大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)特征與定位研究一、引言1.1研究背景與意義腦缺血性疾病作為一類嚴(yán)重危害人類健康的疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，給患者及其家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)，也對(duì)社會(huì)醫(yī)療資源造成了巨大的壓力。腦缺血再灌注損傷（CerebralIschemia-ReperfusionInjury，CIRI）是指腦缺血后恢復(fù)血流灌注，腦組織損傷反而加重的現(xiàn)象。在腦缺血的急性期，由于血流中斷，腦組織會(huì)迅速出現(xiàn)缺氧、能量代謝障礙等問(wèn)題，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損。當(dāng)恢復(fù)血流灌注后，原本缺血的腦組織卻面臨著更為復(fù)雜和嚴(yán)重的損傷，這一過(guò)程涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性氨基酸毒性以及細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制。氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用。在缺血期間，腦組織中的氧供應(yīng)急劇減少，細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能受損，導(dǎo)致能量代謝障礙。當(dāng)血流恢復(fù)后，大量的氧分子進(jìn)入缺血組織，產(chǎn)生大量的氧自由基，如超氧陰離子、羥自由基等。這些自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，使細(xì)胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。自由基還可以氧化蛋白質(zhì)和核酸，影響細(xì)胞的正常代謝和基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。炎癥反應(yīng)也是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。在缺血再灌注過(guò)程中，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞被迅速激活，它們會(huì)聚集在缺血腦組織周圍，并釋放大量的炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等。這些炎性介質(zhì)不僅會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增加，加重腦水腫，還會(huì)吸引更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。炎癥反應(yīng)還會(huì)破壞血腦屏障的完整性，使有害物質(zhì)更容易進(jìn)入腦組織，加劇神經(jīng)功能障礙。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是腦缺血再灌注損傷的另一個(gè)重要因素。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平，這對(duì)于細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。在腦缺血期間，由于細(xì)胞膜的損傷和離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的紊亂，細(xì)胞外的鈣離子大量涌入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度急劇升高。當(dāng)血流恢復(fù)后，這種鈣離子超載的情況進(jìn)一步加劇，激活了多種酶類，如磷脂酶、蛋白激酶和核酸酶等。這些酶的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂的分解、蛋白質(zhì)的磷酸化和核酸的降解，從而破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。興奮性氨基酸毒性在腦缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著重要作用。在腦缺血再灌注過(guò)程中，興奮性氨基酸如谷氨酸等大量釋放，過(guò)度激活谷氨酸受體。這會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜對(duì)鈉離子和氯離子的通透性增加，使大量的鈉離子和氯離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞腫脹和損傷。過(guò)度激活谷氨酸受體還會(huì)導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加，加重細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。興奮性氨基酸還可以通過(guò)引發(fā)氧化應(yīng)激和凋亡等機(jī)制，加重腦缺血再灌注損傷。細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的一種重要方式。在缺血再灌注過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞受到多種損傷信號(hào)的刺激，會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。凋亡過(guò)程涉及多種基因和蛋白的表達(dá)調(diào)控，如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，它們之間的平衡決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在腦缺血再灌注損傷中，促凋亡蛋白的表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白的表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。盡管目前針對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療方法眾多，如溶栓治療、神經(jīng)保護(hù)劑治療、低溫治療、細(xì)胞治療和血管生成治療等，但這些治療方法仍存在一定的局限性，無(wú)法完全有效地逆轉(zhuǎn)腦缺血再灌注損傷。因此，深入探究腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略，對(duì)于提高腦血管疾病的治療效果，改善患者的預(yù)后具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。Wnt信號(hào)通路作為一種在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移以及組織穩(wěn)態(tài)維持等多種生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，Wnt信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中也扮演著重要角色。Wnt信號(hào)通路可分為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在該通路中，當(dāng)Wnt配體與Frizzled受體和共受體LRP5/6結(jié)合后，會(huì)激活下游的信號(hào)分子，抑制β-catenin的降解。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并易位到細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）結(jié)合，啟動(dòng)Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路則不依賴于β-catenin，包括Wnt/PCP通路和Wnt-Ca2?通路等，它們?cè)诩?xì)胞極性、遷移和鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要作用。Wnt7b作為Wnt蛋白家族的重要成員之一，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能維持中具有不可或缺的作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt7b參與調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育至關(guān)重要。研究表明，Wnt7b基因敲除的小鼠會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，如神經(jīng)管閉合缺陷、神經(jīng)元遷移障礙等。在成年神經(jīng)系統(tǒng)中，Wnt7b也參與維持神經(jīng)細(xì)胞的正常功能和神經(jīng)突觸的可塑性。Wnt7b通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的存活、增殖和分化，促進(jìn)神經(jīng)突觸的形成和維持，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能具有重要影響。在腦缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的異常激活或抑制與神經(jīng)細(xì)胞的損傷和修復(fù)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷模型中，Wnt7b的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生顯著變化，并且這種變化與神經(jīng)功能的恢復(fù)密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，激活Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增加神經(jīng)細(xì)胞的存活，減少細(xì)胞凋亡，從而對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。相反，抑制該信號(hào)通路則會(huì)加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙加重。海馬作為大腦中與學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)，在腦缺血再灌注損傷中極易受到損傷。海馬中的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧非常敏感，腦缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞的大量死亡和凋亡，從而引起學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能障礙。研究Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷后海馬中的表達(dá)與定位，對(duì)于深入了解該信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制，以及尋找新的治療靶點(diǎn)和策略具有重要意義。通過(guò)研究該信號(hào)通路在海馬中的變化規(guī)律，可以揭示其在神經(jīng)細(xì)胞損傷和修復(fù)過(guò)程中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對(duì)腦缺血再灌注損傷的治療藥物提供理論依據(jù)。對(duì)Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的研究還可以為臨床治療腦缺血再灌注損傷提供新的思路和方法，有望改善患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探究大鼠腦缺血再灌注后，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在海馬區(qū)的表達(dá)變化規(guī)律及其細(xì)胞定位情況，從而揭示該信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制，為腦缺血性疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。圍繞這一目的，提出以下關(guān)鍵問(wèn)題：Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)的表達(dá)如何變化？：在腦缺血再灌注的不同時(shí)間點(diǎn)，Wnt7b及β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)改變。研究這些變化有助于了解該信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷進(jìn)程中的激活或抑制情況，明確其在損傷不同階段的作用。比如在缺血早期，Wnt7b的表達(dá)可能迅速上調(diào)，以啟動(dòng)內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，其表達(dá)又可能呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，這對(duì)判斷神經(jīng)細(xì)胞的損傷與修復(fù)進(jìn)程具有重要意義。Wnt7b和β-catenin在海馬區(qū)的細(xì)胞定位有何特點(diǎn)？：明確Wnt7b和β-catenin在海馬區(qū)具體的細(xì)胞定位，如在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞中的分布情況，有助于深入理解該信號(hào)通路在不同細(xì)胞類型中的作用機(jī)制。若Wnt7b主要在神經(jīng)元中表達(dá)并激活β-catenin信號(hào)，可能提示其對(duì)神經(jīng)元的存活和功能維持具有直接作用；而若在星形膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，則可能通過(guò)調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的功能間接影響神經(jīng)細(xì)胞的微環(huán)境，進(jìn)而影響神經(jīng)損傷與修復(fù)。Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的變化與腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷及功能恢復(fù)有何關(guān)聯(lián)？：通過(guò)觀察Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的變化與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡、壞死、增殖以及神經(jīng)突觸可塑性等指標(biāo)的相關(guān)性，能夠進(jìn)一步明確該信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。若信號(hào)通路的激活能減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)突觸的再生，那么可以推測(cè)其對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)具有積極影響，這為后續(xù)開發(fā)基于該信號(hào)通路的治療策略提供了重要的理論基礎(chǔ)。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇選用健康成年的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重控制在250-300g之間。選擇雄性大鼠是因?yàn)樾坌源笫笤谏硖卣骱蛯?duì)實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)上相對(duì)更為一致，可減少因性別差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)，有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。從正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商處采購(gòu)大鼠，確保其遺傳背景清晰、無(wú)特定病原體感染，且在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水，維持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，溫度控制在22-25℃，濕度保持在40%-60%。1.3.2腦缺血再灌注模型制備采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（MCAO/R）模型。術(shù)前12h大鼠禁食不禁水，用10%水合氯醛（300mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部剃毛后，使用碘伏消毒。在手術(shù)顯微鏡下，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。小心分離與CCA和ECA伴行的迷走神經(jīng)，避免損傷。在近心端結(jié)扎CCA，用微動(dòng)脈夾夾閉CCA分叉處以及ECA近心端，在CCA中央打一活結(jié)備用。用1ml注射器針頭在CCA活結(jié)下方1cm處斜刺一小口，插入頭端經(jīng)石蠟處理的魚線（直徑0.26mm，頭端1mm做過(guò)蠟處理，從過(guò)蠟端算起，在18-22mm處做好標(biāo)記），拉緊活結(jié)固定魚線，松開動(dòng)脈夾，將魚線緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至遇到輕微阻力，此時(shí)魚線已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端，插入深度約18-22mm，固定線栓，結(jié)扎ECA近心端，消毒后逐層縫合切口，將多余魚線剪掉，留一段在皮膚外以便后續(xù)再灌注操作。缺血120min后，輕輕拉出栓線尾端，恢復(fù)腦血流灌注。假手術(shù)組大鼠除不插入魚線和不結(jié)扎CCA、ECA外，其余操作與MCAO/R組相同。手術(shù)過(guò)程中使用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)大鼠腦血流變化，確保缺血和再灌注成功。缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)為腦血流相對(duì)灌注單位小于20%基線值，再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)為腦血流灌注恢復(fù)至50%以上基線值。術(shù)后密切觀察大鼠的蘇醒情況、飲食和活動(dòng)狀態(tài)，單籠飼養(yǎng)，白熾燈照射維持肛溫在36-37℃，直至大鼠完全蘇醒恢復(fù)活動(dòng)，并給予正常飲水和泡發(fā)的鼠糧。1.3.3樣本采集在腦缺血再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)（6h、12h、24h、48h、72h），分別對(duì)MCAO/R組和假手術(shù)組大鼠進(jìn)行樣本采集。用過(guò)量10%水合氯醛麻醉大鼠，迅速斷頭取腦，將大腦置于冰生理鹽水中沖洗，去除血液和雜質(zhì)。在冰臺(tái)上，沿冠狀面將大腦切成厚度約2mm的腦片，使用大鼠腦圖譜定位海馬區(qū)，用眼科剪小心分離出海馬組織，一部分海馬組織立即放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)；另一部分海馬組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫熒光（IF）檢測(cè)。1.3.4檢測(cè)技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）：將凍存的海馬組織取出，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分研磨，使組織裂解完全。4℃、12000rpm離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。取等量的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入兔抗大鼠Wnt7b抗體、兔抗大鼠β-catenin抗體和鼠抗大鼠GAPDH抗體（內(nèi)參），4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。TBST洗膜3次后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算Wnt7b和β-catenin蛋白的相對(duì)表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）：使用TRIzol試劑提取海馬組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH?O。引物序列根據(jù)GenBank中大鼠Wnt7b和β-catenin的基因序列設(shè)計(jì)，由專業(yè)生物公司合成，以GAPDH作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算Wnt7b和β-cateninmRNA的相對(duì)表達(dá)量。免疫組織化學(xué)（IHC）：將固定好的海馬組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片，厚度為4μm。切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻后用5%山羊血清封閉30min。分別加入兔抗大鼠Wnt7b抗體和兔抗大鼠β-catenin抗體，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗片3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。PBS洗片后，使用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，脫水、透明后封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，分析Wnt7b和β-catenin在海馬組織中的表達(dá)和定位情況。免疫熒光（IF）：石蠟切片脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)和封閉處理，方法同IHC。分別加入兔抗大鼠Wnt7b抗體和兔抗大鼠β-catenin抗體，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗片3次，加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗），室溫避光孵育1h。PBS洗片后，用DAPI染液染細(xì)胞核，封片。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析Wnt7b和β-catenin在海馬組織中的共定位情況以及在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)情況，可通過(guò)與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1進(jìn)行雙標(biāo)染色來(lái)確定其細(xì)胞定位。1.3.5數(shù)據(jù)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett'sT3法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用GraphPadPrism8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，直觀展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先選取健康成年雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行腦缺血再灌注模型制備，分為MCAO/R組和假手術(shù)組。在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩組大鼠進(jìn)行樣本采集，包括海馬組織。然后運(yùn)用Westernblot、qRT-PCR、IHC和IF等檢測(cè)技術(shù)，分別從蛋白和基因水平檢測(cè)Wnt7b和β-catenin在海馬組織中的表達(dá)和定位情況。最后對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以揭示W(wǎng)nt7b/β-catenin信號(hào)通路在大鼠腦缺血再灌注后海馬區(qū)的變化規(guī)律及作用機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備、模型制備、樣本采集、檢測(cè)技術(shù)到數(shù)據(jù)分析的整個(gè)流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，注明關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)和操作內(nèi)容]二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1腦缺血再灌注損傷概述腦缺血再灌注損傷（CIRI）是指腦缺血后恢復(fù)血流灌注，腦組織損傷反而加重的現(xiàn)象。這種損傷在急性缺血性腦血管病的治療過(guò)程中極為常見，如腦梗死患者在進(jìn)行溶栓、取栓等再通治療后，雖恢復(fù)了腦部血流，但卻可能面臨更復(fù)雜的損傷機(jī)制，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙進(jìn)一步加劇。腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，是多種病理生理過(guò)程相互作用的結(jié)果。在缺血初期，腦組織由于血液供應(yīng)中斷，氧氣和葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法正常輸送，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量代謝迅速障礙。細(xì)胞內(nèi)的線粒體作為能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，因缺氧而無(wú)法正常進(jìn)行有氧呼吸，三磷酸腺苷（ATP）生成急劇減少。ATP是細(xì)胞維持正常生理功能的重要能量來(lái)源，其含量的降低會(huì)引發(fā)一系列連鎖反應(yīng)，如細(xì)胞膜上的離子泵功能受損，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子平衡失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)鈉離子和氯離子大量積聚，引起細(xì)胞水腫。當(dāng)血流恢復(fù)后，原本缺血的腦組織會(huì)經(jīng)歷再灌注過(guò)程，然而這一過(guò)程卻會(huì)觸發(fā)更為嚴(yán)重的損傷。氧化應(yīng)激是腦缺血再灌注損傷中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在缺血期間，細(xì)胞內(nèi)的氧自由基清除系統(tǒng)因能量缺乏而功能下降，導(dǎo)致氧自由基在細(xì)胞內(nèi)大量積累。再灌注時(shí)，大量的氧氣進(jìn)入缺血組織，為氧自由基的產(chǎn)生提供了更多的底物，使得氧自由基的生成進(jìn)一步增加。這些氧自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)外流，進(jìn)一步破壞細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。氧自由基還可以氧化蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性失活，影響細(xì)胞內(nèi)的各種酶促反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)通路；氧化核酸則會(huì)導(dǎo)致基因突變和DNA損傷，影響細(xì)胞的正常代謝和遺傳信息傳遞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中也起著重要作用。缺血再灌注過(guò)程會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等被迅速募集到缺血腦組織周圍。這些炎癥細(xì)胞會(huì)釋放大量的炎性介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些炎性介質(zhì)不僅會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增加，使血漿中的蛋白質(zhì)和液體滲出到組織間隙，加重腦水腫，還會(huì)吸引更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。炎癥反應(yīng)還會(huì)破壞血腦屏障的完整性，使有害物質(zhì)更容易進(jìn)入腦組織，加劇神經(jīng)功能障礙。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是腦缺血再灌注損傷的另一個(gè)重要因素。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度受到嚴(yán)格的調(diào)控，維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的低水平。在腦缺血期間，由于細(xì)胞膜的損傷和離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的紊亂，細(xì)胞外的鈣離子大量涌入細(xì)胞內(nèi)。再灌注時(shí)，這種鈣離子超載的情況進(jìn)一步加劇，激活了多種酶類，如磷脂酶、蛋白激酶和核酸酶等。磷脂酶的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂的分解，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)；蛋白激酶的激活會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)過(guò)度磷酸化，影響蛋白質(zhì)的正常功能；核酸酶的激活則會(huì)導(dǎo)致核酸的降解，破壞細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。興奮性氨基酸毒性在腦缺血再灌注損傷中也發(fā)揮著重要作用。在腦缺血再灌注過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞會(huì)大量釋放興奮性氨基酸，如谷氨酸等。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在正常情況下，其釋放和攝取處于平衡狀態(tài)，以維持正常的神經(jīng)傳導(dǎo)。在腦缺血再灌注損傷時(shí)，這種平衡被打破，谷氨酸大量釋放且攝取減少，導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸濃度急劇升高。過(guò)高濃度的谷氨酸會(huì)過(guò)度激活谷氨酸受體，如N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（AMPA）受體。這些受體的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜對(duì)鈉離子和氯離子的通透性增加，使大量的鈉離子和氯離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞腫脹和損傷。過(guò)度激活谷氨酸受體還會(huì)導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加，加重細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。興奮性氨基酸還可以通過(guò)引發(fā)氧化應(yīng)激和凋亡等機(jī)制，加重腦缺血再灌注損傷。細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的一種重要方式。在缺血再灌注過(guò)程中，神經(jīng)細(xì)胞受到多種損傷信號(hào)的刺激，會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。凋亡過(guò)程涉及多種基因和蛋白的表達(dá)調(diào)控，如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl等），它們之間的平衡決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。在腦缺血再灌注損傷中，促凋亡蛋白的表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白的表達(dá)減少，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，如Caspase-3、Caspase-9等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。腦缺血再灌注損傷對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成的損害是多方面的，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。在細(xì)胞水平上，神經(jīng)細(xì)胞的死亡和凋亡會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)傳導(dǎo)功能受損。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，如星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，在腦缺血再灌注損傷后也會(huì)發(fā)生形態(tài)和功能的改變，影響其對(duì)神經(jīng)元的支持和保護(hù)作用。在組織水平上，腦缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致腦組織水腫、梗死灶形成，破壞腦組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在功能水平上，患者可能出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙、運(yùn)動(dòng)功能障礙、感覺功能障礙等多種臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的日常生活能力和社會(huì)適應(yīng)能力。細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷中起著重要作用。研究表明，在腦缺血再灌注后的早期，神經(jīng)細(xì)胞凋亡就已經(jīng)開始發(fā)生，并在一定時(shí)間內(nèi)逐漸增加。通過(guò)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和凋亡細(xì)胞的數(shù)量，可以發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后，Bax、Caspase-3等促凋亡蛋白的表達(dá)明顯增加，而Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)減少，凋亡細(xì)胞的數(shù)量也顯著增多。這些結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡是腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要機(jī)制之一。炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷中的作用也得到了廣泛的研究。在腦缺血再灌注損傷后，炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性介質(zhì)的釋放會(huì)導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，缺血腦組織中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量在再灌注后迅速增加，同時(shí)TNF-α、IL-1β等炎性介質(zhì)的表達(dá)也顯著上調(diào)。這些炎癥細(xì)胞和炎性介質(zhì)會(huì)相互作用，形成炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷。氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中的機(jī)制也有深入的研究。通過(guò)檢測(cè)氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，可以發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注損傷后，缺血腦組織中氧自由基的含量明顯增加，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物如丙二醛（MDA）的含量也顯著升高。這些結(jié)果表明，氧化應(yīng)激在腦缺血再灌注損傷中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)清除氧自由基和抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，可以減輕腦缺血再灌注損傷。2.2海馬的結(jié)構(gòu)與功能海馬位于大腦顳葉內(nèi)側(cè)，是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和重要的生理功能使其在神經(jīng)科學(xué)研究中占據(jù)著舉足輕重的地位。從解剖學(xué)角度來(lái)看，海馬呈C形或S形彎曲，緊密環(huán)繞在側(cè)腦室下角的底部。它主要由海馬體、齒狀回和下托等部分構(gòu)成。海馬體是海馬的主體部分，其神經(jīng)元呈層狀排列，根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和連接方式的不同，又可進(jìn)一步細(xì)分為CA1、CA2、CA3和CA4區(qū)。CA1區(qū)位于海馬體的最前端，與下托相連，其神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧等損傷因素極為敏感，在腦缺血再灌注損傷中往往最早出現(xiàn)損傷和死亡。研究表明，在腦缺血再灌注模型中，CA1區(qū)的神經(jīng)元在缺血后短時(shí)間內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，如細(xì)胞腫脹、線粒體損傷等，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元死亡的數(shù)量逐漸增加。CA3區(qū)是海馬體中細(xì)胞最為密集的區(qū)域，具有豐富的神經(jīng)纖維連接，它不僅接受來(lái)自齒狀回的傳入纖維，還發(fā)出大量的傳出纖維投射到其他腦區(qū)，在海馬的神經(jīng)信息處理和傳遞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CA2區(qū)的神經(jīng)元相對(duì)較少，但其功能獨(dú)特，在維持海馬的正常節(jié)律和穩(wěn)定性方面具有重要作用。CA4區(qū)則與齒狀回緊密相連，參與了齒狀回與海馬體之間的神經(jīng)信號(hào)傳遞。齒狀回是海馬的另一個(gè)重要組成部分，它位于海馬體的內(nèi)側(cè)，呈齒狀外觀，故而得名。齒狀回主要由顆粒細(xì)胞組成，這些顆粒細(xì)胞是齒狀回的主要神經(jīng)元類型，它們的軸突形成苔蘚纖維，投射到CA3區(qū)，與CA3區(qū)的錐體細(xì)胞形成突觸連接。齒狀回在神經(jīng)發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，成年哺乳動(dòng)物的齒狀回中存在著神經(jīng)干細(xì)胞，這些神經(jīng)干細(xì)胞可以不斷增殖、分化，產(chǎn)生新的神經(jīng)元，參與海馬的神經(jīng)可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注損傷后，齒狀回的神經(jīng)發(fā)生會(huì)受到顯著影響，表現(xiàn)為神經(jīng)干細(xì)胞增殖減少、分化異常等，這可能與腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)。下托是海馬與其他腦區(qū)之間的過(guò)渡區(qū)域，它連接著海馬體和海馬旁回等腦區(qū)，在海馬的信息輸出和整合中發(fā)揮著重要作用。下托接受來(lái)自海馬體的傳出纖維，并將這些信息進(jìn)一步傳遞到其他腦區(qū)，如丘腦、杏仁核等，參與了情緒調(diào)節(jié)、記憶鞏固等多種生理功能。海馬在學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著核心作用。在學(xué)習(xí)和記憶方面，海馬參與了多種類型的記憶形成和鞏固過(guò)程。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，海馬損傷會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的記憶障礙，尤其是情景記憶和空間記憶受損。例如，在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，海馬損傷的大鼠表現(xiàn)出明顯的空間學(xué)習(xí)和記憶能力下降，無(wú)法準(zhǔn)確找到隱藏在水中的平臺(tái)。這是因?yàn)楹ｑR中的神經(jīng)元通過(guò)復(fù)雜的突觸連接和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，參與了記憶的編碼、存儲(chǔ)和提取過(guò)程。在記憶編碼階段，海馬神經(jīng)元對(duì)新的信息進(jìn)行特異性的神經(jīng)元活動(dòng)模式編碼，將外界刺激轉(zhuǎn)化為神經(jīng)信號(hào)并存儲(chǔ)在神經(jīng)元之間的突觸連接中。在記憶鞏固階段，海馬通過(guò)與其他腦區(qū)的相互作用，將短期記憶轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)期記憶，使記憶信息更加穩(wěn)定地存儲(chǔ)在大腦中。在情緒調(diào)節(jié)方面，海馬與杏仁核、前額葉皮質(zhì)等腦區(qū)共同構(gòu)成了情緒調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。海馬通過(guò)與杏仁核的雙向連接，參與了情緒的認(rèn)知和調(diào)控過(guò)程。當(dāng)個(gè)體面臨情緒刺激時(shí)，杏仁核會(huì)迅速被激活，產(chǎn)生情緒反應(yīng)，而海馬則通過(guò)對(duì)情緒事件的背景信息進(jìn)行編碼和存儲(chǔ)，幫助個(gè)體更好地理解和應(yīng)對(duì)情緒刺激，調(diào)節(jié)情緒反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。臨床研究發(fā)現(xiàn)，海馬損傷的患者往往出現(xiàn)情緒調(diào)節(jié)障礙，表現(xiàn)為焦慮、抑郁等情緒問(wèn)題，這進(jìn)一步證明了海馬在情緒調(diào)節(jié)中的重要作用。在腦缺血再灌注損傷研究中，海馬因其對(duì)缺血缺氧的高度敏感性而成為重點(diǎn)關(guān)注的腦區(qū)。腦缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞的大量死亡和凋亡，破壞海馬的正常結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而引發(fā)學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能障礙和情緒調(diào)節(jié)異常。研究海馬在腦缺血再灌注損傷后的病理變化和修復(fù)機(jī)制，對(duì)于深入了解腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法具有重要意義。通過(guò)對(duì)海馬的研究，可以揭示腦缺血再灌注損傷對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷機(jī)制，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等在海馬中的具體作用途徑，為開發(fā)針對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物提供理論依據(jù)。2.3Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路簡(jiǎn)介Wnt信號(hào)通路是一類在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、遷移以及組織穩(wěn)態(tài)維持等多種生理過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該信號(hào)通路主要包括經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，其中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路在細(xì)胞命運(yùn)決定、組織器官形成等方面起著核心調(diào)控作用。Wnt7b是Wnt蛋白家族的重要成員之一，其編碼基因位于染色體12q13.13上，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成。Wnt7b蛋白是一種分泌型糖蛋白，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)信號(hào)肽序列、一個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD）和一個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域。信號(hào)肽序列位于Wnt7b蛋白的N端，負(fù)責(zé)引導(dǎo)蛋白質(zhì)的分泌；富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域則是Wnt7b與受體結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，其中包含多個(gè)保守的半胱氨酸殘基，這些殘基通過(guò)形成二硫鍵維持CRD的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，確保Wnt7b能夠與受體特異性結(jié)合。C末端結(jié)構(gòu)域則在Wnt7b信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它參與了Wnt7b與下游信號(hào)分子的相互作用，調(diào)節(jié)信號(hào)通路的激活和傳導(dǎo)。β-catenin是一種多功能的蛋白質(zhì)，它在細(xì)胞內(nèi)具有雙重作用。一方面，β-catenin是細(xì)胞間黏附連接的重要組成部分，與E-cadherin等黏附分子結(jié)合，形成鈣黏蛋白-catenin復(fù)合物，參與維持細(xì)胞間的黏附連接，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、組織的完整性和穩(wěn)定性具有重要意義。另一方面，β-catenin也是經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子。在該信號(hào)通路中，β-catenin的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位受到嚴(yán)格調(diào)控。在沒(méi)有Wnt信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin與結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白（APC）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和軸蛋白（Axin）等形成降解復(fù)合物。GSK-3β可使β-catenin的N端特定氨基酸殘基磷酸化，磷酸化后的β-catenin被泛素連接酶識(shí)別并泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)Wnt配體（如Wnt7b）與細(xì)胞膜上的Frizzled（Fz）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合后，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的Dishevelled（Dsh）蛋白。Dsh蛋白通過(guò)抑制GSK-3β的活性，阻止β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中逐漸積累。隨著β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的濃度升高，它會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物。該復(fù)合物能夠招募多種轉(zhuǎn)錄共激活因子，如B細(xì)胞淋巴瘤9（BCL9）、Pygopus等，從而啟動(dòng)Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1、AxIN2等。這些靶基因參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，對(duì)細(xì)胞的命運(yùn)和功能產(chǎn)生重要影響。在細(xì)胞增殖方面，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如CyclinD1等，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。研究表明，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在神經(jīng)干細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著重要作用，維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力，保證神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，該信號(hào)通路的異常激活也會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖，許多腫瘤細(xì)胞中都存在Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的異常活化，使得腫瘤細(xì)胞獲得持續(xù)增殖的能力。在細(xì)胞分化方面，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路可以調(diào)控細(xì)胞的分化方向。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，該信號(hào)通路參與神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化過(guò)程。適當(dāng)激活Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，而抑制該信號(hào)通路則會(huì)影響神經(jīng)元的分化，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)育異常。在其他組織和器官的發(fā)育過(guò)程中，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路也在細(xì)胞分化調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如在骨骼發(fā)育中，它參與調(diào)控成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化。在細(xì)胞遷移方面，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，影響細(xì)胞的遷移能力。該信號(hào)通路可以激活Rho家族小GTP酶，如Rac1、Cdc42等，這些小GTP酶能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，促進(jìn)細(xì)胞的偽足形成和遷移。Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，如E-cadherin等，改變細(xì)胞間的黏附力，從而影響細(xì)胞的遷移行為。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞的遷移對(duì)于組織器官的形成至關(guān)重要，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)。2.4研究現(xiàn)狀與進(jìn)展在腦缺血再灌注損傷的研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已針對(duì)海馬區(qū)展開了大量深入研究。在病理生理機(jī)制方面，已明確海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧高度敏感，腦缺血再灌注后，海馬區(qū)會(huì)迅速啟動(dòng)一系列復(fù)雜的病理生理變化。在缺血初期，由于血液供應(yīng)中斷，海馬神經(jīng)細(xì)胞的能量代謝急劇障礙，ATP生成大幅減少，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的離子泵功能受損，細(xì)胞內(nèi)鈉離子和氯離子大量積聚，引發(fā)細(xì)胞水腫。隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)一步受損，呼吸鏈中斷，氧自由基大量產(chǎn)生，這些自由基具有極強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重受損，細(xì)胞內(nèi)的離子和小分子物質(zhì)外流，進(jìn)一步破壞細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。再灌注階段，大量的氧氣進(jìn)入缺血的海馬組織，使得氧自由基的生成進(jìn)一步增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇。炎癥反應(yīng)也在這一階段被迅速激活，炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等大量浸潤(rùn)到海馬區(qū)，它們釋放出大量的炎性介質(zhì)，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，這些炎性介質(zhì)不僅會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增加，加重腦水腫，還會(huì)吸引更多的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載也是腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)的重要病理變化之一，再灌注時(shí)，細(xì)胞外的鈣離子大量涌入細(xì)胞內(nèi)，激活多種酶類，如磷脂酶、蛋白激酶和核酸酶等，這些酶的激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜磷脂的分解、蛋白質(zhì)的磷酸化和核酸的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在腦缺血再灌注損傷后海馬神經(jīng)細(xì)胞死亡中起著關(guān)鍵作用。研究表明，腦缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生顯著變化，如Bax、Caspase-3等促凋亡蛋白的表達(dá)明顯增加，而Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)減少，從而促使神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。興奮性氨基酸毒性在海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷中也發(fā)揮著重要作用，腦缺血再灌注損傷后，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞會(huì)大量釋放興奮性氨基酸，如谷氨酸等，過(guò)高濃度的谷氨酸會(huì)過(guò)度激活谷氨酸受體，導(dǎo)致細(xì)胞膜對(duì)鈉離子和氯離子的通透性增加，細(xì)胞腫脹和損傷，同時(shí)還會(huì)導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增加，加重細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，進(jìn)一步損傷神經(jīng)細(xì)胞。在Wnt信號(hào)通路與腦缺血再灌注損傷的研究方面，近年來(lái)取得了一系列重要進(jìn)展。眾多研究表明，Wnt信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中被激活，且其激活狀態(tài)與神經(jīng)細(xì)胞的損傷和修復(fù)密切相關(guān)。激活Wnt信號(hào)通路可以通過(guò)多種機(jī)制對(duì)腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，如促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，增加神經(jīng)細(xì)胞的存活，減少細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激損傷等。在一項(xiàng)針對(duì)大鼠腦缺血再灌注模型的研究中，通過(guò)給予外源性Wnt配體激活Wnt信號(hào)通路，發(fā)現(xiàn)能夠顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，增加海馬區(qū)新生神經(jīng)元的數(shù)量，從而改善神經(jīng)功能。另一項(xiàng)研究表明，激活Wnt信號(hào)通路可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)腦缺血再灌注損傷后的海馬神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。然而，目前對(duì)于Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)的表達(dá)與定位研究仍存在一定的不足與空白。雖然已有研究表明Wnt信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，但對(duì)于Wnt7b這一特定的Wnt配體在海馬區(qū)的具體作用機(jī)制研究相對(duì)較少。在Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)方面，雖然一些研究觀察到了該信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷后的變化趨勢(shì)，但對(duì)于其在不同時(shí)間點(diǎn)的精確表達(dá)水平以及在海馬不同亞區(qū)（如CA1、CA2、CA3和齒狀回等）的表達(dá)差異研究不夠深入。對(duì)于Wnt7b和β-catenin在海馬區(qū)的細(xì)胞定位研究也不夠系統(tǒng)全面，尚未明確它們?cè)诓煌?xì)胞類型（如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等）中的具體分布情況以及在細(xì)胞內(nèi)的亞定位（如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等）。這些研究空白限制了我們對(duì)Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中作用機(jī)制的深入理解，也為后續(xù)開發(fā)基于該信號(hào)通路的治療策略帶來(lái)了困難。因此，深入研究Wnt7b/β-catenin信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)的表達(dá)與定位，對(duì)于揭示該信號(hào)通路在腦缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和策略具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境本實(shí)驗(yàn)選用健康成年的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，共計(jì)60只，體重范圍嚴(yán)格控制在250-300g。選擇雄性大鼠的原因在于，雄性大鼠在生理特征和對(duì)實(shí)驗(yàn)處理的反應(yīng)上相對(duì)更為一致，這有助于減少因性別差異導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果波動(dòng)，從而提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。這些大鼠均從正規(guī)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商處采購(gòu)，供應(yīng)商具備完善的動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)體系，能夠確保大鼠的遺傳背景清晰，無(wú)特定病原體感染，為實(shí)驗(yàn)的可靠性提供了有力保障。大鼠購(gòu)入后，先在實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。動(dòng)物房環(huán)境嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制，維持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，以模擬自然環(huán)境，確保大鼠的生理節(jié)律不受干擾。溫度恒定控制在22-25℃，濕度保持在40%-60%，這樣的溫濕度條件有利于大鼠的健康生長(zhǎng)，能減少因環(huán)境因素導(dǎo)致的大鼠生理狀態(tài)變化，從而降低對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的潛在影響。在飼養(yǎng)期間，大鼠自由進(jìn)食和飲水，所提供的飼料為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒類動(dòng)物專用飼料，營(yíng)養(yǎng)成分均衡，能夠滿足大鼠的生長(zhǎng)和生理需求；飲用水為經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理的純凈水，確保大鼠的飲食安全，避免因飲食問(wèn)題引發(fā)感染或其他健康問(wèn)題，影響實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行。3.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器本實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑涵蓋多個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域，在蛋白與基因檢測(cè)方面，兔抗大鼠Wnt7b抗體、兔抗大鼠β-catenin抗體，均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，這兩種抗體特異性強(qiáng)，能夠精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)蛋白，為后續(xù)對(duì)Wnt7b和β-catenin的蛋白表達(dá)與定位研究提供可靠保障。鼠抗大鼠GAPDH抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，GAPDH作為常用的內(nèi)參蛋白，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，用于校正樣本上樣量，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗，同樣來(lái)自武漢博士德生物工程有限公司，其能與一抗特異性結(jié)合，通過(guò)酶促反應(yīng)放大信號(hào)，增強(qiáng)檢測(cè)的靈敏度。TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，它是一種高效的總RNA提取試劑，能有效裂解細(xì)胞，保持RNA的完整性，防止RNA降解，為后續(xù)的qRT-PCR實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的RNA模板。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，這些試劑盒操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)高效，能將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)精確檢測(cè)Wnt7b和β-catenin的mRNA表達(dá)水平。在免疫組織化學(xué)與免疫熒光檢測(cè)中，3%過(guò)氧化氫溶液用于消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免非特異性染色，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。檸檬酸鹽緩沖液用于抗原修復(fù)，使抗原決定簇重新暴露，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。5%山羊血清用于封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色，提高實(shí)驗(yàn)的特異性。DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，用于免疫組織化學(xué)染色的顯色反應(yīng)，使目標(biāo)蛋白在顯微鏡下呈現(xiàn)出清晰的棕色沉淀，便于觀察和分析。AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗兔IgG，用于免疫熒光染色，這兩種熒光標(biāo)記二抗能分別與一抗結(jié)合，在熒光顯微鏡下發(fā)出不同顏色的熒光，便于對(duì)Wnt7b和β-catenin進(jìn)行共定位分析。DAPI染液用于染細(xì)胞核，使其在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出藍(lán)色熒光，方便對(duì)細(xì)胞進(jìn)行定位和計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)用到的主要儀器包括PCR儀，型號(hào)為ABI7500Fast，購(gòu)自美國(guó)AppliedBiosystems公司，該儀器具有高效、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠快速完成PCR反應(yīng)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。熒光顯微鏡，型號(hào)為ZEISSLSM880，購(gòu)自德國(guó)ZEISS公司，其具備高分辨率和高靈敏度，能夠清晰觀察到熒光標(biāo)記的樣本，為免疫熒光檢測(cè)提供了良好的觀察條件。凝膠成像系統(tǒng)，型號(hào)為Bio-RadChemiDocMP，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，可對(duì)蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)中的凝膠進(jìn)行成像和分析，精確測(cè)量條帶灰度值，定量分析蛋白表達(dá)水平。高速離心機(jī)，型號(hào)為Eppendorf5424R，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品的高速離心，滿足實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞裂解液、RNA提取液等樣本的離心需求。酶標(biāo)儀，型號(hào)為ThermoScientificMultiskanGO，購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司，用于蛋白質(zhì)定量和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定等實(shí)驗(yàn)，具有高精度和高重復(fù)性。石蠟切片機(jī)，型號(hào)為L(zhǎng)eicaRM2235，購(gòu)自德國(guó)Leica公司，能夠制作出厚度均勻的石蠟切片，滿足免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)對(duì)切片質(zhì)量的要求。包埋機(jī)，型號(hào)為L(zhǎng)eicaEG1160，同樣購(gòu)自德國(guó)Leica公司，用于將組織樣本包埋在石蠟中，制成便于切片的蠟塊。3.3實(shí)驗(yàn)分組與模型制備本實(shí)驗(yàn)將60只健康成年雄性SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）和腦缺血再灌注組（MCAO/R組），每組各30只。分組的隨機(jī)性旨在最大程度減少組間差異，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和科學(xué)性，使兩組大鼠在年齡、體重、生理狀態(tài)等方面盡可能均衡，避免因個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生干擾。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注（MCAO/R）模型，該方法能夠較好地模擬人類腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程，具有操作相對(duì)簡(jiǎn)便、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于腦缺血再灌注損傷的相關(guān)研究中。術(shù)前12h，大鼠禁食不禁水，以避免手術(shù)過(guò)程中因食物反流導(dǎo)致窒息等意外情況發(fā)生，同時(shí)保證大鼠體內(nèi)的生理代謝狀態(tài)相對(duì)穩(wěn)定，減少實(shí)驗(yàn)誤差。用10%水合氯醛（300mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，該麻醉劑量能夠使大鼠迅速進(jìn)入麻醉狀態(tài)，且麻醉效果穩(wěn)定，便于后續(xù)手術(shù)操作。將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，使大鼠身體保持平穩(wěn)，便于手術(shù)操作，同時(shí)可減少大鼠因掙扎而造成的手術(shù)損傷。頸部剃毛后，使用碘伏消毒，以殺滅皮膚表面的細(xì)菌，降低手術(shù)感染的風(fēng)險(xiǎn)。在手術(shù)顯微鏡下，沿頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織，小心暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。在分離過(guò)程中，動(dòng)作需輕柔，避免損傷周圍的血管和神經(jīng)，因?yàn)檫@些結(jié)構(gòu)的損傷可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。仔細(xì)分離與CCA和ECA伴行的迷走神經(jīng)，迷走神經(jīng)在心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用，若在手術(shù)過(guò)程中受到損傷，可能會(huì)引起大鼠心率、血壓等生理指標(biāo)的波動(dòng)，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在近心端結(jié)扎CCA，用微動(dòng)脈夾夾閉CCA分叉處以及ECA近心端，以阻斷血流，為后續(xù)插入線栓做準(zhǔn)備。在CCA中央打一活結(jié)備用，活結(jié)的作用是便于后續(xù)插入線栓時(shí)固定線栓，防止線栓脫出。用1ml注射器針頭在CCA活結(jié)下方1cm處斜刺一小口，插入頭端經(jīng)石蠟處理的魚線（直徑0.26mm，頭端1mm做過(guò)蠟處理，從過(guò)蠟端算起，在18-22mm處做好標(biāo)記），石蠟處理可使魚線頭端更加光滑，減少對(duì)血管壁的損傷，同時(shí)便于插入血管。拉緊活結(jié)固定魚線，松開動(dòng)脈夾，將魚線緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至遇到輕微阻力，此時(shí)魚線已到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始端，插入深度約18-22mm，固定線栓，結(jié)扎ECA近心端，消毒后逐層縫合切口，將多余魚線剪掉，留一段在皮膚外以便后續(xù)再灌注操作。插入深度的控制至關(guān)重要，若插入過(guò)淺，無(wú)法有效阻斷大腦中動(dòng)脈血流，導(dǎo)致缺血不完全，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；若插入過(guò)深，則可能損傷其他腦血管，造成腦出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，同樣會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。缺血120min后，輕輕拉出栓線尾端，恢復(fù)腦血流灌注。缺血時(shí)間的選擇基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，120min的缺血時(shí)間能夠?qū)е麓笫竽X組織出現(xiàn)明顯的缺血再灌注損傷，且模型成功率較高，同時(shí)可重復(fù)性好。假手術(shù)組大鼠除不插入魚線和不結(jié)扎CCA、ECA外，其余操作與MCAO/R組相同。假手術(shù)組的設(shè)置是為了排除手術(shù)操作本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，作為對(duì)照組，用于對(duì)比分析腦缺血再灌注組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，明確實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化是由腦缺血再灌注損傷引起的，而非手術(shù)操作等其他因素。手術(shù)過(guò)程中使用激光多普勒血流儀監(jiān)測(cè)大鼠腦血流變化，確保缺血和再灌注成功。缺血成功的標(biāo)準(zhǔn)為腦血流相對(duì)灌注單位小于20%基線值，再灌注成功的標(biāo)準(zhǔn)為腦血流灌注恢復(fù)至50%以上基線值。激光多普勒血流儀能夠?qū)崟r(shí)、準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)腦血流變化，為判斷缺血和再灌注是否成功提供客觀依據(jù)，有助于提高實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷馁|(zhì)量和可靠性。術(shù)后密切觀察大鼠的蘇醒情況、飲食和活動(dòng)狀態(tài)，單籠飼養(yǎng)，白熾燈照射維持肛溫在36-37℃，直至大鼠完全蘇醒恢復(fù)活動(dòng)，并給予正常飲水和泡發(fā)的鼠糧。術(shù)后的護(hù)理和觀察對(duì)于大鼠的恢復(fù)至關(guān)重要，維持肛溫穩(wěn)定可減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生，單籠飼養(yǎng)可避免大鼠之間的相互干擾，保證每只大鼠都能得到充分的觀察和護(hù)理。3.4指標(biāo)檢測(cè)方法3.4.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分在腦缺血再灌注損傷研究中，準(zhǔn)確評(píng)估大鼠的神經(jīng)功能缺損程度至關(guān)重要，這有助于判斷模型的成功與否以及后續(xù)治療措施的效果。目前，常用的神經(jīng)功能缺損評(píng)分方法包括Bederson評(píng)分和Longa評(píng)分等。Bederson評(píng)分系統(tǒng)依據(jù)大鼠的神經(jīng)行為表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分，共分為4個(gè)等級(jí)。0分表示大鼠無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損，其肢體活動(dòng)自如，無(wú)任何異常行為；1分表明大鼠出現(xiàn)輕度神經(jīng)功能缺損，主要表現(xiàn)為不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢，這是由于腦缺血再灌注損傷影響了對(duì)側(cè)肢體的運(yùn)動(dòng)控制；2分提示大鼠存在中度神經(jīng)功能缺損，此時(shí)大鼠在行走時(shí)會(huì)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，這是因?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)受損導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性和平衡能力下降；3分則代表大鼠有重度神經(jīng)功能缺損，大鼠在行走時(shí)會(huì)向?qū)?cè)傾倒，甚至無(wú)法維持正常的行走姿勢(shì)，這反映出其神經(jīng)系統(tǒng)損傷較為嚴(yán)重，對(duì)運(yùn)動(dòng)功能產(chǎn)生了極大的影響。Longa評(píng)分同樣是基于大鼠的神經(jīng)行為改變來(lái)評(píng)估神經(jīng)功能缺損程度，其評(píng)分范圍為0-4分。0分表示大鼠神經(jīng)功能正常，無(wú)任何神經(jīng)系統(tǒng)異常體征；1分表現(xiàn)為大鼠不能完全伸展病變對(duì)側(cè)上肢，這是神經(jīng)系統(tǒng)受損的早期表現(xiàn)之一；2分顯示大鼠行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，說(shuō)明其運(yùn)動(dòng)功能受到了進(jìn)一步的影響；3分體現(xiàn)為大鼠行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒，表明其神經(jīng)功能缺損較為嚴(yán)重；4分則表示大鼠無(wú)自發(fā)活動(dòng)且意識(shí)降低，這是神經(jīng)功能嚴(yán)重受損的表現(xiàn)，可能與大腦皮質(zhì)和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)的廣泛損傷有關(guān)。本研究采用Longa評(píng)分法，分別在腦缺血再灌注后的2h、24h、48h和72h對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。選擇這些時(shí)間點(diǎn)是因?yàn)樵谀X缺血再灌注后的早期（2h），可以觀察到神經(jīng)功能的急性損傷變化；24h時(shí)，神經(jīng)損傷可能進(jìn)一步發(fā)展，同時(shí)也是炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程較為活躍的時(shí)期；48h和72h則有助于了解神經(jīng)功能的恢復(fù)情況以及損傷的持續(xù)進(jìn)展。評(píng)分由兩名經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)且不知道實(shí)驗(yàn)分組的實(shí)驗(yàn)人員配合完成，以減少主觀因素對(duì)評(píng)分結(jié)果的影響。在評(píng)分過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員會(huì)仔細(xì)觀察大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)、行走姿態(tài)、平衡能力等多個(gè)方面的表現(xiàn)，嚴(yán)格按照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分，確保評(píng)分結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.4.2腦梗死體積測(cè)定腦梗死體積是評(píng)估腦缺血再灌注損傷程度的重要指標(biāo)之一，它能夠直觀地反映腦組織的受損范圍和程度。本研究采用TTC染色法測(cè)定腦梗死體積，該方法具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于腦梗死體積的測(cè)定。TTC染色法的原理基于正常腦組織和梗死腦組織對(duì)TTC的不同反應(yīng)。TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）是一種無(wú)色的水溶性化合物，在正常腦組織中，由于線粒體脫氫酶的存在，TTC能夠被還原為紅色的三苯基甲臜（TPF），從而使正常腦組織染成紅色。而在梗死腦組織中，由于線粒體功能受損，脫氫酶活性喪失，TTC無(wú)法被還原，梗死組織則呈現(xiàn)白色。通過(guò)這種顏色差異，可以清晰地區(qū)分正常腦組織和梗死腦組織。具體操作步驟如下：在腦缺血再灌注后的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，將大鼠用過(guò)量10%水合氯醛麻醉后迅速斷頭取腦。將大腦置于冰生理鹽水中沖洗，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后在冰臺(tái)上，沿冠狀面將大腦切成厚度約2mm的腦片。將腦片立即放入2%的TTC溶液中，37℃避光孵育30min，期間輕輕搖晃，使TTC溶液充分接觸腦片。孵育結(jié)束后，將腦片取出，用生理鹽水沖洗數(shù)次，去除表面多余的TTC溶液。將染色后的腦片放入4%多聚甲醛溶液中固定24h，使腦組織形態(tài)保持穩(wěn)定。固定后的腦片使用圖像分析軟件（如ImageJ）進(jìn)行分析，通過(guò)設(shè)定合適的閾值，將紅色的正常腦組織和白色的梗死腦組織進(jìn)行區(qū)分，計(jì)算梗死腦組織的面積。將各個(gè)腦片的梗死面積進(jìn)行累加，并結(jié)合腦片的厚度，計(jì)算出腦梗死體積百分比，公式為：腦梗死體積百分比=（梗死體積/全腦體積）×100%。通過(guò)這種方法，可以準(zhǔn)確地測(cè)定腦梗死體積，為研究腦缺血再灌注損傷的程度提供量化的數(shù)據(jù)支持。3.4.3RT-PCR檢測(cè)Wnt7bmRNA表達(dá)RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測(cè)基因的表達(dá)水平。其原理是先以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成互補(bǔ)的DNA（cDNA），然后以cDNA為模板，利用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)和分析，間接反映出樣本中原始RNA的含量，從而了解基因的表達(dá)情況。在本研究中，使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)Wnt7bmRNA的表達(dá)，具體操作步驟如下：首先，提取海馬組織總RNA。將凍存的海馬組織取出，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入適量的液氮，將組織研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中，加入1mlTRIzol試劑，劇烈振蕩15s，使組織充分裂解。室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩30s，室溫靜置3min。4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無(wú)色水相，含有RNA；中層為白色蛋白層；下層為紅色有機(jī)相。小心吸取上層無(wú)色水相，轉(zhuǎn)移至另一新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃靜置30min，使RNA沉淀。4℃、12000rpm離心10min，棄上清，可見管底部有白色或透明的RNA沉淀。加入1ml75%乙醇，輕輕振蕩洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心10min，棄上清。用濾紙小心吸取殘留液體，室溫干燥5-10min，注意不要使RNA沉淀過(guò)于干燥，以免影響后續(xù)溶解。將干燥后的RNA沉淀溶于20μlDEPC水（無(wú)RNA酶水）中，取1μl加入79μlDEPC水，使用分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280值，評(píng)估RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280值在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)和DNA污染，-70℃保存?zhèn)溆谩＝又M(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書配置反應(yīng)體系，一般包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPMix、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物、RNA模板和DEPC水。將上述試劑依次加入到無(wú)RNA酶的PCR管中，輕輕混勻，短暫離心，使試劑集中在管底。將PCR管放入PCR儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，一般程序?yàn)椋?7℃孵育15-30min（引物與RNA模板退火及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃孵育5s（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶），4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA可直接用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增，或-20℃保存?zhèn)溆?。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中大鼠Wnt7b的基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性引物，由專業(yè)生物公司合成。引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。以GAPDH作為內(nèi)參基因，其引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。按照SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書配置PCR反應(yīng)體系，一般包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。將上述試劑依次加入到無(wú)核酸酶的PCR管中，輕輕混勻，短暫離心，使試劑集中在管底。將PCR管放入熒光定量PCR儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，一般程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，儀器會(huì)自動(dòng)采集熒光信號(hào)，生成擴(kuò)增曲線和熔解曲線。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算Wnt7bmRNA的相對(duì)表達(dá)量，公式為：ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組），相對(duì)表達(dá)量=2^(-ΔΔCt)。通過(guò)比較不同組間Wnt7bmRNA的相對(duì)表達(dá)量，分析其表達(dá)水平的變化。3.4.4免疫熒光檢測(cè)Wnt7b和β-catenin蛋白表達(dá)與定位免疫熒光技術(shù)是一種利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)熒光標(biāo)記的二抗來(lái)檢測(cè)和定位組織或細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的技術(shù)。在本研究中，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬組織中Wnt7b和β-catenin蛋白的表達(dá)與定位情況。具體操作步驟如下：首先進(jìn)行海馬組織切片的制備。將固定在4%多聚甲醛溶液中的海馬組織取出，依次進(jìn)行脫水處理，即分別用70%、80%、90%、95%和100%的乙醇溶液浸泡，每個(gè)濃度浸泡時(shí)間根據(jù)組織大小和質(zhì)地而定，一般為1-2h，以去除組織中的水分。脫水后的組織用二甲苯透明，同樣每個(gè)濃度浸泡1-2h，使組織變得透明，便于后續(xù)浸蠟和包埋。將透明后的組織放入融化的石蠟中浸蠟，一般在60℃左右的石蠟中浸蠟2-3次，每次1-2h，使石蠟充分滲透到組織中。將浸蠟后的組織包埋在石蠟塊中，使用石蠟切片機(jī)切成厚度為4μm的切片，將切片貼附在載玻片上，60℃烤片1-2h，使切片牢固附著在載玻片上。然后進(jìn)行抗原修復(fù)。將切片放入盛有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，放入微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù)，一般采用高火加熱至沸騰，然后轉(zhuǎn)中火維持10-15min，使抗原決定簇重新暴露。修復(fù)結(jié)束后，將修復(fù)盒取出，自然冷卻至室溫。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min，以去除殘留的緩沖液。接著進(jìn)行抗體孵育。用5%山羊血清室溫封閉切片30min，以減少非特異性染色。封閉結(jié)束后，吸去多余的血清，不洗，直接加入兔抗大鼠Wnt7b抗體和兔抗大鼠β-catenin抗體（一抗），按照抗體說(shuō)明書稀釋至合適濃度，一般為1:100-1:500，4℃孵育過(guò)夜。次日，將切片從冰箱中取出，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5min，以去除未結(jié)合的一抗。加入AlexaFluor488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和AlexaFluor594標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗），按照抗體說(shuō)明書稀釋至合適濃度，一般為1:200-1:500，室溫避光孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min，以去除未結(jié)合的二抗。最后進(jìn)行熒光染色。用DAPI染液染細(xì)胞核，將DAPI染液稀釋至合適濃度，一般為1:1000-1:2000，滴加在切片上，室溫避光孵育5-10min。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5min，以去除多余的DAPI染液。將切片用抗熒光淬滅封片劑封片，蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)波長(zhǎng)分別為488nm（AlexaFluor488）和594nm（AlexaFluor594），DAPI的激發(fā)波長(zhǎng)為360nm。觀察并分析Wnt7b和β-catenin蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)熒光強(qiáng)度的高低來(lái)判斷蛋白表達(dá)量的多少；分析其定位情況，觀察熒光信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)的分布位置，確定蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核等。為了確定Wnt7b和β-catenin在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)情況，還可以通過(guò)與神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1進(jìn)行雙標(biāo)染色，在熒光顯微鏡下觀察不同熒光信號(hào)的共定位情況，從而明確Wnt7b和β-catenin在不同細(xì)胞類型中的表達(dá)。3.5數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)且全面的分析，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。首先，對(duì)所有收集到的計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。正態(tài)性檢驗(yàn)采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)法，若P值大于0.05，則表明數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布；若P值小于0.05，則數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布。通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，能夠明確后續(xù)應(yīng)采用的統(tǒng)計(jì)分析方法，保證分析結(jié)果的有效性。對(duì)于符合正態(tài)分布的計(jì)量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式進(jìn)行表示，以便直觀地反映數(shù)據(jù)的集中趨勢(shì)和離散程度。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，該檢驗(yàn)方法能夠準(zhǔn)確地分析兩組數(shù)據(jù)之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。例如，在比較假手術(shù)組和腦缺血再灌注組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積等指標(biāo)時(shí)，可運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，判斷腦缺血再灌注損傷對(duì)這些指標(biāo)的影響。當(dāng)涉及多組間比較時(shí)，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。單因素方差分析能夠同時(shí)考慮多個(gè)組的數(shù)據(jù)，分析不同組之間的總體差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在本研究中，若要比較腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)（如6h、12h、24h、48h、72h）的Wnt7b和β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)水平，可通過(guò)單因素方差分析，確定這些時(shí)間點(diǎn)之間的表達(dá)差異是否顯著。對(duì)于單因素方差分析結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的多組數(shù)據(jù)，進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較。組間兩兩比較采用LSD法或Dunnett'sT3法，根據(jù)數(shù)據(jù)的特點(diǎn)和方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果選擇合適的方法。LSD法適用于方差齊性的數(shù)據(jù)，它對(duì)組間差異的檢驗(yàn)敏感度較高，能夠檢測(cè)出較小的差異；Dunnett'sT3法適用于方差不齊的數(shù)據(jù)，它在保證檢驗(yàn)效能的同時(shí)，能夠有效控制I型錯(cuò)誤的發(fā)生率。在比較不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平時(shí)，若方差齊性，可選用LSD法進(jìn)行兩兩比較，明確具體哪些時(shí)間點(diǎn)之間存在顯著差異；若方差不齊，則選用Dunnett'sT3法進(jìn)行分析。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，這是科學(xué)研究中廣泛采用的顯著性水平，能夠在保證研究結(jié)果可靠性的同時(shí)，合理控制假陽(yáng)性錯(cuò)誤的發(fā)生概率。采用GraphPadPrism8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖，該軟件功能強(qiáng)大，能夠根據(jù)不同的數(shù)據(jù)類型和分析目的，繪制出直觀、清晰、美觀的柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖等，便于展示實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更直觀地呈現(xiàn)數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)和組間差異，為研究結(jié)果的解讀和討論提供有力支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分與腦梗死體積結(jié)果在腦缺血再灌注后的不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)假手術(shù)組和MCAO/R組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，結(jié)果如圖2所示。假手術(shù)組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分，表明手術(shù)操作未對(duì)其神經(jīng)功能造成明顯影響。MCAO/R組大鼠在腦缺血再灌注2h后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高，平均評(píng)分為（2.80±0.42）分，這表明腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，MCAO/R組大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分逐漸下降，在再灌注24h時(shí)，評(píng)分為（2.33±0.51）分，與2h時(shí)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明大鼠的神經(jīng)功能開始逐漸恢復(fù)。在再灌注48h時(shí)，評(píng)分為（1.87±0.48）分，神經(jīng)功能進(jìn)一步改善。再灌注72h時(shí)，評(píng)分為（1.40±0.41）分，神經(jīng)功能恢復(fù)更為明顯。通過(guò)對(duì)MCAO/R組不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較，采用單因素方差分析，結(jié)果顯示F=25.684，P<0.01，表明不同時(shí)間點(diǎn)之間的神經(jīng)功能缺損評(píng)分存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，采用LSD法，結(jié)果顯示2h與24h、48h、72h之間的評(píng)分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），24h與48h、72h之間的評(píng)分差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），48h與72h之間的評(píng)分差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠的神經(jīng)功能逐漸恢復(fù)，且不同時(shí)間點(diǎn)之間的恢復(fù)程度存在顯著差異。[此處插入神經(jīng)功能缺損評(píng)分隨時(shí)間變化的折線圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間點(diǎn)（2h、24h、48h、72h），縱坐標(biāo)為神經(jīng)功能缺損評(píng)分，用不同顏色的折線分別表示假手術(shù)組和MCAO/R組，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]采用TTC染色法測(cè)定腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組和MCAO/R組大鼠的腦梗死體積，結(jié)果如圖3所示。假手術(shù)組大鼠腦組織未見明顯梗死灶，腦梗死體積為0。MCAO/R組大鼠在腦缺血再灌注2h后，腦梗死體積明顯增大，平均梗死體積百分比為（35.67±4.21）%。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，腦梗死體積呈現(xiàn)逐漸減小的趨勢(shì)，在再灌注24h時(shí)，腦梗死體積百分比為（30.53±3.85）%，與2h時(shí)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在再灌注48h時(shí)，腦梗死體積百分比為（25.73±3.52）%，神經(jīng)功能進(jìn)一步改善。再灌注72h時(shí)，腦梗死體積百分比為（20.40±3.20）%，腦梗死體積明顯減小。通過(guò)對(duì)MCAO/R組不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積的比較，采用單因素方差分析，結(jié)果顯示F=38.762，P<0.01，表明不同時(shí)間點(diǎn)之間的腦梗死體積存在顯著差異。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較，采用LSD法，結(jié)果顯示2h與24h、48h、72h之間的腦梗死體積差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），24h與48h、72h之間的腦梗死體積差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），48h與72h之間的腦梗死體積差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，腦梗死體積逐漸減小，且不同時(shí)間點(diǎn)之間的減小程度存在顯著差異。[此處插入腦梗死體積隨時(shí)間變化的柱狀圖，橫坐標(biāo)為時(shí)間點(diǎn)（2h、24h、48h、72h），縱坐標(biāo)為腦梗死體積百分比，用不同顏色的柱狀分別表示假手術(shù)組和MCAO/R組，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差]4.2Wnt7bmRNA表達(dá)結(jié)果運(yùn)用RT-PCR技術(shù)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組和MCAO/R組大鼠海馬組織中Wnt7bmRNA的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。假手術(shù)組大鼠海馬組織中Wnt7bmRNA呈現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定的低水平表達(dá)狀態(tài)。在腦缺血再灌注6h時(shí)，MCAO/R組大鼠缺血側(cè)海馬組織中Wnt7bmRNA的表達(dá)水平較假手術(shù)組無(wú)明顯變化（P>0.05），這可能是因?yàn)樵谌毖俟嘧⒃缙冢瑱C(jī)體尚未充分啟動(dòng)對(duì)缺血損傷的應(yīng)激反應(yīng)，Wnt7b的表達(dá)尚未受到顯著影響。隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)至12h，MCAO/R組缺血側(cè)海馬組織中Wnt7bmRNA的表達(dá)水平開始逐漸升高，但與假手術(shù)組相比，差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），此時(shí)可能是機(jī)體開始啟動(dòng)內(nèi)源性的保護(hù)機(jī)制，Wn