棉花黃萎菌拮抗細菌BDT25抗菌蛋白的分離純化及特性研究1.引言棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticilliumdahliae）引起的一種世界范圍內的毀滅性土傳病害，嚴重影響棉花的產量和品質?；瘜W農藥的長期使用帶來了環(huán)境污染、病原菌抗藥性增強等問題。生物防治作為一種綠色、可持續(xù)的防治手段，受到了廣泛關注。拮抗細菌分泌的抗菌蛋白在抑制病原菌生長方面具有重要作用。本研究聚焦于棉花黃萎菌拮抗細菌BDT25抗菌蛋白，旨在通過分離純化確定其特性，為棉花黃萎病的生物防治提供理論依據。2.材料與方法2.1材料菌株：拮抗細菌BDT25由本實驗室從棉花根際土壤中分離保存；棉花黃萎菌標準菌株購自中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)拮抗細菌BDT25；PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)棉花黃萎菌。主要試劑：硫酸銨、SDSPAGE凝膠制備試劑、蛋白質純化相關試劑等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。2.2方法2.2.1抗菌蛋白的粗提取將拮抗細菌BDT25接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)物于4℃、10000r/min離心20min，取上清液。采用硫酸銨分級沉淀法，分別用30%、50%、70%和90%飽和度的硫酸銨進行沉淀，4℃靜置過夜后，12000r/min離心30min，收集沉淀，用少量PBS緩沖液溶解，透析除鹽，得到抗菌蛋白粗提液。2.2.2抗菌蛋白的分離純化離子交換層析：將抗菌蛋白粗提液上樣到DEAESepharoseFastFlow離子交換柱，用含不同濃度NaCl的PBS緩沖液進行梯度洗脫，流速為1mL/min，收集各洗脫峰，檢測其抗菌活性。凝膠過濾層析：將具有抗菌活性的洗脫峰收集液濃縮后，上樣到SephadexG75凝膠過濾柱，用PBS緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min，收集各洗脫峰，檢測抗菌活性。2.2.3抗菌蛋白的特性研究分子量測定：采用SDSPAGE電泳法測定純化抗菌蛋白的分子量，以標準蛋白分子量Marker為對照。等電點測定：使用等電聚焦電泳法測定抗菌蛋白的等電點。熱穩(wěn)定性：將純化的抗菌蛋白分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃處理30min，然后測定其對棉花黃萎菌的抗菌活性。pH穩(wěn)定性：將純化的抗菌蛋白置于不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0）的緩沖液中處理2h，然后測定其抗菌活性。酶敏感性：分別用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理純化的抗菌蛋白，然后測定其抗菌活性。3.結果與分析3.1抗菌蛋白的粗提取通過硫酸銨分級沉淀，發(fā)現70%飽和度硫酸銨沉淀得到的蛋白粗提液抗菌活性最強，對棉花黃萎菌的抑菌圈直徑達到（20.5±1.2）mm，而其他飽和度沉淀得到的蛋白粗提液抗菌活性較弱。3.2抗菌蛋白的分離純化離子交換層析：經過DEAESepharoseFastFlow離子交換層析，得到了3個洗脫峰，其中峰Ⅱ具有較強的抗菌活性，對棉花黃萎菌的抑菌圈直徑為（18.6±1.0）mm。凝膠過濾層析：將峰Ⅱ收集液進行凝膠過濾層析，得到1個主要的洗脫峰，該洗脫峰具有明顯的抗菌活性，對棉花黃萎菌的抑菌圈直徑為（22.3±1.1）mm，表明該洗脫峰為純化的抗菌蛋白。3.3抗菌蛋白的特性研究分子量測定：SDSPAGE電泳結果顯示，純化的抗菌蛋白分子量約為35kDa。等電點測定：等電聚焦電泳結果表明，該抗菌蛋白的等電點約為5.8。熱穩(wěn)定性：隨著溫度的升高，抗菌蛋白的抗菌活性逐漸降低。當溫度達到80℃時，抗菌活性仍保留約60%；當溫度達到90℃時，抗菌活性僅保留約30%，說明該抗菌蛋白具有一定的熱穩(wěn)定性。pH穩(wěn)定性：該抗菌蛋白在pH5.08.0范圍內具有較高的抗菌活性，在pH7.0時抗菌活性最強；當pH低于5.0或高于8.0時，抗菌活性明顯下降。酶敏感性：蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，抗菌蛋白的抗菌活性均顯著降低，說明該抗菌蛋白對這些酶敏感，其活性依賴于蛋白質的完整結構。4.討論本研究成功從拮抗細菌BDT25中分離純化得到一種抗菌蛋白，該蛋白對棉花黃萎菌具有較強的抑制作用。其分子量約為35kDa，等電點約為5.8，具有一定的熱穩(wěn)定性和較寬的pH適應范圍，但對蛋白酶敏感。與其他已報道的抗菌蛋白相比，本研究得到的抗菌蛋白在特性上有一定的差異。例如，某些抗菌蛋白熱穩(wěn)定性較差，在60℃處理后抗菌活性幾乎喪失；而本研究的抗菌蛋白在80℃處理后仍保留約60%的抗菌活性。這可能與抗菌蛋白的氨基酸組成和結構有關。該抗菌蛋白的發(fā)現為棉花黃萎病的生物防治提供了新的資源。在實際應用中，可以進一步研究其作用機制，開發(fā)基于該抗菌蛋白的生物農藥，以提高棉花黃萎病的防治效果，減少化學農藥的使用。5.結論本研究通過硫酸銨分級沉淀、離子交換層析和凝膠過濾層析等方法，從拮抗細菌BDT25中分離純化得到一種抗菌蛋白。該抗菌蛋白分子量約為35kDa，等電點約為5.8，具有一定的