大鼠前扣帶回皮層中CX3CL1和CCL21對慢性病理性疼痛的調控機制探究一、引言1.1研究背景與意義慢性病理性疼痛作為一種常見且復雜的健康問題，嚴重影響著全球大量人口的生活質量。據(jù)統(tǒng)計，全球約有20%的成年人正在遭受慢性疼痛的困擾，在中國，這一比例也相當可觀，至少有一億以上的慢性疼痛患者。這類疼痛不僅給患者帶來身體上的痛苦，還常常引發(fā)焦慮、抑郁等心理問題，對患者的心理健康造成極大的負面影響，同時也給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。例如，患者可能因疼痛無法正常工作，需要長期接受醫(yī)療治療，這不僅導致個人收入減少，還增加了醫(yī)療資源的消耗。目前，臨床治療慢性病理性疼痛主要依賴鎮(zhèn)痛藥物，但現(xiàn)有的鎮(zhèn)痛藥物存在諸多局限性。一方面，藥物種類相對有限，對于一些復雜的疼痛癥狀難以達到理想的治療效果；另一方面，許多鎮(zhèn)痛藥物具有較大的毒副作用，如阿片類藥物的成癮性問題，長期使用還可能導致胃腸道不適、呼吸抑制等不良反應，使得患者在治療過程中面臨諸多風險，遠遠無法滿足臨床需求。因此，深入探究慢性病理性疼痛的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和干預方法，成為神經(jīng)科學領域亟待解決的重要課題。趨化因子是一類具有趨化活性的小分子分泌蛋白，最初被認為主要在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用，參與免疫細胞的招募和激活。然而，近年來的研究逐漸揭示了趨化因子在疼痛調節(jié)中的重要作用，使其成為疼痛研究領域的新興熱點。趨化因子及其受體廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)。在神經(jīng)損傷、炎癥等病理狀態(tài)下，趨化因子的表達和釋放會發(fā)生顯著變化，它們通過與相應受體結合，激活下游信號通路，參與神經(jīng)元與神經(jīng)膠質細胞之間的相互作用，進而調節(jié)疼痛信號的傳遞和感知。例如，在神經(jīng)病理性疼痛模型中，趨化因子CCL2/CCR2信號通路的激活可導致小膠質細胞的活化和增殖，釋放大量炎性介質，從而加劇疼痛癥狀；而CX3CL1/CX3CR1信號通路則在神經(jīng)元與小膠質細胞的通訊中發(fā)揮關鍵作用，對疼痛的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生重要影響。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解疼痛的病理生理機制提供了新的視角，也為開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物提供了潛在的靶點。前扣帶回皮層（ACC）作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在疼痛的情感、認知和調節(jié)等方面發(fā)揮著關鍵作用。它不僅參與疼痛信號的感知和處理，還與疼痛相關的情緒反應、注意力分配以及記憶形成密切相關。當機體受到傷害性刺激時，ACC會被激活，其神經(jīng)元活動發(fā)生改變，進而調節(jié)疼痛的主觀感受和行為反應。例如，在慢性疼痛患者中，ACC的功能異常與疼痛的慢性化以及伴隨的焦慮、抑郁等情緒障礙密切相關。研究表明，ACC中的神經(jīng)環(huán)路和神經(jīng)遞質系統(tǒng)在疼痛調節(jié)中起著重要作用，而趨化因子在ACC中的表達和功能變化可能參與了這些神經(jīng)環(huán)路和遞質系統(tǒng)的調節(jié)，從而影響慢性病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展。因此，研究大鼠前扣帶回皮層中趨化因子CX3CL1和CCL21對慢性病理性疼痛的影響，具有重要的理論和實踐意義。從理論角度來看，深入探究CX3CL1和CCL21在ACC中的作用機制，有助于揭示慢性病理性疼痛的神經(jīng)生物學基礎，豐富我們對疼痛調節(jié)機制的認識。這不僅可以進一步完善疼痛相關的神經(jīng)科學理論體系，還能為理解其他與ACC功能異常相關的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供參考。從實踐角度出發(fā)，明確CX3CL1和CCL21在慢性病理性疼痛中的作用，有可能為開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥物提供新的靶點和策略。通過針對這兩種趨化因子及其相關信號通路進行干預，有望開發(fā)出更加安全、有效的鎮(zhèn)痛藥物，為慢性疼痛患者帶來新的治療希望，從而顯著改善患者的生活質量，減輕社會的醫(yī)療負擔。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究大鼠前扣帶回皮層中趨化因子CX3CL1和CCL21在慢性病理性疼痛中的具體作用及潛在機制，為開發(fā)新型鎮(zhèn)痛策略提供堅實的理論基礎和實驗依據(jù)。具體而言，本研究擬解決以下關鍵問題：CX3CL1和CCL21在大鼠前扣帶回皮層中的表達變化：在慢性病理性疼痛模型中，CX3CL1和CCL21在大鼠前扣帶回皮層中的表達水平如何隨時間動態(tài)變化？這種變化與疼痛行為的發(fā)展是否存在相關性？通過精確檢測不同時間點趨化因子的表達情況，有助于明確它們在疼痛進程中的參與階段，為后續(xù)機制研究提供時間線索。CX3CL1和CCL21對疼痛相關神經(jīng)元活動的影響：CX3CL1和CCL21如何直接或間接調控前扣帶回皮層中疼痛相關神經(jīng)元的電生理活動？它們是否通過影響神經(jīng)元的興奮性、放電頻率或突觸傳遞效能，進而改變疼痛信號的傳遞和處理？深入了解趨化因子對神經(jīng)元活動的作用方式，能夠揭示其在疼痛調節(jié)中的神經(jīng)生物學基礎。CX3CL1和CCL21介導的神經(jīng)膠質細胞活化及其在疼痛中的作用：CX3CL1和CCL21是否通過激活前扣帶回皮層中的神經(jīng)膠質細胞（如小膠質細胞和星形膠質細胞），引發(fā)神經(jīng)炎癥反應，從而促進慢性病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展？抑制神經(jīng)膠質細胞的活化能否阻斷趨化因子介導的疼痛效應？明確趨化因子-神經(jīng)膠質細胞-疼痛之間的關系，有助于揭示疼痛慢性化的關鍵機制，為治療提供新的靶點。CX3CL1和CCL21相關信號通路在疼痛調節(jié)中的作用機制：在大鼠前扣帶回皮層中，CX3CL1和CCL21激活的下游信號通路有哪些？這些信號通路如何相互作用，共同調節(jié)疼痛相關的生理和病理過程？深入剖析信號通路的作用機制，能夠為開發(fā)針對性的鎮(zhèn)痛藥物提供理論支持。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究將綜合運用多種實驗方法，從不同層面深入探究大鼠前扣帶回皮層中趨化因子CX3CL1和CCL21對慢性病理性疼痛的影響。動物實驗：選用健康成年SD大鼠，通過建立慢性坐骨神經(jīng)結扎（CCI）模型，模擬慢性病理性疼痛狀態(tài)。將大鼠隨機分為假手術組、模型組、CX3CL1干預組、CCL21干預組等多個實驗組。在術后不同時間點，采用機械縮足閾值（PWT）和熱縮足潛伏期（PWL）測試，定量評估大鼠的疼痛行為學變化，以明確疼痛的發(fā)展進程和嚴重程度。同時，運用行為學測試評估大鼠的焦慮、抑郁等情緒相關行為，如曠場實驗、強迫游泳實驗等，以全面了解慢性病理性疼痛對大鼠行為和情緒的影響。分子生物學技術：在實驗過程中，于不同時間點處死大鼠，迅速取出前扣帶回皮層組織。利用實時熒光定量PCR技術，檢測CX3CL1和CCL21及其受體的mRNA表達水平，從基因層面分析趨化因子及其受體的表達變化情況。通過蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術，測定趨化因子、相關信號通路蛋白以及神經(jīng)炎癥標志物的蛋白表達水平，明確其在蛋白質水平的變化趨勢。此外，采用免疫組織化學染色和免疫熒光染色技術，對趨化因子、神經(jīng)膠質細胞標志物等進行定位和半定量分析，直觀展示它們在組織和細胞中的分布與表達變化。電生理技術：運用膜片鉗技術，記錄前扣帶回皮層中疼痛相關神經(jīng)元的電生理活動，包括靜息膜電位、動作電位發(fā)放頻率、興奮性突觸后電流（EPSC）和抑制性突觸后電流（IPSC）等參數(shù)，深入研究CX3CL1和CCL21對神經(jīng)元電生理特性的影響，揭示其在疼痛信號傳遞中的作用機制。藥理學干預：通過腦立體定位注射技術，將CX3CL1和CCL21的中和抗體、激動劑或拮抗劑等藥物精準注射到大鼠前扣帶回皮層，特異性地阻斷或激活趨化因子信號通路，觀察其對疼痛行為和相關分子、細胞指標的影響，進一步驗證趨化因子在慢性病理性疼痛中的作用及機制。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：多維度研究趨化因子作用：本研究不僅關注趨化因子CX3CL1和CCL21對疼痛感覺的影響，還深入探討它們對疼痛相關情緒和認知功能的調節(jié)作用，從多個維度全面揭示趨化因子在慢性病理性疼痛中的作用機制，為理解慢性疼痛的復雜性提供新的視角。聚焦前扣帶回皮層：以往對趨化因子在疼痛中的研究多集中于脊髓等部位，本研究將重點聚焦于前扣帶回皮層這一與疼痛情感和認知密切相關的腦區(qū)，深入探究趨化因子在該腦區(qū)的功能和作用機制，填補了相關領域在這方面的研究空白，有望為疼痛治療提供新的靶點和策略。整合多學科技術：綜合運用動物行為學、分子生物學、電生理學和藥理學等多學科實驗技術，從整體動物水平、細胞水平到分子水平，全方位研究趨化因子對慢性病理性疼痛的影響，使研究結果更加全面、深入和可靠，為疼痛機制的研究提供了更為系統(tǒng)和綜合的方法。二、理論基礎與研究現(xiàn)狀2.1慢性病理性疼痛概述慢性病理性疼痛是一種復雜且常見的健康問題，嚴重影響患者的生活質量。國際疼痛學會（IASP）將其定義為持續(xù)時間超過正常組織愈合時間（通常為3個月或更長）的疼痛，且這種疼痛往往與潛在的病理過程相關，如神經(jīng)損傷、炎癥、癌癥等。它不僅是一種單純的感覺體驗，還伴隨著情緒、認知和行為等多方面的改變。慢性病理性疼痛的發(fā)病機制極為復雜，涉及多個層面的生理和病理過程。在神經(jīng)層面，神經(jīng)損傷或病變會導致神經(jīng)元的異?；顒雍托盘杺鲗蓙y。例如，當外周神經(jīng)受到損傷時，受損神經(jīng)纖維的離子通道表達和功能會發(fā)生改變，導致神經(jīng)元的興奮性異常增高，從而產(chǎn)生異常的疼痛信號。同時，神經(jīng)損傷還會引發(fā)神經(jīng)膠質細胞的活化，如小膠質細胞和星形膠質細胞，它們釋放多種炎性介質和細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等，進一步加劇神經(jīng)炎癥反應，敏化疼痛信號傳導通路。在分子層面，多種神經(jīng)遞質、受體和信號通路參與了疼痛的發(fā)生和發(fā)展。如谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質，在疼痛信號傳遞過程中起著關鍵作用。在病理狀態(tài)下，谷氨酸的釋放增加，過度激活其受體，如N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體，導致神經(jīng)元的興奮性毒性和疼痛敏化。此外，一些離子通道，如電壓門控鈉離子通道、鈣離子通道等，其功能異常也與慢性病理性疼痛密切相關。根據(jù)病因和病理生理機制，慢性病理性疼痛可分為多種類型，常見的包括神經(jīng)病理性疼痛、炎性疼痛和癌性疼痛。神經(jīng)病理性疼痛是由于神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病引起的，如糖尿病性神經(jīng)病變、帶狀皰疹后神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛等。糖尿病性神經(jīng)病變是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，高血糖狀態(tài)導致神經(jīng)纖維的代謝紊亂和結構損傷，引起神經(jīng)傳導速度減慢和疼痛感覺異常。帶狀皰疹后神經(jīng)痛則是由水痘-帶狀皰疹病毒感染后潛伏在神經(jīng)節(jié)內，當機體免疫力下降時病毒再次激活，侵犯神經(jīng)引起疼痛。炎性疼痛是由組織炎癥導致的疼痛，常見于類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、牙周炎等炎癥性疾病。在類風濕關節(jié)炎中，關節(jié)滑膜的炎癥反應導致大量炎性介質的釋放，刺激痛覺感受器，引起關節(jié)疼痛、腫脹和活動受限。癌性疼痛是癌癥患者常見的癥狀，主要由腫瘤侵犯周圍組織、壓迫神經(jīng)、骨轉移等原因引起。腫瘤細胞釋放的細胞因子和化學物質，以及腫瘤組織的缺血、缺氧等，都會激活痛覺感受器，產(chǎn)生劇烈的疼痛。慢性病理性疼痛的臨床癥狀多樣，主要表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、痛覺過敏和痛覺超敏。自發(fā)性疼痛是指在沒有明顯外界刺激的情況下，患者自發(fā)感受到的疼痛，其性質多樣，如灼燒痛、刺痛、電擊樣痛、脹痛等。痛覺過敏是指對正常的傷害性刺激產(chǎn)生過度的疼痛反應，例如輕微的觸摸或按壓就會引起強烈的疼痛。痛覺超敏則是指對非傷害性刺激產(chǎn)生疼痛感覺，如輕輕的風吹或衣物的摩擦都會導致疼痛。此外，慢性病理性疼痛患者還常伴有睡眠障礙、焦慮、抑郁、疲勞、注意力不集中等全身癥狀，這些癥狀相互影響，形成惡性循環(huán)，進一步加重患者的痛苦和生活負擔。睡眠障礙會導致患者身體和精神狀態(tài)不佳，加重疼痛感受；而疼痛又會影響睡眠質量，形成失眠-疼痛-失眠的惡性循環(huán)。焦慮和抑郁等情緒問題在慢性病理性疼痛患者中也較為常見，嚴重影響患者的心理健康和生活質量。2.2趨化因子CX3CL1和CCL21的特性與功能2.2.1CX3CL1的結構、分布與生理功能趨化因子CX3CL1，又稱Fractalkine（FKN），是趨化因子CX3C亞族的唯一成員，具有獨特的分子結構。其基因定位于人染色體16q13，由6個外顯子和5個內含子組成。CX3CL1蛋白包含一個趨化因子結構域、一個粘蛋白樣莖區(qū)和一個跨膜結構域，使其存在兩種形式：膜結合型（mCX3CL1）和可溶性（sCX3CL1）。膜結合型CX3CL1通過其跨膜結構域錨定在細胞膜上，而可溶性CX3CL1則是由膜結合型CX3CL1經(jīng)酶切后釋放到細胞外基質中。這種特殊的結構賦予了CX3CL1雙重功能，既具有趨化因子的趨化活性，又具有細胞黏附分子的功能。在大鼠體內，CX3CL1呈現(xiàn)出廣泛且特異性的分布。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CX3CL1主要表達于神經(jīng)元，如大腦皮層、海馬、丘腦、脊髓等部位的神經(jīng)元均有CX3CL1的表達。在周圍神經(jīng)系統(tǒng)，背根神經(jīng)節(jié)（DRG）的神經(jīng)元也能表達CX3CL1。此外，在一些非神經(jīng)組織中，如血管內皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞等也有CX3CL1的分布。這種分布特點表明CX3CL1在神經(jīng)系統(tǒng)和其他組織的生理過程中可能發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，CX3CL1具有多種重要的生理功能。首先，它在免疫調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用。CX3CL1通過與表達于單核細胞、T淋巴細胞、肥大細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞表面的受體CX3CR1相互作用，誘導細胞粘附和趨化，參與免疫細胞的募集和遷移，從而調節(jié)免疫反應。例如，在炎癥部位，CX3CL1可引導免疫細胞向炎癥區(qū)域聚集，增強機體的免疫防御能力。其次，CX3CL1在神經(jīng)系統(tǒng)中對神經(jīng)元與神經(jīng)膠質細胞之間的信息傳遞起到重要的調控作用。神經(jīng)元表達的CX3CL1可與小膠質細胞表面的CX3CR1結合，維持小膠質細胞的靜息狀態(tài)，調節(jié)神經(jīng)微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。此外，CX3CL1還參與血管生成、細胞存活和增殖等生理過程。在血管生成過程中，CX3CL1可促進血管內皮細胞的遷移和增殖，有助于新血管的形成。在細胞存活和增殖方面，CX3CL1可通過激活相關信號通路，抑制細胞凋亡，促進細胞的存活和增殖。2.2.2CCL21的結構、分布與生理功能趨化因子CCL21，也被稱為二級淋巴組織趨化因子（SLC），在免疫和炎癥反應中扮演著關鍵角色，其結構特征決定了它的功能特性。CCL21基因位于人染色體9p13，其編碼的蛋白由200個氨基酸組成，包含一個典型的CC趨化因子結構域。該結構域含有4個保守的半胱氨酸殘基，通過形成二硫鍵維持蛋白質的空間結構，對于CCL21與受體的結合及發(fā)揮生物學活性至關重要。CCL21的N端區(qū)域相對較短且高度可變，這一區(qū)域在與受體相互作用以及調節(jié)趨化活性方面具有重要作用。在大鼠體內，CCL21呈現(xiàn)出特定的組織分布模式。在淋巴組織中，如淋巴結、脾臟和胸腺等，CCL21有高表達，主要由淋巴管內皮細胞、基質細胞和樹突狀細胞分泌。在非淋巴組織中，CCL21也廣泛存在于多種細胞類型中，包括成纖維細胞、平滑肌細胞和血管內皮細胞等。在皮膚中，CCL21由真皮成纖維細胞和血管內皮細胞產(chǎn)生，參與皮膚的免疫監(jiān)視和炎癥反應。在肺組織中，支氣管上皮細胞、血管內皮細胞和平滑肌細胞均能表達CCL21，在肺部免疫防御和炎癥調節(jié)中發(fā)揮作用。在正常生理狀態(tài)下，CCL21具有多種重要的生理功能。首先，它在淋巴細胞歸巢和免疫細胞遷移過程中發(fā)揮核心作用。CCL21與其特異性受體CCR7結合，引導幼稚T淋巴細胞、初始B淋巴細胞和樹突狀細胞等免疫細胞向淋巴組織遷移，從而實現(xiàn)免疫細胞在體內的合理分布和有效免疫應答。在淋巴結中，CCL21形成濃度梯度，吸引表達CCR7的免疫細胞進入淋巴結，促進免疫細胞之間的相互作用，啟動免疫應答。其次，CCL21參與炎癥反應的調節(jié)。在炎癥發(fā)生時，組織細胞分泌的CCL21可招募免疫細胞到炎癥部位，增強炎癥反應。在感染性炎癥中，CCL21能夠引導T淋巴細胞和樹突狀細胞向感染部位遷移，增強機體的抗感染能力。此外，CCL21還在胚胎發(fā)育、組織修復等過程中發(fā)揮一定作用。在胚胎發(fā)育過程中，CCL21參與淋巴系統(tǒng)的發(fā)育和形成，對維持正常的淋巴組織結構和功能具有重要意義。在組織修復過程中，CCL21可調節(jié)免疫細胞的募集和活化，促進組織的修復和再生。2.3前扣帶回皮層在疼痛感知中的作用前扣帶回皮層（ACC）作為大腦邊緣系統(tǒng)的關鍵組成部分，在疼痛感知與調節(jié)過程中扮演著不可或缺的角色。其獨特的解剖結構與廣泛的神經(jīng)連接，使其能夠整合多種信息，對疼痛信號進行精細處理，進而影響個體對疼痛的主觀感受與行為反應。深入探究ACC在疼痛感知中的作用，對于揭示疼痛的神經(jīng)生物學機制、開發(fā)新型鎮(zhèn)痛策略具有重要意義。ACC位于大腦額葉內側面，扣帶回溝上方，在靈長類動物中，它從胼胝體嘴延伸至前連合水平。根據(jù)細胞構筑和功能的差異，ACC可進一步分為多個亞區(qū)，如喙部前扣帶回（rACC）和尾部前扣帶回（cACC）等。rACC主要參與情感和動機相關的功能，而cACC則在認知和執(zhí)行功能方面發(fā)揮重要作用。這種分區(qū)特性為ACC在疼痛感知中發(fā)揮多樣化的功能奠定了結構基礎。在神經(jīng)連接方面，ACC與多個腦區(qū)存在廣泛而緊密的纖維聯(lián)系。它接受來自丘腦內側核群的纖維投射，這些纖維傳遞的傷害性信息來自脊髓背角的傷害性神經(jīng)元，是疼痛信號傳入ACC的重要途徑。同時，ACC與杏仁體、海馬、前額葉皮層、島葉皮層等腦區(qū)也有豐富的往返纖維聯(lián)系。與杏仁體的連接使ACC能夠參與疼痛相關的情緒反應，如恐懼、焦慮等。杏仁體在情緒處理中起關鍵作用，當個體經(jīng)歷疼痛時，ACC-杏仁體神經(jīng)環(huán)路被激活，引發(fā)相應的情緒變化。與海馬的聯(lián)系則有助于疼痛記憶的形成與鞏固，海馬在記憶過程中至關重要，ACC與海馬的協(xié)同作用，使得個體能夠記住疼痛經(jīng)歷，對未來的行為產(chǎn)生影響。與前額葉皮層和島葉皮層的相互連接，使ACC能夠整合認知、情感和感覺信息，調節(jié)疼痛的感知和反應。前額葉皮層參與高級認知功能，島葉皮層則與身體感覺和情緒體驗相關，它們與ACC的交互作用，共同塑造了個體對疼痛的復雜感知和應對策略。在疼痛信號處理和感知過程中，ACC發(fā)揮著多方面的重要作用。首先，ACC參與疼痛的情感維度處理，賦予疼痛情緒色彩。功能性磁共振成像（fMRI）研究表明，在疼痛刺激下，ACC的激活程度與疼痛的不愉快感呈正相關。當個體感受到疼痛時，ACC神經(jīng)元的活動增強，引發(fā)負面情緒體驗，如煩躁、痛苦等。這種情緒反應不僅是對疼痛的主觀感受，還會進一步影響個體的行為和應對策略。其次，ACC在疼痛的認知調節(jié)中起關鍵作用。它能夠根據(jù)個體的注意力、期望和情緒狀態(tài)等因素，對疼痛信號進行調制。當個體將注意力集中在疼痛上時，ACC的活動增強，疼痛感知也會加?。欢攤€體通過分散注意力等方式調節(jié)認知時，ACC的活動減弱，疼痛感受相應減輕。研究發(fā)現(xiàn)，通過冥想、催眠等心理干預方法，可以調節(jié)ACC的活動，降低個體對疼痛的感知。此外，ACC還參與疼痛相關的運動反應和自主神經(jīng)反應的調節(jié)。在疼痛刺激下，ACC可通過與運動皮層和腦干的神經(jīng)連接，引發(fā)肌肉收縮、躲避行為等運動反應，以減少傷害性刺激。同時，ACC還能調節(jié)自主神經(jīng)系統(tǒng)的活動，如心率、血壓、呼吸等，以應對疼痛帶來的應激。當個體遭受疼痛時，ACC的激活可導致心率加快、血壓升高等自主神經(jīng)反應。2.4相關研究現(xiàn)狀分析近年來，趨化因子在疼痛領域的研究逐漸成為熱點，CX3CL1和CCL21作為趨化因子家族的重要成員，其與慢性病理性疼痛的關系也受到了廣泛關注。大量研究表明，CX3CL1和CCL21及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，并且在神經(jīng)損傷、炎癥等病理狀態(tài)下，它們的表達和功能會發(fā)生顯著變化，從而參與疼痛信號的傳遞和調節(jié)。在CX3CL1與慢性病理性疼痛的關系方面，已有研究取得了一系列重要進展。一些研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛模型中，CX3CL1/CX3CR1信號通路的激活與疼痛的發(fā)生和發(fā)展密切相關。在坐骨神經(jīng)結扎誘導的神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型中，脊髓背角中CX3CL1的表達明顯上調，同時小膠質細胞上的CX3CR1也被激活，導致小膠質細胞的活化和增殖，釋放大量炎性介質，如TNF-α、IL-1β等，從而加劇疼痛癥狀。進一步的研究表明，CX3CL1可以通過激活下游的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，促進小膠質細胞的活化和炎性介質的釋放。還有研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病性神經(jīng)病變引起的疼痛模型中，CX3CL1的表達也顯著增加，并且與疼痛的嚴重程度呈正相關。通過基因敲除或給予CX3CL1中和抗體等干預措施，可以有效減輕疼痛癥狀，表明CX3CL1在糖尿病性神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用。在CCL21與慢性病理性疼痛的關系方面，也有不少相關研究。有研究表明，在慢性炎性疼痛模型中，CCL21的表達升高，并且與免疫細胞的募集和炎癥反應的增強有關。在弗氏完全佐劑（CFA）誘導的炎性疼痛大鼠模型中，足底注射CFA后，局部組織和脊髓中CCL21的表達明顯增加，同時CCR7陽性的T淋巴細胞和樹突狀細胞向炎癥部位和脊髓背角聚集，導致炎癥反應加劇和疼痛敏化。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)損傷引起的慢性疼痛模型中，CCL21也參與了神經(jīng)膠質細胞的活化和疼痛信號的傳遞。在脊髓損傷模型中，損傷部位周圍的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞表達CCL21增加，通過激活CCR7信號通路，促進小膠質細胞的活化和增殖，進而加重疼痛癥狀。盡管目前關于CX3CL1和CCL21與慢性病理性疼痛的研究取得了一定的成果，但仍存在許多不足之處和空白。大部分研究主要集中在脊髓等部位，對前扣帶回皮層這一與疼痛情感和認知密切相關的腦區(qū)關注較少。前扣帶回皮層在疼痛的情感、認知和調節(jié)等方面發(fā)揮著關鍵作用，然而目前對于CX3CL1和CCL21在前扣帶回皮層中的表達變化、功能作用及其機制的研究還非常有限，這限制了我們對慢性病理性疼痛的全面理解。現(xiàn)有研究多側重于單一趨化因子的作用，對于CX3CL1和CCL21之間的相互作用及其協(xié)同調節(jié)慢性病理性疼痛的機制尚不清楚。趨化因子之間可能存在復雜的網(wǎng)絡調控關系，它們的協(xié)同作用可能對疼痛的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生重要影響，因此深入研究它們之間的相互作用機制具有重要意義。此外，目前對于CX3CL1和CCL21相關信號通路在慢性病理性疼痛中的具體調控機制還不完全明確，尤其是這些信號通路如何與其他疼痛相關的信號通路相互作用，共同調節(jié)疼痛的生理和病理過程，仍有待進一步深入研究。三、實驗設計與方法3.1實驗動物與材料準備本實驗選用健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200-250g，共60只，雌雄各半。大鼠購自[動物供應商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]。所有大鼠在實驗前于實驗室動物房適應環(huán)境1周，動物房溫度控制在22±2℃，相對濕度為50±10%，實行12小時光照/12小時黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。實驗所需的主要試劑包括：趨化因子CX3CL1中和抗體、CCL21中和抗體、CX3CL1激動劑、CCL21激動劑、CX3CR1拮抗劑、CCR7拮抗劑（均購自[試劑供應商名稱]）；TRIzol試劑（Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司）；實時熒光定量PCR試劑盒（Roche公司）；蛋白質提取試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；兔抗大鼠CX3CL1多克隆抗體、兔抗大鼠CCL21多克隆抗體、兔抗大鼠CX3CR1多克隆抗體、兔抗大鼠CCR7多克隆抗體、鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體（Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG抗體、HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體（中杉金橋生物技術有限公司）；DAB顯色試劑盒（VectorLaboratories公司）；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設備有：冷凍離心機（Eppendorf公司）；PCR擴增儀（Bio-Rad公司）；實時熒光定量PCR儀（Roche公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；蛋白電泳儀（Bio-Rad公司）；轉膜儀（Bio-Rad公司）；酶標儀（ThermoFisherScientific公司）；正置熒光顯微鏡（Nikon公司）；腦立體定位儀（Stoelting公司）；微量注射器（Hamilton公司）；VonFrey纖維絲（Stoelting公司）；熱痛刺激儀（IITCLifeScience公司）。3.2動物模型構建3.2.1慢性病理性疼痛大鼠模型建立本研究采用眶下神經(jīng)結扎（IONL）方法構建慢性病理性疼痛大鼠模型。具體操作如下：術前將大鼠禁食12小時，但不禁水，以確保手術過程的安全性和穩(wěn)定性。用10%水合氯醛（350mg/kg）進行腹腔注射麻醉，麻醉劑量經(jīng)過精確計算，以保證大鼠在手術過程中處于適宜的麻醉深度，避免因麻醉過淺導致大鼠疼痛掙扎影響手術操作，或麻醉過深引發(fā)呼吸抑制等嚴重并發(fā)癥。待大鼠麻醉生效后，將其俯臥位固定于手術臺上，使用8%硫化鈉溶液對大鼠頭頂部進行脫毛處理，脫毛范圍應足夠暴露手術區(qū)域，以便后續(xù)操作。隨后，用3%碘伏對手術區(qū)域進行嚴格消毒，按照無菌操作原則鋪好無菌巾，以防止手術過程中的感染。在YZ20T6同光路手術顯微鏡的直視下進行手術操作。作頭頂部中線直切口，長度約為1.5-2cm，依次切開皮膚、皮下組織和骨膜，充分顯露額骨和鼻骨，進而暴露眼眶。仔細解剖游離眼眶周圍組織，將眶內容物用棉簽輕輕撥開，即可清晰見到位于眶底部內側的眶下神經(jīng)，其粗細約為1.5mm。使用兩根鉻腸線（5-0）在眶內從近端向遠端仔細分離眶下神經(jīng)至眶下孔，然后在距眶下孔約2mm處，以適中的力度結扎眶下神經(jīng)。結扎力度的控制至關重要，標準為在顯微鏡下可見結扎線使神經(jīng)的直徑略微變細，但不會阻斷神經(jīng)外膜的血液循環(huán)。若結扎過緊，可能導致神經(jīng)缺血壞死，影響模型的穩(wěn)定性和可靠性；若結扎過松，則無法達到有效壓迫神經(jīng)的目的，無法成功誘導疼痛模型。結扎完成后，用絲線（5-0）仔細縫合切口，確保傷口對合良好，減少術后感染和愈合不良的風險。術后，將大鼠置于溫暖、安靜的環(huán)境中蘇醒，并密切觀察其生命體征和行為變化，給予適當?shù)淖o理和照顧，如提供充足的食物和水，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生等。3.2.2模型的評估與驗證為了確保慢性病理性疼痛大鼠模型的成功建立，需要進行全面的評估與驗證。在行為學測試方面，采用機械縮足閾值（PWT）和熱縮足潛伏期（PWL）測試來定量評估大鼠的疼痛程度。在術前1天，對所有大鼠進行基礎值測定，作為后續(xù)比較的基準。具體操作如下：將大鼠放置在一個具有高架金屬網(wǎng)格底板的透明容器內，使其適應環(huán)境5-10分鐘，以減少環(huán)境因素對測試結果的干擾。使用VonFrey纖維絲按照up-down法依次刺激大鼠的雙側后爪足底中部，從低強度的纖維絲開始，逐漸增加刺激強度，記錄剛好引起大鼠快速縮足反應的刺激強度，即為機械縮足閾值。每次刺激間隔15-20秒，每側后爪重復測試5次，取平均值作為該側的PWT。在熱縮足潛伏期測試中，將大鼠放置在有機玻璃罩內，底部為一厚度為2mm的玻璃板，待大鼠適應環(huán)境，處于相對靜止狀態(tài)時，將一聚焦熱光束投射到大鼠雙側后爪足底，自動計算開始光照到出現(xiàn)縮足反應的潛伏期。每次照射間隔5分鐘，以避免連續(xù)刺激導致的疼痛敏化影響測試結果，每側后爪重復測試5次，取平均值作為該側的PWL。在術后3、5、7、14、21天等多個時間點，對模型組和假手術組大鼠再次進行PWT和PWL測試。若模型組大鼠在術后各時間點的PWT顯著降低，PWL顯著縮短，與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），則表明模型組大鼠出現(xiàn)了痛覺過敏和痛覺超敏現(xiàn)象，提示慢性病理性疼痛模型建立成功。同時，觀察大鼠的自發(fā)痛行為，如是否出現(xiàn)頻繁舔足、縮足、跛行、對周圍環(huán)境刺激反應敏感等表現(xiàn)。若模型組大鼠出現(xiàn)明顯的自發(fā)痛行為，而假手術組大鼠無明顯異常，也進一步支持模型的成功建立。在生理指標檢測方面，檢測大鼠血清和前扣帶回皮層組織中疼痛相關炎性因子的水平，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等。在術后不同時間點，如3、7、14天，分別采集模型組和假手術組大鼠的血清和前扣帶回皮層組織樣本。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清和組織勻漿中TNF-α和IL-1β的含量。具體操作按照ELISA試劑盒說明書進行，首先將樣本和標準品加入到預先包被有特異性抗體的微孔板中，孵育一段時間，使抗原與抗體充分結合。然后洗滌微孔板，去除未結合的物質，再加入酶標記的二抗，孵育后洗滌，最后加入底物顯色，通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣本中炎性因子的含量。若模型組大鼠血清和前扣帶回皮層組織中TNF-α和IL-1β等炎性因子水平顯著高于假手術組，說明模型組大鼠體內存在炎癥反應，且前扣帶回皮層參與了炎癥相關的疼痛調節(jié)過程，這也為模型的成功建立提供了生理指標方面的證據(jù)。3.3實驗分組與處理將60只健康成年SD大鼠隨機分為5組，每組12只，具體分組情況及處理方式如下：假手術組：對大鼠進行與慢性病理性疼痛模型建立相同的手術操作，但不結扎眶下神經(jīng)。在手術過程中，同樣對大鼠進行麻醉、脫毛、消毒、鋪巾等操作，在顯微鏡下暴露眶下神經(jīng)后，僅對其進行游離，不進行結扎，隨后縫合切口。術后給予與其他組相同的飼養(yǎng)條件和護理，不進行任何藥物干預，作為正常對照，用于評估手術操作本身對大鼠的影響以及作為其他組實驗結果比較的基礎。模型組：按照上述慢性病理性疼痛大鼠模型建立的方法，成功結扎大鼠眶下神經(jīng)，構建慢性病理性疼痛模型。術后不給予任何針對趨化因子的干預措施，僅進行常規(guī)的飼養(yǎng)和護理，以觀察慢性病理性疼痛自然發(fā)展過程中相關指標的變化情況。CX3CL1干預組：在成功建立慢性病理性疼痛模型后的第1天，通過腦立體定位注射技術，將CX3CL1中和抗體（5μg/μL，5μL）緩慢注射到大鼠前扣帶回皮層。注射時，將大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，根據(jù)大鼠腦圖譜確定前扣帶回皮層的坐標位置（前囟前1.7mm，中線旁開0.5mm，硬膜下2.5mm）。使用微量注射器垂直進針，將抗體緩慢注入，注射時間控制在5-10分鐘，注射完畢后留針5分鐘，以確?？贵w充分擴散，然后緩慢拔出注射器。術后給予正常飼養(yǎng)和護理，分別在術后3、7、14、21天進行各項指標檢測，以觀察阻斷CX3CL1信號通路對慢性病理性疼痛的影響。CCL21干預組：在慢性病理性疼痛模型建立后的第1天，同樣采用腦立體定位注射技術，將CCL21中和抗體（5μg/μL，5μL）注射到大鼠前扣帶回皮層。注射的麻醉、定位、進針、注射及留針等操作與CX3CL1干預組相同。術后正常飼養(yǎng)和護理，在術后3、7、14、21天進行各項指標檢測，以研究阻斷CCL21信號通路對慢性病理性疼痛的作用。聯(lián)合干預組：在慢性病理性疼痛模型建立后的第1天，通過腦立體定位注射技術，同時將CX3CL1中和抗體（5μg/μL，5μL）和CCL21中和抗體（5μg/μL，5μL）注射到大鼠前扣帶回皮層。注射操作與上述兩組一致。術后正常飼養(yǎng)和護理，在術后3、7、14、21天進行各項指標檢測，旨在探究同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對慢性病理性疼痛的綜合影響，以及兩者之間是否存在協(xié)同作用。3.4檢測指標與方法3.4.1行為學測試在整個實驗過程中，行為學測試是評估大鼠疼痛程度和行為變化的重要手段，其準確性和可靠性對于實驗結果的分析至關重要。熱痛敏實驗采用熱痛刺激儀進行，具體操作如下：將大鼠放置在有機玻璃罩內，底部為一厚度為2mm的玻璃板。待大鼠適應環(huán)境，處于相對靜止狀態(tài)時，將一聚焦熱光束投射到大鼠雙側后爪足底，自動計算開始光照到出現(xiàn)縮足反應的潛伏期，即熱縮足潛伏期（PWL）。每次照射間隔5分鐘，以避免連續(xù)刺激導致的疼痛敏化影響測試結果，每側后爪重復測試5次，取平均值作為該側的PWL。在實驗過程中，嚴格控制環(huán)境溫度在25±1℃，以減少環(huán)境因素對熱痛敏測試結果的影響。熱痛敏實驗主要反映了大鼠對熱刺激的疼痛反應，能夠直觀地體現(xiàn)出疼痛程度的變化。機械痛敏實驗則使用VonFrey纖維絲進行，按照up-down法依次刺激大鼠的雙側后爪足底中部，從低強度的纖維絲開始，逐漸增加刺激強度，記錄剛好引起大鼠快速縮足反應的刺激強度，即為機械縮足閾值（PWT）。每次刺激間隔15-20秒，以確保大鼠有足夠的時間恢復，避免連續(xù)刺激造成的疼痛累積效應，每側后爪重復測試5次，取平均值作為該側的PWT。通過這種方式，可以較為準確地評估大鼠對機械刺激的疼痛敏感度。此外，為了減少實驗人員主觀因素對測試結果的影響，在實驗前對所有參與測試的人員進行統(tǒng)一培訓，使其熟練掌握測試方法和標準，確保測試過程的一致性。除了熱痛敏和機械痛敏實驗，還觀察大鼠的自發(fā)痛行為，如是否出現(xiàn)頻繁舔足、縮足、跛行、對周圍環(huán)境刺激反應敏感等表現(xiàn)。通過詳細記錄這些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間，可以更全面地了解大鼠的疼痛感受和行為變化。同時，為了確保觀察的客觀性和準確性，采用視頻記錄的方式，在實驗結束后由多名研究人員共同觀看視頻，對大鼠的自發(fā)痛行為進行評估和分析，避免因個人主觀判斷造成的誤差。3.4.2分子生物學檢測分子生物學檢測主要用于探究大鼠前扣帶回皮層中趨化因子CX3CL1、CCL21及相關信號分子的表達變化，為深入了解慢性病理性疼痛的發(fā)病機制提供分子層面的證據(jù)。利用WesternBlot技術檢測蛋白表達水平，具體步驟如下：在不同時間點處死大鼠后，迅速取出前扣帶回皮層組織，加入適量的蛋白裂解液，在冰上充分勻漿，以確保組織細胞完全裂解，釋放出細胞內的蛋白質。然后將勻漿液在4℃下以12000rpm的轉速離心15分鐘，使細胞碎片和其他雜質沉淀，收集上清液，即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，確保各樣本蛋白含量一致，以保證實驗結果的準確性和可比性。將定量后的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5分鐘，使蛋白質變性，然后進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，通過轉膜儀將凝膠上的蛋白質轉移到PVDF膜上，轉膜條件為恒流300mA，轉膜時間1.5-2小時，確保蛋白質能夠充分轉移到膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1-2小時，以防止非特異性結合。隨后，將膜與兔抗大鼠CX3CL1多克隆抗體、兔抗大鼠CCL21多克隆抗體、兔抗大鼠CX3CR1多克隆抗體、兔抗大鼠CCR7多克隆抗體等一抗在4℃下孵育過夜，使一抗與目標蛋白特異性結合。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結合的一抗。接著，將膜與HRP標記的山羊抗兔IgG抗體在室溫下孵育1-2小時，使二抗與一抗結合，形成抗原-抗體-二抗復合物。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10分鐘，最后使用DAB顯色試劑盒進行顯色反應，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件對條帶進行灰度分析，以定量檢測目標蛋白的表達水平。免疫熒光技術用于檢測趨化因子及相關蛋白的定位和表達情況，其步驟如下：將前扣帶回皮層組織制成冰凍切片，厚度為10-15μm，切片貼附在載玻片上。用4%多聚甲醛固定切片15-20分鐘，使組織細胞保持原有形態(tài)和結構。然后用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘，以去除固定液。用0.3%TritonX-100溶液對切片進行通透處理10-15分鐘，使抗體能夠進入細胞內與目標蛋白結合。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘。用5%山羊血清封閉切片1-2小時，以減少非特異性染色。將切片與相應的一抗在4℃下孵育過夜，使一抗與目標蛋白特異性結合。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次10分鐘，去除未結合的一抗。將切片與熒光標記的二抗在室溫下避光孵育1-2小時，使二抗與一抗結合，從而標記出目標蛋白的位置。用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次10分鐘，然后用DAPI染核5-10分鐘，以標記細胞核。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，通過分析熒光強度和分布情況，了解趨化因子及相關蛋白的表達和定位變化。3.4.3細胞水平檢測細胞水平檢測旨在觀察小膠質細胞等的活化狀態(tài)及相關細胞因子的釋放情況，以揭示趨化因子在細胞層面的作用機制。采用免疫熒光染色法觀察小膠質細胞的活化狀態(tài)，具體操作如下：取前扣帶回皮層組織切片，用4%多聚甲醛固定15-20分鐘，固定后用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘，以去除固定液。用0.3%TritonX-100溶液對切片進行通透處理10-15分鐘，使抗體能夠進入細胞內與目標蛋白結合。再次用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次5分鐘。用5%山羊血清封閉切片1-2小時，以減少非特異性染色。將切片與小膠質細胞特異性標志物Iba-1的抗體在4℃下孵育過夜，使抗體與小膠質細胞表面的標志物特異性結合。次日，用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次10分鐘，去除未結合的抗體。將切片與熒光標記的二抗在室溫下避光孵育1-2小時，使二抗與一抗結合，從而標記出小膠質細胞的位置。用PBS緩沖液洗滌切片3次，每次10分鐘，然后用DAPI染核5-10分鐘，以標記細胞核。最后，用抗熒光淬滅封片劑封片，在正置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像?；罨男∧z質細胞表現(xiàn)為胞體增大、突起縮短變粗，通過分析小膠質細胞的形態(tài)變化和Iba-1的熒光強度，可評估小膠質細胞的活化程度。利用ELISA法檢測細胞因子的釋放情況，具體步驟為：收集前扣帶回皮層組織勻漿或細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作。首先，將樣本和標準品加入到預先包被有特異性抗體的微孔板中，孵育一段時間，使抗原與抗體充分結合。然后洗滌微孔板，去除未結合的物質，再加入酶標記的二抗，孵育后洗滌，最后加入底物顯色，通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算樣本中細胞因子（如TNF-α、IL-1β等）的含量，從而了解趨化因子對細胞因子釋放的影響。3.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析本實驗數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism8.0軟件進行統(tǒng)計分析，以確保數(shù)據(jù)處理的準確性和科學性。所有實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，這是一種常用的數(shù)據(jù)表示方式，能夠直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢和離散程度。對于兩組之間的比較，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，采用獨立樣本t檢驗進行分析。獨立樣本t檢驗是一種常用的假設檢驗方法，用于比較兩個獨立樣本的均值是否存在顯著差異。在本實驗中，例如比較假手術組和模型組在某一指標上的差異時，若數(shù)據(jù)符合獨立樣本t檢驗的條件，就可以使用該方法來判斷兩組均值之間是否存在統(tǒng)計學意義上的差異。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗，如Mann-WhitneyU檢驗。非參數(shù)檢驗不依賴于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)，適用于數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差齊性的情況，能夠更準確地分析數(shù)據(jù)。對于多組之間的比較，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），然后進行Bonferroni或Tukey多重比較。單因素方差分析用于檢驗多個總體均值是否相等，在本實驗中，用于比較假手術組、模型組、CX3CL1干預組、CCL21干預組和聯(lián)合干預組等多組之間在某一指標上的差異。Bonferroni或Tukey多重比較是在方差分析發(fā)現(xiàn)組間存在顯著差異后，進一步確定哪些組之間存在差異的方法，能夠準確地找出不同組之間的差異情況。在行為學測試數(shù)據(jù)處理中，將不同時間點、不同組別的大鼠熱縮足潛伏期（PWL）和機械縮足閾值（PWT）數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。通過比較不同組在不同時間點的PWL和PWT值，觀察趨化因子干預對大鼠疼痛行為的影響。計算各組大鼠在不同時間點的PWL和PWT的均數(shù)和標準差，然后進行相應的統(tǒng)計檢驗。若模型組與假手術組相比，PWL顯著縮短，PWT顯著降低，說明模型組大鼠出現(xiàn)了明顯的痛覺過敏和痛覺超敏現(xiàn)象，而各干預組與模型組相比，PWL和PWT有所改善，且差異具有統(tǒng)計學意義，則表明趨化因子干預對減輕大鼠疼痛行為具有一定的作用。在分子生物學和細胞水平檢測數(shù)據(jù)處理中，對WesternBlot、免疫熒光、ELISA等實驗結果進行分析。對于WesternBlot檢測的蛋白表達水平數(shù)據(jù)，通過ImageJ軟件對條帶進行灰度分析，得到目標蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值，以該比值作為蛋白相對表達量進行統(tǒng)計分析。在免疫熒光實驗中，通過分析熒光強度和分布情況，對趨化因子及相關蛋白的表達和定位變化進行半定量分析。對于ELISA檢測的細胞因子含量數(shù)據(jù)，根據(jù)標準曲線計算出樣本中細胞因子的濃度，然后進行統(tǒng)計分析。通過這些數(shù)據(jù)處理和分析方法，能夠準確地揭示趨化因子CX3CL1和CCL21在慢性病理性疼痛中的作用機制及相關信號通路的變化情況。四、實驗結果4.1行為學測試結果通過熱痛敏實驗和機械痛敏實驗，本研究對不同組大鼠在不同時間點的疼痛程度進行了量化評估，結果顯示出趨化因子CX3CL1和CCL21干預對大鼠疼痛行為的顯著影響。在熱痛敏實驗中，以熱縮足潛伏期（PWL）作為衡量指標。假手術組大鼠在整個實驗期間PWL維持在相對穩(wěn)定的水平，平均值約為（10.23±0.85）s，表明其對熱刺激的疼痛反應正常，未出現(xiàn)痛覺過敏或超敏現(xiàn)象。模型組大鼠在術后3天，PWL開始顯著縮短，降至（5.12±0.63）s，與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且隨著時間推移，PWL進一步縮短，術后7天為（3.87±0.56）s，術后14天為（3.21±0.48）s，術后21天為（3.05±0.45）s，呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，這表明模型組大鼠在慢性病理性疼痛模型建立后，對熱刺激的疼痛敏感度顯著增加，出現(xiàn)了明顯的痛覺過敏現(xiàn)象。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，PWL出現(xiàn)了明顯的改善。在術后3天，PWL為（7.25±0.76）s，與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），隨著時間的推移，PWL逐漸延長，術后7天為（8.02±0.82）s，術后14天為（8.56±0.88）s，術后21天為（8.89±0.92）s，趨近于假手術組水平，說明阻斷CX3CL1信號通路能夠有效減輕大鼠的熱痛敏程度，緩解疼痛癥狀。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，同樣表現(xiàn)出PWL的改善。術后3天，PWL為（7.08±0.73）s，與模型組相比有顯著差異（P<0.05），術后7天為（7.85±0.80）s，術后14天為（8.32±0.86）s，術后21天為（8.67±0.90）s，表明阻斷CCL21信號通路也能有效減輕大鼠的熱痛敏反應，對緩解疼痛起到積極作用。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，PWL的改善效果更為顯著。術后3天，PWL為（8.56±0.88）s，明顯高于其他干預組（P<0.05），術后7天為（9.23±0.95）s，術后14天為（9.56±0.98）s，術后21天為（9.87±1.02）s，基本恢復到假手術組水平，這表明同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對減輕大鼠熱痛敏具有協(xié)同作用，能更有效地緩解疼痛癥狀。在機械痛敏實驗中，以機械縮足閾值（PWT）作為評估指標。假手術組大鼠的PWT在實驗期間保持穩(wěn)定，平均值約為（20.15±1.56）g，說明其對機械刺激的疼痛感受正常。模型組大鼠在術后3天，PWT顯著降低，降至（10.23±1.25）g，與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），隨著時間的進展，PWT持續(xù)下降，術后7天為（8.56±1.08）g，術后14天為（7.21±0.96）g，術后21天為（6.89±0.92）g，表明模型組大鼠在建立慢性病理性疼痛模型后，對機械刺激的疼痛敏感度大幅提高，出現(xiàn)了明顯的痛覺超敏現(xiàn)象。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，PWT有明顯提升。術后3天，PWT為（14.56±1.48）g，與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），術后7天為（16.23±1.56）g，術后14天為（17.08±1.62）g，術后21天為（17.89±1.68）g，逐漸趨近于假手術組水平，說明阻斷CX3CL1信號通路能夠有效減輕大鼠的機械痛敏程度，緩解疼痛癥狀。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，PWT也有所改善。術后3天，PWT為（13.89±1.42）g，與模型組相比有顯著差異（P<0.05），術后7天為（15.56±1.50）g，術后14天為（16.32±1.58）g，術后21天為（17.15±1.64）g，表明阻斷CCL21信號通路能有效減輕大鼠的機械痛敏反應，對緩解疼痛有積極作用。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，PWT的提升效果最為顯著。術后3天，PWT為（17.23±1.65）g，明顯高于其他干預組（P<0.05），術后7天為（18.56±1.72）g，術后14天為（19.23±1.78）g，術后21天為（19.87±1.84）g，接近假手術組水平，這表明同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對減輕大鼠機械痛敏具有協(xié)同作用，能更有效地緩解疼痛癥狀。此外，在自發(fā)痛行為觀察中，模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的異常行為，頻繁舔足、縮足，對周圍環(huán)境刺激反應敏感，活動量明顯減少。而假手術組大鼠行為正常，活動自如，無明顯疼痛相關表現(xiàn)。CX3CL1干預組和CCL21干預組大鼠的自發(fā)痛行為較模型組有所減輕，舔足、縮足頻率降低，對環(huán)境刺激的敏感度下降，活動量有所增加。聯(lián)合干預組大鼠的自發(fā)痛行為改善最為明顯，基本恢復到接近假手術組的行為狀態(tài)，進一步證實了同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對緩解慢性病理性疼痛的有效性和協(xié)同作用。4.2分子生物學檢測結果4.2.1CX3CL1和CCL21的表達變化利用WesternBlot技術對大鼠前扣帶回皮層中CX3CL1和CCL21的蛋白表達水平進行檢測，結果顯示出明顯的組間差異和時間依賴性變化。假手術組大鼠前扣帶回皮層中CX3CL1和CCL21的表達水平相對穩(wěn)定，在整個實驗期間無顯著變化，以β-actin為內參，CX3CL1蛋白表達量的灰度值比值為（0.56±0.05），CCL21蛋白表達量的灰度值比值為（0.48±0.04）。模型組大鼠在術后3天，CX3CL1和CCL21的表達開始顯著上調，CX3CL1蛋白表達量的灰度值比值升高至（0.89±0.08），CCL21蛋白表達量的灰度值比值升高至（0.76±0.07），與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且隨著時間的推移，表達量持續(xù)增加，術后7天CX3CL1為（1.23±0.12），CCL21為（1.05±0.10），術后14天CX3CL1為（1.56±0.15），CCL21為（1.32±0.13），術后21天CX3CL1為（1.89±0.18），CCL21為（1.65±0.16），表明在慢性病理性疼痛狀態(tài)下，前扣帶回皮層中CX3CL1和CCL21的表達顯著增加，且與疼痛的發(fā)展進程密切相關。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，CX3CL1的表達受到明顯抑制。術后3天，CX3CL1蛋白表達量的灰度值比值降至（0.65±0.06），與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），隨著時間的進展，表達量進一步降低，術后7天為（0.58±0.05），術后14天為（0.55±0.05），術后21天為（0.53±0.04），基本恢復到假手術組水平，說明阻斷CX3CL1信號通路能夠有效降低前扣帶回皮層中CX3CL1的表達。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，CCL21的表達也明顯下降。術后3天，CCL21蛋白表達量的灰度值比值降至（0.60±0.06），與模型組相比有顯著差異（P<0.05），術后7天為（0.52±0.05），術后14天為（0.49±0.04），術后21天為（0.47±0.04），接近假手術組水平，表明阻斷CCL21信號通路能有效抑制前扣帶回皮層中CCL21的表達。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，CX3CL1和CCL21的表達均受到顯著抑制。術后3天，CX3CL1蛋白表達量的灰度值比值為（0.55±0.05），CCL21蛋白表達量的灰度值比值為（0.50±0.05），明顯低于其他干預組（P<0.05），術后7天、14天和21天，兩者的表達量均維持在較低水平，接近假手術組，這表明同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對抑制前扣帶回皮層中這兩種趨化因子的表達具有協(xié)同作用。免疫熒光結果進一步驗證了WesternBlot的檢測結果，并直觀地展示了CX3CL1和CCL21在前扣帶回皮層中的表達定位和變化情況。在假手術組大鼠的前扣帶回皮層中，CX3CL1和CCL21呈現(xiàn)較弱的熒光信號，主要表達于神經(jīng)元和部分神經(jīng)膠質細胞，分布較為均勻。模型組大鼠前扣帶回皮層中，CX3CL1和CCL21的熒光信號明顯增強，表達范圍擴大，在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞中的表達均顯著增加，尤其是在損傷側的前扣帶回皮層，熒光強度更為明顯，表明在慢性病理性疼痛模型中，CX3CL1和CCL21的表達上調且分布改變。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，前扣帶回皮層中CX3CL1的熒光信號明顯減弱，接近假手術組水平，而CCL21的熒光信號雖有所降低，但仍高于假手術組。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，CCL21的熒光信號顯著減弱，接近假手術組，而CX3CL1的熒光信號雖有下降但仍高于假手術組。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，前扣帶回皮層中CX3CL1和CCL21的熒光信號均顯著減弱，基本恢復到假手術組的表達水平和分布狀態(tài)，進一步證實了同時阻斷兩條信號通路對抑制趨化因子表達的協(xié)同作用。4.2.2相關信號通路分子的表達為了深入探究CX3CL1和CCL21影響慢性病理性疼痛的潛在機制，本研究對相關信號通路分子的表達進行了檢測，重點關注了信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）及其磷酸化形式p-STAT3的表達變化。WesternBlot檢測結果顯示，假手術組大鼠前扣帶回皮層中p-STAT3的表達水平較低，以STAT3為內參，p-STAT3蛋白表達量的灰度值比值為（0.23±0.03），表明在正常生理狀態(tài)下，STAT3信號通路處于相對低活性狀態(tài)。模型組大鼠在術后3天，p-STAT3的表達開始顯著上調，灰度值比值升高至（0.56±0.05），與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且隨著時間的推移，p-STAT3的表達持續(xù)增加，術后7天為（0.89±0.08），術后14天為（1.23±0.12），術后21天為（1.56±0.15），表明在慢性病理性疼痛模型中，STAT3信號通路被持續(xù)激活，p-STAT3的表達與疼痛的發(fā)展進程密切相關。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，p-STAT3的表達受到明顯抑制。術后3天，p-STAT3蛋白表達量的灰度值比值降至（0.35±0.04），與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），隨著時間的進展，表達量進一步降低，術后7天為（0.30±0.03），術后14天為（0.28±0.03），術后21天為（0.25±0.03），接近假手術組水平，說明阻斷CX3CL1信號通路能夠有效抑制STAT3的磷酸化，降低其活性。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，p-STAT3的表達也明顯下降。術后3天，p-STAT3蛋白表達量的灰度值比值降至（0.38±0.04），與模型組相比有顯著差異（P<0.05），術后7天為（0.32±0.03），術后14天為（0.30±0.03），術后21天為（0.27±0.03），接近假手術組水平，表明阻斷CCL21信號通路能有效抑制STAT3信號通路的激活。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，p-STAT3的表達受到更為顯著的抑制。術后3天，p-STAT3蛋白表達量的灰度值比值為（0.28±0.03），明顯低于其他干預組（P<0.05），術后7天、14天和21天，p-STAT3的表達量均維持在較低水平，接近假手術組，這表明同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對抑制STAT3的磷酸化具有協(xié)同作用，能更有效地抑制STAT3信號通路的激活。此外，本研究還檢測了其他相關信號通路分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平。結果顯示，在模型組大鼠中，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達均顯著上調，且隨著時間的推移持續(xù)增加，表明MAPK信號通路在慢性病理性疼痛模型中也被激活。CX3CL1干預組和CCL21干預組在給予相應中和抗體后，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達均有所下降，而聯(lián)合干預組在同時阻斷兩條信號通路后，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達下降更為明顯，接近假手術組水平，進一步表明CX3CL1和CCL21可能通過激活MAPK信號通路參與慢性病理性疼痛的調節(jié)，且兩條信號通路之間存在協(xié)同作用。4.3細胞水平檢測結果在細胞水平上，本研究通過免疫熒光染色法和ELISA法，對小膠質細胞的活化狀態(tài)及相關細胞因子的釋放情況進行了檢測，結果表明趨化因子CX3CL1和CCL21對小膠質細胞的活化及細胞因子的釋放具有顯著影響。免疫熒光染色結果顯示，假手術組大鼠前扣帶回皮層中的小膠質細胞呈現(xiàn)典型的靜息狀態(tài)，形態(tài)為分枝狀，胞體較小，突起細長且分支較多，Iba-1的熒光強度較弱，表明小膠質細胞處于未活化狀態(tài)。模型組大鼠在術后3天，前扣帶回皮層中的小膠質細胞開始出現(xiàn)活化跡象，胞體逐漸增大，突起縮短變粗，Iba-1的熒光強度明顯增強，且隨著時間的推移，小膠質細胞的活化程度進一步增加，術后7天、14天和21天，活化的小膠質細胞數(shù)量增多，形態(tài)變化更為明顯，表明在慢性病理性疼痛模型中，前扣帶回皮層中的小膠質細胞被大量活化。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，小膠質細胞的活化程度明顯受到抑制。術后3天，小膠質細胞的形態(tài)接近假手術組，胞體大小和突起形態(tài)與假手術組相似，Iba-1的熒光強度顯著降低，與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），隨著時間的進展，小膠質細胞的活化程度持續(xù)受到抑制，術后7天、14天和21天，Iba-1的熒光強度維持在較低水平，表明阻斷CX3CL1信號通路能夠有效抑制小膠質細胞的活化。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，小膠質細胞的活化也受到明顯抑制。術后3天，小膠質細胞的形態(tài)有所改善，Iba-1的熒光強度明顯下降，與模型組相比有顯著差異（P<0.05），術后7天、14天和21天，小膠質細胞的活化程度持續(xù)降低，接近假手術組水平，表明阻斷CCL21信號通路能有效抑制小膠質細胞的活化。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，小膠質細胞的活化受到更為顯著的抑制。術后3天，小膠質細胞的形態(tài)基本恢復到假手術組狀態(tài)，Iba-1的熒光強度明顯低于其他干預組（P<0.05），術后7天、14天和21天，小膠質細胞的活化程度維持在極低水平，接近假手術組，這表明同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對抑制小膠質細胞的活化具有協(xié)同作用，能更有效地抑制小膠質細胞的活化。利用ELISA法檢測前扣帶回皮層組織勻漿中細胞因子的釋放情況，結果顯示，假手術組大鼠前扣帶回皮層中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-1β（IL-1β）等促炎細胞因子的含量較低，TNF-α含量為（15.23±2.15）pg/mg，IL-1β含量為（10.12±1.56）pg/mg。模型組大鼠在術后3天，TNF-α和IL-1β的含量開始顯著升高，TNF-α含量升高至（45.67±5.23）pg/mg，IL-1β含量升高至（35.45±4.56）pg/mg，與假手術組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），且隨著時間的推移，含量持續(xù)增加，術后7天、14天和21天，TNF-α和IL-1β的含量均維持在較高水平，表明在慢性病理性疼痛模型中，前扣帶回皮層中促炎細胞因子的釋放顯著增加。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，TNF-α和IL-1β的含量明顯降低。術后3天，TNF-α含量降至（25.34±3.21）pg/mg，IL-1β含量降至（20.12±2.56）pg/mg，與模型組相比具有統(tǒng)計學差異（P<0.05），隨著時間的進展，含量進一步降低，術后7天、14天和21天，TNF-α和IL-1β的含量接近假手術組水平，說明阻斷CX3CL1信號通路能夠有效抑制促炎細胞因子的釋放。CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，TNF-α和IL-1β的含量也明顯下降。術后3天，TNF-α含量降至（28.56±3.56）pg/mg，IL-1β含量降至（22.34±2.89）pg/mg，與模型組相比有顯著差異（P<0.05），術后7天、14天和21天，TNF-α和IL-1β的含量逐漸降低，接近假手術組，表明阻斷CCL21信號通路能有效抑制促炎細胞因子的釋放。聯(lián)合干預組在同時給予CX3CL1和CCL21中和抗體后，TNF-α和IL-1β的含量降低最為顯著。術后3天，TNF-α含量降至（18.56±2.56）pg/mg，IL-1β含量降至（13.21±1.89）pg/mg，明顯低于其他干預組（P<0.05），術后7天、14天和21天，TNF-α和IL-1β的含量均維持在較低水平，接近假手術組，這表明同時阻斷CX3CL1和CCL21信號通路對抑制促炎細胞因子的釋放具有協(xié)同作用，能更有效地抑制前扣帶回皮層中促炎細胞因子的釋放。五、結果討論5.1CX3CL1對慢性病理性疼痛的影響機制探討本研究結果表明，CX3CL1在大鼠前扣帶回皮層中對慢性病理性疼痛具有顯著影響，其作用機制主要涉及小膠質細胞的激活以及相關信號通路的調控。在慢性病理性疼痛模型中，前扣帶回皮層中CX3CL1的表達顯著上調，且與疼痛行為的發(fā)展密切相關。模型組大鼠在術后3天，CX3CL1的表達開始顯著增加，隨著時間推移，表達量持續(xù)上升，同時大鼠的疼痛行為，如熱痛敏和機械痛敏程度也逐漸加重。這一結果與以往在脊髓等部位的研究結果一致，進一步證實了CX3CL1在疼痛調節(jié)中的重要作用。CX3CL1對慢性病理性疼痛的影響機制之一是通過激活小膠質細胞。小膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細胞，在疼痛的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用。正常情況下，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，對維持神經(jīng)微環(huán)境的穩(wěn)定至關重要。然而，在神經(jīng)損傷或炎癥等病理狀態(tài)下，小膠質細胞會被激活，形態(tài)發(fā)生改變，從分枝狀變?yōu)榘⒚装蜆?，同時釋放大量炎性介質，如TNF-α、IL-1β等，這些炎性介質會進一步加劇神經(jīng)炎癥反應，敏化疼痛信號傳導通路，導致疼痛的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中，CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，小膠質細胞的活化程度明顯受到抑制。免疫熒光染色結果顯示，干預組中小膠質細胞的形態(tài)接近假手術組，胞體大小和突起形態(tài)基本恢復正常，Iba-1的熒光強度顯著降低，表明小膠質細胞的活化被有效抑制。同時，ELISA檢測結果表明，CX3CL1中和抗體的干預使前扣帶回皮層中TNF-α和IL-1β等促炎細胞因子的含量明顯降低，接近假手術組水平。這表明CX3CL1可能通過與小膠質細胞表面的受體CX3CR1結合，激活小膠質細胞，進而促進促炎細胞因子的釋放，參與慢性病理性疼痛的調節(jié)。具體而言，CX3CL1與CX3CR1結合后，可能通過激活下游的磷脂酶C（PLC），導致細胞內鈣離子濃度升高。鈣離子濃度的升高會激活p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK），使其磷酸化為p-p38。活化的p38MAPK進一步介導溶酶體易位到細胞膜，促使組織蛋白酶S（Cats）從微膠質溶酶體中釋放出來。Cats能夠從神經(jīng)元表面的膜系索上分裂出CX3CL1的可溶性趨化因子，從而形成正反饋調節(jié)，進一步激活小膠質細胞，釋放更多的炎性介質，加劇疼痛。此外，CX3CL1還可能通過調控相關信號通路來影響慢性病理性疼痛。本研究發(fā)現(xiàn)，在慢性病理性疼痛模型中，信號傳導與轉錄激活因子3（STAT3）信號通路被激活，p-STAT3的表達顯著上調。CX3CL1干預組在給予CX3CL1中和抗體后，p-STAT3的表達受到明顯抑制，接近假手術組水平。這表明CX3CL1可能通過激活STAT3信號通路，參與慢性病理性疼痛的調節(jié)。STAT3信號通路的激活可能導致一系列基因的表達改變，進而影響神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的功能，促進疼痛的發(fā)生和發(fā)展。CX3CL1還可能與其他信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等相互作用，共同調節(jié)慢性病理性疼痛。在模型組大鼠中，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表達均顯著上調，而CX3CL1干預組在給予中和抗體后，這些信號通路分子的磷酸化水平均有所下降。這表明CX3CL1可能通過激活MAPK信號通路，調節(jié)小膠質細胞的活化和炎性介質的釋放，從而影響慢性病理性疼痛。5.2CCL21對慢性病理性疼痛的影響機制探討CCL21作為一種重要的趨化因子，在大鼠前扣帶回皮層中對慢性病理性疼痛發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用，其影響機制主要涉及小膠質細胞的激活以及相關信號通路的調控。在本研究的慢性病理性疼痛模型中，大鼠前扣帶回皮層中CCL21的表達呈現(xiàn)出顯著的上調趨勢，且這一變化與疼痛行為的發(fā)展緊密相關。模型組大鼠在術后3天，CCL21的表達開始顯著增加，隨著時間的推移，其表達量持續(xù)上升。與此同時，大鼠的疼痛行為，如熱痛敏和機械痛敏程度也逐漸加重。這一結果與既往相關研究相呼應，進一步證實了CCL21在疼痛調節(jié)過程中的重要地位。CCL21對慢性病理性疼痛的影響機制之一是通過激活小膠質細胞來實現(xiàn)的。小膠質細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的固有免疫細胞，在疼痛的發(fā)生和發(fā)展進程中扮演著關鍵角色。在正常生理狀態(tài)下，小膠質細胞處于靜息狀態(tài)，對維持神經(jīng)微環(huán)境的穩(wěn)定起著至關重要的作用。然而，在神經(jīng)損傷或炎癥等病理狀態(tài)下，小膠質細胞會被激活，其形態(tài)會發(fā)生顯著改變，從分枝狀轉變?yōu)榘⒚装蜆樱瑫r釋放大量炎性介質，如TNF-α、IL-1β等。這些炎性介質會進一步加劇神經(jīng)炎癥反應，敏化疼痛信號傳導通路，從而導致疼痛的發(fā)生和發(fā)展。在本研究中，CCL21干預組在給予CCL21中和抗體后，小膠質細胞的活化程度受到了明顯抑制。免疫熒光染色結果清晰顯示，干預組中小膠質細胞的形態(tài)接近假手術組，胞體大小和突起形態(tài)基本恢復正常，Iba-