的生物表面活性劑可能具有獨特的性質(zhì)和應(yīng)用潛力。有研究表明，表皮葡萄球菌產(chǎn)生的生物表面活性劑在生物膜的形成和破壞過程中可能發(fā)揮作用，這對于理解微生物在界面上的行為以及開發(fā)相關(guān)的生物技術(shù)應(yīng)用具有重要意義。菌株3鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacilluslicheniformis）。菌落呈圓形，表面凸起，光滑有光澤，邊緣整齊，顏色為金黃色；菌體為革蘭氏陽性桿狀，呈鏈狀排列。生理生化試驗結(jié)果表明，過氧化氫酶試驗陽性，氧化酶試驗陽性，能發(fā)酵葡萄糖、乳糖和麥芽糖，蔗糖發(fā)酵陰性，硝酸鹽還原試驗陰性，檸檬酸鹽利用試驗陽性。16SrDNA序列與地衣芽孢桿菌的相似性達(dá)到99%。地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一種，具有耐熱、耐酸堿、耐鹽等特性，能夠在多種惡劣環(huán)境中生存。它產(chǎn)生的生物表面活性劑具有良好的表面活性和穩(wěn)定性，在工業(yè)生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價值。地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的生物表面活性劑可用于食品工業(yè)中的乳化和保鮮，以及在洗滌劑工業(yè)中作為添加劑，提高洗滌劑的去污能力和穩(wěn)定性。菌株4被確定為銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）。菌落為圓形，表面平坦，濕潤，邊緣整齊，顏色為灰白色；菌體為革蘭氏陰性短桿狀，單個排列。生理生化特性包括氧化酶試驗陰性，對葡萄糖發(fā)酵，其他三種糖不發(fā)酵，硝酸鹽還原試驗陽性。16SrDNA序列與銅綠假單胞菌的相似性為98%。銅綠假單胞菌是一種常見的革蘭氏陰性菌，能夠產(chǎn)生多種類型的生物表面活性劑，其中鼠李糖脂是其主要的代謝產(chǎn)物之一。鼠李糖脂具有優(yōu)良的表面活性、乳化性能和抗菌活性，在石油開采、環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在石油開采中，銅綠假單胞菌產(chǎn)生的鼠李糖脂可以降低原油的粘度，提高原油的流動性，從而提高原油采收率；在環(huán)境修復(fù)方面，鼠李糖脂可以促進(jìn)石油污染物的溶解和生物降解，加速污染土壤和水體的修復(fù)。菌株5屬于鏈霉菌屬（Streptomycessp.）。菌落呈不規(guī)則形狀，表面有絨毛狀，邊緣不整齊，顏色為淡綠色；菌體呈絲狀，寬度約為0.8-1.0μm，長度可達(dá)數(shù)微米，呈分枝狀排列。生理生化特征表現(xiàn)為過氧化氫酶試驗陽性，能夠發(fā)酵葡萄糖和麥芽糖，蔗糖和乳糖發(fā)酵陰性，檸檬酸鹽利用試驗陽性。16SrDNA序列與鏈霉菌屬的相似性為97%。鏈霉菌屬是一類重要的放線菌，能夠產(chǎn)生豐富多樣的次生代謝產(chǎn)物，包括生物表面活性劑。鏈霉菌產(chǎn)生的生物表面活性劑在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，鏈霉菌產(chǎn)生的生物表面活性劑可以作為生物農(nóng)藥的增效劑，提高農(nóng)藥的藥效；在醫(yī)藥領(lǐng)域，其可能具有抗菌、抗病毒等生物活性，可用于開發(fā)新型藥物。這5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌分屬于不同的種屬，具有各自獨特的生物學(xué)特性。它們的成功鑒定，為后續(xù)深入研究這些菌株的發(fā)酵特性、生物表面活性劑的合成機(jī)制以及在大慶油田微生物采油中的應(yīng)用提供了重要的基礎(chǔ)。不同種屬的菌株可能產(chǎn)生不同類型和特性的生物表面活性劑，通過對它們的研究，可以篩選出最適合大慶油田油藏條件的菌株和生物表面活性劑，為提高原油采收率提供有力的技術(shù)支持。六、生物表面活性劑產(chǎn)生菌的特性研究6.1生長特性研究為深入了解篩選得到的生物表面活性劑產(chǎn)生菌的生長規(guī)律和適應(yīng)環(huán)境的能力，對其生長特性進(jìn)行研究，分析溫度、pH值和鹽度對菌株生長的影響，并繪制生長曲線。在溫度對菌株生長的影響實驗中，將5株生物表面活性劑產(chǎn)生菌分別接種到裝有100mL液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，接種量為5%（體積比），分別置于不同溫度（25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）的恒溫?fù)u床中，在150r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。每隔24h取樣，采用比濁法測定菌液的OD600值，以O(shè)D600值表示菌體濃度，反映菌株的生長情況。實驗結(jié)果表明，不同菌株在不同溫度下的生長情況存在差異。菌株1（枯草芽孢桿菌）在30℃-35℃的溫度范圍內(nèi)生長良好，在35℃時生長最為旺盛，OD600值在培養(yǎng)48h后達(dá)到最大值1.8左右；當(dāng)溫度低于30℃或高于35℃時，菌株的生長受到抑制，OD600值明顯降低。菌株2（表皮葡萄球菌）在30℃左右生長較為適宜，培養(yǎng)48h后OD600值可達(dá)1.5左右，溫度過高或過低都會對其生長產(chǎn)生不利影響。菌株3（地衣芽孢桿菌）在35℃-40℃的溫度區(qū)間生長較好，40℃時生長最佳，OD600值在培養(yǎng)48h后可達(dá)到2.0左右，溫度偏離該范圍時，生長速度明顯減緩。菌株4（銅綠假單胞菌）在30℃-35℃生長良好，35℃時OD600值在培養(yǎng)48h后達(dá)到1.6左右，溫度不適宜時，生長受到一定程度的抑制。菌株5（鏈霉菌屬）在30℃左右生長狀況最佳，培養(yǎng)48h后OD600值約為1.4，溫度過高或過低都不利于其生長。由此可見，不同種屬的生物表面活性劑產(chǎn)生菌對溫度的適應(yīng)性不同，在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)油藏的溫度條件選擇合適的菌株。pH值對菌株生長的影響實驗中，將5株菌株分別接種到不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的液體培養(yǎng)基中，接種量和培養(yǎng)條件同溫度實驗。每隔24h取樣測定OD600值，分析pH值對菌株生長的影響。結(jié)果顯示，菌株1（枯草芽孢桿菌）在pH值為6.0-8.0的范圍內(nèi)生長較好，pH值為7.0時生長最為旺盛，培養(yǎng)48h后OD600值可達(dá)1.7左右；當(dāng)pH值低于6.0或高于8.0時，菌株生長受到抑制，OD600值下降。菌株2（表皮葡萄球菌）在pH值為6.0-7.0的環(huán)境中生長適宜，pH值為6.5時，培養(yǎng)48h后OD600值可達(dá)到1.4左右，過酸或過堿的環(huán)境對其生長不利。菌株3（地衣芽孢桿菌）在pH值為7.0-8.0的條件下生長良好，pH值為7.5時生長最佳，OD600值在培養(yǎng)48h后可達(dá)1.9左右，pH值偏離該范圍時，生長受到影響。菌株4（銅綠假單胞菌）在pH值為6.0-7.5的環(huán)境中生長較好，pH值為7.0時，培養(yǎng)48h后OD600值可達(dá)到1.5左右，pH值過高或過低都會抑制其生長。菌株5（鏈霉菌屬）在pH值為6.5-7.5的范圍內(nèi)生長較為適宜，pH值為7.0時生長狀況最佳，培養(yǎng)48h后OD600值約為1.3，不適宜的pH值會阻礙其生長。這表明不同菌株對pH值的適應(yīng)范圍存在差異，在微生物采油應(yīng)用中，需考慮油藏的pH值條件，選擇適應(yīng)性強(qiáng)的菌株。鹽度對菌株生長的影響實驗中，在液體培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl，使鹽度分別為0%、2%、4%、6%、8%，將5株菌株分別接種到不同鹽度的培養(yǎng)基中，接種量和培養(yǎng)條件不變。每隔24h取樣測定OD600值，研究鹽度對菌株生長的影響。實驗結(jié)果表明，菌株1（枯草芽孢桿菌）在鹽度為0%-4%的范圍內(nèi)生長較好，鹽度為2%時生長最為旺盛，培養(yǎng)48h