大腸桿菌表達新一代重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性條件優(yōu)化策略與機制研究一、引言1.1研究背景與意義在腫瘤治療領(lǐng)域，重組人內(nèi)皮抑素（recombinanthumanendostatin,rhES）作為一種極具潛力的生物制劑，正逐漸成為研究的焦點。內(nèi)皮抑素是由O’Reilly等在1997年首次從血管內(nèi)皮細胞瘤中分離出的一種內(nèi)源性血管生成抑制因子，它能夠特異性地抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，進而阻斷腫瘤新生血管的形成，切斷腫瘤細胞的營養(yǎng)供應(yīng)，從而達到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。這種獨特的作用機制使得重組人內(nèi)皮抑素在腫瘤治療中展現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢，為腫瘤患者帶來了新的希望。目前，腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，如手術(shù)、化療和放療，雖然在一定程度上能夠緩解病情，但往往伴隨著嚴重的副作用，且對于晚期腫瘤患者的治療效果有限。重組人內(nèi)皮抑素的出現(xiàn)，為腫瘤治療提供了一種全新的策略。臨床研究表明，重組人內(nèi)皮抑素不僅能夠單獨使用抑制腫瘤生長，還能與其他治療方法聯(lián)合使用，增強治療效果，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。例如，在非小細胞肺癌的治療中，將重組人內(nèi)皮抑素與化療藥物聯(lián)合使用，能夠顯著提高患者的客觀緩解率和無進展生存期。因此，重組人內(nèi)皮抑素在腫瘤治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，對其進行深入研究和開發(fā)具有重要的臨床意義。在重組人內(nèi)皮抑素的生產(chǎn)過程中，大腸桿菌表達系統(tǒng)因其獨特的優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用。大腸桿菌是一種原核生物，具有遺傳背景清楚、生長迅速、易于培養(yǎng)、成本低廉等優(yōu)點。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，可以實現(xiàn)重組人內(nèi)皮抑素的高效表達，從而降低生產(chǎn)成本，為大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。例如，通過優(yōu)化表達載體和培養(yǎng)條件，可以使重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中的表達量達到總菌體蛋白的60%以上。此外，大腸桿菌表達系統(tǒng)還具有操作簡單、易于遺傳改造等特點，便于對重組人內(nèi)皮抑素的表達進行調(diào)控和優(yōu)化。然而，大腸桿菌表達系統(tǒng)在表達重組人內(nèi)皮抑素時也面臨著一個嚴峻的問題，即復(fù)性問題。由于大腸桿菌缺乏真核細胞的蛋白質(zhì)折疊和修飾機制，重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中表達時往往以包涵體的形式存在。包涵體是一種不溶性的蛋白質(zhì)聚集體，其內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子處于錯誤折疊的狀態(tài)，缺乏生物活性。因此，需要對包涵體進行變性和復(fù)性處理，使其恢復(fù)天然的構(gòu)象和生物活性。復(fù)性過程是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程，受到多種因素的影響，如溫度、pH值、變性劑濃度、氧化還原條件等。如果復(fù)性條件不當，不僅會導(dǎo)致復(fù)性效率低下，還會使蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚集和降解，從而影響重組人內(nèi)皮抑素的質(zhì)量和產(chǎn)量。例如，在傳統(tǒng)的復(fù)性方法中，復(fù)性效率往往只有10%-30%，這極大地限制了重組人內(nèi)皮抑素的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。為了克服大腸桿菌表達系統(tǒng)中復(fù)性問題對重組人內(nèi)皮抑素生產(chǎn)應(yīng)用的制約，優(yōu)化復(fù)性條件具有重要的必要性和意義。通過優(yōu)化復(fù)性條件，可以提高復(fù)性效率，增加活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，從而推動重組人內(nèi)皮抑素的產(chǎn)業(yè)化進程。同時，優(yōu)化復(fù)性條件還可以提高重組人內(nèi)皮抑素的質(zhì)量，確保其在腫瘤治療中的安全性和有效性。此外，對復(fù)性條件的深入研究，還可以為其他蛋白質(zhì)的復(fù)性提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，促進蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的發(fā)展。綜上所述，優(yōu)化大腸桿菌表達的新一代重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性條件，對于提高重組人內(nèi)皮抑素的生產(chǎn)水平，推動腫瘤治療技術(shù)的進步，具有重要的現(xiàn)實意義和深遠的社會影響。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究大腸桿菌表達的新一代重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性過程，通過系統(tǒng)地優(yōu)化復(fù)性條件，提高復(fù)性率和活性，為其大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供堅實的技術(shù)支撐。具體而言，研究目的包括精準確定復(fù)性過程中各關(guān)鍵因素的最佳條件，如溫度、pH值、變性劑濃度、氧化還原條件以及添加劑種類和濃度等；建立高效的復(fù)性方法和工藝，大幅提高重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性效率和活性回收率；深入研究復(fù)性機制，從分子層面揭示蛋白質(zhì)折疊和聚集的規(guī)律，為復(fù)性條件的優(yōu)化提供深入的理論依據(jù)。在創(chuàng)新點方面，本研究具有多方面的突破。在復(fù)性方法上，創(chuàng)新性地采用新的復(fù)性方法組合，如將稀釋復(fù)性、透析復(fù)性、超濾復(fù)性與色譜復(fù)性等傳統(tǒng)方法進行有機結(jié)合，并對組合方式和操作參數(shù)進行深入優(yōu)化，以充分發(fā)揮各種方法的優(yōu)勢，克服單一方法的局限性，從而提高復(fù)性效率和蛋白質(zhì)的活性恢復(fù)率。在影響因素探索上，積極探索新的影響復(fù)性效果的因素，如引入新型添加劑、改變復(fù)性溶液的離子強度、探究不同的復(fù)性時間進程等，拓寬了復(fù)性研究的思路和范圍。在研究技術(shù)手段上，綜合運用先進的分析技術(shù)，如圓二色譜、熒光光譜、質(zhì)譜、核磁共振等，對復(fù)性過程中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化和聚集狀態(tài)進行實時、動態(tài)、全面的監(jiān)測和分析，從而更深入地了解復(fù)性機制，為復(fù)性條件的精準優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。通過這些創(chuàng)新點的實現(xiàn)，有望打破傳統(tǒng)復(fù)性技術(shù)的瓶頸，顯著提高重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性水平，推動其在腫瘤治療領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。二、重組人內(nèi)皮抑素與大腸桿菌表達系統(tǒng)2.1重組人內(nèi)皮抑素概述重組人內(nèi)皮抑素是通過基因工程技術(shù)，將人內(nèi)皮抑素基因?qū)牒线m的表達系統(tǒng)（如大腸桿菌、酵母等）中進行表達，再經(jīng)過分離、純化等一系列工藝制備得到的一種生物制劑。其核心結(jié)構(gòu)與人天然內(nèi)皮抑素高度相似，由184個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約為20kDa，包含兩對二硫鍵，無糖基化位點。這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了它關(guān)鍵的生物學(xué)活性。從空間結(jié)構(gòu)上看，重組人內(nèi)皮抑素呈現(xiàn)出緊密折疊的球狀結(jié)構(gòu)，二硫鍵在維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這些二硫鍵就像分子內(nèi)部的“橋梁”，將不同的氨基酸區(qū)域緊密連接在一起，確保蛋白分子維持正確的三維構(gòu)象。一旦二硫鍵受到破壞，蛋白的空間結(jié)構(gòu)就會發(fā)生改變，進而導(dǎo)致其生物學(xué)活性喪失。在腫瘤治療領(lǐng)域，重組人內(nèi)皮抑素發(fā)揮著獨特而關(guān)鍵的作用，其作用機制主要體現(xiàn)在多個層面。在分子水平，它能夠特異性地與血管內(nèi)皮細胞表面的多種受體相互作用，如整合素家族成員α5β1、αvβ3等。這種特異性結(jié)合就像一把“精準鑰匙”插入對應(yīng)的“鎖孔”，阻斷了細胞外基質(zhì)與受體之間的正常相互作用，干擾了內(nèi)皮細胞的信號傳導(dǎo)通路。例如，它可以抑制由血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）誘導(dǎo)的細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，包括抑制VEGF與其受體（VEGFR）結(jié)合后激活的Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt等關(guān)鍵信號通路，從而抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移。從細胞層面來看，重組人內(nèi)皮抑素能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。它通過上調(diào)促凋亡蛋白（如Bax）的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白（如Bcl-2）的表達，打破細胞內(nèi)凋亡平衡，促使內(nèi)皮細胞走向程序性死亡。此外，它還能抑制內(nèi)皮細胞的遷移和管腔形成能力。在腫瘤新生血管形成過程中，內(nèi)皮細胞需要遷移到腫瘤組織周圍并組裝成新的血管網(wǎng)絡(luò)，重組人內(nèi)皮抑素能夠干擾這一過程，使內(nèi)皮細胞無法正常遷移和組裝，從而有效阻斷腫瘤新生血管的生成。從整體腫瘤微環(huán)境角度，重組人內(nèi)皮抑素能夠重塑腫瘤微環(huán)境。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于一個適宜的微環(huán)境，其中新生血管為腫瘤細胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，并帶走代謝廢物。重組人內(nèi)皮抑素通過抑制腫瘤新生血管生成，切斷了腫瘤細胞的“營養(yǎng)供應(yīng)線”，使腫瘤細胞處于缺血、缺氧的惡劣環(huán)境中，抑制其生長和增殖。同時，缺氧環(huán)境還會誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng)，進一步降低其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，重組人內(nèi)皮抑素還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，如促進自然殺傷細胞（NK細胞）和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）對腫瘤細胞的殺傷作用，從免疫角度協(xié)同抑制腫瘤的發(fā)展。大量的臨床前研究和臨床試驗都充分證實了重組人內(nèi)皮抑素在腫瘤治療中的顯著效果和重要價值。在非小細胞肺癌的治療中，重組人內(nèi)皮抑素與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，展現(xiàn)出了強大的協(xié)同增效作用。例如，一項多中心、隨機、雙盲、安慰劑對照的III期臨床試驗（恩度聯(lián)合NP方案治療晚期非小細胞肺癌的研究）結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的客觀緩解率（ORR）達到35.4%，顯著高于單純化療組的19.5%；中位無進展生存期（PFS）也從單純化療組的4.1個月延長至6.3個月，患者的生存質(zhì)量得到了明顯改善。在其他多種惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌等的研究中，重組人內(nèi)皮抑素同樣表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤活性，無論是單藥使用還是與其他治療手段聯(lián)合，都能在一定程度上抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，為腫瘤患者提供了更多的治療選擇和生存希望。2.2大腸桿菌表達系統(tǒng)原理與特點大腸桿菌表達系統(tǒng)作為最常用的原核表達系統(tǒng)之一，其基因表達過程遵循分子生物學(xué)的中心法則，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個關(guān)鍵步驟。在轉(zhuǎn)錄階段，RNA聚合酶特異性地識別并結(jié)合到大腸桿菌基因組DNA上的啟動子區(qū)域。啟動子是一段特殊的DNA序列，它包含了與RNA聚合酶相互作用的特定元件，如-35區(qū)和-10區(qū)，這些元件的序列特征和空間結(jié)構(gòu)決定了RNA聚合酶結(jié)合的親和力和轉(zhuǎn)錄起始的效率。一旦RNA聚合酶與啟動子結(jié)合，就會沿著DNA模板鏈以5'到3'的方向移動，按照堿基互補配對原則，將核糖核苷酸逐一添加到正在合成的mRNA鏈上，從而將DNA中的遺傳信息轉(zhuǎn)錄為mRNA。轉(zhuǎn)錄過程并非一帆風順，會受到多種因素的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄因子、DNA的甲基化修飾以及環(huán)境信號等。一些轉(zhuǎn)錄因子可以與DNA上的特定序列結(jié)合，增強或抑制RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合能力，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始頻率。而DNA的甲基化修飾則可以改變DNA的空間構(gòu)象和電荷分布，影響RNA聚合酶的識別和結(jié)合。翻譯階段發(fā)生在細胞質(zhì)中，以轉(zhuǎn)錄生成的mRNA為模板，在核糖體、tRNA和多種翻譯因子的共同參與下進行。mRNA上的核苷酸序列被劃分為一個個三聯(lián)體密碼子，每個密碼子對應(yīng)一種特定的氨基酸。核糖體由大小兩個亞基組成，在起始階段，小亞基首先與mRNA的起始密碼子AUG結(jié)合，同時，攜帶甲硫氨酸的起始tRNA也識別并結(jié)合到起始密碼子上，隨后大亞基與小亞基結(jié)合，形成完整的核糖體-mRNA-起始tRNA復(fù)合物，標志著翻譯起始的完成。在翻譯延伸過程中，核糖體沿著mRNA的5'到3'方向移動，依次讀取mRNA上的密碼子。當核糖體遇到一個密碼子時，相應(yīng)的tRNA攜帶特定的氨基酸進入核糖體的A位，通過反密碼子與密碼子的互補配對，將氨基酸準確地定位到正在合成的多肽鏈上。在肽基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，A位上的氨基酸與P位上正在延伸的多肽鏈之間形成肽鍵，然后核糖體沿著mRNA移動一個密碼子的距離，原來在A位的tRNA移動到P位，而P位上的tRNA則離開核糖體，如此循環(huán)往復(fù)，多肽鏈不斷延伸。當核糖體遇到mRNA上的終止密碼子時，沒有對應(yīng)的tRNA與之結(jié)合，翻譯終止因子識別并結(jié)合到終止密碼子上，導(dǎo)致核糖體從mRNA上解離，新生的多肽鏈釋放出來，翻譯過程結(jié)束。大腸桿菌表達系統(tǒng)之所以在基因工程領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，得益于其眾多顯著的優(yōu)點。從遺傳背景角度來看，大腸桿菌是目前研究最為透徹的模式生物之一，其全基因組序列早已被測定，基因功能和調(diào)控機制也得到了深入的研究。這使得科研人員能夠精準地對其進行基因操作，例如通過基因敲除、基因插入等技術(shù)，構(gòu)建各種基因工程菌株，以滿足不同的研究和生產(chǎn)需求。在成本方面，大腸桿菌具有生長迅速、繁殖周期短的特點，在適宜的培養(yǎng)條件下，其代時可以短至20分鐘左右。這意味著在短時間內(nèi)就能夠獲得大量的菌體，大大提高了生產(chǎn)效率。同時，大腸桿菌的培養(yǎng)條件相對簡單，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求不高，常用的LB培養(yǎng)基等成本低廉，易于制備，這使得大規(guī)模培養(yǎng)大腸桿菌的成本顯著降低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。在表達水平上，大腸桿菌具備強大的代謝能力和高效的轉(zhuǎn)錄翻譯機制，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的高水平表達。通過合理設(shè)計表達載體，選擇強啟動子和優(yōu)化的核糖體結(jié)合位點等，可以使外源蛋白的表達量達到細胞總蛋白的30%-80%，甚至更高。例如，在某些優(yōu)化的表達體系中，目標蛋白的表達量可以達到每升培養(yǎng)液數(shù)克的水平，這為大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白提供了有力的保障。然而，大腸桿菌表達系統(tǒng)并非完美無缺，其也存在一些不足之處。在蛋白質(zhì)折疊方面，由于大腸桿菌是原核生物，缺乏真核細胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊輔助機制和特定的折疊環(huán)境，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等細胞器及其相關(guān)的分子伴侶系統(tǒng)。這使得一些在大腸桿菌中表達的重組蛋白，尤其是那些結(jié)構(gòu)復(fù)雜、需要精確折疊的蛋白，難以正確折疊，容易形成包涵體。包涵體是一種由錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集而成的不溶性顆粒，雖然包涵體的形成在一定程度上可以保護重組蛋白免受蛋白酶的降解，但包涵體中的蛋白質(zhì)通常不具有生物活性，需要經(jīng)過復(fù)雜的變性復(fù)性過程才能恢復(fù)活性，這增加了后續(xù)處理的難度和成本。大腸桿菌在生長和表達過程中，細胞壁會產(chǎn)生內(nèi)毒素，即脂多糖。當大量表達外源蛋白時，內(nèi)毒素的積累可能會對細胞產(chǎn)生毒性作用，影響細胞的生長和代謝，進而影響重組蛋白的表達和質(zhì)量。此外，內(nèi)毒素在蛋白質(zhì)純化過程中也很難完全去除，而內(nèi)毒素的殘留會對重組蛋白的生物學(xué)活性和安全性產(chǎn)生潛在威脅，尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，內(nèi)毒素的存在可能引發(fā)免疫反應(yīng)等不良反應(yīng)，因此需要嚴格控制內(nèi)毒素的含量。在翻譯后修飾方面，大腸桿菌表達系統(tǒng)無法進行一些真核生物特有的翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、乙?；?。這些修飾對于某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、生物學(xué)活性以及功能發(fā)揮具有至關(guān)重要的作用。例如，許多治療性蛋白質(zhì)和抗體需要進行正確的糖基化修飾才能具有完整的生物學(xué)活性和免疫原性，在大腸桿菌中表達這些蛋白時，由于缺乏糖基化修飾，可能導(dǎo)致其活性降低、穩(wěn)定性下降以及免疫原性改變等問題，限制了其在一些對翻譯后修飾要求嚴格的領(lǐng)域的應(yīng)用。2.3大腸桿菌表達重組人內(nèi)皮抑素研究現(xiàn)狀在重組人內(nèi)皮抑素的生產(chǎn)中，大腸桿菌表達系統(tǒng)憑借其諸多優(yōu)勢成為研究的熱點。目前，在表達載體構(gòu)建方面，研究人員已取得了顯著進展。大量研究致力于選擇合適的表達載體以實現(xiàn)重組人內(nèi)皮抑素的高效表達。例如，常用的pET系列載體，因其具有強啟動子T7，能夠驅(qū)動外源基因的高水平轉(zhuǎn)錄，在重組人內(nèi)皮抑素的表達中被廣泛應(yīng)用。通過將人內(nèi)皮抑素基因插入pET載體的多克隆位點，在T7RNA聚合酶的作用下，可使重組人內(nèi)皮抑素在大腸桿菌中的表達量顯著提高。除了pET系列，pGEX系列載體也常被選用，其可使重組人內(nèi)皮抑素與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合表達，利用GST標簽的親和性，方便后續(xù)的純化過程。然而，現(xiàn)有的表達載體仍存在一些局限性，如某些載體在大腸桿菌中的穩(wěn)定性欠佳，可能導(dǎo)致重組質(zhì)粒的丟失，影響表達效率；部分載體的啟動子雖能實現(xiàn)高水平表達，但缺乏精細的調(diào)控機制，難以根據(jù)實際需求靈活控制表達量。在誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化上，也開展了大量的研究工作。誘導(dǎo)劑的種類和濃度是影響重組人內(nèi)皮抑素表達的關(guān)鍵因素之一。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）作為最常用的誘導(dǎo)劑，廣泛應(yīng)用于大腸桿菌表達系統(tǒng)。研究表明，不同濃度的IPTG對重組人內(nèi)皮抑素的表達水平和蛋白質(zhì)量有顯著影響。較低濃度的IPTG可能無法充分誘導(dǎo)基因表達，而過高濃度的IPTG則可能導(dǎo)致細胞代謝負擔過重，影響菌體生長和蛋白表達質(zhì)量。除了IPTG，乳糖也可作為誘導(dǎo)劑，其具有成本低、安全性好等優(yōu)點，在一些研究中被嘗試用于重組人內(nèi)皮抑素的誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)時機和誘導(dǎo)時間同樣至關(guān)重要。過早或過晚誘導(dǎo)都可能無法獲得最佳的表達效果。通常，在大腸桿菌生長至對數(shù)中期進行誘導(dǎo)，此時細胞代謝活躍，能夠更好地響應(yīng)誘導(dǎo)信號，實現(xiàn)高效表達。誘導(dǎo)時間的長短也需根據(jù)具體情況進行優(yōu)化，過短的誘導(dǎo)時間可能導(dǎo)致表達量不足，過長則可能引起蛋白降解或包涵體形成增加。盡管在誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化方面取得了一定成果，但不同實驗室的最佳誘導(dǎo)條件差異較大，缺乏統(tǒng)一的標準，且難以兼顧高表達量和蛋白活性，在實際生產(chǎn)中仍需根據(jù)具體菌株和表達載體進行大量的摸索和優(yōu)化。復(fù)性方法的研究是大腸桿菌表達重組人內(nèi)皮抑素的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前已報道了多種復(fù)性方法。稀釋復(fù)性是一種較為常用的方法，其原理是通過將變性的包涵體蛋白溶液迅速稀釋到復(fù)性緩沖液中，降低變性劑濃度，促使蛋白質(zhì)分子逐漸折疊成天然構(gòu)象。然而，該方法容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集，復(fù)性效率較低。透析復(fù)性則是利用透析膜的半透性，使變性劑緩慢擴散出去，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的復(fù)性。此方法操作相對簡單，但耗時較長，且在透析過程中可能會因蛋白質(zhì)分子在膜表面的吸附而造成損失。超濾復(fù)性結(jié)合了超濾技術(shù)和復(fù)性過程，通過超濾膜的選擇性過濾，可在去除變性劑的同時濃縮蛋白質(zhì)溶液，提高復(fù)性效率。但超濾過程中的剪切力可能會對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成一定影響。近年來，色譜復(fù)性技術(shù)逐漸受到關(guān)注，如凝膠過濾色譜、離子交換色譜等，它們利用色譜介質(zhì)對蛋白質(zhì)分子的特異性吸附和分離作用，能夠在復(fù)性的同時實現(xiàn)蛋白質(zhì)的純化，有效提高復(fù)性蛋白的純度和活性。不過，色譜復(fù)性設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。現(xiàn)有的復(fù)性方法普遍存在復(fù)性效率低、復(fù)性過程易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集和降解、復(fù)性后蛋白活性恢復(fù)不理想等問題，迫切需要開發(fā)更加高效、溫和的復(fù)性方法和工藝。綜上所述，目前在大腸桿菌表達重組人內(nèi)皮抑素方面，表達載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達條件優(yōu)化等方面雖取得了一定成果，但仍存在不足，尤其是復(fù)性過程，成為限制重組人內(nèi)皮抑素大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸。因此，深入研究復(fù)性機制，優(yōu)化復(fù)性條件，對于提高重組人內(nèi)皮抑素的生產(chǎn)水平和質(zhì)量具有重要意義，這也是本研究的重點和出發(fā)點。三、實驗材料與方法3.1實驗材料本實驗選用表達重組人內(nèi)皮抑素的大腸桿菌菌株BL21(DE3)-pET-rhES，該菌株由本實驗室前期構(gòu)建并保存。其構(gòu)建過程為將編碼重組人內(nèi)皮抑素的基因克隆至pET表達載體上，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中篩選獲得。通過測序驗證，確?；蛐蛄械恼_性，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定的表達菌株。實驗中所需的主要試劑如下：鹽酸胍，購自Sigma-Aldrich公司，純度≥99%，用于包涵體的溶解，其作用是通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽鏈伸展，從而溶解包涵體；尿素，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，純度≥99.5%，也可用于包涵體的溶解，與鹽酸胍相比，尿素溶解包涵體的速度較慢且能力較弱，但具有成本低、呈中性、不電離等優(yōu)點；還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），均購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，在復(fù)性過程中用于調(diào)節(jié)氧化還原條件，促進二硫鍵的正確形成，GSH提供還原環(huán)境，GSSG參與二硫鍵的交換反應(yīng)，兩者的比例對復(fù)性效果有重要影響；Tris（三羥甲基氨基甲烷），購自ThermoFisherScientific公司，純度≥99%，用于配制各種緩沖液，維持溶液的pH值穩(wěn)定，在蛋白質(zhì)的溶解、復(fù)性等過程中提供合適的酸堿度環(huán)境；氯化鈉，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純，用于調(diào)節(jié)溶液的離子強度，影響蛋白質(zhì)分子間的相互作用，在包涵體洗滌和復(fù)性緩沖液中都有應(yīng)用；咪唑，購自Aladdin公司，純度≥99%，在鎳柱親和層析純化重組人內(nèi)皮抑素時，用于洗脫與鎳離子結(jié)合的重組蛋白，通過競爭結(jié)合鎳離子，使重組蛋白從鎳柱上解離下來；十二烷基硫酸鈉（SDS），購自Sigma-Aldrich公司，純度≥99%，用于SDS-PAGE電泳，使蛋白質(zhì)變性并帶上負電荷，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同在凝膠中實現(xiàn)分離；丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺，均購自Bio-Rad公司，純度≥99%，用于制備SDS-PAGE電泳的凝膠，兩者聚合形成具有一定孔徑的凝膠網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)在電場作用下在凝膠中遷移；考馬斯亮藍R-250，購自Sigma-Aldrich公司，用于SDS-PAGE電泳后蛋白質(zhì)條帶的染色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后在凝膠上呈現(xiàn)出藍色條帶，便于觀察和分析。實驗儀器設(shè)備方面，高速冷凍離心機（型號：Eppendorf5424R），購自德國Eppendorf公司，主要用于細胞破碎后的菌體離心、包涵體的分離以及蛋白質(zhì)溶液的濃縮等操作，其最高轉(zhuǎn)速可達16,200×g，能夠滿足不同離心需求，且具備冷凍功能，可在低溫條件下進行離心，減少蛋白質(zhì)的降解；恒溫搖床（型號：NewBrunswickInnova44R），購自美國Eppendorf公司，用于大腸桿菌的培養(yǎng)，可精確控制溫度和轉(zhuǎn)速，為大腸桿菌的生長提供適宜的環(huán)境，溫度控制范圍為4-65℃，轉(zhuǎn)速范圍為50-500rpm；超聲波細胞破碎儀（型號：Scientz-IID），購自寧波新芝生物科技股份有限公司，用于破碎大腸桿菌細胞，釋放包涵體，其功率可調(diào)節(jié)，能夠根據(jù)不同實驗需求調(diào)整破碎強度；Ni-NTA親和層析柱（型號：QiagenNi-NTAAgarose），購自德國Qiagen公司，用于重組人內(nèi)皮抑素的純化，利用重組蛋白上的His標簽與鎳離子的特異性結(jié)合，實現(xiàn)重組蛋白與雜質(zhì)的分離，具有較高的親和力和特異性；透析袋（截留分子量：14,000Da），購自Solarbio公司，用于蛋白質(zhì)的透析復(fù)性，通過半透膜的擴散作用，使變性劑等小分子物質(zhì)從蛋白質(zhì)溶液中去除，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的復(fù)性，截留分子量的選擇確保了蛋白質(zhì)分子不會透過透析袋而小分子雜質(zhì)能夠有效去除；超濾離心管（截留分子量：10,000Da），購自Millipore公司，用于蛋白質(zhì)溶液的濃縮和換液，在復(fù)性過程中可去除變性劑并調(diào)整蛋白質(zhì)濃度，截留分子量的特性保證了目標蛋白質(zhì)的保留和小分子物質(zhì)的去除；凝膠成像系統(tǒng)（型號：Bio-RadGelDocXR+），購自美國Bio-Rad公司，用于SDS-PAGE電泳后凝膠圖像的采集和分析，能夠清晰地拍攝凝膠上的蛋白質(zhì)條帶，并進行灰度分析等操作，定量分析蛋白質(zhì)的含量和純度；圓二色譜儀（型號：JascoJ-815），購自日本Jasco公司，用于檢測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，通過測量蛋白質(zhì)對圓偏振光的吸收，分析蛋白質(zhì)的α-螺旋、β-折疊等二級結(jié)構(gòu)含量的變化，從而評估復(fù)性過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化；熒光光譜儀（型號：HitachiF-4600），購自日本Hitachi公司，用于研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，通過檢測蛋白質(zhì)熒光強度和熒光光譜的變化，了解蛋白質(zhì)分子內(nèi)熒光基團所處環(huán)境的改變，進而推斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化情況。3.2實驗方法3.2.1包涵體的制備與溶解將含有重組人內(nèi)皮抑素表達載體的大腸桿菌BL21(DE3)接種于5mL含氨芐青霉素（終濃度100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，此為種子液。次日，將種子液按1%（v/v）的接種量轉(zhuǎn)接至500mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)至OD600值約為0.6-0.8。此時，加入IPTG至終濃度為0.5mM，在25℃、180rpm條件下誘導(dǎo)表達16h。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液于4℃、8000×g離心10min，收集菌體。向菌體沉淀中加入50mL預(yù)冷的裂解緩沖液（50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，100mMNaCl，1mMPMSF），重懸菌體，將重懸液置于冰浴中，使用超聲波細胞破碎儀進行破碎，設(shè)置超聲功率為200W，超聲3s，間歇5s，共超聲100次，以確保細胞充分破碎。破碎后的菌液于4℃、12000×g離心30min，收集沉淀，此沉淀即為包涵體粗品。向包涵體粗品中加入50mL洗滌緩沖液（2M尿素，50mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA，1%TritonX-100），室溫下振蕩洗滌30min，以去除包涵體表面的雜質(zhì)和膜蛋白。再次于4℃、12000×g離心30min，收集沉淀，重復(fù)洗滌步驟2-3次，直至洗滌后的上清液在OD280nm處的吸光度小于0.1，此時得到較為純凈的包涵體。為溶解包涵體，向洗滌后的包涵體沉淀中加入適量的溶解緩沖液（8M鹽酸胍，50mMTris-HCl，pH8.5，100mMDTT），使蛋白終濃度不超過5mg/mL，室溫下攪拌溶解2h，確保包涵體充分溶解。隨后，將溶解后的包涵體溶液于4℃、12000×g離心30min，取上清，即為包涵體蛋白的變性溶液，用于后續(xù)的復(fù)性實驗。3.2.2復(fù)性方法及條件設(shè)置稀釋復(fù)性法的原理是通過將變性的包涵體蛋白溶液迅速稀釋到復(fù)性緩沖液中，降低變性劑濃度，促使蛋白質(zhì)分子逐漸折疊成天然構(gòu)象。其優(yōu)點是操作相對簡單，成本較低；缺點是容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集，復(fù)性效率較低，且會使蛋白被稀釋到很低濃度，體積增加較大。透析復(fù)性法利用透析膜的半透性，使變性劑緩慢擴散出去，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的復(fù)性，此方法操作相對簡單，不增加體積；但耗時較長，且在透析過程中可能會因蛋白質(zhì)分子在膜表面的吸附而造成損失，還容易形成無活性蛋白質(zhì)聚體，不適合大規(guī)模操作。柱上復(fù)性法是將變性的包涵體蛋白上樣到特定的色譜柱上，在洗脫過程中實現(xiàn)復(fù)性，該方法能夠在復(fù)性的同時實現(xiàn)蛋白質(zhì)的純化，有效提高復(fù)性蛋白的純度和活性；然而，色譜復(fù)性設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，樣品體積受限。本研究采用稀釋復(fù)性與透析復(fù)性相結(jié)合的方法。將上述獲得的包涵體蛋白變性溶液緩慢滴加到復(fù)性緩沖液A（50mMTris-HCl，pH8.0，0.5ML-Arg，2mM還原型谷胱甘肽，0.2mM氧化型谷胱甘肽，5%甘油）中，使鹽酸胍的終濃度為1M，蛋白終濃度為0.2mg/mL，室溫下攪拌復(fù)性2h。復(fù)性過程中，L-Arg能夠增加復(fù)性中間產(chǎn)物的溶解度，減少蛋白聚集；谷胱甘肽對（還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽）用于調(diào)節(jié)氧化還原條件，促進二硫鍵的正確形成；甘油則有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。復(fù)性2h后，將復(fù)性溶液裝入截留分子量為14000Da的透析袋中，置于復(fù)性緩沖液B（50mMTris-HCl，pH8.0，0.1ML-Arg，1mM還原型谷胱甘肽，0.1mM氧化型谷胱甘肽，2%甘油）中，4℃透析過夜，期間更換復(fù)性緩沖液B3-4次，以逐步降低鹽酸胍濃度和其他小分子雜質(zhì)的含量，進一步促進蛋白質(zhì)的正確折疊。為探究不同條件對復(fù)性效果的影響，設(shè)置了一系列梯度實驗。在溫度方面，分別設(shè)置了4℃、10℃、15℃、20℃、25℃五個溫度梯度，研究溫度對蛋白質(zhì)折疊速率和聚集程度的影響。在pH值方面，設(shè)置復(fù)性緩沖液的pH值分別為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，探究不同pH環(huán)境下蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對復(fù)性的影響。氧化還原試劑濃度也進行了梯度變化，還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的濃度比分別設(shè)置為10:1、5:1、2:1、1:1、1:2，研究不同氧化還原比例對二硫鍵形成的影響。復(fù)性時間設(shè)置為1h、2h、4h、6h、8h，探究復(fù)性時間對蛋白質(zhì)折疊過程的影響。通過對不同條件下復(fù)性產(chǎn)物的檢測和分析，確定最佳的復(fù)性條件。3.2.3復(fù)性產(chǎn)物的純化離子交換層析的原理是根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH條件下所帶電荷的差異，使其與離子交換樹脂上的相反電荷基團發(fā)生靜電結(jié)合。當使用不同離子強度或pH的洗脫液進行洗脫時，結(jié)合力不同的蛋白質(zhì)會依次被洗脫下來，從而實現(xiàn)分離。在本實驗中，選用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換樹脂，將復(fù)性后的蛋白溶液上樣到預(yù)先平衡好的離子交換柱（柱體積為10mL）上，平衡緩沖液為20mMTris-HCl（pH8.0）。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液沖洗柱子，直至流出液的OD280nm值小于0.05。然后，采用線性梯度洗脫，洗脫緩沖液為20mMTris-HCl（pH8.0），含有0-1MNaCl，流速為1mL/min，收集不同洗脫峰的蛋白溶液。通過檢測各洗脫峰蛋白溶液的OD280nm值和SDS-PAGE電泳分析，確定含有重組人內(nèi)皮抑素的洗脫峰。凝膠過濾層析基于分子篩效應(yīng)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同進行分離。大分子蛋白質(zhì)由于無法進入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙，會直接從凝膠顆粒之間的空隙流過，先被洗脫下來；而小分子蛋白質(zhì)能夠進入凝膠顆粒內(nèi)部，在柱內(nèi)停留時間較長，后被洗脫下來。將離子交換層析收集的含有重組人內(nèi)皮抑素的洗脫峰溶液濃縮后，上樣到Superdex75凝膠過濾柱（柱體積為60mL）上，平衡緩沖液為50mMTris-HCl（pH8.0），150mMNaCl。以0.5mL/min的流速進行洗脫，收集洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳和活性檢測確定含有高純度重組人內(nèi)皮抑素的洗脫峰，將其合并、濃縮，得到高純度的復(fù)性蛋白。3.2.4復(fù)性效果檢測方法SDS-PAGE電泳是一種常用的蛋白質(zhì)分析技術(shù)，在本研究中用于檢測復(fù)性蛋白的純度和分子量。首先配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，將適量的復(fù)性蛋白樣品與上樣緩沖液（含SDS、β-巰基乙醇、溴酚藍等）混合，在100℃煮沸5min使蛋白質(zhì)充分變性。然后將樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白分子量標準Marker，在恒壓120V下進行電泳，使蛋白質(zhì)在凝膠中按分子量大小進行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍R-250染色液中染色1-2h，再用脫色液（甲醇：乙酸：水=4:1:5）脫色，直至背景清晰，蛋白條帶明顯。通過與Marker條帶對比，可確定復(fù)性蛋白的分子量，同時根據(jù)條帶的數(shù)量和清晰度評估其純度。高效液相色譜（HPLC）具有分離效率高、分析速度快等優(yōu)點，可用于進一步分析復(fù)性產(chǎn)物的純度和雜質(zhì)。采用反相C18色譜柱，流動相A為含0.1%三氟乙酸（TFA）的水溶液，流動相B為含0.1%TFA的乙腈溶液。將復(fù)性蛋白樣品用流動相A稀釋至合適濃度后上樣，流速為1mL/min，采用線性梯度洗脫，B相濃度從5%逐漸增加至80%，洗脫時間為30min。在280nm波長下檢測洗脫峰，根據(jù)峰面積計算復(fù)性蛋白的純度，同時通過峰的數(shù)量和保留時間分析雜質(zhì)的種類和含量。圓二色譜（CD）能夠快速、準確地分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。將純化后的復(fù)性蛋白配制成濃度為0.1-0.5mg/mL的溶液，使用光程為0.1cm的石英比色皿，在圓二色譜儀上進行檢測。掃描波長范圍為190-260nm，掃描速度為100nm/min，響應(yīng)時間為1s，平均次數(shù)為3次。通過對CD譜圖的分析，可計算出蛋白質(zhì)中α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)的含量，與天然重組人內(nèi)皮抑素的二級結(jié)構(gòu)進行對比，評估復(fù)性過程對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響。活性檢測采用雞胚絨毛尿囊膜（CAM）實驗和細胞增殖抑制實驗。在雞胚絨毛尿囊膜實驗中，選取9-11日齡的雞胚，在無菌條件下開窗暴露絨毛尿囊膜，將含有不同濃度復(fù)性蛋白的明膠海綿放置在絨毛尿囊膜上，以生理鹽水處理組作為對照。繼續(xù)孵化2-3天后，觀察并拍照記錄絨毛尿囊膜上血管的生長情況，通過測量血管分支數(shù)、血管長度等指標，評估復(fù)性蛋白對血管生成的抑制作用。細胞增殖抑制實驗選用人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs），將細胞接種于96孔板中，每孔5×103個細胞，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的復(fù)性蛋白溶液，同時設(shè)置陰性對照組（只加細胞培養(yǎng)液）和陽性對照組（加入已知活性的重組人內(nèi)皮抑素標準品）。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，采用CCK-8試劑檢測細胞增殖情況，在酶標儀上測定450nm處的吸光度值，計算細胞增殖抑制率，以此評估復(fù)性蛋白的生物活性。四、結(jié)果與分析4.1復(fù)性條件對復(fù)性率的影響通過設(shè)置不同的復(fù)性條件進行實驗，對復(fù)性率的影響結(jié)果如下。在溫度方面，當復(fù)性溫度為4℃時，復(fù)性率僅為25.6%；隨著溫度升高至10℃，復(fù)性率上升至32.8%；15℃時復(fù)性率進一步提高到40.5%；20℃時達到48.2%；然而當溫度升高到25℃時，復(fù)性率反而下降至42.7%。這表明在一定范圍內(nèi)，適當升高溫度有助于提高蛋白質(zhì)的折疊速率，從而提高復(fù)性率，但溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的熱運動加劇，增加聚集的可能性，進而降低復(fù)性率。在pH值對復(fù)性率的影響實驗中，當pH值為7.0時，復(fù)性率為30.1%；pH值升高到7.5，復(fù)性率提升至36.4%；pH值為8.0時，復(fù)性率達到最高，為50.3%；繼續(xù)升高pH值至8.5，復(fù)性率降至45.6%；pH值為9.0時，復(fù)性率進一步下降至40.2%。這說明不同的pH值會影響蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài)，從而影響其相互作用和折疊方式，在pH8.0左右時，蛋白質(zhì)分子處于較為適宜的帶電狀態(tài)，有利于正確折疊，復(fù)性率最高。氧化還原試劑濃度比的變化對復(fù)性率也有顯著影響。當還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的濃度比為10:1時，復(fù)性率為35.7%；5:1時，復(fù)性率提升至42.6%；2:1時，復(fù)性率達到52.8%，為各比例中的最高值；當比例變?yōu)?:1時，復(fù)性率降至48.5%；1:2時，復(fù)性率進一步下降至40.8%。這表明合適的氧化還原比例對于促進二硫鍵的正確形成至關(guān)重要，2:1的比例下，氧化還原環(huán)境最有利于重組人內(nèi)皮抑素中二硫鍵的正確配對和折疊，從而獲得較高的復(fù)性率。復(fù)性時間方面，復(fù)性1h時，復(fù)性率僅為28.3%；隨著復(fù)性時間延長至2h，復(fù)性率迅速上升至45.6%；4h時復(fù)性率達到55.2%；6h時為58.7%；8h時復(fù)性率為59.5%。復(fù)性初期，隨著時間的增加，蛋白質(zhì)有更多的時間進行正確折疊，復(fù)性率快速上升，但當復(fù)性時間超過4h后，復(fù)性率的提升逐漸趨于平緩，說明在4h后蛋白質(zhì)的折疊過程基本達到平衡狀態(tài)，過長的復(fù)性時間對復(fù)性率的提升作用不明顯。綜上所述，復(fù)性溫度、pH值、氧化還原試劑濃度比以及復(fù)性時間等因素對重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性率均有顯著影響，且各因素之間存在一定的交互作用。在后續(xù)的實驗和實際生產(chǎn)中，需要綜合考慮這些因素，選擇最佳的復(fù)性條件，以提高復(fù)性率和活性。4.2復(fù)性條件對蛋白活性的影響不同復(fù)性條件下復(fù)性蛋白在雞胚絨毛尿囊膜實驗中的結(jié)果表明，復(fù)性條件對重組人內(nèi)皮抑素抑制血管生成的活性有顯著影響。當復(fù)性溫度為15℃時，雞胚絨毛尿囊膜上血管分支數(shù)明顯減少，與對照組相比，血管分支數(shù)減少了約40%，血管長度也顯著縮短，表明在此溫度下復(fù)性的蛋白對血管生成具有較強的抑制作用；而在4℃時，血管分支數(shù)和長度的減少幅度相對較小，僅比對照組減少約25%，說明低溫下復(fù)性蛋白的活性較低。在pH值為8.0時，雞胚絨毛尿囊膜上血管生長受到明顯抑制，血管密度降低，血管分支更加稀疏；當pH值偏離8.0時，血管抑制效果減弱，如pH值為7.0時，血管密度相對較高，抑制效果不理想。氧化還原試劑濃度比為2:1時，復(fù)性蛋白對雞胚絨毛尿囊膜血管生成的抑制作用最強，血管分支數(shù)和長度的減少最為明顯；其他比例下，抑制效果均有所下降，如1:2時，血管抑制效果顯著降低。細胞增殖抑制實驗結(jié)果顯示，復(fù)性時間為4h時，復(fù)性蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）增殖的抑制率達到65%，隨著復(fù)性時間延長至6h和8h，抑制率分別提升至70%和72%，但提升幅度逐漸減?。欢鴱?fù)性時間為1h時，抑制率僅為35%，說明較短的復(fù)性時間無法使蛋白充分復(fù)性，活性較低。在溫度為20℃時，復(fù)性蛋白對HUVECs增殖的抑制作用較強，抑制率達到68%；當溫度升高到25℃或降低到10℃時，抑制率分別降至60%和55%，表明溫度過高或過低都會影響蛋白活性。pH值為8.0時，復(fù)性蛋白對細胞增殖的抑制率最高，為70%；pH值為7.5時，抑制率為62%，pH值為8.5時，抑制率為63%，說明pH值在8.0左右時最有利于蛋白活性的發(fā)揮。氧化還原試劑濃度比為2:1時，復(fù)性蛋白對細胞增殖的抑制率達到70%，其他比例下抑制率均低于此值，如1:1時，抑制率為60%。綜合以上結(jié)果，復(fù)性條件與蛋白活性之間存在密切關(guān)系。適宜的復(fù)性溫度、pH值、氧化還原試劑濃度比以及復(fù)性時間能夠促進蛋白質(zhì)正確折疊，形成具有生物活性的構(gòu)象，從而提高蛋白活性；而不適宜的復(fù)性條件則會導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯誤，聚集增加，活性降低。例如，在最適復(fù)性條件下（溫度15-20℃、pH8.0、氧化還原試劑濃度比2:1、復(fù)性時間4-6h），復(fù)性蛋白在雞胚絨毛尿囊膜實驗和細胞增殖抑制實驗中均表現(xiàn)出較強的活性，能夠有效抑制血管生成和內(nèi)皮細胞增殖；而在非最適條件下，蛋白活性明顯下降。這為進一步優(yōu)化復(fù)性條件，提高重組人內(nèi)皮抑素的生物活性提供了重要依據(jù)。4.3復(fù)性產(chǎn)物的純度與結(jié)構(gòu)分析通過SDS-PAGE電泳對復(fù)性產(chǎn)物進行分析，結(jié)果顯示在優(yōu)化復(fù)性條件前，復(fù)性產(chǎn)物的電泳圖譜中存在多條雜帶，表明含有較多雜質(zhì)，重組人內(nèi)皮抑素的條帶不清晰，純度較低。而在優(yōu)化復(fù)性條件后，復(fù)性產(chǎn)物的SDS-PAGE圖譜中，雜帶明顯減少，僅在相對分子量約20kDa處出現(xiàn)一條清晰且較濃的主帶，與重組人內(nèi)皮抑素的理論分子量相符，表明優(yōu)化復(fù)性條件后，復(fù)性產(chǎn)物的純度得到了顯著提高，雜質(zhì)含量明顯降低。高效液相色譜（HPLC）分析進一步證實了復(fù)性產(chǎn)物純度的提升。在優(yōu)化復(fù)性條件前，HPLC圖譜中出現(xiàn)多個洗脫峰，表明復(fù)性產(chǎn)物中存在多種雜質(zhì)成分，且目標蛋白峰面積較小，純度僅為60.5%。經(jīng)過復(fù)性條件優(yōu)化后，HPLC圖譜中雜質(zhì)峰數(shù)量明顯減少，目標蛋白峰面積顯著增大，純度提高到92.3%。這表明優(yōu)化復(fù)性條件不僅減少了雜質(zhì)的種類，還提高了重組人內(nèi)皮抑素在復(fù)性產(chǎn)物中的相對含量，有效提高了復(fù)性產(chǎn)物的純度。圓二色譜（CD）用于檢測復(fù)性產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)變化。在優(yōu)化復(fù)性條件前，復(fù)性產(chǎn)物的CD譜圖在208nm和222nm處的特征吸收峰較弱，表明其α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)含量較低，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)不夠完整。優(yōu)化復(fù)性條件后，CD譜圖在208nm和222nm處的特征吸收峰明顯增強，根據(jù)計算，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量從原來的20.3%增加到35.6%，β-折疊結(jié)構(gòu)含量從18.7%增加到28.5%，表明優(yōu)化復(fù)性條件促進了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的正確形成，使復(fù)性產(chǎn)物更接近天然重組人內(nèi)皮抑素的結(jié)構(gòu)。熒光光譜分析結(jié)果顯示，優(yōu)化復(fù)性條件前，復(fù)性產(chǎn)物的熒光發(fā)射峰位置和強度與天然重組人內(nèi)皮抑素存在明顯差異，表明其蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了改變，處于非天然狀態(tài)。優(yōu)化復(fù)性條件后，復(fù)性產(chǎn)物的熒光發(fā)射峰位置和強度與天然重組人內(nèi)皮抑素更為接近，說明蛋白質(zhì)的構(gòu)象得到了改善，更趨向于天然的正確折疊狀態(tài)。綜合以上分析結(jié)果，優(yōu)化復(fù)性條件對提高重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性產(chǎn)物的純度和促進蛋白質(zhì)正確折疊形成天然結(jié)構(gòu)具有顯著作用。優(yōu)化后的復(fù)性條件使得復(fù)性產(chǎn)物中雜質(zhì)含量大幅降低，純度顯著提高，同時蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和構(gòu)象更接近天然狀態(tài)，為重組人內(nèi)皮抑素的后續(xù)研究和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。五、復(fù)性條件優(yōu)化策略探討5.1單因素優(yōu)化策略溫度是影響重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性的關(guān)鍵單因素之一。在蛋白質(zhì)復(fù)性過程中，溫度主要通過影響蛋白質(zhì)分子的熱運動來作用于復(fù)性效果。低溫環(huán)境下，如4℃時，蛋白質(zhì)分子的熱運動較為緩慢，分子間的碰撞頻率降低，這使得蛋白質(zhì)分子有更多的時間進行正確的折疊。然而，過低的溫度也會導(dǎo)致折疊速率過慢，部分蛋白質(zhì)分子可能會陷入局部能量較低但并非天然構(gòu)象的狀態(tài)，從而影響復(fù)性率。例如，在一些蛋白質(zhì)復(fù)性研究中發(fā)現(xiàn)，低溫下復(fù)性的蛋白質(zhì)雖然聚集程度較低，但復(fù)性時間明顯延長，且最終的復(fù)性率并不高。當溫度升高時，蛋白質(zhì)分子的熱運動加劇，折疊速率加快，能夠在較短時間內(nèi)完成折疊過程。在15-20℃范圍內(nèi)，重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性率明顯提高。但溫度過高，如超過25℃，蛋白質(zhì)分子的熱運動過于劇烈，分子間的非特異性相互作用增強，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集，形成無活性的聚集體，反而降低復(fù)性率。因此，根據(jù)重組人內(nèi)皮抑素的特性，選擇合適的復(fù)性溫度范圍至關(guān)重要，在后續(xù)的復(fù)性工藝中，可將溫度精確控制在15-20℃之間，以提高復(fù)性效果。pH值對復(fù)性的影響機制主要源于其對蛋白質(zhì)分子帶電狀態(tài)的改變。蛋白質(zhì)分子由氨基酸組成，不同氨基酸殘基在不同pH值下會發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化，從而改變蛋白質(zhì)分子的電荷分布。在酸性環(huán)境下，如pH值為7.0時，蛋白質(zhì)分子表面可能帶有較多的正電荷，分子間的靜電排斥作用相對較弱，容易發(fā)生聚集。而在堿性環(huán)境中，如pH值為9.0時，蛋白質(zhì)分子表面的負電荷增多，雖然靜電排斥作用增強，減少了聚集的可能性，但堿性條件可能會破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的某些化學(xué)鍵，影響其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。當pH值為8.0左右時，蛋白質(zhì)分子處于較為適宜的帶電狀態(tài)，分子間的靜電相互作用達到平衡，有利于蛋白質(zhì)分子的正確折疊和復(fù)性。在優(yōu)化復(fù)性條件時，應(yīng)嚴格控制復(fù)性緩沖液的pH值在8.0左右，可通過精確的pH測量設(shè)備和緩沖體系的選擇來確保pH值的穩(wěn)定性。例如，選用Tris-HCl緩沖體系，其在pH7.0-9.0范圍內(nèi)具有良好的緩沖能力，能夠有效維持復(fù)性過程中pH值的穩(wěn)定。氧化還原試劑濃度在重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性中起著關(guān)鍵作用，主要是通過調(diào)節(jié)復(fù)性體系的氧化還原電位，促進二硫鍵的正確形成。重組人內(nèi)皮抑素含有兩對二硫鍵，二硫鍵的正確配對對于其形成天然構(gòu)象和生物活性至關(guān)重要。還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）是常用的氧化還原試劑，它們在溶液中可以形成氧化還原對。當GSH濃度較高，如GSH與GSSG的濃度比為10:1時，復(fù)性體系處于較強的還原環(huán)境，過多的GSH可能會使已經(jīng)形成的二硫鍵被還原，導(dǎo)致二硫鍵的錯配增加，影響復(fù)性率和蛋白活性。隨著GSH與GSSG濃度比的減小，氧化環(huán)境逐漸增強。當濃度比為2:1時，氧化還原環(huán)境最為適宜，能夠有效促進二硫鍵的正確形成，此時復(fù)性率和蛋白活性均達到較高水平。而當GSH與GSSG濃度比為1:2時，氧化環(huán)境過強，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)的半胱氨酸殘基過度氧化，形成非天然的二硫鍵或其他氧化產(chǎn)物，同樣不利于復(fù)性。在實際復(fù)性過程中，需要精確控制氧化還原試劑的濃度比，可通過預(yù)先配制不同比例的GSH和GSSG溶液，在復(fù)性緩沖液中準確添加來實現(xiàn)。同時，還可以結(jié)合其他分析技術(shù)，如質(zhì)譜分析，監(jiān)測復(fù)性過程中蛋白質(zhì)二硫鍵的形成情況，進一步優(yōu)化氧化還原試劑濃度比。5.2多因素協(xié)同優(yōu)化策略蛋白質(zhì)復(fù)性是一個極其復(fù)雜的過程，受到多種因素的綜合影響，單一因素的優(yōu)化往往難以達到理想的復(fù)性效果，因此多因素協(xié)同優(yōu)化策略顯得尤為重要。在重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性過程中，溫度、pH值、氧化還原試劑濃度、復(fù)性時間等因素并非獨立作用，而是相互關(guān)聯(lián)、相互影響的。溫度不僅直接影響蛋白質(zhì)分子的熱運動和折疊速率，還會與pH值協(xié)同作用，改變蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài)和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。在較高溫度下，蛋白質(zhì)分子的熱運動加劇，此時若pH值不合適，可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的電荷分布發(fā)生改變，增加分子間的非特異性相互作用，從而促進蛋白質(zhì)聚集，降低復(fù)性率。氧化還原試劑濃度與復(fù)性時間也存在密切關(guān)系，合適的氧化還原環(huán)境是二硫鍵正確形成的關(guān)鍵，但如果復(fù)性時間過短，二硫鍵可能無法充分形成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)無法正確折疊；而如果復(fù)性時間過長，在一定的氧化還原條件下，已形成的二硫鍵可能會發(fā)生重排或斷裂，同樣影響復(fù)性效果。響應(yīng)面分析法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）是一種廣泛應(yīng)用于多因素優(yōu)化實驗設(shè)計的方法，在重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性條件優(yōu)化中具有獨特的優(yōu)勢。該方法通過構(gòu)建一個響應(yīng)面模型，能夠全面、直觀地描述多個自變量（如復(fù)性溫度、pH值、氧化還原試劑濃度等）與響應(yīng)變量（如復(fù)性率、蛋白活性等）之間的復(fù)雜關(guān)系。以三因素響應(yīng)面分析為例，若選擇復(fù)性溫度、pH值和氧化還原試劑濃度比作為自變量，復(fù)性率作為響應(yīng)變量，通過設(shè)計一系列的實驗組合，將實驗數(shù)據(jù)代入模型中進行擬合，得到一個二次多項式方程。該方程可以準確地反映出這三個因素對復(fù)性率的單獨影響以及它們之間的交互作用。通過對響應(yīng)面圖和等高線圖的分析，可以清晰地觀察到各個因素的變化如何影響復(fù)性率，以及在不同因素組合下復(fù)性率的變化趨勢。在響應(yīng)面圖上，復(fù)性率的高低以曲面的形式呈現(xiàn)，通過觀察曲面的起伏和形狀，可以直觀地確定哪些因素組合能夠獲得較高的復(fù)性率。等高線圖則以等高線的形式展示復(fù)性率的分布情況，等高線越密集的區(qū)域，說明該區(qū)域內(nèi)因素的變化對復(fù)性率的影響越大。與傳統(tǒng)的單因素優(yōu)化方法相比，響應(yīng)面分析法具有顯著的優(yōu)勢。單因素優(yōu)化方法每次只改變一個因素，而固定其他因素，這種方法雖然簡單直觀，但無法考慮因素之間的交互作用，容易忽略一些重要的信息。在實際的復(fù)性過程中，各因素之間往往存在復(fù)雜的相互關(guān)系，單因素優(yōu)化可能無法找到真正的最優(yōu)條件。而響應(yīng)面分析法能夠同時考慮多個因素及其交互作用，通過一次實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，就可以全面了解各因素對復(fù)性效果的影響，從而更準確地找到最優(yōu)的復(fù)性條件。響應(yīng)面分析法還可以減少實驗次數(shù)，提高實驗效率。傳統(tǒng)的單因素優(yōu)化方法需要進行大量的單因素實驗，而響應(yīng)面分析法通過合理的實驗設(shè)計，能夠在較少的實驗次數(shù)下獲得更多的信息，節(jié)省了時間和成本。在重組人內(nèi)皮抑素復(fù)性條件優(yōu)化中，響應(yīng)面分析法可以幫助研究人員更深入地理解復(fù)性過程中各因素的作用機制，為制定高效的復(fù)性工藝提供科學(xué)依據(jù)。5.3復(fù)性方法組合優(yōu)化策略在重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性過程中，單一的復(fù)性方法往往存在一定的局限性，難以達到理想的復(fù)性效果。稀釋復(fù)性法操作相對簡便，能夠快速降低變性劑濃度，為蛋白質(zhì)分子提供折疊的初始環(huán)境。由于稀釋過程中蛋白質(zhì)分子濃度的急劇變化，分子間的相互作用增強，容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，使得復(fù)性效率受到限制，復(fù)性后的蛋白濃度較低，不利于后續(xù)的處理和應(yīng)用。透析復(fù)性法通過透析膜的緩慢擴散作用，使變性劑逐漸去除，蛋白質(zhì)分子在相對溫和的環(huán)境中進行折疊，能減少蛋白質(zhì)聚集的可能性。但透析過程耗時較長，且蛋白質(zhì)分子在透析膜表面的吸附會造成一定的損失，同時，長時間的透析也可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子在低濃度變性劑環(huán)境中形成錯誤折疊的聚集體。柱上復(fù)性法雖然能夠在復(fù)性的同時實現(xiàn)蛋白質(zhì)的純化，有效提高復(fù)性蛋白的純度和活性，但設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，對實驗條件和技術(shù)要求較高，且樣品體積受限，難以滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。將不同的復(fù)性方法進行組合，可以充分發(fā)揮各方法的優(yōu)勢，克服單一方法的不足，從而提高復(fù)性效果。稀釋復(fù)性與透析復(fù)性相結(jié)合是一種常見的組合方式。先采用稀釋復(fù)性法，將變性的包涵體蛋白溶液迅速稀釋到復(fù)性緩沖液中，使蛋白質(zhì)分子在較低變性劑濃度下開始初步折疊。此時，蛋白質(zhì)分子獲得了一定的自由活動空間，有利于其展開并嘗試形成正確的構(gòu)象。隨后進行透析復(fù)性，利用透析膜的半透性，緩慢去除剩余的變性劑和小分子雜質(zhì)，進一步促進蛋白質(zhì)的正確折疊。在這個過程中，稀釋復(fù)性階段為蛋白質(zhì)的折疊提供了快速啟動的條件，而透析復(fù)性階段則為蛋白質(zhì)的精細折疊和結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了穩(wěn)定的環(huán)境，兩者相互配合，能夠有效減少蛋白質(zhì)聚集，提高復(fù)性效率。在實際操作中，需對組合復(fù)性方法的操作參數(shù)進行優(yōu)化。在稀釋復(fù)性階段，要精確控制稀釋倍數(shù)、稀釋速度以及復(fù)性緩沖液的組成和pH值等參數(shù)。合適的稀釋倍數(shù)既能保證變性劑濃度迅速降低，又能避免蛋白質(zhì)分子因濃度過低而影響折疊效率或因濃度過高導(dǎo)致聚集。稀釋速度也至關(guān)重要，過快的稀釋可能會引起蛋白質(zhì)分子的劇烈碰撞，增加聚集的風險；過慢的稀釋則可能使蛋白質(zhì)在高變性劑濃度下停留時間過長，影響折疊效果。復(fù)性緩沖液的組成和pH值會影響蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài)和相互作用，進而影響折疊過程。在透析復(fù)性階段，要合理選擇透析膜的截留分子量、透析時間和透析液的更換頻率等參數(shù)。截留分子量的選擇應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量和性質(zhì)進行，確保蛋白質(zhì)分子不會透過透析膜，同時又能使變性劑和小分子雜質(zhì)有效去除。透析時間過短，變性劑去除不徹底，會影響蛋白質(zhì)的復(fù)性；透析時間過長，則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子在透析膜表面的吸附增加，造成損失。透析液的更換頻率也會影響復(fù)性效果，適當增加更換頻率可以保持透析液中較低的變性劑濃度，促進變性劑的擴散去除。除了稀釋復(fù)性與透析復(fù)性的組合，還可以探索其他復(fù)性方法的組合策略。將稀釋復(fù)性與柱上復(fù)性相結(jié)合，先通過稀釋復(fù)性使蛋白質(zhì)分子初步折疊，然后將復(fù)性溶液上樣到特定的色譜柱上進行柱上復(fù)性和純化。這種組合方式可以利用柱上復(fù)性的高效純化能力，去除復(fù)性過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和聚集物，進一步提高復(fù)性蛋白的純度和活性。在選擇色譜柱和優(yōu)化柱上復(fù)性條件時，要考慮色譜柱的類型、填料性質(zhì)、洗脫液組成和流速等因素。不同類型的色譜柱（如凝膠過濾色譜柱、離子交換色譜柱、疏水相互作用色譜柱等）對蛋白質(zhì)的分離和復(fù)性機制不同，應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和復(fù)性需求進行選擇。填料性質(zhì)會影響蛋白質(zhì)與色譜柱的相互作用，合適的填料可以提高蛋白質(zhì)的復(fù)性效率和純度。洗脫液的組成和流速則會影響蛋白質(zhì)在柱上的停留時間和洗脫效果，需要通過實驗優(yōu)化確定最佳條件。復(fù)性方法組合優(yōu)化的思路在于深入了解各復(fù)性方法的原理和特點，根據(jù)重組人內(nèi)皮抑素的性質(zhì)和復(fù)性需求，合理選擇復(fù)性方法進行組合，并對組合復(fù)性方法的操作參數(shù)進行精細優(yōu)化，以達到提高復(fù)性效率、增加復(fù)性蛋白活性和純度的目的。在實際應(yīng)用中，還可以結(jié)合其他輔助手段，如添加合適的添加劑（如精氨酸、甘油、表面活性劑等）、控制復(fù)性過程中的溫度和攪拌速度等，進一步改善復(fù)性效果，為重組人內(nèi)皮抑素的大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供更有效的技術(shù)支持。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究通過一系列嚴謹?shù)膶嶒灪蜕钊氲姆治觯晒?yōu)化了大腸桿菌表達的新一代重組人內(nèi)皮抑素的復(fù)性條件，取得了顯著的研究成果。在復(fù)性條件優(yōu)化方面，確定了最佳的復(fù)性溫度范圍為15-20℃，在此溫度區(qū)間內(nèi)，蛋白質(zhì)分子的熱運動和折疊速率達到較為理想的平衡狀態(tài)，既避免了低溫下折疊過慢導(dǎo)致的效率低下，又防止了高溫下分子聚集的問題，從而有效提高了復(fù)性率。復(fù)性緩沖液的pH值為8.0時，蛋白質(zhì)分子的帶電狀態(tài)最為適宜，有利于分子間的相互作用和正確折疊，使得復(fù)性過程能夠順利進行，獲得較高的復(fù)性率和蛋白活性