第十單元專題突破10綜合PCR的基因工程問題選擇題1～2題，每小題7分，3～8題，每小題8分，共62分。一、選擇題1．(2024·武漢期末)基因工程中，通過PCR可以特異性地快速擴增目的基因，PCR產物常采用瓊脂糖凝膠電泳實驗進行鑒定。下列有關該實驗的敘述，正確的是()A．在同一電場作用下，DNA片段越長遷移速率越快B．DNA分子在凝膠中的遷移速率與凝膠的濃度無關C．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紅外燈下被檢測出來D．如果引物特異性不強，擴增出來的條帶可能不止一條2．(2025·武漢一模)油菜的綠葉對黃化葉為顯性。與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發(fā)生了改變，從而出現一個限制酶B的酶切位點。為鑒定某綠葉油菜的基因型，提取其DNA進行了PCR和電泳。下列敘述正確的是()A．需設計能與目的基因結合的雙鏈DNA作為PCR引物B．應在PCR擴增體系中添加Mg2＋，以激活DNA聚合酶C．可適當降低復性的溫度，以減少PCR中非特異性條帶的產生D．用限制酶B作用后進行電泳，若有2條電泳條帶可判斷為雜合子3．(2024·廈門質檢)如圖表示PCR過程中某個階段反應體系的情況，①②③④表示相關物質，L、R表示方向。下列敘述正確的是()A．②鏈從L到R的方向為3′→5′，①②鏈均可作為子鏈合成的模板B．PCR過程需要通過解旋酶斷開氫鍵，且為邊解旋邊復制C．以1個DNA為模板經3次循環(huán)需消耗8個引物③D．物質③的5′端添加了某序列，至少需經2次循環(huán)才可獲得該序列的雙鏈產物4．(2024·重慶模擬)不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產生大量單鏈DNA(ssDNA)的方法，如圖所示。不對稱PCR中加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物，兩者的比例通常為1∶100。PCR反應最初的若干次循環(huán)中，其擴增產物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，但當限制性引物消耗完后，就會產生大量的ssDNA。下列相關說法錯誤的是()A．用不對稱PCR方法擴增目的基因時，不需要知道基因的全部序列B．進行最初若干次循環(huán)的目的是增加模板DNA的量C．最后大量獲得的ssDNA與圖中乙鏈的堿基序列一致D．因為雙鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離5.反向PCR是一種通過已知序列設計引物對未知序列(圖中L、R)進行擴增的技術，其過程如圖所示。下列相關敘述不正確的是()A．過程①用同一種限制酶對未知序列兩端進行切割B．過程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二酯鍵C．過程③PCR體系需要添加耐高溫的DNA聚合酶和解旋酶D．該技術可檢測T－DNA整合到植物染色體DNA的位置6．(2024·無錫模擬)重疊延伸PCR可實現定點基因誘變，其操作過程如圖所示(凸起處代表突變位點)。下列說法正確的是()A．過程①需要把兩對引物同時加入一個擴增體系以提高擴增效率B．過程①需要2輪PCR才能得到圖中所示PCR產物C．過程②的產物都可以完成延伸過程D．若過程④得到16個突變基因，則需要消耗15個通用引物RP27.(2024·安順調研)熒光定量PCR技術可定量檢測樣本中DNA含量，用于病毒檢測。其原理是在PCR反應體系中加入引物的同時，加入與某條模板鏈互補的熒光探針。當耐高溫的DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會水解探針，使熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號，即每擴增一次，就有一個熒光分子生成(如圖)。通過實時檢測熒光信號強度，可得Ct值(熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環(huán)次數)。下列相關敘述錯誤的是()A．PCR每個循環(huán)包括變性、復性(引物和模板結合)、延伸3個階段B．耐高溫的DNA聚合酶在該反應中的作用是形成磷酸二酯鍵和水解磷酸二酯鍵C．最終監(jiān)測的熒光強度與起始時反應管內樣本DNA的含量呈正相關D．Ct值越大表示被檢測樣本中病毒數目越多，患者危險性更高8．(2025·成都期末)某科研小組采用PCR技術構建了紅色熒光蛋白基因(dsred2)和α淀粉酶基因(amy)的dsred2－amy融合基因，其過程如圖所示，其中引物②和引物③中部分序列(灰色區(qū)域)可互補配對。下列說法錯誤的是()A．利用PCR技術擴增基因時不需要解旋酶來打開DNA雙鏈B．不能在同一反應體系中進行dsred2基因和amy基因的擴增C．dsred2基因和amy基因混合后只能得到一種類型的雜交鏈D．雜交鏈延伸得到dsred2－amy融合基因的過程不需要加引物二、非選擇題9．(12分)(2025·長沙模擬)水稻穗粒數可影響水稻產量。農桿菌Ti質粒的T－DNA可以轉移并隨機插入野生型水稻基因組中(可在基因組單一位點插入也可以同時插入多個位點)，導致被插入的基因功能喪失，從而得到一系列水稻突變體。研究者從中篩選得到一株穗粒數異常突變體，為確定T－DNA插入植物細胞的染色體位置，可根據T－DNA序列，擴增其兩側未知序列比對，從而確定插入的染色體。(1)圖1所示序列使用限制酶酶切后，將所得DNA使用__________酶連成環(huán)狀(如圖2)，再設計引物進行PCR擴增，其中復性過程的作用是____________________________。(2)請根據圖1的T－DNA的一條鏈的堿基序列，選出PCR中使用的引物序列是______和______(填序號)。T－DNA序列引物序列5′－AACTATGCGC……CGTAGCCTAT－3′①5′－GCGCATAGTT－3′②5′－ATAGGCTACG－3′③5′－CGTAGCCTAT－3′④5′－AACTATGCGC－3′(3)由圖2中環(huán)狀DNA至少經過______輪循環(huán)才能得到圖示鏈狀PCR產物(如圖3)。(4)經過與野生型水稻基因組序列比對，確定T－DNA插入2號染色體上的B基因中。研究發(fā)現，該突變體產量明顯低于野生型，據此推測B基因可______(填“促進”或“抑制”)水稻穗粒的形成，從而控制高產性狀。10．(14分)(2025·安慶模擬)巢式PCR是一種特殊的聚合酶鏈式反應，使用兩組不同的引物實現對目標DNA片段的擴增。第一組外引物大小為25bp，復性溫度較高(68℃)，擴增后得到中間產物；第二組內引物大小為17bp，復性溫度較低(46℃)，內引物的結合部位在中間產物內部。具體過程如圖一所示，回答下列問題：(1)巢式PCR反應體系中除模板、引物、Mg2＋外，還應加入____________________________(答出兩點即可)等。(2)巢式PCR時，復性溫度與引物長度呈________(填“正相關”或“負相關”)。若使用外引物進行第一次PCR擴增時產生了錯誤片段，則使用內引物進行第二次PCR擴增時，完成配對并擴增的概率會__________。由此可知，巢式PCR相較于常規(guī)PCR具有的優(yōu)點是________________________________________________________________________。(3)家畜胚胎的性別鑒定技術對畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要意義?？蒲腥藛T利用多重巢式PCR技術同時擴增奶牛Y染色體上的雄性決定基因(SRY)和常染色體上的酪蛋白基因(CSN1S1)，進行早期胚胎性別鑒定和胚胎移植，獲得高產奶牛。實驗目的方法步驟要點囊胚樣品DNA提取選取滋養(yǎng)層細胞提取DNAPCR引物的設計和合成根據牛的SRY和CSN1S1基因序列設計并合成a.______對引物PCR擴增預變性→變性→復性→延伸鑒定分析采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定，確定胚胎性別b._______________對受體奶牛注射前列腺素胚胎移植將符合要求的胚胎移植到受體奶牛的子宮內①請將表格內容補充完整：a是____________；b是________________。②巢式PCR產物鑒定結果如圖二所示，1～5號為取自不同胚胎的DNA樣品，其中符合要求的胚胎是__________。11．(12分)(2023·江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術構建質粒，如圖1所示。請回答下列問題：(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有______________，擴增程序中最主要的不同是________________。(2)將PCR產物片段與線性質粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質粒，直接用于轉化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質粒構建過程相比，無需使用的酶主要有________________________________________________________________________。(3)轉化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有________。A．稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落B．抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C．抗性平板上常常會出現大量雜菌形成的菌落D．抗性平板上長出的單菌落不需要進一步劃線純化(4)為了驗證平板上菌落中的質粒是否符合設計，用不同菌落的質粒為模板、用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，質粒P1～P4的擴增產物電泳結果如圖2。根據圖中結果判斷，可以舍棄的質粒有________。(5)對于PCR產物電泳結果符合預期的質粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。答案精析1．D[在同一電場作用下，DNA片段越長遷移速率越慢，A錯誤；凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移速率，B錯誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子經過核酸染料染色后可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，C錯誤；如果引物特異性不強，引物可能會與目的基因以外的其他的DNA片段結合，擴增出來的條帶可能不止一條，D正確。]2．B[引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，A錯誤；PCR過程中用到了緩沖液，緩沖液中一般要添加Mg2＋用于激活DNA聚合酶，B正確；復性溫度過低會導致引物與模板鏈的結合不牢固，會增加PCR中非特異性條帶，C錯誤；與綠葉基因相比，黃化葉基因有一個堿基對發(fā)生了改變，從而出現一個限制酶B的酶切位點，用限制酶B作用后進行電泳，若有3條電泳條帶可判斷為雜合子，D錯誤。]3．D[根據DNA分子中兩條鏈的反向平行關系及圖示可判斷，②鏈從L到R的方向為5′→3′，A錯誤；PCR過程是通過高溫將雙鏈DNA之間的氫鍵斷開，并且是全部解旋之后才進行復制，B錯誤；以1個DNA為模板經3次循環(huán)產生的DNA分子數目為23＝8，需消耗7個引物③，C錯誤。]4．C[不對稱PCR中加入的一對引物中含量較多的被稱為非限制性引物，非限制性引物與乙鏈結合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，C錯誤。]5．C[過程③即PCR擴增，PCR技術中DNA解旋是在高溫下實現的，不需要加入解旋酶，C錯誤。]6．D[兩種突變引物能互補配對，因此過程①必須分兩個反應系統(tǒng)進行，A錯誤；過程①至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產物，B錯誤；過程②獲得的產物不都可以完成延伸過程，因為子鏈只能從引物的3′端開始延伸，C錯誤；若過程④得到16個突變基因，由于模板中不含有通用引物，則產生16個突變基因共需要消耗16×2－2＝30(個)通用引物，而需要通用引物RP2的數量為30÷2＝15(個)，D正確。]7．D[Ct值越小，說明所需循環(huán)的次數越少，被檢測樣本中病毒數目越多，D錯誤。]8．C[利用PCR技術擴增基因時，高溫變性使DNA雙鏈解旋，不需要解旋酶來打開DNA雙鏈，A正確；引物②和引物③中部分序列可互補配對，引物之間的結合會干擾引物和模板鏈的結合，從而影響PCR過程，因此不能在同一個反應體系中進行dsred2基因和amy基因的擴增，B正確；dsred2基因和amy基因混合可以得到兩種類型的雜交鏈，C錯誤；雜交鏈延伸得到dsred2－amy融合基因的過程中，不需要加入引物，兩條母鏈的起始位置的堿基序列即為引物，可以作為子鏈合成的引物，D正確。]9．(1)DNA連接使引物通過堿基互補配對結合到模板鏈上(2)①③(3)3(4)促進解析(2)T－DNA序列引物序列5′—AACTATGCGC……CGTAGCCTAT—3′3′—TTGATACGCG……GCATCGGATA—5′5′—GCGCATAGTT—3′5′－CGTAGCCTAT－3′據上述分析，PCR中使用的引物序列是①和③。(4)該突變體產量明顯低于野生型，而突變體內B基因由于插入了T－DNA功能喪失，據此推測B基因促進水稻穗粒的形成。10．(1)緩沖液、耐高溫的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)、4種脫氧核苷酸(或dNTP)(2)正相關下降特異性強、靈敏度高(3)①4同期發(fā)情②1、2、4解析(2)PCR過程包括高溫變性、低溫復性、中溫延伸，巢式PCR時，復性溫度與引物長度呈正相關。巢式PCR時，若使用外引物進行第一次PCR擴增時產生了錯誤片段，再使用內引物擴增，在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率會下降，因此，相比于常規(guī)PCR而言，巢式PCR特異性強、靈敏度高。(3)①本實驗用巢式PCR技術，用的是兩輪PCR，因此擴增一種基因片段則需要設計2對引物，而擴增2種基因片段則需要設計4對引物。在胚胎移植前需要對受體奶牛進行同期發(fā)情處理，便于移植。②題中利用多重巢式PCR技術同時擴增Y染色體上的雄性決定基因(SRY)和常染色體上的酪蛋白基因(CSNIS1)并進行電泳，雌性個體沒有SRY，只有一條帶，雄性有兩條帶，因此1、2、4是雌性，3、5是雄性，故符合要求的胚胎是1、2、4。11．(1)模板、引物引物的設計(2)限制酶、DNA連接酶(3)ABC(4)P3、P4(5)電泳只能檢測DNA分子的大小(長度)，無法確定待檢測DNA分子的堿基序列解析(1)PCR反應進行的條件：引物、酶、4種脫氧核苷