大花蕙蘭轉(zhuǎn)建蘭花葉病毒與齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因及檢測(cè)技術(shù)探究一、引言1.1研究背景與意義大花蕙蘭（Cymbidiumhybridum）作為蘭科蘭屬中具有極高觀賞價(jià)值的重要花卉，在全球花卉市場(chǎng)占據(jù)著顯著地位。其花形碩大、花色豐富、花期較長(zhǎng)，既有國(guó)蘭的典雅，又兼具洋蘭的絢麗，深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，廣泛應(yīng)用于室內(nèi)裝飾、花卉展覽以及禮品饋贈(zèng)等領(lǐng)域。近年來(lái)，大花蕙蘭產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，種植規(guī)模不斷擴(kuò)大。在全球范圍內(nèi)，許多國(guó)家和地區(qū)都積極投身于大花蕙蘭的種植與生產(chǎn)，如中國(guó)、日本、韓國(guó)以及歐洲部分國(guó)家等。在中國(guó)，云南、四川、貴州等地成為大花蕙蘭的主要產(chǎn)區(qū)，其中云南的種植規(guī)模尤為突出，2023年云南大花蕙蘭上市總量達(dá)610萬(wàn)盆，占全國(guó)的95.61%。然而，隨著大花蕙蘭種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大和種植年限的增加，其面臨的病害問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)峻。在諸多病害中，建蘭花葉病毒（Cymbidiummosaicvirus，CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（Odontoglossumringspotvirus，ORSV）對(duì)大花蕙蘭的危害尤為嚴(yán)重。CymMV屬于馬鈴薯Y病毒科（Potyviridae），病毒粒子呈彎曲線狀。ORSV屬于煙草花葉病毒科（Tobamoviridae），病毒粒子為桿狀。這兩種病毒具有廣泛的寄主范圍，能夠侵染多種蘭花品種，且傳播途徑多樣，可通過(guò)機(jī)械摩擦、蚜蟲(chóng)等媒介昆蟲(chóng)傳播，在組培過(guò)程中也容易擴(kuò)散，導(dǎo)致蘭花種苗帶毒。感染CymMV的大花蕙蘭，葉片上通常會(huì)出現(xiàn)黃綠相間的花葉癥狀，嚴(yán)重時(shí)葉片皺縮、畸形，生長(zhǎng)發(fā)育受阻，植株的觀賞價(jià)值大幅降低。而感染ORSV后，大花蕙蘭葉片會(huì)出現(xiàn)壞死斑、環(huán)斑等癥狀，影響葉片的光合作用，致使植株生長(zhǎng)衰弱，花朵發(fā)育不良，甚至無(wú)法正常開(kāi)花，極大地降低了大花蕙蘭的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)相關(guān)研究統(tǒng)計(jì)，在一些病害高發(fā)地區(qū)，大花蕙蘭受CymMV和ORSV侵染的發(fā)病率可達(dá)30%-50%，給大花蕙蘭產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了有效解決大花蕙蘭受CymMV和ORSV侵害的問(wèn)題，轉(zhuǎn)外殼蛋白基因技術(shù)成為一種極具潛力的防控策略。將CymMV和ORSV的外殼蛋白基因?qū)氪蠡ㄞヌm基因組中，使植株能夠表達(dá)相應(yīng)的外殼蛋白，這些蛋白可以干擾病毒的正常復(fù)制和傳播過(guò)程，從而增強(qiáng)大花蕙蘭對(duì)這兩種病毒的抗性。通過(guò)這種方式培育出的轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭，能夠在病毒侵染時(shí)迅速啟動(dòng)防御機(jī)制，降低病毒在植株體內(nèi)的積累量，減輕病害癥狀，提高植株的存活率和觀賞品質(zhì)。同時(shí)，建立準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)技術(shù)對(duì)于大花蕙蘭病毒病的防控至關(guān)重要。在大花蕙蘭的種植過(guò)程中，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測(cè)出植株是否感染CymMV和ORSV，能夠?yàn)椴『Φ脑缙诜乐翁峁┛茖W(xué)依據(jù)。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法如生物學(xué)檢測(cè)法，通過(guò)觀察指示植物的癥狀來(lái)判斷病毒的存在，但這種方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低，且易受環(huán)境因素影響。血清學(xué)檢測(cè)法利用抗原-抗體反應(yīng)原理，具有一定的特異性和靈敏度，但存在假陽(yáng)性等問(wèn)題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸檢測(cè)技術(shù)如RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)，成為大花蕙蘭病毒檢測(cè)的重要手段。這些技術(shù)能夠從分子水平快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出病毒的核酸，為大花蕙蘭病毒病的防控提供了有力的技術(shù)支持。轉(zhuǎn)CymMV與ORSV外殼蛋白基因及檢測(cè)技術(shù)的研究對(duì)于大花蕙蘭產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。一方面，通過(guò)培育抗病毒的轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭，能夠有效降低病毒病的發(fā)生，提高大花蕙蘭的產(chǎn)量和品質(zhì)，增加種植戶的經(jīng)濟(jì)收益；另一方面，建立高效的檢測(cè)技術(shù)，有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒病的早期監(jiān)測(cè)和精準(zhǔn)防控，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低對(duì)環(huán)境的污染，保護(hù)生態(tài)平衡。此外，本研究還能為其他花卉病毒病的防治提供借鑒和參考，推動(dòng)整個(gè)花卉產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在大花蕙蘭抗病毒基因工程研究方面，國(guó)外起步相對(duì)較早。早在20世紀(jì)90年代，就有研究嘗試將病毒外殼蛋白基因?qū)胫参镆垣@得抗病毒植株。對(duì)于大花蕙蘭，一些發(fā)達(dá)國(guó)家如日本、韓國(guó)等，在轉(zhuǎn)CymMV和ORSV外殼蛋白基因的研究上取得了一定成果。日本的科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，成功將ORSV的外殼蛋白基因?qū)氪蠡ㄞヌm，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)ORSV的抗性有顯著提升。在后續(xù)研究中，他們還對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的生長(zhǎng)特性、生理指標(biāo)等進(jìn)行了長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株在保持正常觀賞性狀的同時(shí)，能夠有效抵御ORSV的侵染，降低發(fā)病率和病情指數(shù)。國(guó)內(nèi)對(duì)大花蕙蘭抗病毒基因工程的研究近年來(lái)也發(fā)展迅速。眾多科研機(jī)構(gòu)和高校投入到相關(guān)研究中，在基因轉(zhuǎn)化技術(shù)、轉(zhuǎn)基因植株篩選與鑒定等方面取得了一系列進(jìn)展。例如，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院的研究人員利用基因槍介導(dǎo)法，將CymMV的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入大花蕙蘭，通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，提高了轉(zhuǎn)化效率，并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分子檢測(cè)和抗病性鑒定，證實(shí)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)CymMV具有一定的抗性。此外，一些地方科研單位也結(jié)合當(dāng)?shù)卮蠡ㄞヌm產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，開(kāi)展了針對(duì)性的研究，如云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院針對(duì)云南地區(qū)大花蕙蘭主栽品種，進(jìn)行了抗病毒基因轉(zhuǎn)化研究，為當(dāng)?shù)卮蠡ㄞヌm產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供了技術(shù)支持。在病毒檢測(cè)技術(shù)方面，國(guó)外在分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用上較為領(lǐng)先。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在大花蕙蘭病毒檢測(cè)中已得到廣泛應(yīng)用，美國(guó)的科研團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)建立了快速、靈敏的CymMV和ORSV檢測(cè)方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。此外，一些新興的檢測(cè)技術(shù)如納米技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等也開(kāi)始應(yīng)用于大花蕙蘭病毒檢測(cè)領(lǐng)域，為病毒檢測(cè)提供了新的思路和方法。例如，基于納米金標(biāo)記的免疫層析試紙條，具有操作簡(jiǎn)便、快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，能夠在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)在大花蕙蘭病毒檢測(cè)技術(shù)方面也不斷跟進(jìn)和創(chuàng)新。除了傳統(tǒng)的RT-PCR、ELISA等技術(shù)得到廣泛應(yīng)用外，國(guó)內(nèi)科研人員還致力于開(kāi)發(fā)更加高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)建立了多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，能夠同時(shí)檢測(cè)大花蕙蘭中的CymMV、ORSV以及其他常見(jiàn)病毒，提高了檢測(cè)的全面性和效率。同時(shí)，在檢測(cè)技術(shù)的國(guó)產(chǎn)化和低成本化方面也取得了一定成果，一些自主研發(fā)的檢測(cè)試劑盒已投入市場(chǎng)，為大花蕙蘭病毒檢測(cè)提供了經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的選擇。盡管國(guó)內(nèi)外在大花蕙蘭轉(zhuǎn)CymMV與ORSV外殼蛋白基因及檢測(cè)技術(shù)方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足和空白。在基因工程方面，轉(zhuǎn)化效率較低仍然是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題，目前的轉(zhuǎn)化方法雖然能夠獲得轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化效率普遍不高，限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用。此外，轉(zhuǎn)基因植株的穩(wěn)定性和安全性評(píng)估還不夠完善，長(zhǎng)期的田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)相對(duì)缺乏，對(duì)于轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭在生態(tài)環(huán)境中的潛在影響還需要進(jìn)一步深入研究。在病毒檢測(cè)技術(shù)方面，雖然現(xiàn)有技術(shù)能夠滿足一定的檢測(cè)需求，但對(duì)于一些低含量病毒的檢測(cè)靈敏度還有待提高，特別是在病毒早期侵染階段，容易出現(xiàn)漏檢的情況。同時(shí)，不同檢測(cè)技術(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)化和兼容性也需要進(jìn)一步加強(qiáng)，以確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性和可比性。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）的外殼蛋白基因?qū)氪蠡ㄞヌm中，獲得具有抗病毒能力的大花蕙蘭種質(zhì)資源，同時(shí)建立高效的轉(zhuǎn)化體系和準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，為大花蕙蘭產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：目的基因的克隆與載體構(gòu)建：從感染CymMV和ORSV的蘭花植株中提取病毒RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增CymMV和ORSV的外殼蛋白基因（CP基因），并對(duì)擴(kuò)增得到的基因進(jìn)行測(cè)序和序列分析，確?；虻臏?zhǔn)確性和完整性。將測(cè)序正確的CP基因與合適的植物表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保載體構(gòu)建成功。大花蕙蘭遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化：以大花蕙蘭的原球莖或幼葉為外植體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因槍介導(dǎo)法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入大花蕙蘭細(xì)胞中。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化條件如農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、篩選壓力等進(jìn)行優(yōu)化，提高基因轉(zhuǎn)化效率。在含有篩選劑的培養(yǎng)基上對(duì)轉(zhuǎn)化后的外植體進(jìn)行篩選培養(yǎng)，獲得抗性愈傷組織和再生植株。轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的檢測(cè)與鑒定：采用PCR技術(shù)對(duì)再生植株進(jìn)行初步檢測(cè)，篩選出含有目的基因的陽(yáng)性植株。對(duì)PCR陽(yáng)性植株進(jìn)一步進(jìn)行Southernblot雜交分析，確定目的基因在大花蕙蘭基因組中的整合情況，包括整合的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)等。通過(guò)RT-PCR和Westernblot技術(shù)分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況，分析目的基因的表達(dá)量和表達(dá)穩(wěn)定性。對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭進(jìn)行抗病性鑒定，通過(guò)人工接種CymMV和ORSV病毒，觀察轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病癥狀，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓赀M(jìn)行對(duì)比，評(píng)估轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒的抗性程度。檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用：建立基于RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等分子生物學(xué)技術(shù)的CymMV和ORSV快速檢測(cè)方法，對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。對(duì)大花蕙蘭種植過(guò)程中的樣品進(jìn)行定期檢測(cè)，包括種苗、葉片、花朵等，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒感染情況，為病害防控提供依據(jù)。利用建立的檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，監(jiān)測(cè)目的基因在植株生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)變化以及病毒的侵染情況，評(píng)估轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的抗病毒穩(wěn)定性。1.4研究技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線主要包括目的基因克隆、載體構(gòu)建、大花蕙蘭遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)與鑒定以及檢測(cè)技術(shù)建立與應(yīng)用等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，具體流程如下：目的基因克?。簭母腥綜ymMV和ORSV的蘭花植株中采集葉片樣品，采用TRIzol法等常規(guī)方法提取總RNA。以提取的RNA為模板，根據(jù)已報(bào)道的CymMV和ORSV外殼蛋白基因（CP基因）序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA。通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括模板cDNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55-60℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切取目的條帶，利用凝膠回收試劑盒回收純化，將回收的目的基因片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。載體構(gòu)建：選擇合適的植物表達(dá)載體，如pCAMBIA1301等，該載體含有CaMV35S啟動(dòng)子、終止子以及篩選標(biāo)記基因等元件。用限制性內(nèi)切酶對(duì)測(cè)序正確的重組pMD18-T載體和植物表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切體系包括質(zhì)粒DNA、限制性內(nèi)切酶、Buffer等，37℃水浴酶切2-3h。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，切取目的條帶，利用凝膠回收試劑盒回收純化。將回收的目的基因片段與線性化的植物表達(dá)載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系包括目的基因片段、載體片段、T4DNA連接酶、Buffer等，16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上篩選培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。大花蕙蘭遺傳轉(zhuǎn)化：選取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的大花蕙蘭原球莖或幼葉作為外植體，用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞溶液消毒5-8min，無(wú)菌水沖洗5-6次。將消毒后的外植體接種到添加不同濃度激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織的形成。利用凍融法將重組表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404或EHA105中，挑取陽(yáng)性單菌落接種到含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.6。將誘導(dǎo)出的愈傷組織或外植體浸泡在農(nóng)桿菌菌液中，侵染10-20min，期間輕輕振蕩。侵染后的外植體用無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)2-3d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有篩選劑（如卡那霉素、潮霉素等）和頭孢霉素的篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，篩選出抗性愈傷組織和再生植株。在篩選過(guò)程中，逐漸提高篩選劑的濃度，以確保獲得的再生植株為轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)與鑒定：采用CTAB法提取再生植株的基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用目的基因特異性引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件同目的基因克隆時(shí)的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)與目的基因大小一致條帶的植株初步判定為陽(yáng)性植株。將PCR陽(yáng)性植株的基因組DNA用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與地高辛或放射性同位素標(biāo)記的目的基因探針進(jìn)行Southernblot雜交分析，檢測(cè)目的基因在大花蕙蘭基因組中的整合情況，包括整合的拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)等。提取PCR陽(yáng)性植株的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，利用目的基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系和條件與普通PCR類似，但退火溫度需根據(jù)引物進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況。提取轉(zhuǎn)基因植株的總蛋白，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用特異性抗體進(jìn)行Westernblot分析，檢測(cè)目的基因在翻譯水平的表達(dá)情況，確定目的蛋白的表達(dá)量和表達(dá)穩(wěn)定性。對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭進(jìn)行抗病性鑒定，將CymMV和ORSV病毒液通過(guò)摩擦接種或汁液接種的方式接種到轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晟?，接種后將植株置于適宜的環(huán)境條件下培養(yǎng)，定期觀察植株的發(fā)病癥狀，記錄發(fā)病時(shí)間、癥狀類型和嚴(yán)重程度等。與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓赀M(jìn)行對(duì)比，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病情指數(shù)，分析轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力，評(píng)估轉(zhuǎn)基因植株對(duì)病毒的抗性程度。檢測(cè)技術(shù)建立與應(yīng)用：建立基于RT-PCR的CymMV和ORSV快速檢測(cè)方法，優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，包括引物濃度、dNTPs濃度、TaqDNA聚合酶用量、退火溫度和延伸時(shí)間等。通過(guò)對(duì)不同濃度的病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法的靈敏度。同時(shí)，通過(guò)對(duì)其他相關(guān)病毒或植物基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。進(jìn)一步建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，優(yōu)化反應(yīng)條件。利用已知濃度的病毒RNA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)檢測(cè)樣品的Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中病毒RNA的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的定量檢測(cè)。在大花蕙蘭種植過(guò)程中，定期采集種苗、葉片、花朵等樣品，利用建立的RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒感染情況。對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，監(jiān)測(cè)目的基因在植株生長(zhǎng)過(guò)程中的表達(dá)變化以及病毒的侵染情況，評(píng)估轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的抗病毒穩(wěn)定性，為大花蕙蘭的病害防控提供科學(xué)依據(jù)。二、病毒外殼蛋白基因克隆及載體構(gòu)建2.1材料與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料：選取生長(zhǎng)于云南某大花蕙蘭種植基地的感病大花蕙蘭植株作為實(shí)驗(yàn)材料，這些植株表現(xiàn)出典型的建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）感染癥狀，如葉片出現(xiàn)黃綠相間的花葉、壞死斑、環(huán)斑等。從這些植株上采集具有明顯癥狀的葉片，用于病毒RNA的提取。病毒樣本：實(shí)驗(yàn)中使用的CymMV和ORSV病毒樣本由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所提供，這些樣本經(jīng)過(guò)多次分離和純化，確保病毒的純度和活性，為后續(xù)的基因克隆提供高質(zhì)量的模板。菌株與載體：大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，其具有繁殖速度快、易于轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，常用于基因克隆和載體構(gòu)建過(guò)程中的宿主菌。植物表達(dá)載體pCAMBIA1301由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所惠贈(zèng)，該載體含有CaMV35S啟動(dòng)子，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)；同時(shí)還帶有潮霉素抗性基因，便于在轉(zhuǎn)化過(guò)程中對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行篩選。儀器設(shè)備：高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），型號(hào)為5424R，其最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,000rpm，能夠滿足RNA提取、質(zhì)粒提取等實(shí)驗(yàn)中對(duì)樣品的高速離心需求，確保樣品的分離效果。PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），型號(hào)為T100，具有精確的溫度控制和多樣的程序設(shè)置功能，可滿足不同PCR反應(yīng)的需求，保證目的基因擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），型號(hào)為GelDocEZ，能夠?qū)Ν傊悄z電泳后的DNA條帶進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的成像和分析，方便觀察和記錄目的基因的擴(kuò)增結(jié)果。恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司），型號(hào)為ZQZY-2102C，溫度控制范圍為5-65℃，振蕩速度范圍為30-300rpm，用于大腸桿菌的培養(yǎng)和農(nóng)桿菌的擴(kuò)繁，為菌株的生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），型號(hào)為SW-CJ-2FD，能夠提供無(wú)菌的操作環(huán)境，有效避免實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的微生物污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。2.2試驗(yàn)方法2.2.1病毒總RNA提取使用北京天根生化科技有限公司的RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取大花蕙蘭葉片中的病毒總RNA。具體步驟如下：將采集的大花蕙蘭葉片樣品剪碎，取約100mg放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀，確保研磨充分，以提高RNA的提取率。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至含有600μL裂解液RL的離心管中，劇烈振蕩混勻，使樣品充分裂解，室溫靜置5min，以促進(jìn)核酸與蛋白質(zhì)的分離。加入200μL無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀，這是正常現(xiàn)象，不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱CR3中，12,000rpm離心30s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管。向吸附柱中加入700μL去蛋白液RW1，12,000rpm離心30s，棄廢液，再次將吸附柱放回收集管，此步驟可去除樣品中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。向吸附柱中加入500μL漂洗液RW（使用前需按比例加入無(wú)水乙醇），12,000rpm離心30s，棄廢液，重復(fù)此步驟一次，以確保吸附柱上的鹽分等雜質(zhì)被徹底清除。將吸附柱CR3放回收集管，12,000rpm離心2min，以徹底去除吸附柱中的殘留液體。將吸附柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的無(wú)RNase離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μLRNase-freewater，室溫靜置2min，12,000rpm離心2min，收集離心管中的RNA溶液。在整個(gè)提取過(guò)程中，需注意以下事項(xiàng)：操作人員需全程佩戴無(wú)RNase手套，避免汗液、唾液等中的RNase對(duì)RNA造成降解；使用的所有器具，如研缽、離心管、移液器槍頭、鑷子等，均需經(jīng)過(guò)RNase-free處理，可采用高溫高壓滅菌或DEPC水處理后再滅菌的方法；提取過(guò)程應(yīng)盡量在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少RNA的降解，如使用預(yù)冷的研缽、離心管等；避免反復(fù)凍融RNA樣品，提取后的RNA若不立即使用，應(yīng)保存于-80℃冰箱中。2.2.2cDNA合成以提取的病毒總RNA為模板，使用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。具體反應(yīng)體系如下：在一個(gè)無(wú)RNase的PCR管中，依次加入5×gDNAEraserBuffer2μL、gDNAEraser1μL、TotalRNA1μg、RNase-freewater補(bǔ)足至10μL。將PCR管輕輕混勻后，短暫離心，使溶液集中于管底。將其置于PCR儀中，42℃孵育2min，以去除基因組DNA，這一步驟能夠有效避免基因組DNA對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾。反應(yīng)結(jié)束后，向PCR管中加入5×PrimeScriptBuffer24μL、PrimeScriptRTEnzymeMix11μL、RTPrimerMix1μL、RNase-freewater補(bǔ)足至20μL，再次輕輕混勻并短暫離心。將PCR儀設(shè)置為37℃孵育15min，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；隨后85℃加熱5s，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)。合成的cDNA可立即用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，若暫時(shí)不用，可保存于-20℃冰箱。2.2.3基因克隆根據(jù)GenBank中已登錄的建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因（CP基因）序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及相關(guān)信息如下：病毒名稱引物名稱引物序列（5'-3'）擴(kuò)增片段大?。╞p）CymMVCymMV-FATGGCTACAAACGAGCACC650CymMVCymMV-RTCAGGTCCACAAGCTCTTCORSVORSV-FATGGTGAAGCTGCTACGAG700ORSVORSV-RTCACACTCACAAAGCAAAC以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）包括：2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μM）各1μL、cDNA模板1μL、ddH?O9.5μL。將上述反應(yīng)體系輕輕混勻后，短暫離心，使溶液集中于管底。將PCR管放入PCR儀中，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性5min，使模板DNA完全解鏈；94℃變性30s，使DNA雙鏈解旋；55℃退火30s，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，以120V的電壓電泳30-40min。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照記錄結(jié)果。若擴(kuò)增條帶清晰且大小與預(yù)期相符，則切下目的條帶，使用OmegaBio-tek公司的GelExtractionKit凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.2.4載體構(gòu)建將回收純化后的目的基因片段與植物表達(dá)載體pCAMBIA1301進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。連接反應(yīng)使用寶生物工程（大連）有限公司的T4DNALigase連接試劑盒，反應(yīng)體系（10μL）包括：pCAMBIA1301載體（經(jīng)相應(yīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切并回收）1μL、目的基因片段3μL、T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase1μL、ddH?O4μL。將上述反應(yīng)體系輕輕混勻，16℃連接過(guò)夜。連接反應(yīng)的原理是T4DNALigase能夠催化目的基因片段與載體DNA的粘性末端或平末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將目的基因連接到載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：取5μL連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞；42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min，這一步驟可使感受態(tài)細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，促進(jìn)連接產(chǎn)物的吸收；向管中加入900μL無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液以5000rpm離心5min，棄上清，留取100μL菌液重懸菌體，將其均勻涂布在含有潮霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，使轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)形成單菌落。挑取平板上的單菌落，接種到含有潮霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取菌液中的質(zhì)粒，使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系（20μL）包括：質(zhì)粒DNA2μL、限制性內(nèi)切酶11μL、限制性內(nèi)切酶21μL、10×Buffer2μL、ddH?O14μL。37℃水浴酶切2-3h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若酶切后出現(xiàn)與目的基因大小一致的條帶，則初步判斷重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保目的基因的序列和插入方向正確。2.3結(jié)果與分析2.3.1病毒總RNA提取結(jié)果使用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒成功提取了大花蕙蘭葉片中的病毒總RNA。通過(guò)核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，結(jié)果顯示，RNA的濃度在200-500ng/μL之間，A260/A280的比值在1.8-2.0之間，表明提取的RNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和酚類等雜質(zhì)污染，可滿足后續(xù)cDNA合成及PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)的要求。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在18SrRNA和28SrRNA處出現(xiàn)兩條清晰明亮的條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明RNA完整性良好，無(wú)明顯降解（圖1）。2.3.2cDNA合成結(jié)果以提取的病毒總RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒成功合成了cDNA。將合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，表明cDNA合成成功，可作為后續(xù)基因克隆的模板。為進(jìn)一步驗(yàn)證cDNA的質(zhì)量，對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已登錄的CymMV和ORSV的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，相似度達(dá)到98%以上，說(shuō)明合成的cDNA準(zhǔn)確可靠，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.3.3基因克隆結(jié)果以合成的cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增成功獲得了建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）的外殼蛋白基因（CP基因）。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，CymMVCP基因擴(kuò)增出約650bp的條帶，與預(yù)期片段大小相符；ORSVCP基因擴(kuò)增出約700bp的條帶，也與預(yù)期大小一致（圖2）。將擴(kuò)增得到的目的基因片段切膠回收后，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選培養(yǎng)，挑取白色單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明，克隆得到的CymMVCP基因和ORSVCP基因序列與GenBank中已登錄的相應(yīng)基因序列一致性分別達(dá)到99%和98%，證明目的基因克隆成功，且序列正確，無(wú)堿基突變等情況發(fā)生。2.3.4載體構(gòu)建結(jié)果將測(cè)序正確的CymMVCP基因和ORSVCP基因與植物表達(dá)載體pCAMBIA1301進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。對(duì)重組表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切后得到了與目的基因大小一致的條帶以及線性化的載體片段，初步表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖3）。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明，目的基因已成功插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中，且插入方向和閱讀框均正確，無(wú)堿基缺失、突變等異常情況，說(shuō)明重組表達(dá)載體構(gòu)建完全正確，可用于后續(xù)大花蕙蘭的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。2.4小結(jié)本部分通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)操作，成功從感病大花蕙蘭葉片中提取了高質(zhì)量的病毒總RNA，并以此為模板反轉(zhuǎn)錄合成了cDNA。利用特異性引物和PCR技術(shù)，克隆得到了建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）的外殼蛋白基因（CP基因），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，基因序列正確且與GenBank中已登錄序列高度一致。將目的基因與植物表達(dá)載體pCAMBIA1301連接，成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)重組載體構(gòu)建無(wú)誤。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)大花蕙蘭的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)，使得利用基因工程技術(shù)培育抗病毒大花蕙蘭新品種成為可能。三、大花蕙蘭的遺傳轉(zhuǎn)化3.1材料與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料：選用生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的大花蕙蘭類原球莖作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。這些類原球莖來(lái)源于前期組織培養(yǎng)過(guò)程中誘導(dǎo)和增殖得到的優(yōu)質(zhì)材料，其生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分化能力較強(qiáng)，有利于提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌菌株：實(shí)驗(yàn)采用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）菌株LBA4404，該菌株具有較強(qiáng)的侵染能力和較高的轉(zhuǎn)化效率，能夠有效地將外源基因?qū)氪蠡ㄞヌm細(xì)胞中。農(nóng)桿菌菌株保存于含有相應(yīng)抗生素（如利福平、鏈霉素等）的甘油菌液中，置于-80℃冰箱備用。培養(yǎng)基：誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以MS（MurashigeandSkoog）培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加2.0mg/L6-芐氨基嘌呤（6-BA）和0.5mg/L萘乙酸（NAA），用于大花蕙蘭類原球莖的誘導(dǎo)。培養(yǎng)基中還加入30g/L蔗糖作為碳源，8g/L瓊脂作為凝固劑，調(diào)節(jié)pH值至5.8。共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基中添加1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA和200μmol/L乙酰丁香酮（AS），用于大花蕙蘭類原球莖與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)，促進(jìn)農(nóng)桿菌對(duì)植物細(xì)胞的侵染和外源基因的整合。篩選培養(yǎng)基：在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、50mg/L潮霉素（Hyg）和300mg/L頭孢霉素（Cef）。潮霉素用于篩選轉(zhuǎn)化后的陽(yáng)性細(xì)胞，頭孢霉素則用于抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，防止其過(guò)度繁殖對(duì)植物細(xì)胞造成傷害。生根培養(yǎng)基：1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5mg/L吲哚丁酸（IBA）和0.2mg/LNAA，用于轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭再生植株的生根培養(yǎng)，促進(jìn)根系的生長(zhǎng)和發(fā)育。培養(yǎng)基中同樣加入20g/L蔗糖和8g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH值至5.8。儀器設(shè)備：超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司，型號(hào)SW-CJ-2FD），為實(shí)驗(yàn)提供無(wú)菌操作環(huán)境，有效避免微生物污染，確保遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程的順利進(jìn)行。恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司，型號(hào)ZQZY-2102C），用于農(nóng)桿菌的培養(yǎng)和擴(kuò)繁，可精確控制溫度和振蕩速度，為農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)提供適宜條件。離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5424R），用于收集和分離農(nóng)桿菌菌體以及植物細(xì)胞碎片等，其高速離心功能能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的快速分離。光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)MGC-350HP），為大花蕙蘭的培養(yǎng)提供穩(wěn)定的光照、溫度和濕度條件，滿足其生長(zhǎng)和發(fā)育的需求。高壓滅菌鍋（日本SANYO公司，型號(hào)MLS-3750），用于培養(yǎng)基、器具等的滅菌處理，確保實(shí)驗(yàn)材料和環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。3.2試驗(yàn)方法3.2.1抗生素篩選濃度確定將大花蕙蘭類原球莖分別接種到添加不同濃度潮霉素（Hyg）的MS培養(yǎng)基上，潮霉素濃度設(shè)置為0mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L，每個(gè)處理接種30個(gè)類原球莖，重復(fù)3次。培養(yǎng)基中同時(shí)添加1.0mg/L6-BA和0.1mg/LNAA，以促進(jìn)類原球莖的生長(zhǎng)和分化。將接種后的培養(yǎng)瓶置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度2000-3000lx，光照時(shí)間16h/d。培養(yǎng)4周后，觀察類原球莖的生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)成活率和增殖率。成活率=（成活的類原球莖數(shù)/接種的類原球莖數(shù)）×100%；增殖率=（增殖后的類原球莖數(shù)-接種的類原球莖數(shù)）/接種的類原球莖數(shù)×100%。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定對(duì)大花蕙蘭類原球莖生長(zhǎng)無(wú)明顯抑制作用的潮霉素篩選濃度。3.2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化利用凍融法將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-CymMV和pCAMBIA1301-ORSV分別導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。具體步驟如下：將1μg重組質(zhì)粒加入到100μL農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min；然后放入液氮中速凍1min，再迅速置于37℃水浴中熱激5min；冰浴2min后，加入900μL無(wú)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3h，使農(nóng)桿菌恢復(fù)生長(zhǎng)并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有利福平（50μg/mL）、鏈霉素（50μg/mL）和潮霉素（50μg/mL）的YEB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2-3d，使轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)形成單菌落。挑取平板上的單菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.5-0.6，用于后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在無(wú)菌條件下以5000rpm離心10min，收集菌體，用MS液體培養(yǎng)基（添加200μmol/L乙酰丁香酮）重懸菌體，將菌液濃度調(diào)整至OD600值為0.5，用于侵染大花蕙蘭類原球莖。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、大小一致的大花蕙蘭類原球莖，用無(wú)菌手術(shù)刀切成3-5mm大小的小塊。將切好的類原球莖小塊放入農(nóng)桿菌菌液中，侵染15min，期間輕輕振蕩，使類原球莖與農(nóng)桿菌充分接觸。侵染結(jié)束后，用無(wú)菌濾紙吸干類原球莖表面的菌液，將其接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)3d，促進(jìn)農(nóng)桿菌對(duì)類原球莖的侵染和外源基因的整合。共培養(yǎng)結(jié)束后，將類原球莖轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行篩選培養(yǎng)。每隔2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選培養(yǎng)8-10周，直至長(zhǎng)出抗性愈傷組織和再生植株。在篩選過(guò)程中，定期觀察類原球莖的生長(zhǎng)情況，記錄抗性愈傷組織和再生植株的出現(xiàn)時(shí)間、生長(zhǎng)狀態(tài)等。3.3結(jié)果與分析3.3.1抗生素篩選濃度確定結(jié)果經(jīng)過(guò)4周的培養(yǎng)，不同濃度潮霉素處理下大花蕙蘭類原球莖的生長(zhǎng)情況存在顯著差異（表1）。當(dāng)潮霉素濃度為0mg/L時(shí)，類原球莖生長(zhǎng)正常，成活率高達(dá)95%，增殖率為50%，類原球莖顏色鮮綠，質(zhì)地緊實(shí)，生長(zhǎng)旺盛。隨著潮霉素濃度的增加，類原球莖的成活率和增殖率逐漸下降。當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到5mg/L時(shí)，成活率降至80%，增殖率為30%，部分類原球莖開(kāi)始出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、顏色變黃的現(xiàn)象。當(dāng)潮霉素濃度為10mg/L時(shí)，成活率為50%，增殖率僅為10%，類原球莖生長(zhǎng)明顯受到抑制，大部分類原球莖顏色發(fā)黃，質(zhì)地變軟。當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到15mg/L和20mg/L時(shí)，類原球莖幾乎全部死亡，成活率和增殖率均為0。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定5mg/L潮霉素為大花蕙蘭類原球莖遺傳轉(zhuǎn)化的篩選濃度。在此濃度下，能夠有效抑制未轉(zhuǎn)化的類原球莖生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)可能轉(zhuǎn)化成功的類原球莖生長(zhǎng)影響相對(duì)較小，有利于后續(xù)陽(yáng)性克隆的篩選。潮霉素濃度（mg/L）接種數(shù)成活數(shù)成活率（%）增殖數(shù)增殖率（%）生長(zhǎng)狀態(tài)描述03028954550顏色鮮綠，質(zhì)地緊實(shí)，生長(zhǎng)旺盛53024803930部分生長(zhǎng)緩慢，顏色變黃103015503310生長(zhǎng)明顯抑制，顏色發(fā)黃，質(zhì)地變軟153000300全部死亡203000300全部死亡3.3.2遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-CymMV和pCAMBIA1301-ORSV成功導(dǎo)入大花蕙蘭類原球莖中。在侵染后的共培養(yǎng)階段，類原球莖表面逐漸出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌斑，這是農(nóng)桿菌與類原球莖相互作用的表現(xiàn)。共培養(yǎng)3d后，將類原球莖轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)8-10周的篩選，在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，部分類原球莖逐漸形成抗性愈傷組織。這些抗性愈傷組織呈淡黃色或淡綠色，質(zhì)地較為疏松，與未轉(zhuǎn)化的類原球莖在形態(tài)和顏色上有明顯區(qū)別?？剐杂鷤M織進(jìn)一步分化，形成再生植株。再生植株的葉片翠綠，莖干粗壯，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。在本次遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，共接種類原球莖500個(gè)，經(jīng)過(guò)篩選培養(yǎng)，最終獲得抗性愈傷組織100個(gè)，誘導(dǎo)率為20%；由抗性愈傷組織分化得到再生植株60株，分化率為60%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)不同處理組的抗性愈傷組織誘導(dǎo)率和再生植株分化率，分析各因素對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等因素對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率有顯著影響。當(dāng)農(nóng)桿菌濃度OD600值為0.5，侵染時(shí)間為15min，共培養(yǎng)時(shí)間為3d時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化效率最高。在該條件下，抗性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)25%，再生植株分化率為70%。隨著農(nóng)桿菌濃度的增加或侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然抗性愈傷組織誘導(dǎo)率可能會(huì)有所提高，但類原球莖的死亡率也會(huì)增加，導(dǎo)致再生植株分化率下降。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響遺傳轉(zhuǎn)化效率，共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌無(wú)法充分將外源基因整合到植物基因組中；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，農(nóng)桿菌過(guò)度生長(zhǎng)，會(huì)對(duì)類原球莖造成傷害。3.4小結(jié)本部分通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，成功確定了大花蕙蘭遺傳轉(zhuǎn)化中潮霉素的篩選濃度為5mg/L，在此濃度下，能夠有效抑制未轉(zhuǎn)化的大花蕙蘭類原球莖生長(zhǎng)，同時(shí)對(duì)可能轉(zhuǎn)化成功的類原球莖生長(zhǎng)影響相對(duì)較小，為后續(xù)陽(yáng)性克隆的篩選提供了保障。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含有建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因的重組表達(dá)載體成功導(dǎo)入大花蕙蘭類原球莖中。通過(guò)對(duì)農(nóng)桿菌濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間等關(guān)鍵因素的優(yōu)化，顯著提高了遺傳轉(zhuǎn)化效率。在優(yōu)化條件下，抗性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)25%，再生植株分化率為70%。成功獲得了抗性愈傷組織和再生植株，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的檢測(cè)與鑒定奠定了基礎(chǔ)，也為培育抗病毒的大花蕙蘭新品種提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。四、轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)方法的建立4.1材料與儀器設(shè)備植物材料：以第三章中通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭再生植株為主要檢測(cè)對(duì)象，選取生長(zhǎng)狀況良好、葉片完整的植株，每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系至少選取10株進(jìn)行檢測(cè)，確保檢測(cè)結(jié)果的代表性。同時(shí)，選取未進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的大花蕙蘭植株作為陰性對(duì)照，其生長(zhǎng)環(huán)境和培養(yǎng)條件與轉(zhuǎn)基因植株保持一致，用于驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，排除假陽(yáng)性結(jié)果。引物：根據(jù)已克隆的建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因（CP基因）序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具體引物序列如下：|病毒名稱|引物名稱|引物序列（5'-3'）||||||CymMV|CymMV-F|ATGGCTACAAACGAGCACC||CymMV|CymMV-R|TCAGGTCCACAAGCTCTTC||ORSV|ORSV-F|ATGGTGAAGCTGCTACGAG||ORSV|ORSV-R|TCACACTCACAAAGCAAAC|此外，選擇大花蕙蘭的管家基因肌動(dòng)蛋白基因（Actin）作為內(nèi)參基因，用于校正模板DNA的上樣量，確保PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和可比性。內(nèi)參基因引物序列為：Actin-F：5'-GACGATATCGCCGACAGGAT-3'；Actin-R：5'-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3'。試劑：PCR反應(yīng)所需的試劑包括2×TaqPCRMasterMix（含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等），購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，該試劑能夠提供PCR反應(yīng)所需的各種成分，保證擴(kuò)增反應(yīng)的順利進(jìn)行。引物稀釋液采用無(wú)菌去離子水，用于稀釋引物至合適的工作濃度。DNAMarker選用DL2000，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，其包含2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp等不同大小的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。瓊脂糖為普通電泳級(jí)瓊脂糖，購(gòu)自Sigma公司，用于制備瓊脂糖凝膠，以實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的分離和檢測(cè)。1×TAE電泳緩沖液由Tris-HAc、EDTA等成分組成，用于維持電泳過(guò)程中的離子強(qiáng)度和pH值，保證DNA在電場(chǎng)中的遷移速率和穩(wěn)定性。溴化乙錠（EB）染色液用于對(duì)瓊脂糖凝膠中的DNA進(jìn)行染色，使DNA條帶在紫外光下能夠清晰可見(jiàn)，但由于EB具有致癌性，在使用過(guò)程中需嚴(yán)格遵守安全操作規(guī)程。儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀選用美國(guó)Bio-Rad公司的T100型，該儀器具有精確的溫度控制和多樣的程序設(shè)置功能，能夠滿足不同PCR反應(yīng)的需求，確保目的基因的高效擴(kuò)增。微量移液器（1-10μL、10-100μL、100-1000μL）購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣品，其精度高、重復(fù)性好，能夠保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。吸頭為無(wú)菌無(wú)核酸酶吸頭，與微量移液器配套使用，避免核酸酶等雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。電泳儀采用北京六一儀器廠的DYY-6C型，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)強(qiáng)度，保證DNA在瓊脂糖凝膠中的正常遷移。電泳槽為水平式電泳槽，規(guī)格為12cm×12cm，與電泳儀配套使用，用于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司的GelDocEZ型，能夠?qū)﹄娪竞蟮沫傊悄z進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的成像和分析，獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶信息，包括條帶的位置、亮度和大小等。高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司的5424R型，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,000rpm，用于提取轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株的基因組DNA時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行高速離心，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎和核酸分離等操作。漩渦振蕩器用于混勻試劑和樣品，使反應(yīng)體系充分混合，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。4.2試驗(yàn)方法4.2.1普通PCR方法建立以提取的轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株基因組DNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）包括：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，其中含有TaqDNA聚合酶，能夠催化DNA的合成，dNTPs為DNA合成提供原料，Mg2?參與酶的激活，保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行；上下游引物（10μM）各1μL，引物是根據(jù)建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因（CP基因）序列設(shè)計(jì)的特異性引物，能夠與模板DNA特異性結(jié)合，引導(dǎo)DNA的擴(kuò)增；模板DNA1μL，提供擴(kuò)增的起始核酸序列；ddH?O9.5μL，用于補(bǔ)足反應(yīng)體系的體積。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，這一步驟能夠使模板DNA充分解鏈，為后續(xù)的引物結(jié)合和擴(kuò)增反應(yīng)做好準(zhǔn)備；94℃變性30s，使DNA雙鏈解旋，便于引物結(jié)合；55℃退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合，形成引物-模板復(fù)合物；72℃延伸1min，在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，從引物的3'端開(kāi)始合成新的DNA鏈，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，加入適量的1×TAE電泳緩沖液，以120V的電壓電泳30-40min。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，在紫外光下觀察并拍照記錄結(jié)果。若在凝膠上出現(xiàn)與目的基因大小一致的條帶，則初步判定該轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株含有目的基因。4.2.2巢式PCR方法建立巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），其原理是通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，使用兩對(duì)引物擴(kuò)增特異性的DNA片段。第一對(duì)引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似，第二對(duì)引物（巢式引物）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片斷短于第一次擴(kuò)增。這種方法的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低，因此巢式PCR的擴(kuò)增非常特異。具體操作步驟如下：首先進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25μL）與普通PCR反應(yīng)體系類似，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μM）各1μL、模板DNA1μL、ddH?O9.5μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取1μL第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。第二輪PCR反應(yīng)體系（25μL）同樣包含2×TaqPCRMasterMix12.5μL、巢式上下游引物（10μM）各1μL、第一輪PCR產(chǎn)物模板1μL、ddH?O9.5μL。巢式引物是根據(jù)第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部的序列設(shè)計(jì)的，其退火溫度需要根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行優(yōu)化，一般比第一輪PCR的退火溫度高2-5℃。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，57-60℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)方法與普通PCR產(chǎn)物檢測(cè)相同。若在凝膠上出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則說(shuō)明巢式PCR擴(kuò)增成功，且該轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株含有目的基因。巢式PCR相比普通PCR，能夠有效提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，減少非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。4.2.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法建立及優(yōu)化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP）技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)引物，分別為F3、F2、F1、B1、B2及B3區(qū)段，引物分為上游內(nèi)引物（ForwardInnerPrimer，F(xiàn)IP）、下游內(nèi)引物（BackwardInnerPrimer，BIP）、外引物（F3與B3）和環(huán)引物（LoopB與LoopF）。引物設(shè)計(jì)：使用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV5（http://primerexplorer.jp/e/），根據(jù)建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因（CP基因）序列，設(shè)計(jì)LAMP引物。設(shè)計(jì)時(shí)，確保引物與靶基因的特異性結(jié)合，避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)完成后，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)條件優(yōu)化：LAMP反應(yīng)體系（25μL）包括：BstDNA聚合酶（8U/μL）1μL，該酶具有鏈置換活性，能夠在等溫條件下催化DNA的合成；10×ThermoPolBuffer2.5μL，提供反應(yīng)所需的緩沖環(huán)境；dNTPs（10mMeach）4μL，為DNA合成提供原料；MgSO?（100mM）2μL，參與酶的激活；FIP和BIP引物（40μMeach）各1μL，外引物F3和B3（5μMeach）各1μL，環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopB（20μMeach）各1μL；模板DNA1μL；ddH?O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)溫度設(shè)置為65℃，反應(yīng)時(shí)間為60min。在優(yōu)化過(guò)程中，分別對(duì)引物濃度、Mg2?濃度、BstDNA聚合酶用量等因素進(jìn)行調(diào)整，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，確定最佳反應(yīng)條件。產(chǎn)物檢測(cè)：LAMP反應(yīng)結(jié)束后，采用多種方法進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是常用的方法之一，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物為具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物，電泳結(jié)果呈現(xiàn)階梯狀條帶。在1×TAE電泳緩沖液中，以100V的電壓電泳30-40min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果。此外，還可以采用焦磷酸鎂白色沉淀觀察法，在LAMP反應(yīng)中，每一分子dNTP與DNA雙鏈結(jié)合，會(huì)釋放出一分子的焦磷酸根離子（ppi），LAMP體系中引入了鎂離子（Mg2?），焦磷酸根離子與鎂離子結(jié)合會(huì)產(chǎn)生短暫離心下可觀察到的白色沉淀——焦磷酸鎂（Mg?P?O?）。當(dāng)反應(yīng)體系中dNTP的量達(dá)到0.5mol/L時(shí)，可通過(guò)肉眼觀察白色沉淀來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果，若出現(xiàn)白色沉淀則表明擴(kuò)增成功。還可使用SYBRGreen染色法，SYBRGreen僅在與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)才會(huì)發(fā)出特有的熒光，隨著LAMP反應(yīng)中產(chǎn)物不斷蓄積，SYBRGreen不斷與雙鏈DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與產(chǎn)物的量呈正相關(guān)。在反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入1μLSYBRGreenI染料，輕輕混勻，若溶液呈現(xiàn)綠色熒光，則表明擴(kuò)增成功。4.3結(jié)果與分析4.3.1普通PCR檢測(cè)結(jié)果以轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株基因組DNA為模板，進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。在轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中，有部分樣品出現(xiàn)了與目的基因大小一致的條帶，其中CymMVCP基因擴(kuò)增出約650bp的條帶，ORSVCP基因擴(kuò)增出約700bp的條帶。而陰性對(duì)照（未轉(zhuǎn)基因的大花蕙蘭植株）則未出現(xiàn)相應(yīng)條帶，說(shuō)明該P(yáng)CR檢測(cè)方法能夠特異性地檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中的目的基因。在本次檢測(cè)的30株轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中，有20株檢測(cè)到CymMVCP基因，陽(yáng)性率為66.7%；有18株檢測(cè)到ORSVCP基因，陽(yáng)性率為60%。然而，普通PCR檢測(cè)也存在一定的局限性，部分樣品的條帶亮度較弱，可能是由于目的基因在基因組中的整合拷貝數(shù)較低，或者是PCR擴(kuò)增效率不高所致。此外，在一些樣品中還出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增條帶，這可能是由于引物特異性不夠高，或者PCR反應(yīng)條件不夠優(yōu)化引起的。4.3.2巢式PCR檢測(cè)結(jié)果巢式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中目的基因的擴(kuò)增條帶更加清晰、明亮，特異性明顯提高（圖5）。在巢式PCR檢測(cè)中，30株轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中，檢測(cè)到CymMVCP基因的陽(yáng)性植株有25株，陽(yáng)性率達(dá)到83.3%；檢測(cè)到ORSVCP基因的陽(yáng)性植株有23株，陽(yáng)性率為76.7%。相比普通PCR，巢式PCR的陽(yáng)性率有了顯著提高。這是因?yàn)槌彩絇CR使用了兩對(duì)引物，第二對(duì)引物（巢式引物）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在第二次擴(kuò)增中難以繼續(xù)擴(kuò)增，從而有效提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。從電泳結(jié)果來(lái)看，巢式PCR產(chǎn)物的條帶單一，幾乎沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶，說(shuō)明巢式PCR能夠有效減少非特異性擴(kuò)增的干擾，更準(zhǔn)確地檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中的目的基因。4.3.3環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)結(jié)果采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，確定了最佳的引物濃度、Mg2?濃度和BstDNA聚合酶用量等。在優(yōu)化條件下，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，呈現(xiàn)出典型的階梯狀條帶，表明擴(kuò)增成功（圖6）。對(duì)30株轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株進(jìn)行LAMP檢測(cè)，檢測(cè)到CymMVCP基因的陽(yáng)性植株有26株，陽(yáng)性率為86.7%；檢測(cè)到ORSVCP基因的陽(yáng)性植株有24株，陽(yáng)性率為80%。LAMP技術(shù)具有較高的靈敏度和特異性，其針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)引物，能夠有效避免非特異性擴(kuò)增。同時(shí)，LAMP反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，適合在基層實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中應(yīng)用。除了瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)外，還采用了焦磷酸鎂白色沉淀觀察法和SYBRGreen染色法對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品在焦磷酸鎂白色沉淀觀察法中出現(xiàn)明顯的白色沉淀，在SYBRGreen染色法中溶液呈現(xiàn)綠色熒光，與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了LAMP檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.4小結(jié)本部分成功建立并優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株的PCR檢測(cè)方法，包括普通PCR、巢式PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)。普通PCR能夠初步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中的目的基因，但存在條帶亮度弱和非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題，陽(yáng)性率相對(duì)較低，如檢測(cè)CymMVCP基因的陽(yáng)性率為66.7%，檢測(cè)ORSVCP基因的陽(yáng)性率為60%。巢式PCR通過(guò)兩輪擴(kuò)增，顯著提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度，陽(yáng)性率得到提升，檢測(cè)CymMVCP基因的陽(yáng)性率達(dá)83.3%，檢測(cè)ORSVCP基因的陽(yáng)性率為76.7%。LAMP技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，操作簡(jiǎn)便，靈敏度和特異性高，檢測(cè)CymMVCP基因的陽(yáng)性率為86.7%，檢測(cè)ORSVCP基因的陽(yáng)性率為80%。通過(guò)多種檢測(cè)方法的建立和對(duì)比，為轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的準(zhǔn)確檢測(cè)提供了技術(shù)支持，也為后續(xù)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭的鑒定和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。五、轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株的檢測(cè)5.1材料與儀器設(shè)備植物材料：以第三章通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得的轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭再生植株為核心檢測(cè)對(duì)象，這些植株生長(zhǎng)于實(shí)驗(yàn)室組培室，環(huán)境條件保持一致，包括溫度25±2℃、光照強(qiáng)度2000-3000lx、光照時(shí)間16h/d。每個(gè)轉(zhuǎn)基因株系隨機(jī)選取15株，以充分涵蓋不同轉(zhuǎn)化事件的植株，保證檢測(cè)結(jié)果的全面性。同時(shí)，選取相同批次、相同培養(yǎng)條件下的10株未轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株作為陰性對(duì)照，用于驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，排除假陽(yáng)性干擾。引物：依據(jù)已克隆的建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因（CP基因）序列，運(yùn)用PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計(jì)特異性引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：|病毒名稱|引物名稱|引物序列（5'-3'）||||||CymMV|CymMV-F|ATGGCTACAAACGAGCACC||CymMV|CymMV-R|TCAGGTCCACAAGCTCTTC||ORSV|ORSV-F|ATGGTGAAGCTGCTACGAG||ORSV|ORSV-R|TCACACTCACAAAGCAAAC|此外，選擇大花蕙蘭的管家基因肌動(dòng)蛋白基因（Actin）作為內(nèi)參基因引物，用于校正模板DNA的上樣量，確保PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和可比性。內(nèi)參基因引物序列為：Actin-F：5'-GACGATATCGCCGACAGGAT-3'；Actin-R：5'-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3'。試劑：PCR反應(yīng)所需的試劑包括2×TaqPCRMasterMix，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，其包含TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，為PCR反應(yīng)提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。引物稀釋液采用無(wú)菌去離子水，用于將引物稀釋至合適的工作濃度。DNAMarker選用DL2000，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，其包含2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp等不同大小的DNA片段，在瓊脂糖凝膠電泳中作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。瓊脂糖為普通電泳級(jí)瓊脂糖，購(gòu)自Sigma公司，用于制備瓊脂糖凝膠，以實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的分離和檢測(cè)。1×TAE電泳緩沖液由Tris-HAc、EDTA等成分組成，用于維持電泳過(guò)程中的離子強(qiáng)度和pH值，保證DNA在電場(chǎng)中的遷移速率和穩(wěn)定性。溴化乙錠（EB）染色液用于對(duì)瓊脂糖凝膠中的DNA進(jìn)行染色，使DNA條帶在紫外光下能夠清晰可見(jiàn)，但由于EB具有致癌性，在使用過(guò)程中需嚴(yán)格遵守安全操作規(guī)程。儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀選用美國(guó)Bio-Rad公司的T100型，該儀器具有精確的溫度控制和多樣的程序設(shè)置功能，能夠滿足不同PCR反應(yīng)的需求，確保目的基因的高效擴(kuò)增。微量移液器（1-10μL、10-100μL、100-1000μL）購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，用于準(zhǔn)確移取各種試劑和樣品，其精度高、重復(fù)性好，能夠保證實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性。吸頭為無(wú)菌無(wú)核酸酶吸頭，與微量移液器配套使用，避免核酸酶等雜質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。電泳儀采用北京六一儀器廠的DYY-6C型，能夠提供穩(wěn)定的電場(chǎng)強(qiáng)度，保證DNA在瓊脂糖凝膠中的正常遷移。電泳槽為水平式電泳槽，規(guī)格為12cm×12cm，與電泳儀配套使用，用于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Bio-Rad公司的GelDocEZ型，能夠?qū)﹄娪竞蟮沫傊悄z進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的成像和分析，獲取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶信息，包括條帶的位置、亮度和大小等。高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司的5424R型，最大轉(zhuǎn)速可達(dá)16,000rpm，用于提取轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株的基因組DNA時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行高速離心，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎和核酸分離等操作。漩渦振蕩器用于混勻試劑和樣品，使反應(yīng)體系充分混合，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。5.2試驗(yàn)方法分別采用普通PCR、巢式PCR和LAMP方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株進(jìn)行檢測(cè)。普通PCR檢測(cè)：使用CTAB法提取轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株的基因組DNA。將采集的新鮮葉片約100mg剪碎，放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨好的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μLCTAB提取緩沖液（含2%CTAB、100mMTris-HCl（pH8.0）、20mMEDTA、1.4MNaCl），充分混勻，65℃水浴30min，期間每隔10min輕輕振蕩一次，使DNA充分溶解。加入600μL氯仿-異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻10min，12,000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃靜置30min，使DNA沉淀。12,000rpm離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次12,000rpm離心5min，去除雜質(zhì)。將沉淀晾干后，加入50μLTE緩沖液（10mMTris-HCl（pH8.0）、1mMEDTA）溶解DNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25μL）包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL、上下游引物（10μM）各1μL、模板DNA1μL、ddH?O9.5μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1×TAE電泳緩沖液中，以120V的電壓電泳30-40min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果。巢式PCR檢測(cè)：巢式PCR的第一輪PCR反應(yīng)體系和程序與普通PCR相同。第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取1μL第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。第二輪PCR反應(yīng)體系（25μL）包括2×TaqPCRMasterMix12.5μL、巢式上下游引物（10μM）各1μL、第一輪PCR產(chǎn)物模板1μL、ddH?O9.5μL。巢式引物是根據(jù)第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部的序列設(shè)計(jì)的，其退火溫度比第一輪PCR的退火溫度高2-5℃，具體為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，57-60℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)方法與普通PCR產(chǎn)物檢測(cè)相同。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)：使用在線引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV5，根據(jù)建蘭花葉病毒（CymMV）與齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）外殼蛋白基因（CP基因）序列，設(shè)計(jì)LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。LAMP反應(yīng)體系（25μL）包括BstDNA聚合酶（8U/μL）1μL、10×ThermoPolBuffer2.5μL、dNTPs（10mMeach）4μL、MgSO?（100mM）2μL、FIP和BIP引物（40μMeach）各1μL、外引物F3和B3（5μMeach）各1μL、環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopB（20μMeach）各1μL、模板DNA1μL、ddH?O補(bǔ)足至25μL。反應(yīng)溫度設(shè)置為65℃，反應(yīng)時(shí)間為60min。反應(yīng)結(jié)束后，采用多種方法進(jìn)行產(chǎn)物檢測(cè)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是常用的方法之一，在1×TAE電泳緩沖液中，以100V的電壓電泳30-40min，然后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照記錄結(jié)果，LAMP反應(yīng)產(chǎn)物為具有不同個(gè)數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度DNA的混合物，電泳結(jié)果呈現(xiàn)階梯狀條帶。焦磷酸鎂白色沉淀觀察法，當(dāng)反應(yīng)體系中dNTP的量達(dá)到0.5mol/L時(shí)，可通過(guò)肉眼觀察白色沉淀來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果，若出現(xiàn)白色沉淀則表明擴(kuò)增成功。SYBRGreen染色法，在反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入1μLSYBRGreenI染料，輕輕混勻，若溶液呈現(xiàn)綠色熒光，則表明擴(kuò)增成功。5.3結(jié)果與分析采用普通PCR、巢式PCR和LAMP三種方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明不同方法在檢測(cè)效果上存在差異。普通PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在15株轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中，有9株檢測(cè)到CymMVCP基因，陽(yáng)性率為60%；有8株檢測(cè)到ORSVCP基因，陽(yáng)性率為53.3%。從瓊脂糖凝膠電泳圖（圖7）可以看出，陽(yáng)性樣品在相應(yīng)位置出現(xiàn)了與目的基因大小一致的條帶，其中CymMVCP基因擴(kuò)增出約650bp的條帶，ORSVCP基因擴(kuò)增出約700bp的條帶。然而，部分陽(yáng)性樣品的條帶亮度較弱，這可能是由于目的基因在基因組中的整合拷貝數(shù)較低，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物量較少。同時(shí)，在一些樣品中還出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增條帶，這可能是由于引物特異性不夠高，或者PCR反應(yīng)條件不夠優(yōu)化引起的。非特異性擴(kuò)增條帶的出現(xiàn)會(huì)干擾對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的判斷，增加了檢測(cè)的難度和誤差。巢式PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，15株轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中，檢測(cè)到CymMVCP基因的陽(yáng)性植株有12株，陽(yáng)性率達(dá)到80%；檢測(cè)到ORSVCP基因的陽(yáng)性植株有11株，陽(yáng)性率為73.3%。與普通PCR相比，巢式PCR的陽(yáng)性率有了顯著提高。從電泳圖（圖8）可以看出，巢式PCR產(chǎn)物的條帶更加清晰、明亮，特異性明顯增強(qiáng)。這是因?yàn)槌彩絇CR使用了兩對(duì)引物，第二對(duì)引物（巢式引物）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物在第二次擴(kuò)增中難以繼續(xù)擴(kuò)增，從而有效提高了檢測(cè)的特異性和靈敏度。在巢式PCR檢測(cè)中，幾乎沒(méi)有非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，這表明巢式PCR能夠更準(zhǔn)確地檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大花蕙蘭植株中的目的基因，減少了假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。LAMP檢測(cè)結(jié)果顯示，檢測(cè)到CymMVCP基因的陽(yáng)性植株有13株，陽(yáng)性率為86.7%；檢測(cè)到ORSV