自然殺傷（NaturalKiller,NK）細胞作為固有免疫的核心效應細胞，在腫瘤免疫監(jiān)視、抗病毒感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。規(guī)范化的NK細胞培養(yǎng)流程是保障細胞質(zhì)量、實現(xiàn)其基礎研究與臨床轉(zhuǎn)化應用的前提。本標準操作流程（SOP）結合細胞生物學原理與實踐經(jīng)驗，系統(tǒng)闡述NK細胞的分離、培養(yǎng)、擴增及鑒定方法，為科研及臨床機構提供可重復、標準化的操作指引。一、目的建立NK細胞體外分離、培養(yǎng)、擴增及鑒定的標準化流程，確保細胞活性、純度及功能的穩(wěn)定性，滿足基礎研究（如免疫機制探索）或臨床轉(zhuǎn)化（如細胞治療產(chǎn)品制備）的質(zhì)量要求。二、適用范圍本SOP適用于生物醫(yī)學實驗室、細胞治療研發(fā)機構及臨床轉(zhuǎn)化平臺開展外周血、臍帶血或干細胞來源的NK細胞體外培養(yǎng)與擴增操作。三、操作前準備（一）試劑與耗材準備1.培養(yǎng)基：選擇無血清或低血清的NK細胞專用培養(yǎng)基（如NKMACS培養(yǎng)基、或自配含必需氨基酸、維生素、葡萄糖的基礎培養(yǎng)基），添加細胞因子（如IL-2、IL-15、IL-12等，濃度根據(jù)實驗方案優(yōu)化）。2.分離試劑：淋巴細胞分離液（密度梯度離心法分離PBMC）、肝素鈉（外周血抗凝，濃度以維持血液液態(tài)且不影響細胞活性為宜）。3.培養(yǎng)耗材：無菌培養(yǎng)瓶/板（根據(jù)細胞規(guī)模選擇規(guī)格）、移液管、離心管、注射器（過濾細胞懸液時使用）、流式管（鑒定用）。4.功能試劑：流式抗體（CD56-PE、CD3-FITC等表型鑒定抗體）、細胞毒性檢測試劑（如Calcein-AM、LDH檢測試劑盒）、ELISA細胞因子檢測試劑盒（IFN-γ、TNF-α等）。（二）儀器設備準備1.培養(yǎng)設備：CO?培養(yǎng)箱（設置溫度37℃、CO?濃度5%、濕度飽和，使用前驗證參數(shù)穩(wěn)定性）。2.分離與檢測設備：低速離心機（離心力≤400g，避免細胞損傷）、生物安全柜（操作前紫外消毒30分鐘，風速驗證合格）、倒置顯微鏡（觀察細胞形態(tài)）、流式細胞儀（表型與功能鑒定）、超低溫冰箱（-80℃保存細胞或試劑）。（三）環(huán)境與人員準備1.環(huán)境消毒：實驗前用75%乙醇擦拭生物安全柜臺面、離心機轉(zhuǎn)子及顯微鏡載物臺；實驗室開啟紫外線消毒1小時（操作前關閉）。2.人員防護：操作人員穿戴無菌實驗服、口罩、帽子、手套，操作前用洗手液或75%乙醇消毒雙手，進入生物安全柜前通過風淋裝置去除浮塵。四、NK細胞分離（以外周血PBMC為例）（一）樣本處理采集外周血（肝素抗凝），室溫靜置30分鐘（避免劇烈振蕩），待血液自然分層后，吸取上層血漿（可凍存?zhèn)溆茫?，剩余血液與等體積PBS（含2%FBS）混合，制備細胞懸液。（二）密度梯度離心將淋巴細胞分離液（密度1.077g/ml）緩慢加入離心管底部（體積為血液-PBS混合液的1/2），再沿管壁緩慢疊加細胞懸液（保持液層分明）。設置離心機參數(shù)：300g，室溫離心20分鐘（無剎車，避免細胞層紊亂）。（三）PBMC收集與洗滌離心后，管內(nèi)分為四層：上層血漿、中間白膜層（PBMC）、分離液層、紅細胞層。用移液器吸取白膜層（PBMC），轉(zhuǎn)移至新離心管，加入5倍體積的PBS（含2%FBS），輕柔吹打混勻，300g離心10分鐘，棄上清。重復洗滌2次，最終用培養(yǎng)基重懸細胞。（四）細胞活力檢測取10μl細胞懸液與等體積臺盼藍染液混合，靜置3分鐘后鏡下計數(shù)?；罴毎蕬?0%（死細胞呈藍色，活細胞透明）；若活細胞率＜85%，需重新分離或優(yōu)化操作。五、NK細胞培養(yǎng)與擴增（一）初始培養(yǎng)調(diào)整細胞濃度至1×10?cells/ml（或根據(jù)培養(yǎng)體系優(yōu)化），接種于培養(yǎng)瓶/板，加入含細胞因子的培養(yǎng)基（如IL-2終濃度500U/ml、IL-15終濃度20ng/ml，濃度需預實驗驗證）。置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱，每日觀察細胞形態(tài)（倒置顯微鏡下，NK細胞初期為圓形，增殖后逐漸聚集成團）。（二）半量換液（第2-3天）培養(yǎng)24-48小時后，細胞開始增殖，培養(yǎng)基出現(xiàn)輕微渾濁。輕柔加入新鮮培養(yǎng)基（含同等濃度細胞因子），換液體積為原體積的1/2（避免過度稀釋細胞），繼續(xù)培養(yǎng)。（三）擴增培養(yǎng)（第4-14天）當細胞密度達到5×10?cells/ml（或顯微鏡下細胞聚集明顯），進行傳代或擴大培養(yǎng)：1.傳代：將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，300g離心10分鐘，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，按1:2或1:3比例接種于新培養(yǎng)容器（根據(jù)細胞生長速度調(diào)整）。2.飼養(yǎng)細胞輔助擴增（可選）：若需快速擴增，可添加輻照后的K562細胞（輻照劑量使細胞失去增殖能力但保留刺激活性），按NK細胞:飼養(yǎng)細胞=1:1的比例共培養(yǎng)，促進NK細胞增殖（飼養(yǎng)細胞需提前用絲裂霉素C或γ射線處理）。（四）培養(yǎng)終止培養(yǎng)7-14天后（根據(jù)細胞生長曲線），NK細胞數(shù)量可擴增____倍。此時收集細胞，進行表型與功能鑒定。六、NK細胞鑒定（一）表型鑒定（流式細胞術）1.取1×10?cells，加入流式管，300g離心5分鐘，棄上清。2.加入熒光標記的CD56-PE、CD3-FITC抗體（按說明書稀釋，避光孵育20分鐘，室溫）。3.加入2mlPBS洗滌，300g離心5分鐘，棄上清，加入300μlPBS重懸，上流式細胞儀檢測。4.分析結果：NK細胞表型為CD56?CD3?，純度應≥80%（科研級）或≥90%（臨床級）。（二）功能鑒定（細胞毒性實驗）1.靶細胞標記：取腫瘤細胞（如K562），用Calcein-AM染液標記（37℃孵育30分鐘，PBS洗滌2次），調(diào)整濃度至1×10?cells/ml。2.效靶共培養(yǎng)：按效靶比（NK細胞:靶細胞）1:1、5:1、10:1接種于96孔板，37℃、5%CO?培養(yǎng)4小時。3.檢測細胞毒性：離心收集上清，用LDH檢測試劑盒測定靶細胞裂解率（或用AnnexinV/PI雙染檢測凋亡率），計算殺傷率（殺傷率=（實驗組OD-自然釋放組OD）/（最大釋放組OD-自然釋放組OD）×100%）。（三）細胞因子分泌檢測（ELISA）收集培養(yǎng)上清，按ELISA試劑盒說明書操作，檢測IFN-γ、TNF-α等細胞因子濃度，反映NK細胞活化狀態(tài)。七、注意事項（一）無菌操作所有試劑、耗材需經(jīng)滅菌處理（培養(yǎng)基過濾除菌，耗材高壓滅菌）；操作全程在生物安全柜內(nèi)進行，避免說話、咳嗽污染；培養(yǎng)箱定期用75%乙醇擦拭，每月更換托盤水（加入抗生素避免污染）。（二）細胞活力維護離心轉(zhuǎn)速≤400g，時間≤15分鐘（避免細胞機械損傷）；換液時輕柔吹打，避免產(chǎn)生氣泡或過度剪切力；細胞因子現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復凍融（分裝后-80℃保存）。（三）培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定CO?培養(yǎng)箱每日監(jiān)測溫度、CO?濃度（誤差≤0.5℃、0.1%）；培養(yǎng)基每2-3天更換一次（根據(jù)細胞密度調(diào)整，密度高時縮短換液周期）；避免頻繁開啟培養(yǎng)箱，減少溫度波動（每次操作不超過3分鐘）。八、質(zhì)量控制（一）過程控制每批細胞培養(yǎng)前，取培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，確認無細菌、真菌污染；培養(yǎng)第3、7、14天，鏡下觀察細胞形態(tài)（如聚團、增殖速度），記錄生長曲線；流式鑒定時，設置同型對照，確?？贵w特異性。（二）終產(chǎn)品控制細胞純度：CD56?CD3?細胞比例≥80%（科研）或≥90%（臨床）；細胞活性：臺盼藍染色活細胞率≥90%；細胞毒性：效靶比10:1時，殺傷率≥50%（針對K562細胞）；微生物檢測：支原體、細菌、真菌檢測均為陰性。九、常見問題及解決（一）細胞污染細菌污染：培養(yǎng)基渾濁、鏡下見運動細菌→立即丟棄，更換所有耗材，培養(yǎng)箱用甲醛熏蒸；真菌污染：培養(yǎng)基出現(xiàn)菌絲→丟棄細胞，消毒培養(yǎng)箱，更換培養(yǎng)基和血清；支原體污染：細胞生長緩慢、鏡下無明顯污染→用支原體檢測試劑盒確認，陽性則添加支原體清除試劑（如Mynox）或丟棄細胞。（二）細胞增殖緩慢細胞因子濃度不足→調(diào)整IL-2/IL-15濃度（如從500U/ml增至1000U/ml）；起始細胞密度過低→提高接種密度（如從1×10?cells/ml增至2×10?cells/ml）；培養(yǎng)環(huán)境異常→檢查CO?濃度、溫度，更換培養(yǎng)箱或調(diào)整參數(shù)。（三）細胞活性低分離過程損傷→優(yōu)化離心參數(shù)（如降低轉(zhuǎn)速、縮短時間）；培養(yǎng)基質(zhì)量差→更換批次或品牌，驗證血清/無血清培養(yǎng)基的兼容性；自身抗體干擾→改用AB血清或無血清培養(yǎng)基，避免同種異體血清過敏。結語NK細胞培養(yǎng)的標準化操作是實現(xiàn)其基礎研究與臨床轉(zhuǎn)化的核心環(huán)