大鼠彌漫性軸索損傷中炎癥因子的表達(dá)特征與檢測技術(shù)探究一、引言1.1研究背景彌漫性軸索損傷（DiffuseAxonalInjury，DAI）是一種特殊而嚴(yán)重的原發(fā)性顱腦損傷類型，主要是由于外傷性原因致使腦組織內(nèi)產(chǎn)生剪應(yīng)力作用，造成腦組織復(fù)位過程中神經(jīng)軸索和小血管損傷。其損傷后果嚴(yán)重，在重型顱腦損傷中占比頗高，有學(xué)者認(rèn)為占比達(dá)28％-42％，在腦外傷死亡病人中發(fā)病率占29%-43%，重型DAI患者死亡率更是高達(dá)49%。臨床上，DAI患者傷情重、治療難、預(yù)后差，常導(dǎo)致嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為昏迷、逆行性遺忘、肢體運(yùn)動(dòng)障礙等，嚴(yán)重者甚至直接導(dǎo)致患者死亡，即便部分患者意識(shí)能夠恢復(fù)，也會(huì)遺留諸如智力低下、記憶力減退、反應(yīng)遲鈍、肢體癱瘓、語言不清、失語等后遺癥，給患者家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。長期以來，DAI一直是臨床診治和法醫(yī)學(xué)鑒定的難點(diǎn)。目前，雖然對DAI的發(fā)病機(jī)制、病理變化、診斷及治療等方面進(jìn)行了大量研究，但仍缺乏有效的治療手段。隨著研究的不斷深入，炎癥反應(yīng)在DAI中的關(guān)鍵作用逐漸受到關(guān)注。DAI發(fā)生后，多種損傷產(chǎn)物的生成會(huì)導(dǎo)致中樞和外周免疫炎性細(xì)胞的活化，從而激活神經(jīng)炎癥反應(yīng)。神經(jīng)炎癥反應(yīng)在DAI后繼發(fā)性損傷中發(fā)揮著重要作用，它一方面可促進(jìn)組織和神經(jīng)細(xì)胞碎片的清除，對損傷腦組織的修復(fù)和再生有一定幫助；但另一方面，過度活化的免疫炎性細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎癥因子，如白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些炎癥因子會(huì)引發(fā)繼發(fā)性神經(jīng)炎癥損傷，進(jìn)一步加重腦組織的損害，影響患者的預(yù)后。此外，外周炎性細(xì)胞的浸潤在調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮組織修復(fù)或炎性損傷中也扮演著重要角色。例如，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）作為損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的重要成員之一，在細(xì)胞壞死時(shí)被大量釋放進(jìn)入細(xì)胞外間隙，與Toll樣受體（TLRs）和晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGEs）結(jié)合，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。在DAI后，HMGB1誘導(dǎo)趨化因子CXCL12的表達(dá)可能參與外周白細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，并在DAI后神經(jīng)炎性損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。鑒于炎癥反應(yīng)及炎癥因子在DAI中的重要作用，深入研究大鼠DAI中炎癥因子的表達(dá)及檢測具有重要意義。通過對大鼠DAI模型中炎癥因子表達(dá)變化規(guī)律的研究，可以進(jìn)一步揭示DAI的發(fā)病機(jī)制，為尋找有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)措施提供理論依據(jù)，有望改善DAI患者的預(yù)后，提高其生存質(zhì)量。1.2研究目的和意義本研究旨在通過構(gòu)建大鼠彌漫性軸索損傷模型，深入探究炎癥因子在DAI發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化規(guī)律，篩選出對DAI病情評(píng)估和預(yù)后判斷具有關(guān)鍵意義的炎癥因子，并建立高效、準(zhǔn)確的炎癥因子檢測方法，為DAI的早期診斷、病情評(píng)估以及治療干預(yù)提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)和可靠的技術(shù)支持。從理論層面來看，DAI的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，至今尚未完全明確。炎癥反應(yīng)在DAI中的重要作用雖已逐漸被認(rèn)知，但炎癥因子的具體表達(dá)變化規(guī)律以及它們之間的相互作用機(jī)制仍有待深入挖掘。本研究通過對大鼠DAI模型中炎癥因子的系統(tǒng)研究，有望揭示炎癥因子在DAI發(fā)病過程中的具體作用機(jī)制，進(jìn)一步完善DAI的發(fā)病理論，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供更深入的理論指導(dǎo)。例如，深入研究HMGB1等炎癥因子誘導(dǎo)CXCL12表達(dá)從而參與外周白細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤的具體過程，將有助于我們更全面地理解DAI后神經(jīng)炎性損傷的發(fā)生機(jī)制。在臨床應(yīng)用方面，目前DAI的早期診斷和病情評(píng)估主要依賴于影像學(xué)檢查和臨床表現(xiàn)，但這些方法存在一定的局限性。影像學(xué)檢查在早期可能無法發(fā)現(xiàn)明顯的病變，而臨床表現(xiàn)也缺乏特異性，容易導(dǎo)致誤診和漏診。尋找一種或多種能夠準(zhǔn)確反映DAI病情的炎癥因子作為生物標(biāo)志物，對于DAI的早期診斷和病情評(píng)估具有重要意義。通過檢測這些炎癥因子的表達(dá)水平，醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地判斷患者的病情嚴(yán)重程度，預(yù)測患者的預(yù)后，從而制定更合理的治療方案。此外，明確炎癥因子在DAI中的作用機(jī)制，也為開發(fā)新的治療方法提供了潛在的靶點(diǎn)，有望改善DAI患者的治療效果，降低死亡率和致殘率，提高患者的生存質(zhì)量。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在大鼠DAI模型建立方面，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了諸多探索并取得了一定成果。國外早在1982年，Gennarelli等就設(shè)計(jì)出瞬間旋轉(zhuǎn)模型，將狒狒在非打擊力作用下，以頸部為中心按頭顱矢狀面、冠狀面、軸位面作旋轉(zhuǎn)加速運(yùn)動(dòng)，制造出DAI動(dòng)物模型，為DAI發(fā)病機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。此后，Ross等將幼豬頭顱于冠狀面旋轉(zhuǎn)，也成功獲得DAI模型。國內(nèi)學(xué)者He等采用自制旋轉(zhuǎn)裝置復(fù)制出了大鼠DAI模型，解決了以往旋轉(zhuǎn)模型要求使用大動(dòng)物的問題，使得實(shí)驗(yàn)成本降低且操作更易實(shí)施。Fijalkowski等使用重物撞擊頭盔固定器側(cè)緣，使大鼠在冠狀面旋轉(zhuǎn)復(fù)制出彌漫性腦損傷模型，雖組織學(xué)檢查初期未發(fā)現(xiàn)軸索損傷，但提示通過調(diào)整旋轉(zhuǎn)速度或時(shí)間有望建立更精確的小動(dòng)物DAI旋轉(zhuǎn)模型。除旋轉(zhuǎn)模型外，打擊負(fù)荷模型也被用于DAI模型構(gòu)建。Marmarou等將大鼠置海綿墊上，用牙膠將鋼墊固定于大鼠顱骨穹隆部，通過450g銅棒從不同高處墜落撞擊鋼墊產(chǎn)生DAI，該模型生物力學(xué)機(jī)制包含直線加、減速損傷，為DAI致傷機(jī)理研究提供了補(bǔ)充。在炎癥因子作用機(jī)制研究方面，國外研究發(fā)現(xiàn)，DAI發(fā)生后，損傷產(chǎn)物會(huì)激活免疫炎性細(xì)胞，釋放如IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子，引發(fā)繼發(fā)性神經(jīng)炎癥損傷。HMGB1作為重要的損傷相關(guān)分子模式，在細(xì)胞壞死時(shí)釋放，與TLRs和RAGEs結(jié)合誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，其誘導(dǎo)CXCL12表達(dá)參與外周白細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，在DAI后神經(jīng)炎性損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。國內(nèi)研究也表明，神經(jīng)炎癥反應(yīng)在DAI后繼發(fā)性損傷中具有雙重作用，一方面促進(jìn)組織和神經(jīng)細(xì)胞碎片清除，另一方面過度活化會(huì)加重腦組織損害。此外，有研究關(guān)注到炎癥因子之間的相互作用，如IL-1β可誘導(dǎo)IL-6等其他炎癥因子的釋放，形成復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，共同影響DAI的病情發(fā)展。關(guān)于炎癥因子檢測方法，目前國內(nèi)外常用的方法包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、免疫組化、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）等。ELISA具有操作簡便、靈敏度較高的特點(diǎn)，能夠定量檢測生物樣本中的炎癥因子含量；免疫組化可在組織切片上對炎癥因子進(jìn)行定位和半定量分析，直觀展示其在組織中的分布情況；qRT-PCR則從基因水平檢測炎癥因子mRNA的表達(dá)量，反映其轉(zhuǎn)錄水平的變化。近年來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，一些新興的檢測技術(shù)如蛋白質(zhì)芯片技術(shù)、液相芯片技術(shù)等也逐漸應(yīng)用于炎癥因子檢測，這些技術(shù)具有高通量、多指標(biāo)同時(shí)檢測的優(yōu)勢，能夠更全面地分析炎癥因子的表達(dá)譜。盡管國內(nèi)外在大鼠DAI模型建立、炎癥因子作用機(jī)制和檢測方法方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足。在模型建立方面，現(xiàn)有的模型雖然能夠模擬DAI的部分病理特征，但與人類DAI的實(shí)際情況仍存在一定差異，如損傷部位、程度和病理演變過程等方面還不能完全契合，需要進(jìn)一步優(yōu)化模型，使其更接近臨床實(shí)際。炎癥因子作用機(jī)制研究雖已取得一定成果，但炎癥因子之間復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確，仍有許多信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制有待深入挖掘。在檢測方法上，目前的檢測技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測通量等方面還存在一定局限性，難以滿足臨床快速、準(zhǔn)確、全面檢測的需求。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于，綜合運(yùn)用多種先進(jìn)技術(shù)手段，對大鼠DAI模型中炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)、全面的研究。在模型建立上，嘗試對現(xiàn)有模型進(jìn)行改良和優(yōu)化，使其更符合人類DAI的病理特點(diǎn)；在炎癥因子作用機(jī)制研究中，不僅關(guān)注單個(gè)炎癥因子的作用，還將深入探討炎癥因子之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，尋找關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點(diǎn)；在檢測方法上，探索將新興技術(shù)與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，建立一種高效、準(zhǔn)確、高通量的炎癥因子檢測體系，為DAI的研究和臨床診斷提供新的思路和方法。二、大鼠彌漫性軸索損傷模型的建立2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇本研究選用成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，主要基于以下多方面的考慮。從生理特性角度來看，SD大鼠具有體型適中的特點(diǎn)，其體重一般在200-350克之間，這樣的體型便于實(shí)驗(yàn)操作，無論是在手術(shù)過程中對大鼠的固定，還是后續(xù)對其生命體征的監(jiān)測，都相對較為方便。SD大鼠的大腦結(jié)構(gòu)與人類大腦在一定程度上具有相似性，特別是在腦白質(zhì)、胼胝體、腦干等與彌漫性軸索損傷密切相關(guān)的區(qū)域，其神經(jīng)纖維的分布和組織結(jié)構(gòu)與人類具有一定的可比性，這使得通過大鼠模型研究DAI的發(fā)病機(jī)制和病理變化更具參考價(jià)值。此外，SD大鼠的生理周期穩(wěn)定，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力較強(qiáng)，能夠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中保持相對穩(wěn)定的生理狀態(tài)，減少因生理波動(dòng)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在對實(shí)驗(yàn)條件的適應(yīng)性方面，SD大鼠對常見的實(shí)驗(yàn)飼料具有良好的適應(yīng)性，能夠在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料喂養(yǎng)下保持健康生長。它們對溫度、濕度等環(huán)境條件的適應(yīng)范圍較廣，一般在溫度20-26℃、相對濕度40%-70%的環(huán)境中都能正常生活，這使得在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中飼養(yǎng)SD大鼠較為容易，能夠保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在穩(wěn)定的環(huán)境下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，SD大鼠對常用的麻醉藥物如水合氯醛、戊巴比妥鈉等也具有較好的耐受性，在合適的劑量下能夠順利完成麻醉過程，滿足手術(shù)操作和實(shí)驗(yàn)觀察的需求。在相關(guān)研究中的應(yīng)用情況上，SD大鼠在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用極為廣泛，尤其是在顱腦損傷相關(guān)研究中積累了豐富的資料和經(jīng)驗(yàn)。眾多關(guān)于DAI的前期研究都選用了SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這使得本研究能夠與前人的研究成果進(jìn)行對比和驗(yàn)證，增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性和說服力。例如，在許多關(guān)于DAI發(fā)病機(jī)制的研究中，通過對SD大鼠DAI模型的研究，發(fā)現(xiàn)了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等在DAI發(fā)展過程中的重要作用，為本研究進(jìn)一步深入探討炎癥因子在DAI中的表達(dá)及作用機(jī)制提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。此外，大量基于SD大鼠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也為實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)、樣本量的計(jì)算以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析提供了參考依據(jù)，有助于提高本研究的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。2.2造模方法2.2.1Marmarou打擊法Marmarou打擊法是一種經(jīng)典的用于構(gòu)建大鼠彌漫性軸索損傷模型的方法。在具體操作時(shí)，首先將實(shí)驗(yàn)用的SD大鼠進(jìn)行麻醉，通?？刹捎酶骨蛔⑸?0%水合氯醛（3.5ml/kg）的方式，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將其仰臥位固定于特制的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，確保大鼠頭部穩(wěn)定，避免在實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)晃動(dòng)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。打擊部位的確定至關(guān)重要，一般選擇大鼠顱骨穹隆部作為打擊點(diǎn)。使用牙膠將一個(gè)特定規(guī)格的鋼墊（例如直徑10mm，厚度2mm）緊密固定于大鼠顱骨穹隆部，鋼墊的作用是使外力能夠均勻地傳遞到顱骨，減少局部應(yīng)力集中導(dǎo)致的非彌漫性損傷。在打擊力度和高度控制方面，通常選用450g的銅棒，從不同高度進(jìn)行墜落撞擊鋼墊。研究表明，不同的墜落高度會(huì)導(dǎo)致不同程度的DAI損傷，如從100cm高處墜落銅棒可造成中度損傷，從150cm高處墜落則可導(dǎo)致重度損傷。在進(jìn)行打擊操作時(shí)，需要使用專門設(shè)計(jì)的落體裝置，該裝置能夠精確控制銅棒的墜落高度和釋放時(shí)機(jī)，以保證每次打擊的力度和速度具有一致性，從而提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。Marmarou打擊法具有一定的優(yōu)點(diǎn)。從操作角度來看，其操作相對簡便，不需要復(fù)雜的設(shè)備和高超的技術(shù)，一般的實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可掌握。在模擬DAI損傷方面，該方法能夠較好地模擬直線加、減速損傷，這與臨床上部分DAI患者的受傷機(jī)制相符合，為研究直線加、減速外力作用下DAI的發(fā)病機(jī)制提供了有效的模型。然而，該方法也存在一些不足之處。在損傷的一致性方面，雖然通過控制打擊高度和使用特定的鋼墊等措施來保證損傷的一致性，但由于大鼠個(gè)體差異以及打擊過程中一些難以完全控制的因素，如銅棒墜落時(shí)的微小角度偏差等，導(dǎo)致每次實(shí)驗(yàn)中大鼠的損傷程度仍存在一定的差異。在病理特征方面，該模型神經(jīng)元沒有明顯的壞死，與人類DAI患者的一些病理特征不完全一致，這在一定程度上限制了其對DAI全面發(fā)病機(jī)制的研究。2.2.2瞬間旋轉(zhuǎn)法瞬間旋轉(zhuǎn)法的原理基于DAI的臨床發(fā)生機(jī)制，即通過角加速度使腦內(nèi)產(chǎn)生剪應(yīng)力，從而導(dǎo)致神經(jīng)軸索和小血管損傷。在操作過程中，自制的旋轉(zhuǎn)裝置發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該裝置通常包括固定部分和驅(qū)動(dòng)部分。固定部分用于穩(wěn)固地固定大鼠頭部，例如通過門齒孔、一對橫向桿及雙側(cè)耳棒來固定大鼠頭部，門齒孔長3cm，門齒孔距耳棒4cm，橫向桿長度7cm，間距6cm，這樣的設(shè)計(jì)能夠確保大鼠頭部在旋轉(zhuǎn)過程中保持穩(wěn)定，避免因固定不牢而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。驅(qū)動(dòng)部分則負(fù)責(zé)提供旋轉(zhuǎn)的動(dòng)力，常見的是利用優(yōu)質(zhì)粗鋼絲制成的驅(qū)動(dòng)彈簧，經(jīng)烘烤定型后安裝固定在旋轉(zhuǎn)裝置的軸承上。在實(shí)驗(yàn)前，預(yù)先將驅(qū)動(dòng)彈簧扭轉(zhuǎn)180使其處于備用狀態(tài)，此時(shí)與軸承連帶之橫向桿呈上下排列。通過回位旋紐和扳機(jī)來控制旋轉(zhuǎn)的啟動(dòng)和停止，按下扳機(jī)后，彈簧釋放，固定部分遂以橫向桿連線中點(diǎn)為軸心逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)，使大鼠頭顱在瞬間（＜3ms）內(nèi)旋轉(zhuǎn)預(yù)定角度。旋轉(zhuǎn)角度和速度的控制是瞬間旋轉(zhuǎn)法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。一般來說，將大鼠頭顱在冠狀面繞腦中心右向旋轉(zhuǎn)90°，可造成有效的剪力傷。旋轉(zhuǎn)速度則通過驅(qū)動(dòng)彈簧的規(guī)格以及對驅(qū)動(dòng)彈簧力量調(diào)劑孔的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)。不同的旋轉(zhuǎn)速度和角度會(huì)導(dǎo)致不同程度和部位的腦損傷，例如，較低的旋轉(zhuǎn)速度可能只會(huì)導(dǎo)致輕度的軸索損傷，而較高的旋轉(zhuǎn)速度則可能造成更廣泛、更嚴(yán)重的損傷，包括腦干、胼胝體等關(guān)鍵部位的損傷。瞬間旋轉(zhuǎn)法對模擬DAI病理過程具有顯著優(yōu)勢。從損傷機(jī)制角度，該方法通過角加速度使腦內(nèi)產(chǎn)生剪應(yīng)力，與DAI的臨床發(fā)生機(jī)制高度契合，能夠更準(zhǔn)確地模擬人類DAI的發(fā)病過程。在損傷部位方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用瞬間旋轉(zhuǎn)法制作的模型，其損傷部位多見于腦干、胼胝體、大腦腳等部，這些部位與人類DAI患者的常見損傷部位一致，有助于深入研究這些關(guān)鍵部位在DAI中的病理變化和作用機(jī)制。此外，該方法還能夠較好地控制損傷的程度和范圍，通過調(diào)節(jié)旋轉(zhuǎn)角度和速度，可以制作出不同程度的DAI模型，滿足不同研究目的的需求。2.3模型評(píng)估2.3.1行為學(xué)評(píng)估行為學(xué)評(píng)估在判斷大鼠彌漫性軸索損傷模型是否成功構(gòu)建中起著關(guān)鍵作用，通過對大鼠傷后一系列行為學(xué)指標(biāo)的細(xì)致觀察和分析，能夠直觀地反映出模型的損傷程度和效果。在昏迷時(shí)間觀察方面，傷后即刻密切記錄大鼠從受傷到恢復(fù)自主活動(dòng)或意識(shí)的時(shí)間。正常情況下，未受傷的SD大鼠應(yīng)始終保持清醒、活躍狀態(tài)。而對于構(gòu)建DAI模型的大鼠，傷后通常會(huì)出現(xiàn)昏迷現(xiàn)象。研究表明，采用Marmarou打擊法，從100cm高處墜落450g銅棒撞擊大鼠顱骨穹隆部制作的模型，大鼠昏迷時(shí)間一般在10-30分鐘不等；瞬間旋轉(zhuǎn)法使大鼠頭顱在冠狀面繞腦中心右向旋轉(zhuǎn)90°造成的損傷，大鼠昏迷時(shí)間多在5-20分鐘。若大鼠傷后昏迷時(shí)間在合理范圍內(nèi)，可初步判斷模型構(gòu)建成功；若昏迷時(shí)間過短或無昏迷現(xiàn)象，可能提示損傷程度不足，模型構(gòu)建失?。蝗艋杳詴r(shí)間過長甚至導(dǎo)致大鼠死亡，則可能表明損傷過重，超出了實(shí)驗(yàn)預(yù)期的損傷程度。肢體活動(dòng)的評(píng)估也是重要環(huán)節(jié)。觀察大鼠傷后肢體的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性、力量以及活動(dòng)頻率等。正常大鼠肢體活動(dòng)自如，行走時(shí)四肢協(xié)調(diào)配合，步伐穩(wěn)健。DAI模型大鼠傷后常出現(xiàn)肢體運(yùn)動(dòng)障礙，如肢體無力，表現(xiàn)為不能正常支撐身體重量，行走時(shí)肢體拖地；運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)，出現(xiàn)步態(tài)蹣跚、左右搖晃，無法直線行走；活動(dòng)頻率降低，長時(shí)間處于靜止?fàn)顟B(tài)，對周圍環(huán)境刺激反應(yīng)遲鈍。通過對這些肢體活動(dòng)表現(xiàn)的觀察和與正常大鼠的對比，能夠進(jìn)一步判斷模型的有效性。平衡能力測試則通過特定的實(shí)驗(yàn)裝置和方法進(jìn)行。常用的方法如平衡木測試，將平衡木（直徑1cm，長度50cm）固定在離地面30cm高度，讓大鼠在平衡木上行走。正常大鼠能夠迅速適應(yīng)平衡木環(huán)境，平穩(wěn)地在上面行走，偶爾出現(xiàn)短暫的調(diào)整動(dòng)作，但能保持身體平衡。而DAI模型大鼠在平衡木上表現(xiàn)出明顯的平衡障礙，如行走時(shí)頻繁失足掉落，在平衡木上停留時(shí)間較短，難以完成規(guī)定距離的行走。平衡能力的下降程度與DAI的損傷程度密切相關(guān)，因此通過平衡木測試結(jié)果可以對模型的損傷程度進(jìn)行量化評(píng)估，為模型的成功判斷提供有力依據(jù)。2.3.2病理學(xué)評(píng)估病理學(xué)評(píng)估是確定大鼠彌漫性軸索損傷模型病理特征的核心方法，通過采用多種染色技術(shù)對腦組織進(jìn)行觀察，能夠清晰地呈現(xiàn)出軸索及腦組織的形態(tài)學(xué)變化，為模型的準(zhǔn)確性和可靠性提供直觀的病理依據(jù)。HE染色是一種常用的組織學(xué)染色方法，在DAI模型評(píng)估中具有重要作用。將制備好的腦組織石蠟切片進(jìn)行HE染色后，在光鏡下觀察。正常腦組織的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色，神經(jīng)纖維排列整齊。而DAI模型腦組織在HE染色下可見明顯的病理改變，如軸索腫脹，表現(xiàn)為軸索直徑增粗，顏色變淺；軸索斷裂，呈現(xiàn)為軸索的連續(xù)性中斷，斷端不整齊；還可見到神經(jīng)元的變性和壞死，神經(jīng)元細(xì)胞體皺縮，細(xì)胞核固縮、碎裂。此外，在損傷區(qū)域還可能觀察到炎癥細(xì)胞的浸潤，如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，表現(xiàn)為在組織間隙中出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞聚集。這些病理變化在不同損傷時(shí)間點(diǎn)可能會(huì)有所差異，例如在傷后早期，軸索腫脹和斷裂較為明顯，隨著時(shí)間推移，炎癥細(xì)胞浸潤和神經(jīng)元壞死等改變會(huì)逐漸加重。鍍銀染色對于觀察神經(jīng)軸索的損傷情況具有獨(dú)特的優(yōu)勢。鍍銀染色后，正常神經(jīng)軸索呈黑色，結(jié)構(gòu)清晰，粗細(xì)均勻。在DAI模型中，軸索損傷處會(huì)出現(xiàn)明顯的變化，軸索腫脹部位鍍銀染色后顏色變淺，且軸索形態(tài)不規(guī)則；軸索斷裂處可見黑色的軸索連續(xù)性中斷，斷端周圍可能有鍍銀物質(zhì)的沉積。此外，鍍銀染色還能清晰地顯示出軸索球的形成，軸索球是軸索損傷后的一種特征性改變，表現(xiàn)為軸索斷端膨大呈球狀，鍍銀染色后呈黑色球狀結(jié)構(gòu)，其數(shù)量和大小在一定程度上反映了軸索損傷的程度和范圍。通過對鍍銀染色切片的觀察，可以更準(zhǔn)確地判斷軸索損傷的部位、程度以及軸索球的形成情況，為DAI模型的病理學(xué)評(píng)估提供重要的信息。三、炎癥因子在大鼠彌漫性軸索損傷中的表達(dá)3.1常見炎癥因子介紹3.1.1TNF-α腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中扮演著核心角色。它主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，此外，T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞在特定條件下也能分泌TNF-α。在免疫調(diào)節(jié)方面，TNF-α能夠激活T細(xì)胞和B細(xì)胞，增強(qiáng)它們的免疫活性。例如，TNF-α可以促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，使其更好地發(fā)揮細(xì)胞免疫功能，識(shí)別和殺傷被病原體感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。同時(shí)，TNF-α還能刺激B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)，幫助機(jī)體抵御病原體的入侵。在炎癥反應(yīng)中，TNF-α是重要的啟動(dòng)因子和介導(dǎo)者。它可以促使血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使白細(xì)胞更容易黏附并穿過血管壁，遷移到炎癥部位，從而引發(fā)炎癥細(xì)胞的浸潤。此外，TNF-α還能刺激炎癥細(xì)胞釋放其他炎癥介質(zhì)，如前列腺素、白三烯等，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)。在大鼠DAI中，TNF-α的表達(dá)變化對神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的損傷機(jī)制。當(dāng)DAI發(fā)生后，損傷部位的免疫細(xì)胞被激活，大量分泌TNF-α。高水平的TNF-α?xí)?dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞膜的完整性和功能，使神經(jīng)細(xì)胞的離子平衡失調(diào)，影響神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)。TNF-α還能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，通過激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。研究表明，在大鼠DAI模型中，傷后早期TNF-α的表達(dá)迅速升高，且其表達(dá)水平與神經(jīng)細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān)。抑制TNF-α的表達(dá)或活性，可以在一定程度上減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷，改善大鼠的神經(jīng)功能。3.1.2IL-1白細(xì)胞介素-1（IL-1）是白細(xì)胞介素家族中的重要成員，具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)功能。它主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，此外，樹突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞在受到刺激時(shí)也能分泌IL-1。IL-1家族包括多種成員，如IL-1α、IL-1β和IL-1受體拮抗劑（IL-1Ra）等，它們通過與相應(yīng)的受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。IL-1在免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。在局部，低濃度的IL-1具有免疫調(diào)節(jié)功能。它可以與抗原協(xié)同作用，使CD4+T細(xì)胞活化，促進(jìn)IL-2R表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性。IL-1還能促進(jìn)B細(xì)胞的生長和分化，增加抗體的形成，增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。同時(shí)，IL-1可提升單核－巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞（APC）的抗原遞呈能力，幫助免疫系統(tǒng)更好地識(shí)別病原體。IL-1與IL-2或干擾素協(xié)同作用時(shí)，能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，提高機(jī)體的免疫防御能力。在全身，IL-1的大量分泌或注射會(huì)通過血循環(huán)引起全身反應(yīng)。它作用于下丘腦可引起發(fā)熱，具有較強(qiáng)的致熱作用。IL-1還能刺激下丘腦釋放促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素，使垂體釋放促腎上腺素，促進(jìn)腎上腺素釋放糖皮質(zhì)激素，對IL-1自身的分泌起到反饋調(diào)節(jié)作用。此外，IL-1可作用于肝細(xì)胞，使其攝取氨基酸的能力增強(qiáng)，進(jìn)而合成和分泌大量急性期蛋白，如α2球蛋白、纖維蛋白原、C-反應(yīng)蛋白等，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)。在DAI后，IL-1的表達(dá)升高對炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)和維持起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)DAI發(fā)生時(shí)，損傷部位的細(xì)胞會(huì)釋放一系列損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），這些DAMPs會(huì)激活免疫細(xì)胞，促使其分泌IL-1。IL-1的升高會(huì)進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞，促使它們釋放更多的炎癥因子，如TNF-α、IL-6等，從而啟動(dòng)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-1還能吸引中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向損傷部位聚集，引發(fā)炎癥細(xì)胞的浸潤，加重炎癥反應(yīng)。持續(xù)升高的IL-1會(huì)維持炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)和擴(kuò)大，進(jìn)一步損傷神經(jīng)組織。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠DAI模型中，傷后IL-1的表達(dá)迅速升高，且在損傷后的一段時(shí)間內(nèi)維持在較高水平。抑制IL-1的活性或降低其表達(dá)，可以有效減輕炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，改善大鼠的預(yù)后。3.1.3IL-6白細(xì)胞介素-6（IL-6）是一種多效性的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中具有復(fù)雜而重要的作用。它可以由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。IL-6的產(chǎn)生受到多種因素的調(diào)控，如病原體感染、炎癥刺激、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)等。IL-6在炎癥反應(yīng)中的多效性體現(xiàn)在多個(gè)方面。在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-6對T細(xì)胞和B細(xì)胞的功能具有重要影響。它可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性。對于B細(xì)胞，IL-6能促進(jìn)其分化為漿細(xì)胞，增加抗體的分泌，增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)。IL-6還參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化和功能，例如，它可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。在炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)方面，IL-6可以刺激其他炎癥因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1等，形成復(fù)雜的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。IL-6還能調(diào)節(jié)急性期蛋白的合成，作用于肝細(xì)胞，促使其合成和分泌C-反應(yīng)蛋白（CRP）、血清淀粉樣蛋白A（SAA）等急性期蛋白，這些急性期蛋白在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。在大鼠DAI中，IL-6對神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化和神經(jīng)元損傷具有顯著影響。當(dāng)DAI發(fā)生后，損傷部位的細(xì)胞會(huì)釋放多種損傷信號(hào)，刺激神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6。IL-6的升高會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放更多的炎癥因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)元。IL-6還可以直接作用于神經(jīng)元，影響神經(jīng)元的代謝和功能，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。研究表明，在大鼠DAI模型中，傷后IL-6的表達(dá)迅速升高，且其表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度和神經(jīng)元損傷程度呈正相關(guān)。抑制IL-6的表達(dá)或活性，可以減輕神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，減少神經(jīng)元的損傷，改善大鼠的神經(jīng)功能。3.2炎癥因子表達(dá)變化規(guī)律3.2.1時(shí)間變化在大鼠彌漫性軸索損傷（DAI）模型中，通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)深入分析TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子在DAI后不同時(shí)間點(diǎn)（如1h、6h、12h、24h、48h等）的表達(dá)變化趨勢，對于揭示DAI的發(fā)病機(jī)制和病理進(jìn)程具有重要意義。以TNF-α為例，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在DAI后1h，TNF-α的表達(dá)即開始顯著升高。這是因?yàn)镈AI發(fā)生后，損傷部位的免疫細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞迅速被激活，啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)過程，促使TNF-α的合成和釋放增加。在6h時(shí)，TNF-α的表達(dá)達(dá)到峰值。此時(shí)，炎癥反應(yīng)處于最為劇烈的階段，大量的TNF-α釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，引發(fā)了一系列的炎癥相關(guān)事件，如血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)增加，導(dǎo)致白細(xì)胞更容易黏附并遷移到損傷部位，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。隨后，從12h開始，TNF-α的表達(dá)逐漸下降。這可能是由于機(jī)體自身的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮作用，抑制了TNF-α的過度表達(dá)，同時(shí)隨著時(shí)間的推移，炎癥反應(yīng)逐漸得到控制，免疫細(xì)胞的活化程度降低，TNF-α的合成和釋放也相應(yīng)減少。但在24h和48h時(shí)，其表達(dá)仍維持在高于對照組的水平，表明炎癥反應(yīng)在DAI后的較長時(shí)間內(nèi)仍持續(xù)存在，對神經(jīng)組織的損傷仍在進(jìn)行。IL-1在DAI后的表達(dá)變化也呈現(xiàn)出一定的規(guī)律。在DAI后1h，IL-1的表達(dá)明顯升高。這是由于損傷刺激導(dǎo)致免疫細(xì)胞活化，其中單核巨噬細(xì)胞作為IL-1的主要來源細(xì)胞，被大量激活后迅速分泌IL-1。在6-12h期間，IL-1的表達(dá)達(dá)到高峰。在這一階段，IL-1不僅自身大量分泌，還通過與其他炎癥因子如TNF-α、IL-6等相互作用，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。例如，IL-1可以刺激T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，同時(shí)還能促進(jìn)其他炎癥介質(zhì)的釋放，加劇炎癥反應(yīng)。之后，IL-1的表達(dá)逐漸下降，但在2d后仍高于對照組。這說明IL-1在DAI后的炎癥反應(yīng)中持續(xù)發(fā)揮作用，其持續(xù)升高的表達(dá)可能導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的持續(xù)進(jìn)行，對神經(jīng)組織造成持續(xù)性的損傷。IL-6在DAI后的表達(dá)變化同樣值得關(guān)注。在DAI后，IL-6的表達(dá)迅速升高。這是因?yàn)閾p傷信號(hào)刺激了多種細(xì)胞，如單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，這些細(xì)胞紛紛分泌IL-6。隨著時(shí)間的推移，IL-6的表達(dá)在一定時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值。IL-6作為一種多效性的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫活性；促進(jìn)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，增加抗體的分泌，增強(qiáng)體液免疫反應(yīng)；還能刺激其他炎癥因子的產(chǎn)生，形成復(fù)雜的炎癥因子網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。在達(dá)到峰值后，IL-6的表達(dá)逐漸下降，但在較長時(shí)間內(nèi)仍維持在一定水平。這表明IL-6在DAI后的炎癥反應(yīng)和神經(jīng)組織損傷過程中持續(xù)發(fā)揮作用，其持續(xù)存在可能導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)活化，進(jìn)而釋放更多的炎癥因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，對神經(jīng)元造成持續(xù)的損傷。3.2.2空間變化研究炎癥因子在損傷腦組織不同區(qū)域（如皮層、海馬、胼胝體等）的表達(dá)差異，對于深入探討其與損傷程度和病理進(jìn)程的關(guān)系具有關(guān)鍵意義。在皮層區(qū)域，TNF-α的表達(dá)呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化模式。在DAI發(fā)生后，皮層作為直接受到外力作用的區(qū)域之一，TNF-α的表達(dá)迅速升高。這是因?yàn)槠又械拿庖呒?xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在損傷刺激下被大量激活，這些細(xì)胞開始合成和分泌TNF-α。隨著時(shí)間的推移，TNF-α的表達(dá)在皮層的不同部位可能存在差異。在損傷中心區(qū)域，由于損傷最為嚴(yán)重，炎癥反應(yīng)最為劇烈，TNF-α的表達(dá)水平較高且持續(xù)時(shí)間較長。這是因?yàn)閾p傷中心區(qū)域的細(xì)胞壞死和凋亡較為嚴(yán)重，釋放出大量的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），這些DAMPs持續(xù)刺激免疫細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，使其不斷分泌TNF-α。而在損傷周邊區(qū)域，TNF-α的表達(dá)相對較低，且隨著時(shí)間的推移下降速度較快。這可能是由于周邊區(qū)域受到的損傷相對較輕，炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間相對較弱。海馬區(qū)域在學(xué)習(xí)、記憶和情感等功能中起著核心作用，其炎癥因子的表達(dá)變化對神經(jīng)功能的影響至關(guān)重要。在DAI后，海馬區(qū)域的IL-1表達(dá)顯著升高。這是因?yàn)楹ｑR區(qū)域的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對損傷較為敏感，損傷刺激導(dǎo)致這些細(xì)胞活化，進(jìn)而分泌IL-1。IL-1的升高可能對海馬神經(jīng)元的功能產(chǎn)生多方面的影響。一方面，IL-1可以通過激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡增加。例如，IL-1可以誘導(dǎo)一氧化氮合酶（NOS）的表達(dá)增加，產(chǎn)生大量的一氧化氮（NO），NO具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷和凋亡。另一方面，IL-1還可能影響海馬神經(jīng)元的突觸可塑性，干擾學(xué)習(xí)和記憶功能。研究表明，IL-1可以抑制海馬神經(jīng)元的長時(shí)程增強(qiáng)（LTP），而LTP是學(xué)習(xí)和記憶的重要神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，LTP的抑制可能導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力的下降。胼胝體主要由神經(jīng)纖維組成，是連接大腦左右半球的重要結(jié)構(gòu)。在DAI中，胼胝體的軸索容易受到損傷，而炎癥因子在該區(qū)域的表達(dá)變化與軸索損傷密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，IL-6在胼胝體的表達(dá)在DAI后明顯升高。IL-6的升高可能通過多種途徑影響胼胝體軸索的損傷和修復(fù)。IL-6可以促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化，活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可能釋放一些炎癥因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，進(jìn)一步損傷軸索。IL-6還可能影響軸索的再生和修復(fù)過程。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6可以抑制神經(jīng)生長因子（NGF）等促進(jìn)軸索再生的因子的表達(dá)，從而不利于軸索的修復(fù)。3.3炎癥因子表達(dá)的影響因素3.3.1損傷程度不同程度的DAI對炎癥因子表達(dá)水平有著顯著影響，且損傷程度與炎癥反應(yīng)強(qiáng)度之間存在密切的相關(guān)性。在輕度DAI時(shí)，炎癥因子的表達(dá)變化相對較為溫和。以TNF-α為例，研究發(fā)現(xiàn)，在輕度DAI模型中，TNF-α的表達(dá)雖有升高，但升高幅度相對較小。這是因?yàn)檩p度損傷對組織的破壞程度較輕，損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的釋放量相對較少，免疫細(xì)胞的活化程度也相對較低，從而導(dǎo)致TNF-α等炎癥因子的合成和分泌增加有限。此時(shí)，炎癥反應(yīng)處于相對較低的水平，機(jī)體的自身修復(fù)機(jī)制可能能夠較好地控制炎癥反應(yīng)的發(fā)展，對神經(jīng)組織的損傷相對較小。隨著DAI程度加重至中度，炎癥因子的表達(dá)水平明顯升高。在中度DAI模型中，TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的表達(dá)均顯著增加。這是由于中度損傷導(dǎo)致更多的神經(jīng)細(xì)胞和組織受損，大量的DAMPs被釋放，強(qiáng)烈刺激免疫細(xì)胞活化，使其大量合成和分泌炎癥因子。炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度也相應(yīng)增強(qiáng)，大量的炎癥細(xì)胞浸潤到損傷部位，釋放多種炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加劇了炎癥反應(yīng)。這種較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)雖然在一定程度上有助于清除損傷組織和病原體，但同時(shí)也會(huì)對周圍正常神經(jīng)組織造成損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的加重。重度DAI時(shí)，炎癥因子表達(dá)水平急劇上升。在重度DAI模型中，TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平達(dá)到極高值。此時(shí)，嚴(yán)重的組織損傷導(dǎo)致大量細(xì)胞壞死和凋亡，釋放出大量的DAMPs，引發(fā)免疫細(xì)胞的過度活化，炎癥因子呈爆發(fā)式釋放。炎癥反應(yīng)極度劇烈，不僅會(huì)對損傷部位的神經(jīng)組織造成嚴(yán)重破壞，還可能通過炎癥介質(zhì)的擴(kuò)散影響到周圍廣泛的腦組織，導(dǎo)致神經(jīng)功能嚴(yán)重受損，甚至危及生命。研究表明，在重度DAI患者中，炎癥因子的高水平表達(dá)與患者的高死亡率和不良預(yù)后密切相關(guān)。通過對不同程度DAI模型中炎癥因子表達(dá)水平的分析，發(fā)現(xiàn)損傷程度與炎癥反應(yīng)強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系。損傷程度越嚴(yán)重，炎癥因子的表達(dá)水平越高，炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度也越大。這種相關(guān)性提示我們，在臨床治療中，可以通過監(jiān)測炎癥因子的表達(dá)水平來評(píng)估DAI患者的損傷程度和病情進(jìn)展，為制定個(gè)性化的治療方案提供重要依據(jù)。例如，對于炎癥因子表達(dá)水平較高的重度DAI患者，可以采取更積極的抗炎治療措施，以減輕炎癥反應(yīng)對神經(jīng)組織的損傷，改善患者的預(yù)后。3.3.2個(gè)體差異不同個(gè)體大鼠在DAI后炎癥因子表達(dá)存在明顯差異，而遺傳因素和生理狀態(tài)等在其中扮演著重要角色，對炎癥反應(yīng)產(chǎn)生多方面影響。遺傳因素在炎癥因子表達(dá)差異中起著基礎(chǔ)性作用。不同遺傳背景的大鼠，其體內(nèi)炎癥相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控存在差異。例如，某些基因多態(tài)性可能影響炎癥因子的合成、釋放以及受體的表達(dá)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，在某些具有特定遺傳背景的大鼠品系中，其體內(nèi)TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域存在特定的單核苷酸多態(tài)性（SNP），這種SNP會(huì)影響轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致TNF-α的表達(dá)水平在DAI后與其他品系大鼠不同。具有該SNP的大鼠在DAI后，TNF-α的表達(dá)可能更高，炎癥反應(yīng)更為劇烈。不同遺傳背景的大鼠在免疫細(xì)胞的功能和活性上也存在差異，這會(huì)間接影響炎癥因子的表達(dá)。一些大鼠品系的免疫細(xì)胞對損傷刺激更為敏感，在DAI后能夠迅速活化并分泌大量炎癥因子，而另一些品系的免疫細(xì)胞則相對不敏感，炎癥因子的分泌量較少。生理狀態(tài)對炎癥因子表達(dá)同樣具有重要影響。年齡是一個(gè)關(guān)鍵的生理因素。幼年大鼠和老年大鼠在DAI后的炎癥因子表達(dá)與成年大鼠存在顯著差異。幼年大鼠由于免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，在DAI后炎癥因子的表達(dá)相對較低，炎癥反應(yīng)較弱。這是因?yàn)橛啄甏笫蟮拿庖呒?xì)胞功能和數(shù)量相對不足，對損傷刺激的反應(yīng)能力有限。例如，幼年大鼠的單核巨噬細(xì)胞在DAI后分泌TNF-α、IL-1等炎癥因子的能力較弱，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和發(fā)展相對緩慢。而老年大鼠則相反，其免疫系統(tǒng)處于一種慢性炎癥狀態(tài)，基礎(chǔ)炎癥因子水平較高。在DAI后，老年大鼠的炎癥因子表達(dá)進(jìn)一步升高，炎癥反應(yīng)更為劇烈。這可能是由于老年大鼠的免疫細(xì)胞功能失調(diào)，對炎癥反應(yīng)的調(diào)控能力下降，導(dǎo)致炎癥因子過度表達(dá)。大鼠的營養(yǎng)狀況也會(huì)影響炎癥因子表達(dá)。營養(yǎng)不良的大鼠在DAI后，炎癥因子的表達(dá)可能發(fā)生改變。例如，缺乏蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)會(huì)影響免疫細(xì)胞的正常功能和代謝，導(dǎo)致免疫細(xì)胞活化和炎癥因子分泌異常。研究表明，蛋白質(zhì)缺乏的大鼠在DAI后，其體內(nèi)IL-6的表達(dá)水平明顯低于正常營養(yǎng)狀態(tài)的大鼠。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是免疫細(xì)胞合成和分泌炎癥因子所必需的物質(zhì)，蛋白質(zhì)缺乏會(huì)影響炎癥因子的合成過程，從而降低IL-6的表達(dá)水平。而營養(yǎng)過剩，如高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠，在DAI后炎癥因子表達(dá)也可能出現(xiàn)異常。高脂飲食會(huì)導(dǎo)致大鼠體內(nèi)代謝紊亂，引發(fā)慢性炎癥狀態(tài)，在DAI后，炎癥因子的表達(dá)可能進(jìn)一步升高，炎癥反應(yīng)加劇。四、大鼠彌漫性軸索損傷中炎癥因子的檢測方法4.1免疫組織化學(xué)法免疫組織化學(xué)法檢測炎癥因子的原理基于免疫學(xué)中抗原抗體特異性結(jié)合的核心概念。在生物體內(nèi)，抗原是能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。抗體則是機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，由漿細(xì)胞產(chǎn)生的一類能與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。免疫組織化學(xué)法利用這一特性，將標(biāo)記物（如酶、熒光素、放射性同位素等）與特異性抗體相結(jié)合。當(dāng)將這種標(biāo)記抗體加入到組織樣本中時(shí)，抗體能夠與組織中的目標(biāo)炎癥因子（即抗原）發(fā)生特異性結(jié)合。隨后，通過檢測標(biāo)記物的信號(hào)，如酶催化底物產(chǎn)生的顏色變化、熒光素發(fā)出的熒光信號(hào)、放射性同位素的放射性信號(hào)等，就可以確定炎癥因子在組織中的位置和表達(dá)水平。以TNF-α檢測為例，操作步驟如下：首先進(jìn)行組織固定，將實(shí)驗(yàn)獲取的大鼠腦組織樣本迅速放入10%中性福爾馬林溶液中，固定時(shí)間一般控制在4-24小時(shí)。固定的目的是防止組織自溶，保持組織結(jié)構(gòu)和抗原的完整性，確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中抗原能夠與抗體正常結(jié)合。接著進(jìn)行切片制作，將固定后的腦組織切成厚度通常為4-6微米的薄片。切片厚度的均勻性至關(guān)重要，它能夠保證抗體充分滲透到組織內(nèi)部，與抗原充分接觸，從而提高檢測的準(zhǔn)確性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，由于組織固定過程可能會(huì)使抗原的某些表位被遮蔽，導(dǎo)致抗原的可用性降低。因此，需要通過抗原修復(fù)步驟來恢復(fù)抗原的免疫反應(yīng)性。常用的方法有熱處理，即將切片放入特定的緩沖液中，在高溫條件下處理一定時(shí)間；化學(xué)處理則是使用特定的化學(xué)試劑來處理切片。完成抗原修復(fù)后，將特異性抗TNF-α抗體加入到組織切片中，使其與TNF-α抗原結(jié)合?？贵w的選擇應(yīng)考慮其特異性、靈敏度和可及性，一般選擇經(jīng)過商業(yè)化生產(chǎn)和驗(yàn)證的單克隆抗體或多克隆抗體。抗體孵育時(shí)間通常為30分鐘至1小時(shí)，具體時(shí)間可根據(jù)抗體說明書和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整。孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）進(jìn)行洗滌，以去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。洗滌步驟需反復(fù)進(jìn)行，一般進(jìn)行3-5次，每次洗滌時(shí)間為5-10分鐘，以確保徹底去除非特異性結(jié)合的抗體。之后，應(yīng)用染色素進(jìn)行可視化標(biāo)記。若使用酶標(biāo)記的二抗，加入相應(yīng)的酶底物，如二氨基聯(lián)苯胺（DAB），在酶的催化作用下，DAB會(huì)發(fā)生顯色反應(yīng)，使目標(biāo)抗原呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色；若使用熒光染料標(biāo)記的二抗，則在熒光顯微鏡下觀察，目標(biāo)抗原會(huì)發(fā)出特定顏色的熒光。最后，通過顯微鏡觀察標(biāo)記的抗原在組織切片中的位置和表達(dá)水平。觀察時(shí)需注意細(xì)胞形態(tài)、染色強(qiáng)度和分布情況，對結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。評(píng)估內(nèi)容包括陽性細(xì)胞的數(shù)量、分布和染色強(qiáng)度，通常采用半定量或定量方法進(jìn)行評(píng)估，如H-score評(píng)分系統(tǒng)。免疫組織化學(xué)法在定位炎癥因子表達(dá)部位和半定量分析方面具有顯著優(yōu)勢。在定位方面，通過顯微鏡觀察染色后的組織切片，能夠直觀地確定炎癥因子在腦組織不同區(qū)域（如皮層、海馬、胼胝體等）的具體位置，清晰地展示炎癥因子在組織中的分布情況，為研究炎癥因子與不同腦區(qū)損傷的關(guān)系提供了有力的工具。在半定量分析上，雖然不能像一些定量檢測方法（如ELISA）那樣精確地測定炎癥因子的含量，但可以通過評(píng)估陽性細(xì)胞的數(shù)量、染色強(qiáng)度等指標(biāo)，對炎癥因子的表達(dá)水平進(jìn)行相對的半定量分析。例如，將染色強(qiáng)度分為陰性、弱陽性、陽性和強(qiáng)陽性等不同等級(jí)，結(jié)合陽性細(xì)胞的分布范圍和數(shù)量，對炎癥因子在不同樣本或不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)變化進(jìn)行比較和分析。然而，該方法也存在一定的局限性。在定量準(zhǔn)確性方面，由于免疫組織化學(xué)法的半定量分析依賴于主觀判斷，不同的觀察者可能會(huì)得出不同的結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性受到一定影響。該方法只能對炎癥因子的表達(dá)進(jìn)行相對的比較，無法精確地測定其在組織中的具體含量。在檢測靈敏度上，對于一些低表達(dá)的炎癥因子，免疫組織化學(xué)法可能由于檢測信號(hào)較弱而難以準(zhǔn)確檢測，導(dǎo)致檢測靈敏度相對較低。4.2Westernblot法Westernblot法，又稱蛋白質(zhì)免疫印跡法，是一種在蛋白質(zhì)水平檢測炎癥因子表達(dá)的重要技術(shù)，其原理基于抗原抗體的特異性結(jié)合。蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的生物大分子，不同的蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，這些特征使得蛋白質(zhì)成為具有免疫原性的抗原。當(dāng)機(jī)體受到抗原刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生特異性的抗體，抗體能夠識(shí)別并結(jié)合抗原上的特定抗原決定簇。在Westernblot法中，將經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜或聚偏二氟乙烯膜）上。固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。隨后，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的特異性抗體起免疫反應(yīng)?？贵w與抗原的結(jié)合具有高度特異性，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)。再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影，即可檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。例如，若要檢測大鼠DAI模型中TNF-α的表達(dá)，首先利用TNF-α的特異性抗體與轉(zhuǎn)移到固相載體上的TNF-α蛋白結(jié)合，然后加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與一抗特異性結(jié)合，最后加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，從而檢測出TNF-α蛋白的表達(dá)情況。以檢測IL-6蛋白表達(dá)為例，其具體操作流程如下：首先進(jìn)行樣品制備，對于大鼠腦組織樣本，先將其稱重，然后按照每50-100mg組織加入1ml裂解液的比例，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的裂解液。使用勻漿器將組織充分勻漿，勻漿過程需在冰上進(jìn)行，以防止蛋白質(zhì)降解。勻漿后，將樣品在4℃下以12000g離心15-20分鐘，取上清液，即為蛋白質(zhì)樣品。接著進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，采用BCA法或Bradford法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行定量，以確定每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)定量結(jié)果，將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至相同濃度，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)的比較。隨后進(jìn)行SDS電泳，根據(jù)IL-6蛋白的分子量大小，選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將調(diào)整好濃度的蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，加熱使蛋白質(zhì)變性。將變性后的樣品加入到凝膠的加樣孔中，同時(shí)加入蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品作為參照。在一定電壓下進(jìn)行電泳，使蛋白質(zhì)在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上。可采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法，濕轉(zhuǎn)法是將凝膠和固相膜夾在濾紙中間，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，在低溫條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)；半干轉(zhuǎn)法則是在濾紙和固相膜之間直接施加電場進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電流根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小和轉(zhuǎn)膜方法進(jìn)行調(diào)整。轉(zhuǎn)膜完成后，進(jìn)行封閉，將固相膜放入含有5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）的封閉液中，室溫下孵育1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。封閉結(jié)束后，進(jìn)行一抗孵育，將固相膜放入含有特異性抗IL-6抗體的溶液中，4℃孵育過夜。一抗的稀釋度根據(jù)抗體說明書和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。次日，用TBST緩沖液洗滌固相膜3-5次，每次洗滌10-15分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。隨后進(jìn)行二抗孵育，將固相膜放入含有辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗溶液中，室溫下孵育1-2小時(shí)。二抗能夠特異性地結(jié)合一抗，HRP標(biāo)記的二抗可用于后續(xù)的顯色反應(yīng)。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌固相膜3-5次，每次洗滌10-15分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行顯色檢測，使用化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑）與HRP反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將固相膜放入暗盒中，與X光片或化學(xué)發(fā)光成像儀接觸，曝光一段時(shí)間后，即可檢測到IL-6蛋白的條帶。通過分析條帶的強(qiáng)度和位置，可以確定IL-6蛋白的表達(dá)水平和分子量大小。Westernblot法在炎癥因子檢測中具有獨(dú)特的優(yōu)勢。在定量分析方面，通過圖像分析軟件對條帶的灰度值進(jìn)行分析，可以實(shí)現(xiàn)對炎癥因子表達(dá)水平的半定量分析。將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白（如β-actin、GAPDH等）條帶的灰度值進(jìn)行比較，計(jì)算相對表達(dá)量，從而能夠在一定程度上反映炎癥因子在不同樣本中的表達(dá)差異。在結(jié)果準(zhǔn)確性上，該方法基于抗原抗體的特異性結(jié)合，具有較高的特異性，能夠準(zhǔn)確地檢測目標(biāo)炎癥因子。它可以確定炎癥因子的分子量大小，有助于判斷檢測到的蛋白是否為目標(biāo)炎癥因子，以及是否存在蛋白的降解或修飾等情況。然而，該方法也存在一定的局限性。在檢測靈敏度上，對于低表達(dá)的炎癥因子，可能由于檢測信號(hào)較弱而難以準(zhǔn)確檢測，其檢測限相對較高。操作過程相對復(fù)雜，需要一定的實(shí)驗(yàn)技能和經(jīng)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)周期較長，從樣品制備到結(jié)果檢測，整個(gè)過程可能需要2-3天。此外，該方法只能檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，無法提供炎癥因子在組織中的定位信息。4.3Real-timePCR法Real-timePCR法，即實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)，是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，其核心原理是基于DNA的半保留復(fù)制特性以及熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測。在PCR擴(kuò)增過程中，DNA聚合酶以引物為起始點(diǎn)，按照堿基互補(bǔ)配對原則，將dNTPs逐一添加到模板DNA鏈上，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。隨著擴(kuò)增循環(huán)的進(jìn)行，DNA產(chǎn)物的數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長。Real-timePCR通過引入熒光化學(xué)物質(zhì)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測PCR進(jìn)程。常用的熒光化學(xué)物質(zhì)包括SYBRGreenI和熒光探針。SYBRGreenI是一種能夠與雙鏈DNA結(jié)合的熒光染料，在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI幾乎不發(fā)出熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合，就會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈DNA不斷擴(kuò)增，與SYBRGreenI結(jié)合的量也不斷增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，通過檢測熒光信號(hào)強(qiáng)度，就可以實(shí)時(shí)反映PCR產(chǎn)物的量。熒光探針則是一段與目標(biāo)DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，其5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。在PCR反應(yīng)中，當(dāng)引物延伸至探針結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性會(huì)將探針?biāo)?，使熒光?bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，從而發(fā)出熒光信號(hào)。熒光信號(hào)的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，通過監(jiān)測熒光信號(hào)的變化，就可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的定量檢測。以IL-1檢測為例，操作過程如下：首先進(jìn)行RNA提取，對于大鼠腦組織樣本，使用RNA提取試劑盒（如TRIzol試劑）進(jìn)行提取。將適量的TRIzol試劑加入到腦組織中，充分勻漿，使組織細(xì)胞裂解，釋放出RNA。加入氯仿后離心，溶液會(huì)分層，RNA存在于上層水相中，小心吸取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA。經(jīng)過洗滌、干燥等步驟后，得到純凈的RNA。接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（如PrimeScriptRTreagentKit）。按照試劑盒說明書，將RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs等試劑混合，在特定的溫度條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)IL-1基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)需要考慮引物的長度、Tm值、特異性等因素。將cDNA、PCR反應(yīng)緩沖液、引物、dNTPs、Taq酶等試劑混合，加入到PCR反應(yīng)管中。在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)置合適的擴(kuò)增程序，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟。在擴(kuò)增過程中，若使用SYBRGreenI染料，熒光信號(hào)會(huì)隨著PCR產(chǎn)物的增加而增強(qiáng)；若使用熒光探針，探針?biāo)夂髸?huì)釋放出熒光信號(hào)。最后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過PCR儀自帶的軟件或?qū)ｉT的數(shù)據(jù)分析軟件，分析熒光信號(hào)的變化，得到Ct值（Cyclethreshold，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。Ct值與起始模板量呈負(fù)相關(guān)，起始模板量越多，Ct值越小。通過與內(nèi)參基因（如GAPDH）的Ct值進(jìn)行比較，采用2-ΔΔCt法等方法計(jì)算IL-1基因的相對表達(dá)量。Real-timePCR法在炎癥因子mRNA表達(dá)水平檢測方面具有顯著優(yōu)勢。在靈敏度方面，該方法能夠檢測到極低拷貝數(shù)的mRNA，具有極高的靈敏度。這是因?yàn)镻CR反應(yīng)本身具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，能夠?qū)⑽⒘康哪繕?biāo)mRNA擴(kuò)增至可檢測水平，結(jié)合熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，能夠準(zhǔn)確地檢測到低表達(dá)的炎癥因子mRNA。在特異性方面，通過設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，能夠高度特異性地識(shí)別目標(biāo)炎癥因子的mRNA序列，避免了非特異性擴(kuò)增，提高了檢測的準(zhǔn)確性。例如，針對IL-1設(shè)計(jì)的特異性引物和探針，能夠準(zhǔn)確地檢測IL-1的mRNA，而不會(huì)與其他炎癥因子或基因發(fā)生交叉反應(yīng)。然而，該方法也存在一定局限性。在操作復(fù)雜性上，Real-timePCR法涉及RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增等多個(gè)步驟，每個(gè)步驟都需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，操作相對復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高。在樣本要求上，RNA易降解，對樣本的采集、保存和處理要求嚴(yán)格，若樣本處理不當(dāng)，可能會(huì)導(dǎo)致RNA降解，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。4.4酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種基于抗原抗體特異性結(jié)合原理的檢測技術(shù)，其基本原理是將已知的抗原或抗體固定在固相載體表面，然后加入待檢測樣品，樣品中的相應(yīng)抗體或抗原會(huì)與固定在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。隨后，加入酶標(biāo)記的第二抗體，第二抗體與結(jié)合在固相載體上的抗原抗體復(fù)合物特異性結(jié)合。最后，加入酶的底物，在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，通過檢測顯色的程度，利用分光光度計(jì)測定吸光度，從而實(shí)現(xiàn)對樣品中炎癥因子含量的定量分析。例如，在檢測大鼠DAI模型中IL-6時(shí)，首先將抗IL-6抗體包被在酶標(biāo)板上，加入大鼠血清樣本后，樣本中的IL-6會(huì)與包被抗體結(jié)合。再加入酶標(biāo)記的抗IL-6二抗，二抗與結(jié)合在包被抗體上的IL-6結(jié)合。加入底物后，酶催化底物顯色，通過檢測吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可得出樣本中IL-6的含量。以檢測大鼠血清中TNF-α含量為例，具體操作步驟如下：首先進(jìn)行試劑準(zhǔn)備，包括將洗滌液按照1:20用三蒸水稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)品（凍干粉形式，如2000pg/ml）在使用前每管加入200μl蒸餾水溶解。標(biāo)本收集方面，采集大鼠血清后盡早檢測，若2-8℃保存可保存一天，如需更長時(shí)間保存則須冷凍（-20℃），同時(shí)要避免反復(fù)凍融。器材準(zhǔn)備需包括酶標(biāo)儀、37℃恒溫烤箱、濾紙、托盤、量筒、燒杯、各種規(guī)格的移液器、離心管、管架和廢液缸等。接著進(jìn)行加樣操作，在酶標(biāo)板上設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔先加入樣品稀釋液100μl，第一孔再加入標(biāo)準(zhǔn)品100μl，混勻后進(jìn)行對倍稀釋，即從第一孔吸出100μl移至第二孔，如此反復(fù)作對倍稀釋至第7孔，最后從第7孔吸出100μl棄去，使各孔體積均為100μl，第8孔作為空白對照。待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl。加樣完成后，將反應(yīng)板置于37℃孵育120分鐘。孵育結(jié)束后進(jìn)行洗板，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上扣干。然后每孔加入第一抗體工作液50μl，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃孵育60分鐘。再次洗板后，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μl，將反應(yīng)板置于37℃孵育120分鐘。之后再次洗板，每孔中加入底物工作液100μl，置于37℃暗處反應(yīng)5-10分鐘。最后每孔中加入50μl終止液混勻，用酶標(biāo)儀在492nm處測吸光值。通過標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品的吸光值減去空白管值后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出或根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算出相應(yīng)樣品中TNF-α含量。ELISA法在定量檢測血清或腦脊液中炎癥因子含量方面具有廣泛應(yīng)用。在血清檢測中，能夠準(zhǔn)確地測定多種炎癥因子的含量，為臨床診斷和病情評(píng)估提供重要依據(jù)。例如，在大鼠DAI研究中，通過檢測血清中TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的含量變化，可以了解炎癥反應(yīng)的程度和進(jìn)程，輔助判斷DAI的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后。在腦脊液檢測中，ELISA法也能夠檢測出炎癥因子的含量，由于腦脊液直接與腦組織接觸，其炎癥因子含量的變化更能反映腦組織的炎癥狀態(tài)，對于研究DAI后腦組織的炎癥反應(yīng)具有重要意義。ELISA法具有諸多優(yōu)點(diǎn)。在靈敏度方面，其檢測限可以達(dá)到ng級(jí)，能夠檢測到低濃度的炎癥因子。這是因?yàn)槊傅拇呋屎芨撸ㄟ^酶標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合后，酶催化底物產(chǎn)生的顯色反應(yīng)可以放大信號(hào)，從而增大檢測的靈敏度。在特異性上，基于抗原抗體的特異性結(jié)合，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別目標(biāo)炎癥因子，減少非特異性結(jié)合的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性。操作簡便也是其一大優(yōu)勢，實(shí)驗(yàn)過程相對簡單，不需要復(fù)雜的設(shè)備和高超的技術(shù)，一般的實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過培訓(xùn)即可掌握。此外，ELISA法還具有可同時(shí)檢測多個(gè)樣本的特點(diǎn)，適用于大量樣本的檢測，能夠提高實(shí)驗(yàn)效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。然而，ELISA法也存在一定的局限性。在檢測通量上，雖然可以同時(shí)檢測多個(gè)樣本，但對于需要同時(shí)檢測多種炎癥因子的情況，其檢測通量相對較低，無法滿足高通量檢測的需求。該方法需要使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量和準(zhǔn)確性會(huì)影響檢測結(jié)果的可靠性。ELISA法只能檢測已知的炎癥因子，對于未知的炎癥因子無法進(jìn)行檢測。五、炎癥因子表達(dá)與彌漫性軸索損傷病理機(jī)制的關(guān)聯(lián)5.1炎癥因子與軸索損傷腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等炎癥因子在彌漫性軸索損傷（DAI）過程中，對軸索膜通透性和軸漿運(yùn)輸產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而破壞軸索結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致軸索損傷和斷裂。TNF-α作為一種關(guān)鍵的炎癥因子，在DAI后表達(dá)迅速升高。它可以通過多種途徑影響軸索膜通透性。TNF-α能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。在正常生理狀態(tài)下，神經(jīng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)維持著細(xì)胞的正常功能和穩(wěn)定性。然而，當(dāng)TNF-α大量釋放時(shí)，它會(huì)激活一系列氧化酶類，如脂氧合酶和環(huán)氧化酶，導(dǎo)致細(xì)胞膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物。這些脂質(zhì)過氧化物會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和穩(wěn)定性下降，從而導(dǎo)致軸索膜通透性增加。TNF-α還可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，上調(diào)細(xì)胞膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)或改變其功能。NF-κB被激活后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)一些離子通道基因（如鈣離子通道基因）和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。過多的鈣離子內(nèi)流會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，進(jìn)一步損傷軸索膜，導(dǎo)致軸索膜通透性異常升高。軸漿運(yùn)輸是維持軸索正常功能的重要生理過程，它負(fù)責(zé)將神經(jīng)元胞體合成的物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、神經(jīng)遞質(zhì)前體等）運(yùn)輸?shù)捷S索末梢，同時(shí)將軸索末梢攝取的物質(zhì)運(yùn)回胞體。TNF-α對軸漿運(yùn)輸也有顯著的干擾作用。研究表明，TNF-α可以抑制驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白等參與軸漿運(yùn)輸?shù)姆肿玉R達(dá)的活性。驅(qū)動(dòng)蛋白負(fù)責(zé)將物質(zhì)從胞體向軸索末梢運(yùn)輸，而動(dòng)力蛋白則負(fù)責(zé)將物質(zhì)從軸索末梢向胞體運(yùn)輸。TNF-α可能通過磷酸化或其他修飾作用，改變這些分子馬達(dá)的結(jié)構(gòu)和功能，使其與微管的結(jié)合能力下降，從而抑制軸漿運(yùn)輸。TNF-α還可以通過影響微管的穩(wěn)定性來干擾軸漿運(yùn)輸。微管是軸漿運(yùn)輸?shù)能壍?，其穩(wěn)定性對于軸漿運(yùn)輸?shù)恼＿M(jìn)行至關(guān)重要。TNF-α可以誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白的降解或改變其磷酸化狀態(tài)，導(dǎo)致微管解聚，破壞軸漿運(yùn)輸?shù)能壍?，進(jìn)而影響軸漿運(yùn)輸?shù)恼＿M(jìn)行。當(dāng)軸漿運(yùn)輸受到抑制時(shí)，軸索末梢無法獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和神經(jīng)遞質(zhì)前體，導(dǎo)致軸索功能障礙，長期下去，軸索會(huì)逐漸發(fā)生萎縮、變性，最終導(dǎo)致軸索斷裂。IL-1在DAI后的炎癥反應(yīng)中也起著關(guān)鍵作用，對軸索結(jié)構(gòu)和功能同樣會(huì)造成破壞。在軸索膜通透性方面，IL-1可以通過激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化?；罨纳窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞）會(huì)釋放多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，其中一些物質(zhì)可以直接作用于軸索膜，改變其通透性?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）等物質(zhì)。NO具有很強(qiáng)的氧化活性，它可以與軸索膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的損傷和通透性改變。ROS也會(huì)對軸索膜造成氧化損傷，破壞膜的完整性和功能，使軸索膜通透性增加。IL-1還可以通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)來影響軸索膜通透性。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分的酶類。在IL-1的刺激下，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)分泌更多的MMPs，這些MMPs可以降解軸索周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，破壞軸索與周圍組織的正常連接，導(dǎo)致軸索膜的穩(wěn)定性下降，通透性增加。在軸漿運(yùn)輸方面，IL-1可以通過影響細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性來干擾軸漿運(yùn)輸。細(xì)胞骨架（包括微管、微絲和中間絲）是維持軸索形態(tài)和軸漿運(yùn)輸正常進(jìn)行的重要結(jié)構(gòu)。IL-1可以激活一些蛋白激酶，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員。這些蛋白激酶被激活后，會(huì)磷酸化細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。MAPK可以磷酸化微管相關(guān)蛋白tau，使tau蛋白從微管上解離下來，導(dǎo)致微管解聚，破壞軸漿運(yùn)輸?shù)能壍溃瑥亩绊戄S漿運(yùn)輸。IL-1還可以通過影響神經(jīng)生長因子（NGF）等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)來干擾軸漿運(yùn)輸。NGF對軸索的生長、發(fā)育和維持正常功能起著重要作用。IL-1可以抑制NGF的表達(dá)或阻斷其信號(hào)傳導(dǎo)通路，使軸索無法獲得足夠的神經(jīng)營養(yǎng)支持，導(dǎo)致軸漿運(yùn)輸異常，最終影響軸索的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致軸索損傷和斷裂。5.2炎癥因子與神經(jīng)元凋亡炎癥因子在神經(jīng)元凋亡中扮演著關(guān)鍵角色，通過對Caspase家族、Bcl-2家族等神經(jīng)元凋亡相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制，深刻影響著神經(jīng)元的命運(yùn)，其誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的分子機(jī)制復(fù)雜且多途徑。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）作為一種重要的炎癥因子，與神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)，在相關(guān)信號(hào)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TNF-α可以通過與腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）結(jié)合，啟動(dòng)外源性凋亡信號(hào)通路。TNFR1是一種跨膜受體，當(dāng)TNF-α與TNFR1結(jié)合后，TNFR1的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TRADD）。TRADD進(jìn)而招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和半胱天冬酶-8（Caspase-8），形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，Caspase-8發(fā)生自身活化，活化的Caspase-8可以直接切割并激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7，這些效應(yīng)Caspase會(huì)作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。研究表明，在大鼠彌漫性軸索損傷模型中，TNF-α的表達(dá)升高會(huì)伴隨著Caspase-8和Caspase-3的活性增強(qiáng)，以及神經(jīng)元凋亡數(shù)量的增加。當(dāng)使用TNF-α拮抗劑阻斷TNF-α與TNFR1的結(jié)合時(shí)，Caspase-8和Caspase-3的活性降低，神經(jīng)元凋亡明顯減少。TNF-α還可以通過線粒體途徑間接誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。TNF-α與TNFR1結(jié)合后，激活的信號(hào)通路可以導(dǎo)致線粒體膜電位的下降。線粒體膜電位的下降會(huì)使線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP）開放，導(dǎo)致線粒體釋放細(xì)胞色素C（CytoC）到細(xì)胞質(zhì)中。CytoC與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體。凋亡小體招募并激活Caspase-9，Caspase-9再激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。在這個(gè)過程中，Bcl-2家族蛋白起著重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。TNF-α可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和功能，影響線粒體的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，使Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL相互作用，破壞線粒體膜的穩(wěn)定性，促進(jìn)CytoC的釋放。TNF-α還可以抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)線粒體途徑的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)。在大鼠DAI模型中，觀察到TNF-α表達(dá)升高時(shí)，Bax的表達(dá)增加，Bcl-2的表達(dá)減少，線粒體膜電位下降，CytoC釋放增加，神經(jīng)元凋亡加劇。當(dāng)使用藥物上調(diào)Bcl-2的表達(dá)或抑制Bax的功能時(shí)，可以減輕TNF-α誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。白細(xì)胞介素-1（IL-1）同樣能夠通過多種機(jī)制影響神經(jīng)元凋亡相關(guān)信號(hào)通路。IL-1可以激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。IL-1與細(xì)胞表面的IL-1受體結(jié)合后，通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，激活I(lǐng)κB激酶（IKK）。IKK磷酸化IκB，使其降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。在神經(jīng)元凋亡中，NF-κB的激活具有雙重作用。在一定程度上，NF-κB的激活可以誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-xL等，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，過度激活的NF-κB也可以誘導(dǎo)促凋亡基因的表達(dá)，如TNF-α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等。iNOS的表達(dá)增加會(huì)導(dǎo)致一氧化氮（NO）的產(chǎn)生增多，NO具有細(xì)胞毒性，可導(dǎo)致神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。研究表明，在大鼠DAI模型中，IL-1刺激后，NF-κB的活性迅速升高，早期抗凋亡基因的表達(dá)增加，但隨著時(shí)間的推移，促凋亡基因的表達(dá)逐漸占主導(dǎo)地位，神經(jīng)元凋亡增加。當(dāng)使用NF-κB抑制劑抑制NF-κB的活性時(shí)，可以減少神經(jīng)元凋亡。IL-1還可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路來影響神經(jīng)元凋亡。IL-1與受體結(jié)合后，激活MAPK激酶激酶（MKKK），MKKK激活MAPK激酶（MKK），MKK再激活MAPK，包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。ERK信號(hào)通路在正常情況下對神經(jīng)元具有保護(hù)作用，它可以通過磷酸化和激活一些轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖相關(guān)基因的表達(dá)。然而，在炎癥條件下，過度激活的ERK信號(hào)通路可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1刺激后，ERK的磷酸化水平升高，當(dāng)使用ERK抑制劑阻斷其活性時(shí)，可以減輕神經(jīng)元凋亡。JNK和p38MAPK信號(hào)通路在IL-1誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡中主要發(fā)揮促凋亡作用。JNK和p38MAPK被激活后，可以磷酸化多種底物，包括轉(zhuǎn)錄因子c-Jun和ATF-2等，這些轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)促凋亡基因的表達(dá)，如Bax、Fas等，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡。在大鼠DAI模型中，IL-1刺激后，JNK和p38MAPK的磷酸化水平顯著升高，同時(shí)伴隨著Bax和Fas表達(dá)的增加以及神經(jīng)元凋亡的增多。使用JNK和p38MAPK抑制劑可以有效抑制其磷酸化水平，減少Bax和Fas的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)元凋亡。5.3炎癥因子與血腦屏障損傷炎癥因子對血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白的影響顯著，進(jìn)而導(dǎo)致血腦屏障通透性增加，引發(fā)腦水腫和神經(jīng)功能障礙。血腦屏障是大腦與全身血液循環(huán)系統(tǒng)之間的重要屏障結(jié)構(gòu)，由血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的血管周足構(gòu)成。其主要功能是控制物質(zhì)從血液向腦組織的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，阻止大部分細(xì)胞因子、大分子蛋白、細(xì)菌及其毒素等進(jìn)入腦內(nèi)，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受外來有害物質(zhì)的侵害。緊密連接蛋白如閉鎖小帶蛋白（ZO-1）和閉合蛋白（Claudin-5）等是血腦屏障形成的關(guān)鍵，它們通過相互作用形成連續(xù)的屏障，防止大分子物質(zhì)直接穿過細(xì)胞間隙。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-1（IL-1）等炎癥因子在DAI發(fā)生后，可通過多種途徑影響緊密連接蛋白。TNF-α能夠誘導(dǎo)血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞中ZO-1和Claudin-5的表達(dá)減少。在正常生理狀態(tài)下，ZO-1和Claudin-5緊密連接，維持血腦屏障的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當(dāng)TNF-α大量釋放時(shí)，它可以激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB被激活后，會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制ZO-1和Claudin-5基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致其表達(dá)減少。TNF-α還可以通過激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，使ZO-1和Claudin-5發(fā)生磷酸化修飾，改變