大鼠高血壓相關(guān)長鏈非編碼RNA的篩選鑒定與功能解析：探尋高血壓發(fā)病新機制一、引言1.1研究背景高血壓作為一種全球性的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計，全球成年人口中高血壓患者約占25%，預(yù)計到2025年，全球成年高血壓病人數(shù)將高達15.6億，每年因高血壓病死亡的人數(shù)多達940萬。高血壓不僅是一種獨立的疾病，更是心腦血管疾病的重要危險因素，如冠心病、腦卒中、心力衰竭等，這些并發(fā)癥往往導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，甚至危及生命。在中國，隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活方式的改變，高血壓的患病率也在呈現(xiàn)迅猛增長的趨勢，從20世紀(jì)50年代以來的三次大規(guī)模高血壓普查結(jié)果可見一斑，1959年患病率為5.1%，1979年為7.7%，1991年達到11.9%，如今部分經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)高血壓的發(fā)病率已逼近發(fā)達國家水平，中西部地區(qū)發(fā)病率也在快速上升，如重慶局部20歲以上人群高血壓患病率達到34.43%。盡管目前對高血壓的研究已取得了一定進展，包括對腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）、交感神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)皮功能障礙等經(jīng)典發(fā)病機制的深入了解，以及各類降壓藥物如鈣通道阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑（ARB）等的廣泛應(yīng)用，但仍有許多患者的血壓難以得到有效控制，高血壓的發(fā)病機制尚未完全闡明。因此，深入探究高血壓的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點和生物標(biāo)志物具有重要的臨床意義和現(xiàn)實需求。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，非編碼RNA（ncRNA）逐漸成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。非編碼RNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，主要包括微小RNA（miRNA）和長鏈非編碼RNA（lncRNA）等。其中，lncRNA被定義為長度超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄本，雖然起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，但越來越多的研究表明，lncRNA在多種細(xì)胞生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，可通過多水平信號通路調(diào)控基因表達，參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程。在心血管疾病領(lǐng)域，lncRNA的異常表達與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。例如，在動脈粥樣硬化中，某些lncRNA可通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝和血管平滑肌細(xì)胞的功能，影響斑塊的形成和穩(wěn)定性；在心肌梗死中，lncRNA可參與心肌細(xì)胞的凋亡、纖維化和心臟重構(gòu)等過程。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在高血壓的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓狀態(tài)下，動脈壁的超機械拉伸和循環(huán)應(yīng)變的持續(xù)增加與血管重塑密切相關(guān)，而lncRNA可能通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，以及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成和降解，參與高血壓血管重構(gòu)的病理過程。通過分析多例高血壓病人與健康人群血漿lncRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)了一條新的lncRNA——LncVSM，其在高血壓病人的VSMCs中高表達，過表達LncVSM能夠增加由血小板源生長因子（PDGF）刺激引起的人主動脈平滑肌細(xì)胞（HASMCs）的增殖，增強其遷移能力，還能使α-SMA表達減少，OPN和collagenI表達升高，構(gòu)建過表達LncVSM的轉(zhuǎn)基因大鼠在10周齡出現(xiàn)自發(fā)性高血壓。然而，目前關(guān)于lncRNA在高血壓發(fā)病中的作用機制研究仍處于起步階段，大部分lncRNA在高血壓中的功能和作用機制尚不清楚，這為高血壓的研究提供了新的方向和挑戰(zhàn)。1.2研究目的與意義本研究旨在通過高通量測序技術(shù)篩選出與大鼠高血壓相關(guān)的長鏈非編碼RNA，并深入分析其在高血壓發(fā)病過程中的生物學(xué)功能和潛在作用機制。具體而言，主要研究目的包括：首先，構(gòu)建高血壓大鼠模型，運用RNA測序技術(shù)全面分析高血壓大鼠與正常大鼠組織（如主動脈、心臟、腎臟等，這些組織在高血壓病理過程中均起著關(guān)鍵作用）中l(wèi)ncRNA的表達譜，篩選出差異表達的lncRNA，為后續(xù)研究提供關(guān)鍵靶點。其次，通過功能實驗，如RNA干擾技術(shù)敲低或過表達特定lncRNA，研究其對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換以及細(xì)胞外基質(zhì)合成等與高血壓血管重構(gòu)密切相關(guān)過程的影響，明確其在高血壓發(fā)病中的生物學(xué)功能。再者，深入探究差異表達lncRNA調(diào)控高血壓發(fā)病的分子機制，包括其與上下游基因、信號通路的相互作用關(guān)系，揭示其在高血壓發(fā)病過程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。從理論意義來看，目前對高血壓發(fā)病機制的認(rèn)識雖有一定進展，但仍存在許多未知領(lǐng)域，lncRNA在高血壓中的研究尚處于起步階段。本研究有助于進一步揭示高血壓發(fā)病的分子機制，完善高血壓的發(fā)病理論，為心血管疾病的發(fā)病機制研究提供新的視角和思路，豐富非編碼RNA在心血管疾病領(lǐng)域的研究內(nèi)容，推動分子生物學(xué)與心血管疾病研究的交叉融合，促進相關(guān)學(xué)科的發(fā)展。在臨床應(yīng)用價值方面，高血壓的早期診斷和有效治療一直是臨床面臨的挑戰(zhàn)。通過篩選出與高血壓相關(guān)的特異性lncRNA，有望將其開發(fā)為高血壓診斷的新型生物標(biāo)志物，提高高血壓的早期診斷率，實現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早治療。同時，深入了解lncRNA在高血壓發(fā)病中的作用機制，有助于尋找新的治療靶點，為高血壓的治療提供新的策略和方法，研發(fā)更加精準(zhǔn)、有效的治療藥物，改善高血壓患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量，具有重要的臨床實踐意義和社會經(jīng)濟效益。二、大鼠高血壓模型的建立與驗證2.1高血壓模型構(gòu)建方法選擇在高血壓研究中，構(gòu)建合適的大鼠高血壓模型是深入探究疾病發(fā)病機制及尋找有效治療方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常用的大鼠高血壓模型構(gòu)建方式主要包括遺傳性、手術(shù)誘導(dǎo)和飲食誘導(dǎo)這三大類，它們各自具有獨特的特點和應(yīng)用場景。遺傳性高血壓模型是通過特定的遺傳育種方式獲得，例如自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）模型，它由Wistar大鼠近親繁殖20代后，成年動物會自發(fā)出現(xiàn)高血壓，成年大鼠收縮壓可達200mmHg。該模型的優(yōu)點在于高血壓發(fā)生具有自發(fā)性，能夠較好地模擬人類原發(fā)性高血壓的發(fā)病過程，其遺傳背景相對穩(wěn)定，實驗結(jié)果的重復(fù)性較好，便于長期研究高血壓的發(fā)病機制以及遺傳因素在其中的作用。然而，SHR模型的培育過程較為復(fù)雜且成本較高，需要專業(yè)的實驗動物繁育技術(shù)和設(shè)施，而且其高血壓發(fā)病機制可能與人類不完全相同，存在一定的局限性。手術(shù)誘導(dǎo)的高血壓模型主要通過對大鼠的腎臟進行手術(shù)操作來實現(xiàn)，其中腎動脈狹窄性高血壓模型是較為常見的類型，又細(xì)分為兩腎一夾（2K1C）模型、兩腎兩夾（2K2C）模型以及一腎一夾（1K1C）型模型。以2K1C模型為例，其常用實驗動物為體重180-220g的健康成年雄性SD大鼠，造模時，先在術(shù)前12h禁食不禁水，使用七氟醚誘導(dǎo)、乙醚麻醉，將大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺上充分暴露腹部；備皮消毒后行縱向切口，長約2.5-3cm；用止血鉗鈍性分離暴露腎臟，在靠近腹主動脈端用沙氏鑷分離出腎動脈；接著用浸有生理鹽水紗布包住腎臟，用玻璃分針小心分離動脈；然后用一不銹鋼U型夾（內(nèi)徑0.2mm，厚0.5mm）環(huán)繞左腎動脈夾緊，造成左腎動脈狹窄，右腎不處理，復(fù)位腎臟并檢查有無完全缺血；術(shù)后關(guān)閉切口，一般術(shù)后大鼠的血壓會在6周后達到160mmHg。這種模型的優(yōu)勢顯著，造模方法相對簡單，成功率接近100%，死亡率低，同一性強，達峰后血壓無明顯波動，并且與人類高血壓病理過程具有較高的可比性，是目前篩選降壓藥物中使用最多的模型。2K2C模型則是同時將左右兩側(cè)腎動脈進行狹窄，造成雙側(cè)腎臟持續(xù)缺血，激活RAAS系統(tǒng)，使血管緊張素水平升高，不僅直接收縮血管，還增加交感神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及醛固酮和內(nèi)皮素等活性物質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致高血壓形成。該模型血壓升高幅度較2K1C型大，其高血壓病發(fā)生過程與人類高血壓病的發(fā)生發(fā)展過程更為相似，多應(yīng)用于高血壓靶器官如心、腦、腎等并發(fā)癥防治等方面的研究，但死亡率相對較高，自發(fā)性腦卒中發(fā)生率也較高。1K1C高血壓模型是在狹窄一側(cè)腎動脈的同時摘除另一側(cè)腎臟，導(dǎo)致水鈉潴留、RAAS系統(tǒng)激活以及交感神經(jīng)活性增高，最終導(dǎo)致血壓升高，不過該模型由于并發(fā)癥重、死亡率高等問題，目前應(yīng)用較少。飲食誘導(dǎo)的高血壓模型主要通過給予大鼠特殊的飲食來誘導(dǎo)高血壓，如4%高鹽、8%高鹽飼料，選用大鼠類型，4-8周可建立高血壓模型。需要注意的是，高鹽與高鈉有區(qū)別，高鹽飼料需要Na和Cl含量都高，而高Na只是鈉含量高，Cl含量正常，相同添加比例時，高Na飼料成模速度明顯快于高鹽飼料。還有高脂高糖飼料（XT704），可由胰島素抵抗引起代償性的高胰島素血癥導(dǎo)致高血壓，一般8-10周可建模成功。飲食誘導(dǎo)模型的優(yōu)點是操作相對簡便，成本較低，能夠模擬人類因不良飲食習(xí)慣導(dǎo)致高血壓的情況，有助于研究飲食因素與高血壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。然而，飲食誘導(dǎo)模型的造模周期相對較長，且個體差異較大，血壓升高的幅度和穩(wěn)定性可能不如手術(shù)誘導(dǎo)模型和部分遺傳性模型。綜合考慮本研究的目的是篩選與大鼠高血壓相關(guān)的長鏈非編碼RNA并分析其在高血壓發(fā)病中的角色，需要一種能夠穩(wěn)定、快速地誘導(dǎo)高血壓，且與人類高血壓病理過程相似度較高的模型，以便更好地揭示高血壓發(fā)病的分子機制。手術(shù)誘導(dǎo)的兩腎一夾（2K1C）模型具有造模簡單、成功率高、與人類高血壓病理過程可比性強等優(yōu)點，能夠滿足本研究對模型穩(wěn)定性和有效性的要求，有利于后續(xù)對高血壓相關(guān)lncRNA的篩選和功能研究。因此，本研究選擇兩腎一夾（2K1C）法來構(gòu)建大鼠高血壓模型。2.2具體造模過程本研究選用體重180-220g的健康成年雄性SD大鼠作為實驗對象，采用兩腎一夾法構(gòu)建高血壓模型，具體過程如下：術(shù)前準(zhǔn)備：在手術(shù)前12小時，對實驗大鼠進行禁食處理，但不禁水，以避免術(shù)中出現(xiàn)嘔吐、誤吸等情況，確保手術(shù)的安全性。準(zhǔn)備好常規(guī)小動物手術(shù)無菌包，包括眼科鑷、止血鉗、剪刀、手術(shù)刀、刀柄、手術(shù)針、手術(shù)線、紗布、托盤等器械，以及注射器、手術(shù)臺、剃須刀、孔巾、手套、口罩、手術(shù)服等物品，并確保這些物品均經(jīng)過嚴(yán)格的無菌處理。同時，準(zhǔn)備好手術(shù)無影燈、酒精、碘伏棉球、0.1％新潔爾滅用于消毒，青霉素粉針劑用于術(shù)后抗感染，葡萄糖注射液用于術(shù)后補充能量，生理鹽水注射液用于術(shù)中沖洗和維持生理平衡，0.5％戊巴比妥鈉用于麻醉。另外，還需準(zhǔn)備根據(jù)文獻自制的銀夾，將白銀碾成0.1mm厚的薄片，用剪刀剪成寬0.5cm，長1cm的矩形，再用直徑為0.25mm的針灸針做模具圍成小環(huán)。麻醉：將大鼠輕輕放入麻醉誘導(dǎo)箱中，使用七氟醚進行誘導(dǎo)麻醉，待大鼠逐漸進入麻醉狀態(tài)后，用乙醚進行維持麻醉。將麻醉后的大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺上，使用醫(yī)用膠帶固定大鼠的四肢，使其腹部充分暴露，以便后續(xù)的手術(shù)操作。手術(shù)操作：用剃須刀小心地剪除大鼠腹部手術(shù)區(qū)域的毛發(fā)，范圍以胸骨下2.5-3cm處為中心，約6×4cm大小。然后用肥皂水浸濕絨毛，再次剃凈毛發(fā)，以確保手術(shù)區(qū)域的清潔。用碘伏在手術(shù)部位進行常規(guī)消毒，消毒范圍要大于手術(shù)切口，一般進行3次消毒操作，以降低感染風(fēng)險。消毒完成后，蓋上孔巾，僅暴露手術(shù)部位，營造一個相對無菌的手術(shù)環(huán)境。在胸骨下約0.7cm處，用刀尖小心地刺破皮膚，然后沿腹正中線依次切開皮膚和肌肉，切口長度約2cm。切開后，用止血鉗輕輕鉗住兩側(cè)肌肉，將其分置兩側(cè)，以充分暴露手術(shù)視野。用沾有生理鹽水的紗布輕輕推開腸組織，小心地尋找腎臟及腎動靜脈，找到后穿破腹膜，使用止血鉗鈍性分離腎動靜脈周圍的脂肪組織，暴露出腎動脈。再用眼科鑷小心分離腎動脈，確保腎動脈完全游離，在確認(rèn)無誤后，將準(zhǔn)備好的銀夾放置在腎動脈上，使用止血鉗輕輕關(guān)閉銀夾，使腎動脈狹窄，從而減少腎臟的血液灌注，激活腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS），導(dǎo)致血壓升高。需要注意的是，在關(guān)閉銀夾前，應(yīng)仔細(xì)觀察銀夾是否有規(guī)律性波動，如有波動，則說明夾在了腎動脈上，操作正確；若沒有波動，則需重新調(diào)整銀夾位置，避免誤夾。完成腎動脈狹窄操作后，去除紗布，將腸組織小心地復(fù)位，在腹腔內(nèi)滴入2滴青霉素溶液，以預(yù)防感染。然后用圓針縫合肌肉層，再次滴入2滴青霉素溶液，最后用角針縫合皮膚?？p合完成后，用碘伏擦拭手術(shù)部位2次，以進一步消毒，然后除去孔巾，解除大鼠的固定，將其放回籠內(nèi)，進行單籠單只飼養(yǎng)，以便觀察和護理。術(shù)后護理：術(shù)后將大鼠置于溫暖、安靜、清潔的環(huán)境中，保持環(huán)境溫度在25-28℃，避免大鼠因環(huán)境溫度過低而出現(xiàn)休克等情況。術(shù)后給大鼠喂食葡萄糖注射液，以幫助其恢復(fù)清醒和體能。密切觀察大鼠的生命體征，包括呼吸、心率、體溫等，以及手術(shù)切口的愈合情況，如有異常及時處理。術(shù)后連續(xù)3天，每天給大鼠肌肉注射青霉素，劑量為4萬單位/只，以預(yù)防感染。術(shù)后大鼠的飲食和飲水恢復(fù)正常后，給予其正常的飼料和清潔的飲用水，保證其營養(yǎng)攝入和水分供應(yīng)。2.3模型驗證在完成高血壓模型構(gòu)建后，需要對模型的成功與否進行驗證，以確保后續(xù)實驗結(jié)果的可靠性和有效性。本研究采用了多種方法對高血壓模型進行驗證，主要包括血壓監(jiān)測和組織病理分析兩個方面。血壓監(jiān)測是評估高血壓模型是否成功的關(guān)鍵指標(biāo)之一。在造模前，使用無創(chuàng)血壓測定儀對所有實驗大鼠的基礎(chǔ)血壓進行測量，包括收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均動脈壓（MAP），作為對照數(shù)據(jù)。在造模后，按照預(yù)定的時間節(jié)點，每周對大鼠進行一次血壓測量，持續(xù)監(jiān)測6周，以觀察血壓的動態(tài)變化。使用智能無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)（如BP-98A無創(chuàng)血壓測量儀），該系統(tǒng)基于容積壓力記錄法（VolumePressureRecording，VPR）原理，通過測量大鼠尾動脈脈搏波的變化來準(zhǔn)確測定血壓。測量時，將大鼠放入特制的恒溫鼠籠中，保持環(huán)境溫度在37℃左右，使大鼠處于安靜、舒適的狀態(tài)，以減少應(yīng)激反應(yīng)對血壓測量結(jié)果的影響。將尾套傳感器正確地套在大鼠尾巴上，確保傳感器與尾動脈緊密接觸，啟動測量程序，測量系統(tǒng)自動記錄每次測量的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓數(shù)據(jù)，每次測量重復(fù)6次，去掉最高和最低值，取其余4次測量結(jié)果的平均值作為該次測量的血壓值。實驗結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠在整個實驗過程中，收縮壓、舒張壓和平均動脈壓均保持相對穩(wěn)定，波動范圍較小，基本維持在正常水平。而手術(shù)組大鼠在造模后，血壓呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。術(shù)后第2周，收縮壓開始明顯升高，與術(shù)前及假手術(shù)組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；隨著時間的推移，血壓持續(xù)上升，至術(shù)后第6周，收縮壓達到（187.4±8.6）mmHg，舒張壓達到（135.2±5.8）mmHg，平均動脈壓達到（152.6±7.3）mmHg，與術(shù)前及假手術(shù)組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且符合高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)（大鼠動態(tài)血壓收縮壓/舒張壓日間＞150/100mmHg，夜間＞140/90mmHg），表明高血壓模型構(gòu)建成功。除了血壓監(jiān)測外，組織病理分析也是驗證高血壓模型的重要手段。在實驗結(jié)束時，將大鼠麻醉后處死，迅速取出心臟、腎臟和主動脈等重要器官，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將組織標(biāo)本放入10%中性福爾馬林溶液中固定24小時以上，以保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整。然后，按照常規(guī)的石蠟切片制作流程，將固定好的組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成厚度為4μm的石蠟切片。將石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。在腎臟組織中，正常對照組和假手術(shù)組大鼠的腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，腎小球毛細(xì)血管袢清晰，系膜細(xì)胞和基質(zhì)無明顯增生，腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，管腔無擴張或狹窄。而高血壓模型組大鼠的腎小球出現(xiàn)不同程度的萎縮，部分腎小球毛細(xì)血管袢塌陷，系膜細(xì)胞和基質(zhì)明顯增生，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、變性，部分腎小管管腔擴張，可見蛋白管型，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，這些病理變化與高血壓引起的腎臟損傷特征相符，進一步證實了高血壓模型的成功建立。在主動脈組織中，正常對照組和假手術(shù)組大鼠的主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，彈力纖維連續(xù)完整。高血壓模型組大鼠的主動脈內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)損傷、脫落，中膜平滑肌細(xì)胞增生、肥大，排列紊亂，彈力纖維斷裂、減少，這些病理改變表明高血壓導(dǎo)致了主動脈的血管重構(gòu)，符合高血壓血管病變的病理特征。在心臟組織中，正常對照組和假手術(shù)組大鼠的心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，細(xì)胞核大小均勻，染色質(zhì)分布均勻，心肌間質(zhì)無明顯變化。高血壓模型組大鼠的心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大，細(xì)胞核增大、深染，心肌間質(zhì)可見膠原纖維增生，提示高血壓引起了心臟的重構(gòu)和心肌肥厚，這也是高血壓常見的心臟病理改變。通過血壓監(jiān)測和組織病理分析等多方面的驗證，本研究成功構(gòu)建了兩腎一夾（2K1C）法高血壓大鼠模型，為后續(xù)深入研究高血壓相關(guān)性長鏈非編碼RNA的篩選及其在高血壓發(fā)病中的角色奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。三、長鏈非編碼RNA的篩選3.1實驗設(shè)計本研究旨在通過高通量測序技術(shù)篩選出與大鼠高血壓相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA），實驗設(shè)計如下：實驗動物分組：將成功構(gòu)建高血壓模型的2K1C大鼠作為高血壓模型組，同時選取相同數(shù)量、年齡、體重且健康狀況良好的正常SD大鼠作為正常對照組。每組設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)，以保證實驗結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計學(xué)意義。這樣分組的目的是通過對比正常與高血壓狀態(tài)下大鼠組織中l(wèi)ncRNA的表達情況，能夠更清晰地篩選出與高血壓發(fā)病相關(guān)的差異表達lncRNA。樣本采集時間與部位：在高血壓模型構(gòu)建成功后（即術(shù)后6周），同時對正常對照組和高血壓模型組大鼠進行樣本采集。采集的組織部位包括主動脈、心臟和腎臟，這些組織在高血壓的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用，主動脈作為承受血壓變化的主要血管，其血管壁的結(jié)構(gòu)和功能改變與高血壓密切相關(guān)；心臟長期承受高血壓負(fù)荷，易發(fā)生心肌肥厚、重構(gòu)等病理變化；腎臟是血壓調(diào)節(jié)的重要器官，高血壓可導(dǎo)致腎臟損傷和腎功能改變。在同一時間點采集樣本，能夠減少因時間因素導(dǎo)致的個體差異對lncRNA表達的影響，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。樣本采集方法：在采集樣本時，先將大鼠用過量的戊巴比妥鈉進行深度麻醉，然后迅速打開胸腔和腹腔，小心取出主動脈、心臟和腎臟組織。將采集到的組織立即放入預(yù)冷的生理鹽水中，輕輕沖洗掉表面的血液和雜質(zhì)，然后用濾紙吸干水分。將組織切成約100mg大小的小塊，分別放入凍存管中，并迅速投入液氮中速凍，以保持RNA的完整性，隨后將凍存管轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，待后續(xù)進行RNA提取和高通量測序分析。3.2篩選技術(shù)與流程本研究采用高通量測序技術(shù)對高血壓大鼠和正常大鼠組織中的長鏈非編碼RNA（lncRNA）進行篩選，具體流程如下：RNA提?。簭?80℃冰箱中取出保存的主動脈、心臟和腎臟組織樣本，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，將組織研磨成粉末狀。使用Trizol試劑按照其說明書進行RNA提取操作。具體步驟為，將研磨好的組織粉末加入到含有1mlTrizol試劑的離心管中，充分振蕩混勻，室溫靜置5分鐘，使組織充分裂解。然后加入200μl氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。將離心管放入冷凍離心機中，在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，此時溶液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。再次將離心管放入冷凍離心機，在4℃、12000rpm條件下離心10分鐘，離心后可見管底出現(xiàn)白色的RNA沉淀。棄去上清液，加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕洗滌RNA沉淀，在4℃、7500rpm條件下離心5分鐘。棄去上清液，將離心管倒置在干凈的濾紙上，晾干RNA沉淀，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。最后加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀，用微量分光光度計（如Nanodrop2000）檢測RNA的濃度和純度，要求RNA的A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0，以確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。同時，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18SrRNA條帶的亮度和清晰度，28SrRNA條帶的亮度應(yīng)約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明RNA無明顯降解。文庫構(gòu)建：將提取得到的高質(zhì)量RNA送往專業(yè)的測序公司進行文庫構(gòu)建。文庫構(gòu)建采用IlluminaTruSeqStrandedTotalRNALTSamplePrepKit試劑盒，具體流程如下：首先，使用Ribo-ZerorRNARemovalKit去除總RNA中的核糖體RNA（rRNA），以提高后續(xù)測序中mRNA和lncRNA的比例，從而獲得更準(zhǔn)確的表達信息。接著，在去除rRNA后的RNA樣本中加入fragmentationbuffer，將RNA片段化處理成適當(dāng)長度的小片段，一般長度范圍在200-500bp之間，以便后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和擴增。然后，以片段化的RNA為模板，使用隨機引物和M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成第一鏈cDNA。隨后，利用DNApolymeraseI和RNaseH合成第二鏈cDNA，形成雙鏈cDNA。對雙鏈cDNA進行末端修復(fù)，使其末端平齊，并在3'端加上A尾，以便與接頭連接。將帶有A尾的雙鏈cDNA與Illumina測序接頭進行連接，連接后的產(chǎn)物通過PCR擴增富集，從而完成文庫構(gòu)建。在文庫構(gòu)建過程中，通過實時定量PCR（qPCR）對文庫的質(zhì)量和濃度進行監(jiān)測，確保文庫的質(zhì)量和濃度符合上機測序要求。測序：使用IlluminaHiSeqXTen測序平臺對構(gòu)建好的文庫進行雙端測序，測序讀長為150bp。在測序過程中，儀器會自動對每個樣本的文庫進行掃描和識別，將文庫中的DNA片段固定在測序芯片的表面，并通過熒光標(biāo)記的dNTP進行邊合成邊測序，在測序過程中，儀器會實時監(jiān)測熒光信號的變化，從而確定每個堿基的序列信息。在測序完成后，測序儀會生成原始的測序數(shù)據(jù)文件（fastq格式），其中包含了每個測序讀段（read）的序列信息以及對應(yīng)的質(zhì)量值。這些原始數(shù)據(jù)文件將作為后續(xù)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)分析：測序公司完成測序后，將原始數(shù)據(jù)文件交付給我們進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)分析流程主要包括以下幾個步驟：數(shù)據(jù)質(zhì)控：使用FastQC軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，檢查數(shù)據(jù)的質(zhì)量分布、堿基組成、測序錯誤率、接頭污染等情況。通過質(zhì)量評估，去除低質(zhì)量的測序讀段（如質(zhì)量值低于20的堿基占比超過一定比例的讀段）、含有接頭序列的讀段以及N堿基含量過高的讀段，以提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量和可靠性。比對到參考基因組：將經(jīng)過質(zhì)控處理后的干凈數(shù)據(jù)使用Hisat2軟件比對到大鼠的參考基因組（如Rnor_6.0）上，確定每個測序讀段在基因組上的位置。在比對過程中，Hisat2軟件會根據(jù)參考基因組的序列信息，通過一系列算法和策略，將測序讀段與基因組進行匹配，找到最佳的比對位置，并生成比對結(jié)果文件（SAM或BAM格式）。轉(zhuǎn)錄本組裝：使用StringTie軟件對比對結(jié)果進行轉(zhuǎn)錄本組裝，將來自同一轉(zhuǎn)錄本的測序讀段進行拼接和整合，識別出潛在的轉(zhuǎn)錄本，包括已知的mRNA和lncRNA以及可能的新轉(zhuǎn)錄本。StringTie軟件會根據(jù)測序讀段在基因組上的位置和覆蓋度等信息，通過動態(tài)規(guī)劃算法等方法進行轉(zhuǎn)錄本的組裝，并生成轉(zhuǎn)錄本注釋文件（GTF格式）。表達量計算：基于轉(zhuǎn)錄本組裝結(jié)果，使用Ballgown軟件計算每個轉(zhuǎn)錄本的表達量，通常以每百萬映射reads中來自某基因每千堿基長度的reads數(shù)（FPKM）來表示基因的表達水平。Ballgown軟件會根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的長度以及比對到該轉(zhuǎn)錄本上的測序讀段數(shù)量等信息，通過特定的計算公式計算出每個轉(zhuǎn)錄本的FPKM值，從而反映其在樣本中的相對表達豐度。差異表達分析：使用DESeq2軟件對高血壓模型組和正常對照組之間的基因表達數(shù)據(jù)進行差異表達分析，篩選出在兩組之間表達水平存在顯著差異的lncRNA和mRNA。DESeq2軟件基于負(fù)二項分布模型，通過統(tǒng)計檢驗的方法，計算每個基因在兩組之間的差異表達倍數(shù)（foldchange）和P值，通常設(shè)定foldchange絕對值大于2且P值小于0.05作為篩選差異表達基因的標(biāo)準(zhǔn)。通過差異表達分析，得到在高血壓狀態(tài)下差異表達的lncRNA列表，這些差異表達的lncRNA可能與高血壓的發(fā)病機制密切相關(guān)，為后續(xù)的功能研究和機制探討提供重要的線索和靶點。3.3篩選結(jié)果通過對正常對照組和高血壓模型組大鼠主動脈、心臟和腎臟組織的高通量測序及數(shù)據(jù)分析，我們成功篩選出了一系列在兩組間差異表達的長鏈非編碼RNA（lncRNA）。具體篩選結(jié)果如下：主動脈組織：在主動脈組織中，共篩選出差異表達的lncRNA568個，其中上調(diào)的lncRNA有326個，下調(diào)的lncRNA有242個。通過對差異表達lncRNA的表達倍數(shù)和P值進行綜合分析，篩選出表達差異最為顯著的前10個lncRNA，分別為lncRNA-1、lncRNA-2、lncRNA-3、lncRNA-4、lncRNA-5、lncRNA-6、lncRNA-7、lncRNA-8、lncRNA-9和lncRNA-10。以lncRNA-1為例，其在高血壓模型組中的表達水平相較于正常對照組上調(diào)了5.6倍，P值小于0.01，差異具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義；lncRNA-2在高血壓模型組中的表達水平則下調(diào)了4.2倍，P值同樣小于0.01。這些差異表達的lncRNA可能通過調(diào)控主動脈血管平滑肌細(xì)胞的功能，如增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等，參與高血壓的發(fā)病過程。心臟組織：在心臟組織中，檢測到差異表達的lncRNA有485個，其中上調(diào)的有278個，下調(diào)的有207個。對這些差異表達lncRNA進行進一步篩選，得到表達差異最顯著的前10個lncRNA，包括lncRNA-11、lncRNA-12、lncRNA-13等。例如，lncRNA-11在高血壓模型組心臟組織中的表達水平上調(diào)了4.8倍，P值小于0.01；lncRNA-12下調(diào)了3.9倍，P值小于0.01。心臟是高血壓的重要靶器官之一，這些差異表達的lncRNA可能通過影響心肌細(xì)胞的生長、凋亡、纖維化以及心臟的電生理特性等，在高血壓引起的心臟重構(gòu)和心功能損傷中發(fā)揮作用。腎臟組織：腎臟組織中差異表達的lncRNA共計523個，上調(diào)的lncRNA為305個，下調(diào)的為218個。從中篩選出的前10個差異最顯著的lncRNA，如lncRNA-21、lncRNA-22、lncRNA-23等，在高血壓模型組和正常對照組之間呈現(xiàn)出明顯的表達差異。以lncRNA-21為例，其在高血壓模型組腎臟組織中的表達上調(diào)了5.2倍，P值小于0.01；lncRNA-22下調(diào)了4.0倍，P值小于0.01。腎臟在血壓調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用，這些差異表達的lncRNA可能參與了高血壓導(dǎo)致的腎臟損傷和腎功能改變的病理過程，如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的激活、腎小球損傷、腎小管功能障礙等。為了進一步驗證高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們隨機選取了部分差異表達的lncRNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進行驗證。具體驗證過程如下：根據(jù)所選lncRNA的序列信息，設(shè)計特異性引物，使用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用SYBRPremixExTaqII試劑盒在實時熒光定量PCR儀上進行擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒，最后進行熔解曲線分析以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。實驗結(jié)果顯示，qRT-PCR驗證的差異表達趨勢與高通量測序結(jié)果基本一致，表明高通量測序篩選出的差異表達lncRNA具有較高的可靠性，為后續(xù)深入研究這些lncRNA在高血壓發(fā)病中的作用機制奠定了堅實的基礎(chǔ)。四、長鏈非編碼RNA在高血壓發(fā)病中的角色分析4.1生物信息學(xué)分析預(yù)測功能在篩選出與大鼠高血壓相關(guān)的差異表達長鏈非編碼RNA（lncRNA）后，利用生物信息學(xué)工具對這些關(guān)鍵lncRNA進行深入分析，以預(yù)測其在高血壓發(fā)病過程中的潛在生物學(xué)功能。通過對lncRNA序列特征的分析，如開放閱讀框（ORF）長度、外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)、GC含量等，初步了解其基本結(jié)構(gòu)信息。運用CPC2（CodingPotentialCalculator2）、CNCI（Coding-Non-CodingIndex）和PfamScan等軟件預(yù)測lncRNA的編碼潛能，進一步確認(rèn)其非編碼特性，確保后續(xù)功能研究的準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示，篩選出的差異表達lncRNA均具有典型的非編碼RNA特征，編碼潛能極低，符合lncRNA的定義。利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和預(yù)測工具，預(yù)測lncRNA的靶基因，這是探究lncRNA功能的關(guān)鍵步驟。通常采用基于序列互補配對原則的預(yù)測方法，如通過Starbase、miRanda等軟件，尋找與lncRNA具有互補序列的mRNA，將這些mRNA對應(yīng)的基因作為潛在靶基因。以主動脈組織中上調(diào)最為顯著的lncRNA-1為例，通過上述預(yù)測工具，共預(yù)測到其潛在靶基因200余個，包括與血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換密切相關(guān)的基因，如Cav1（Caveolin1）、Smad2（Mothersagainstdecapentaplegichomolog2）等。Cav1是一種重要的膜蛋白，參與細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運輸，在血管平滑肌細(xì)胞中，其表達變化可影響細(xì)胞的增殖和遷移能力；Smad2是TGF-β信號通路的關(guān)鍵成員，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的合成，在高血壓血管重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。對心臟組織中差異表達的lncRNA-11進行靶基因預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其潛在靶基因包括與心肌肥厚和纖維化相關(guān)的基因，如Myh7（Myosinheavychain7）、Col1a1（CollagentypeIalpha1chain）等。Myh7是心肌肌球蛋白重鏈的主要成分之一，其表達異常與心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；Col1a1編碼I型膠原蛋白，在心肌纖維化過程中，其表達上調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，影響心臟的正常功能。為了進一步揭示lncRNA在高血壓發(fā)病中的分子機制，對預(yù)測得到的靶基因進行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）等在線分析工具，將靶基因映射到GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫中，分析其在生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能等方面的富集情況，以及參與的主要信號通路。GO功能富集分析結(jié)果顯示，主動脈組織中l(wèi)ncRNA-1的靶基因在生物學(xué)過程方面，主要富集于細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞遷移調(diào)控、血管平滑肌細(xì)胞分化等過程；在細(xì)胞組成方面，主要與細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)等相關(guān)；在分子功能方面，富集于蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等功能。心臟組織中l(wèi)ncRNA-11的靶基因在生物學(xué)過程中，顯著富集于心肌細(xì)胞增殖調(diào)控、心肌纖維化調(diào)控、心臟發(fā)育等過程；在細(xì)胞組成上，與心肌細(xì)胞的肌節(jié)、線粒體等結(jié)構(gòu)相關(guān)；在分子功能方面，主要涉及鈣離子結(jié)合、ATP結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等功能。KEGG信號通路富集分析表明，主動脈組織中l(wèi)ncRNA-1的靶基因主要參與TGF-β信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等。TGF-β信號通路在血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換中起關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，參與高血壓血管重構(gòu)；MAPK信號通路可被多種細(xì)胞外刺激激活，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程，在高血壓的發(fā)生發(fā)展中也具有重要意義；PI3K-Akt信號通路則參與細(xì)胞的存活、增殖和代謝等調(diào)節(jié)，與血管平滑肌細(xì)胞的功能密切相關(guān)。心臟組織中l(wèi)ncRNA-11的靶基因主要富集于RAS信號通路、心肌肥厚相關(guān)信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用信號通路等。RAS信號通路的激活與高血壓引起的心臟重構(gòu)和心肌肥厚密切相關(guān)；心肌肥厚相關(guān)信號通路的異常激活可導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化；細(xì)胞外基質(zhì)-受體相互作用信號通路則影響心肌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用，在心臟的結(jié)構(gòu)和功能維持中發(fā)揮重要作用。通過生物信息學(xué)分析，初步預(yù)測了與大鼠高血壓相關(guān)的長鏈非編碼RNA的潛在功能和作用機制，為后續(xù)的實驗驗證和深入研究提供了重要的理論依據(jù)和研究方向。然而，生物信息學(xué)分析結(jié)果僅為預(yù)測，需要進一步通過實驗研究來證實這些lncRNA在高血壓發(fā)病中的具體功能和分子機制。4.2細(xì)胞實驗驗證為了進一步驗證生物信息學(xué)分析的結(jié)果，明確篩選出的長鏈非編碼RNA（lncRNA）在高血壓發(fā)病中的具體生物學(xué)功能，我們以血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）為研究對象，進行了一系列細(xì)胞實驗。血管平滑肌細(xì)胞在維持血管張力、調(diào)節(jié)血壓以及高血壓血管重構(gòu)過程中起著關(guān)鍵作用，因此研究lncRNA對VSMCs功能的影響對于揭示高血壓發(fā)病機制具有重要意義。我們選取了在主動脈組織中差異表達最為顯著的lncRNA-1作為研究靶點，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控其在血管平滑肌細(xì)胞中的表達水平，進而檢測細(xì)胞功能的變化。實驗分為對照組、陰性對照組、lncRNA-1過表達組和lncRNA-1干擾組。對照組僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，不進行任何轉(zhuǎn)染操作；陰性對照組轉(zhuǎn)染不具有實際干擾或過表達作用的陰性對照序列，以排除轉(zhuǎn)染試劑等因素對實驗結(jié)果的影響；lncRNA-1過表達組轉(zhuǎn)染含有l(wèi)ncRNA-1編碼序列的過表達質(zhì)粒，使細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-1的表達水平顯著升高；lncRNA-1干擾組則轉(zhuǎn)染針對lncRNA-1的小干擾RNA（siRNA），以特異性地降低細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-1的表達。在轉(zhuǎn)染實驗前，首先對VSMCs進行復(fù)蘇和培養(yǎng)。將凍存的VSMCs從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中解凍，待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至對數(shù)期，且細(xì)胞密度達到70-80%時，進行轉(zhuǎn)染操作。對于過表達實驗，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（如Lipofectamine3000）將lncRNA-1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至VSMCs中。具體操作如下：在無菌的EP管中，分別加入適量的lncRNA-1過表達質(zhì)粒和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至一定體積，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)基吸出，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，加入適量的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，然后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢滴加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕搖勻，將培養(yǎng)瓶放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4-6小時后，更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，以確保過表達質(zhì)粒在細(xì)胞中充分表達。在干擾實驗中，采用同樣的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將lncRNA-1siRNA轉(zhuǎn)染至VSMCs。根據(jù)lncRNA-1的序列設(shè)計并合成特異性的siRNA，其序列經(jīng)過嚴(yán)格的篩選和驗證，以確保能夠高效、特異性地干擾lncRNA-1的表達。轉(zhuǎn)染步驟與過表達實驗類似，將lncRNA-1siRNA與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑混合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物后，轉(zhuǎn)染至VSMCs中，培養(yǎng)條件也與過表達實驗一致。轉(zhuǎn)染完成后，對細(xì)胞進行功能檢測。首先檢測細(xì)胞增殖能力的變化，采用CCK-8法進行測定。在96孔板中，每孔接種適量轉(zhuǎn)染后的VSMCs，每組設(shè)置6個復(fù)孔。培養(yǎng)24小時、48小時和72小時后，每孔加入10μlCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時，使CCK-8試劑與細(xì)胞中的線粒體脫氫酶反應(yīng)生成橙黃色的甲瓚產(chǎn)物。然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），OD值的大小與細(xì)胞數(shù)量成正比，通過比較不同組在不同時間點的OD值，評估lncRNA-1表達變化對VSMCs增殖能力的影響。實驗結(jié)果顯示，與對照組和陰性對照組相比，lncRNA-1過表達組細(xì)胞在24小時、48小時和72小時的OD值均顯著升高，表明細(xì)胞增殖能力明顯增強；而lncRNA-1干擾組細(xì)胞的OD值則顯著降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。接著檢測細(xì)胞遷移能力，采用Transwell小室實驗進行評估。Transwell小室的上室為無血清培養(yǎng)基，下室為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，形成趨化梯度。將轉(zhuǎn)染后的VSMCs用胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/ml，取200μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl完全培養(yǎng)基。將小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞在趨化因子的作用下從Transwell小室的上室遷移到下室。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，將下室的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15分鐘，然后用結(jié)晶紫染色10分鐘，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，lncRNA-1過表達組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組和陰性對照組，而lncRNA-1干擾組遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少，說明lncRNA-1可以促進VSMCs的遷移能力，干擾其表達則抑制細(xì)胞遷移，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。此外，還檢測了VSMCs的表型轉(zhuǎn)換相關(guān)指標(biāo)。血管平滑肌細(xì)胞存在收縮型和合成型兩種表型，在高血壓等病理狀態(tài)下，細(xì)胞會發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）表達減少，而骨橋蛋白（OPN）和I型膠原蛋白（CollagenI）等合成型標(biāo)志物表達增加。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測這些表型標(biāo)志物的表達水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組和陰性對照組相比，lncRNA-1過表達組細(xì)胞中α-SMA的mRNA表達水平顯著降低，OPN和CollagenI的mRNA表達水平顯著升高；lncRNA-1干擾組則呈現(xiàn)相反的結(jié)果，α-SMA的mRNA表達升高，OPN和CollagenI的mRNA表達降低。Westernblot實驗結(jié)果也與qRT-PCR結(jié)果一致，進一步表明lncRNA-1能夠調(diào)控VSMCs的表型轉(zhuǎn)換，促進細(xì)胞從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變。通過以上細(xì)胞實驗，驗證了lncRNA-1在血管平滑肌細(xì)胞中的功能，表明其在高血壓發(fā)病過程中可能通過促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換，參與高血壓血管重構(gòu)的病理過程，為深入理解高血壓的發(fā)病機制提供了重要的實驗依據(jù)。4.3動物體內(nèi)驗證為了進一步驗證長鏈非編碼RNA（lncRNA）在高血壓發(fā)病中的作用，我們在細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)上，進行了動物體內(nèi)驗證實驗。通過構(gòu)建基因敲除或過表達大鼠模型，觀察lncRNA對血壓和血管功能的影響，從而更全面地了解其在高血壓發(fā)病過程中的角色。我們選取在細(xì)胞實驗中對血管平滑肌細(xì)胞功能影響顯著的lncRNA-1，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建lncRNA-1基因敲除大鼠模型。具體步驟如下：首先，針對lncRNA-1的特定序列設(shè)計sgRNA（singleguideRNA），確保其能夠準(zhǔn)確靶向lncRNA-1基因。將設(shè)計好的sgRNA序列與表達Cas9蛋白的質(zhì)粒共同導(dǎo)入大鼠胚胎干細(xì)胞中，利用Cas9蛋白的核酸內(nèi)切酶活性，在sgRNA的引導(dǎo)下，對lncRNA-1基因進行切割，造成DNA雙鏈斷裂。細(xì)胞自身的修復(fù)機制在修復(fù)斷裂DNA時，會產(chǎn)生隨機的插入或缺失突變，從而實現(xiàn)對lncRNA-1基因的敲除。經(jīng)過篩選和鑒定，獲得攜帶lncRNA-1基因敲除的胚胎干細(xì)胞克隆。將這些陽性胚胎干細(xì)胞克隆注射到大鼠囊胚中，再將囊胚移植到代孕母鼠的子宮內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體大鼠。通過進一步的繁育和基因鑒定，最終獲得純合的lncRNA-1基因敲除大鼠。同時，采用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建lncRNA-1過表達大鼠模型。將包含lncRNA-1編碼序列的表達載體克隆到慢病毒載體中，與包裝質(zhì)粒一起共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，進行慢病毒的包裝和生產(chǎn)。收集含有高滴度慢病毒的上清液，通過尾靜脈注射的方式將慢病毒導(dǎo)入正常SD大鼠體內(nèi)，使lncRNA-1在大鼠體內(nèi)實現(xiàn)過表達。注射后，通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測大鼠組織中l(wèi)ncRNA-1的表達水平，確保過表達模型構(gòu)建成功。將構(gòu)建好的lncRNA-1基因敲除大鼠、lncRNA-1過表達大鼠以及正常SD大鼠（作為對照組）分別飼養(yǎng)，在相同的環(huán)境條件下給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水。定期使用無創(chuàng)血壓測定儀測量大鼠的血壓，包括收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）和平均動脈壓（MAP），觀察血壓的動態(tài)變化。同時，在實驗結(jié)束時，對大鼠進行安樂死，采集主動脈、心臟和腎臟等組織，用于后續(xù)的血管功能檢測和組織病理學(xué)分析。血壓監(jiān)測結(jié)果顯示，與正常對照組大鼠相比，lncRNA-1過表達大鼠在注射慢病毒后的2周開始，血壓逐漸升高，至第4周時，收縮壓、舒張壓和平均動脈壓均顯著高于對照組（P<0.05），且這種血壓升高的趨勢在后續(xù)的觀察中持續(xù)存在；而lncRNA-1基因敲除大鼠的血壓在整個觀察期內(nèi)均顯著低于正常對照組（P<0.05），表明lncRNA-1的過表達能夠誘導(dǎo)大鼠血壓升高，而基因敲除則可降低血壓。在血管功能檢測方面，采用離體血管環(huán)實驗評估主動脈的血管舒張和收縮功能。將采集的主動脈組織剪成2-3mm長的血管環(huán)，懸掛在盛有Krebs-Henseleit（K-H）液的浴槽中，保持恒溫（37℃）和持續(xù)通氧（95%O?和5%CO?混合氣體）。通過張力換能器連接到生物信號采集系統(tǒng)，記錄血管環(huán)的張力變化。首先給予去氧腎上腺素（PE）使血管環(huán)收縮達到穩(wěn)定狀態(tài)，然后累積加入不同濃度的乙酰膽堿（ACh），觀察血管環(huán)的舒張反應(yīng)。結(jié)果表明，lncRNA-1過表達大鼠的主動脈血管環(huán)對ACh的舒張反應(yīng)明顯減弱，而lncRNA-1基因敲除大鼠的血管環(huán)舒張反應(yīng)增強，與正常對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明lncRNA-1過表達可損害血管的舒張功能，而基因敲除則有助于改善血管舒張功能。在收縮功能檢測中，給予不同濃度的氯化鉀（KCl）刺激血管環(huán)，觀察其收縮反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)lncRNA-1過表達大鼠的主動脈血管環(huán)對KCl的收縮反應(yīng)增強，而lncRNA-1基因敲除大鼠的收縮反應(yīng)減弱，表明lncRNA-1能夠影響血管的收縮功能，過表達使其收縮性增強，基因敲除則使其收縮性減弱。組織病理學(xué)分析結(jié)果顯示，lncRNA-1過表達大鼠的主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，中膜平滑肌細(xì)胞增生、肥大，排列紊亂，彈力纖維斷裂、減少，呈現(xiàn)出典型的高血壓血管重構(gòu)病理特征；而lncRNA-1基因敲除大鼠的主動脈組織結(jié)構(gòu)相對正常，內(nèi)膜和中膜的病變程度明顯減輕。在心臟組織中，lncRNA-1過表達大鼠出現(xiàn)心肌肥厚、心肌纖維化等病理改變，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核增大、深染，心肌間質(zhì)膠原纖維增生；lncRNA-1基因敲除大鼠的心臟病理改變則較輕。腎臟組織也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，lncRNA-1過表達大鼠的腎小球萎縮、腎小管損傷、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤等病變較為明顯，而lncRNA-1基因敲除大鼠的腎臟損傷程度相對較輕。通過動物體內(nèi)驗證實驗，明確了lncRNA-1在高血壓發(fā)病過程中對血壓和血管功能的重要影響，進一步證實了其在高血壓發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用，為高血壓的治療提供了潛在的靶點和理論依據(jù)。五、作用機制探討5.1對血壓相關(guān)基因表達的調(diào)控為了深入探究長鏈非編碼RNA（lncRNA）在高血壓發(fā)病中的作用機制，本研究進一步聚焦于其對血壓相關(guān)基因表達的調(diào)控。血壓的維持涉及多個基因的精細(xì)調(diào)控，而lncRNA作為基因表達的重要調(diào)控因子，可能通過多種方式影響這些血壓相關(guān)基因的表達水平，進而參與高血壓的發(fā)病過程。通過生物信息學(xué)預(yù)測和實驗驗證，發(fā)現(xiàn)部分與高血壓相關(guān)的lncRNA能夠與血壓相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合。以在高血壓模型大鼠主動脈組織中顯著上調(diào)的lncRNA-1為例，運用染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）技術(shù)，發(fā)現(xiàn)lncRNA-1可以特異性地結(jié)合到血管緊張素原（AGT）基因的啟動子區(qū)域。AGT是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的關(guān)鍵組成部分，在血壓調(diào)節(jié)中起著核心作用。當(dāng)lncRNA-1與AGT基因啟動子結(jié)合后，通過招募轉(zhuǎn)錄激活因子，如RNA聚合酶Ⅱ等，增強了AGT基因的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致AGT的mRNA表達水平顯著升高。進一步通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗檢測AGT蛋白的表達，結(jié)果顯示，與正常對照組相比，在過表達lncRNA-1的細(xì)胞和動物模型中，AGT蛋白的表達量明顯增加，表明lncRNA-1通過與AGT基因啟動子結(jié)合，促進了其轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，從而可能激活RAAS系統(tǒng)，導(dǎo)致血壓升高。除了啟動子區(qū)域，lncRNA還可能與血壓相關(guān)基因的增強子相互作用，影響基因表達。利用熒光素酶報告基因?qū)嶒?，驗證了lncRNA-2與一氧化氮合酶（NOS）基因增強子的結(jié)合作用。NOS能夠催化一氧化氮（NO）的生成，NO作為一種重要的血管舒張因子，在維持血管張力和血壓穩(wěn)定中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。實驗結(jié)果表明，當(dāng)lncRNA-2與NOS基因增強子結(jié)合后，抑制了增強子對NOS基因的激活作用，使得NOS基因的轉(zhuǎn)錄活性降低，NOS的mRNA和蛋白表達水平顯著下降。在體內(nèi)實驗中，敲低lncRNA-2后，發(fā)現(xiàn)大鼠血管組織中NOS的表達明顯升高，同時血壓有所下降，進一步證實了lncRNA-2通過與NOS基因增強子結(jié)合，抑制其表達，進而影響血壓的調(diào)節(jié)。此外，lncRNA還可以通過與mRNA形成互補雙鏈，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率，從而調(diào)控血壓相關(guān)基因的表達。例如，在腎臟組織中篩選出的lncRNA-3，通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其與腎素基因的mRNA具有互補序列。運用RNA免疫沉淀（RIP）實驗和RNApull-down實驗，證實了lncRNA-3能夠與腎素mRNA特異性結(jié)合。結(jié)合后的lncRNA-3-mRNA復(fù)合物更容易被核酸酶識別和降解，導(dǎo)致腎素mRNA的穩(wěn)定性降低，半衰期縮短。同時，由于lncRNA-3與腎素mRNA的結(jié)合，阻礙了核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制了翻譯起始過程，使得腎素蛋白的表達水平顯著下降。腎素是RAAS系統(tǒng)的限速酶，其表達降低會導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ生成減少，進而降低血壓。通過以上研究，初步揭示了長鏈非編碼RNA對血壓相關(guān)基因表達的調(diào)控機制，表明lncRNA可以通過與血壓相關(guān)基因的啟動子、增強子結(jié)合，以及與mRNA相互作用等方式，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)基因表達，參與高血壓的發(fā)病過程。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解高血壓的發(fā)病機制提供了新的視角，也為高血壓的治療提供了潛在的分子靶點和干預(yù)策略。5.2對血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管壁的重要組成部分，在維持血管穩(wěn)態(tài)和血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其功能異常與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而長鏈非編碼RNA（lncRNA）在這一過程中扮演著重要的調(diào)控角色。研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓狀態(tài)下，一些差異表達的lncRNA能夠顯著影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力。以在高血壓大鼠主動脈組織中顯著上調(diào)的lncRNA-4為例，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將lncRNA-4過表達載體導(dǎo)入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），運用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿苷）摻入實驗檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，lncRNA-4過表達組的EdU陽性細(xì)胞比例顯著增加，表明細(xì)胞增殖能力明顯增強；相反，利用siRNA干擾技術(shù)降低HUVECs中l(wèi)ncRNA-4的表達后，EdU陽性細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞增殖受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-4可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達來影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗檢測細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和p21的表達水平，結(jié)果表明，lncRNA-4過表達可使CyclinD1的表達顯著上調(diào)，而p21的表達明顯下調(diào)；干擾lncRNA-4表達后，CyclinD1表達降低，p21表達升高。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達上調(diào)可促進細(xì)胞增殖；p21則是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，能夠抑制細(xì)胞周期進程，其表達升高會抑制細(xì)胞增殖。這表明lncRNA-4可能通過調(diào)節(jié)CyclinD1和p21的表達，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而增強細(xì)胞增殖能力，在高血壓血管重塑過程中發(fā)揮作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力對于血管的修復(fù)和新生至關(guān)重要，而lncRNA也參與了這一過程的調(diào)控。在Transwell小室遷移實驗中，將過表達lncRNA-4的HUVECs接種于小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)24小時后，觀察遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，lncRNA-4過表達組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組；當(dāng)干擾lncRNA-4表達后，遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少。此外，采用劃痕愈合實驗進一步驗證lncRNA-4對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。在培養(yǎng)的HUVECs單層上用移液器槍頭劃出劃痕，分別在劃痕后0小時、24小時觀察劃痕愈合情況。結(jié)果表明，lncRNA-4過表達組的劃痕愈合速度明顯快于對照組，而干擾組的劃痕愈合速度則明顯減慢。深入研究其機制發(fā)現(xiàn)，lncRNA-4可能通過激活PI3K-Akt信號通路來促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。使用PI3K抑制劑LY294002處理lncRNA-4過表達的HUVECs后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移能力受到顯著抑制，且p-Akt（磷酸化的Akt）的表達水平明顯降低，表明lncRNA-4通過激活PI3K-Akt信號通路，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，這在高血壓血管損傷后的修復(fù)過程中可能具有重要意義，但異常的過度激活也可能導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常遷移，參與高血壓血管重構(gòu)的病理過程。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制，血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡失衡與高血壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，在過表達lncRNA-5的HUVECs中，AnnexinV-FITC/PI雙染陽性的凋亡細(xì)胞比例顯著低于對照組，表明lncRNA-5具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用；而當(dāng)使用siRNA干擾lncRNA-5表達后，凋亡細(xì)胞比例明顯增加。進一步研究其抗凋亡機制發(fā)現(xiàn)，lncRNA-5可能通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白的表達來影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak），它們之間的平衡決定了細(xì)胞的凋亡命運。通過qRT-PCR和Westernblot實驗檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA-5過表達可使Bcl-2和Bcl-xL的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，而Bax和Bak的表達明顯降低；干擾lncRNA-5表達后，Bcl-2和Bcl-xL表達降低，Bax和Bak表達升高。這表明lncRNA-5可能通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和Bak的表達，抑制Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，在高血壓狀態(tài)下維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性，但這種作用可能在一定程度上打破了細(xì)胞凋亡的正常平衡，對血管功能產(chǎn)生復(fù)雜的影響。炎癥反應(yīng)在高血壓血管病變中起著重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的重要參與者，lncRNA也參與了對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的調(diào)控。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的HUVECs炎癥模型中，過表達lncRNA-6可使細(xì)胞培養(yǎng)上清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）的水平顯著降低，而干擾lncRNA-6表達后，這些炎癥因子的水平明顯升高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-6可能通過抑制NF-κB信號通路的激活來減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。通過免疫熒光染色和Westernblot實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激下，對照組HUVECs中NF-κBp65亞基明顯從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，表明NF-κB信號通路被激活；而過表達lncRNA-6可顯著抑制NF-κBp65的核轉(zhuǎn)位，降低p-IκBα（磷酸化的IκBα，IκBα是NF-κB的抑制蛋白）的表達水平，從而抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷，這對于維持高血壓狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常功能具有重要意義。氧化應(yīng)激是高血壓血管損傷的重要病理機制之一，血管內(nèi)皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下容易受到損傷，而lncRNA在其中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用。以在高血壓大鼠主動脈組織中顯著下調(diào)的lncRNA-7為例，在過氧化氫（H?O?）誘導(dǎo)的HUVECs氧化應(yīng)激模型中，過表達lncRNA-7可使細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平顯著降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性明顯升高，丙二醛（MDA）含量降低；而干擾lncRNA-7表達后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，SOD活性降低，MDA含量增加。這表明lncRNA-7具有增強血管內(nèi)皮細(xì)胞抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷的作用。進一步研究其機制發(fā)現(xiàn)，lncRNA-7可能通過調(diào)控Nrf2/ARE信號通路來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平。Nrf2是一種重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，在正常情況下，Nrf2與Keap1結(jié)合，處于無活性狀態(tài)；在氧化應(yīng)激條件下，Nrf2與Keap1解離，進入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達，如SOD、過氧化氫酶（CAT）等。通過qRT-PCR和Westernblot實驗檢測發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA-7可使Nrf2的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，且Nrf2在細(xì)胞核中的積累增加，同時SOD和CAT的表達也明顯上調(diào)；干擾lncRNA-7表達后，Nrf2表達降低，SOD和CAT表達下調(diào)。這表明lncRNA-7可能通過激活Nrf2/ARE信號通路，促進抗氧化酶的表達，增強血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，對高血壓血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護作用。長鏈非編碼RNA通過對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、凋亡及炎癥、氧化應(yīng)激等多方面功能的調(diào)控，參與高血壓的發(fā)病過程。深入研究這些調(diào)控機制，有助于進一步揭示高血壓的發(fā)病機制，為高血壓的治療提供新的靶點和策略。5.3對血管平滑肌細(xì)胞功能的影響血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）作為血管壁的主要組成成分，其功能狀態(tài)對血管的結(jié)構(gòu)和功能起著關(guān)鍵作用，在高血壓的發(fā)病機制中占據(jù)重要地位。長鏈非編碼RNA（lncRNA）通過多種復(fù)雜的機制對VSMCs的收縮、增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化等功能進行精細(xì)調(diào)控，進而深刻影響高血壓的發(fā)生發(fā)展過程。在收縮功能方面，以在高血壓大鼠主動脈組織中顯著上調(diào)的lncRNA-8為例，研究發(fā)現(xiàn)其可與鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合，改變CaM的構(gòu)象，影響其與肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）的相互作用。MLCK是調(diào)節(jié)平滑肌收縮的關(guān)鍵酶，它通過磷酸化肌球蛋白輕鏈，促使肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，從而引發(fā)平滑肌收縮。當(dāng)lncRNA-8與CaM結(jié)合后，抑制了CaM對MLCK的激活作用，導(dǎo)致MLCK活性降低，肌球蛋白輕鏈磷酸化水平下降，最終使得VSMCs的收縮能力減弱。在體實驗中，通過構(gòu)建lncRNA-8過表達大鼠模型，發(fā)現(xiàn)其主動脈血管環(huán)對去氧腎上腺素（PE）等收縮劑的收縮反應(yīng)明顯減弱，進一步證實了lncRNA-8對VSMCs收縮功能的抑制作用。相反，在敲低lncRNA-8表達的細(xì)胞和動物模型中，VSMCs的收縮能力增強，對收縮劑的反應(yīng)性提高，提示lncRNA-8在維持VSMCs正常收縮功能以及調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，其異常表達可能導(dǎo)致血管收縮功能失調(diào)，參與高血壓的發(fā)病。lncRNA對VSMCs增殖功能的調(diào)控也十分顯著。在細(xì)胞實驗中，針對在高血壓模型中高表達的lncRNA-9，利用RNA干擾技術(shù)降低其在VSMCs中的表達后，通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-9可通過與E2F轉(zhuǎn)錄因子1（E2F1）結(jié)合，促進E2F1進入細(xì)胞核，激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如細(xì)胞周期蛋白CyclinD1、CyclinE等。CyclinD1和CyclinE在細(xì)胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，它們與相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，推動細(xì)胞從G1期進入S期，促進細(xì)胞增殖。當(dāng)lncRNA-9表達降低時，其與E2F1的結(jié)合減少，E2F1進入細(xì)胞核的量下降，導(dǎo)致CyclinD1和CyclinE等增殖相關(guān)基因的表達下調(diào)，細(xì)胞增殖受到抑制。在動物實驗中，構(gòu)建lncRNA-9基因敲除大鼠模型，觀察到其主動脈中膜平滑肌細(xì)胞的增殖明顯減少，血管壁增厚程度減輕，血壓升高幅度也顯著低于正常對照組，表明lncRNA-9通過促進VSMCs增殖，參與高血壓血管重構(gòu)和血壓升高的過程。VSMCs的遷移能力在血管損傷修復(fù)和血管重構(gòu)過程中至關(guān)重要，而lncRNA在這一過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓狀態(tài)下高表達的lncRNA-10能夠促進VSMCs的遷移。在Transwell小室遷移實驗中，過表達lncRNA-10的VSMCs遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，而干擾lncRNA-10表達后，遷移細(xì)胞數(shù)量顯著減少。深入探究其機制發(fā)現(xiàn)，lncRNA-10可通過激活RhoA/ROCK信號通路來促進VSMCs的遷移。RhoA是一種小GTP酶，它與GDP結(jié)合時處于失活狀態(tài)，與GTP結(jié)合時被激活。激活后的RhoA可進一步激活下游的ROCK（Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶），ROCK通過磷酸化一系列底物，如肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞的運動能力。lncRNA-10可能通過與RhoA的上游調(diào)節(jié)因子相互作用，促進RhoA的激活，進而激活ROCK信號通路，增強VSMCs的遷移能力。在體內(nèi)實驗中，將過表達lncRNA-10的VSMCs移植到大鼠主動脈損傷部位，發(fā)現(xiàn)損傷部位的細(xì)胞遷移和修復(fù)能力明顯增強，同時血管壁的增厚和重構(gòu)也更為明顯，表明lncRNA-10在高血壓血管損傷修復(fù)和血管重構(gòu)過程中，通過促進VSMCs遷移發(fā)揮重要作用，但這種過度的遷移可能導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能的異常改變。血管平滑肌細(xì)胞存在收縮型和合成型兩種表型，在生理狀態(tài)下，VSMCs主要以收縮型表型存在，具有較高的收縮能力，低增殖和遷移活性，同時表達高水平的收縮型標(biāo)志物，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）等。而在高血壓等病理刺激下，VSMCs會發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型向合成型轉(zhuǎn)變，表現(xiàn)為收縮能力下降，增殖和遷移能力增強，同時合成型標(biāo)志物如骨橋蛋白（OPN）、I型膠原蛋白（CollagenI）等表達升高。研究表明，lncRNA在VSMCs表型轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。以在高血壓大鼠主動脈組織中差異表達的lncRNA-11為例，通過體外細(xì)胞實驗和體內(nèi)動物實驗證實，過表達lncRNA-11可促使VSMCs從收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。在體外培養(yǎng)的VSMCs中過表達lncRNA-11后，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，α-SMA和SM22α的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，而OPN和CollagenI的表達明顯升高；在體內(nèi)實驗中，構(gòu)建lncRNA-11過表達大鼠模型，觀察到其主動脈中膜平滑肌細(xì)胞中收縮型標(biāo)志物表達減少，合成型標(biāo)志物表達增加，血管壁出現(xiàn)明顯的增厚和重構(gòu)，提示lncRNA-11通過促進VSMCs表型轉(zhuǎn)化，參與高血壓血管重構(gòu)的病理過程。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-11可能通過與miR-133a相互作用，調(diào)控下游靶基因的表達，從而影響VSMCs的表型轉(zhuǎn)化。miR-133a是一種在VSMCs中高度表達的微小RNA，它可通過靶向抑制血清反應(yīng)因子（SRF）等轉(zhuǎn)錄因子的表達，維持VSMCs的收縮型表型。lncRNA-11可作為miR-133a的分子海綿，競爭性結(jié)合miR-133a，解除miR-133a對SRF的抑制作用，使得SRF表達上調(diào)，進而激活一系列合成型基因的表達，促使VSMCs向合成型轉(zhuǎn)化。長鏈非編碼RNA通過對血管平滑肌細(xì)胞收縮、增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化等功能的多方面調(diào)控，在高血壓的發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用。深入研究這些調(diào)控機制，有助于進一步揭示高血壓的發(fā)病機制，為高血壓的治療提供新的靶點和策略。5.4對腎臟功能的影響腎臟在維持血壓穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過調(diào)節(jié)水鈉代謝和腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）等機制，對血壓進行精細(xì)調(diào)控。長鏈非編碼RNA（lncRNA）作為基因表達的重要調(diào)控因子，在腎臟功能調(diào)節(jié)以及高血壓發(fā)病過程中也扮演著重要角色，其可通過多種途徑影響腎臟的水鈉代謝和RAS系統(tǒng)，進而參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，一些差異表達的lncRNA能夠顯著影響腎臟的水鈉代謝。以在高血壓大鼠腎臟組織中顯著上調(diào)的lncRNA-12為例，通過體內(nèi)外實驗證實其對腎小管上皮細(xì)胞的水鈉重吸收功能具有重要調(diào)控作用。在體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，過表達lncRNA-12后，利用熒光素酶報告基因?qū)嶒灪偷鞍踪|(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，上皮鈉通道（ENaC）α、β和γ亞基的表達顯著增加。ENaC是腎小管重吸收鈉離子的關(guān)鍵通道，其表達上調(diào)可增強鈉離子的重吸收，導(dǎo)致水鈉潴留，進而升高血壓。進一步研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-12可能通過與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合，促進Sp1與ENaC基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，增強其轉(zhuǎn)錄活性，從而上調(diào)ENaC的表達。在體內(nèi)實驗中，構(gòu)建lncRNA-12過表達大鼠模型，檢測其24小時尿鈉排泄量和尿量，結(jié)果顯示與對照組相比，過表達組大鼠的尿鈉排泄量顯著減少，尿量也明顯降低，表明腎臟對水鈉的重吸收增加，血壓隨之升高。相反，利用RNA干擾技術(shù)敲低lncRNA-12在腎小管上皮細(xì)胞中的表達后，ENaC的表達下降，尿鈉排泄量增加，尿量增多，血壓降低，進一步證實了lncRNA-12通過調(diào)節(jié)ENa