專題18基因工程考點三年考情（20232025）命題趨勢考點1基因工程的基本工具2025江蘇卷：基因突變

DNA重組技術的基本工具；2025云南卷：基因分離定律的實質(zhì)和應用

PCR擴增的原理與過程

DNA重組技術的基本工具；2025山東卷：PCR擴增的原理與過程

DNA重組技術的基本工具

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定；2024湖南卷：酶的特性

DNA重組技術的基本工具；2024安徽卷：DNA的粗提取及鑒定；2024山東卷：DNA的粗提取及鑒定；2024山東卷：基因分離定律的實質(zhì)和應用

DNA重組技術的基本工具

目的基因的檢測與鑒定；2023福建卷：DNA的粗提取及鑒定

PCR擴增的原理與過程；2023重慶卷：DNA重組技術的基本工具

篩選、獲取合適的目的基因；2023湖北卷：DNA重組技術的基本工具

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定；2023廣東卷：DNA的粗提取及鑒定；2023山西卷：DNA重組技術的基本工具

基因表達載體的構(gòu)建；1.基因工程的基本工具高考考查頻率較高的知識主要表現(xiàn)在①DNA重組技術的基本工具②DNA的粗提取及鑒定2.基因工程的基本操作程序高考考查頻率較高的知識主要表現(xiàn)在①電泳鑒定②PCR擴增的原理與過程③將目的基因?qū)胧荏w細胞④目的基因的檢測與鑒定⑤基因表達載體的構(gòu)建⑥篩選、獲取合適的目的基因3.基因工程和蛋白質(zhì)工程的應用高考考查頻率較高的知識主要表現(xiàn)在①蛋白質(zhì)工程原理及操作流程②基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用③基因診斷和基因治療考點2基因工程的基本操作程序2025全國卷：電泳鑒定；2025廣東卷：DNA分子的結(jié)構(gòu)和特點

PCR擴增的原理與過程；2025安徽卷：將目的基因?qū)胧荏w細胞

目的基因的檢測與鑒定；2025河北卷：伴性遺傳的遺傳規(guī)律及應用

PCR擴增的原理與過程；2025河南卷：基因表達載體的構(gòu)建

將目的基因?qū)胧荏w細胞

目的基因的檢測與鑒定

蛋白質(zhì)工程的應用及實例分析；2025廣東卷：PCR擴增的原理與過程

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用；2025黑吉遼蒙卷：遺傳信息的翻譯

PCR擴增的原理與過程

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定；2025河北卷：PCR擴增的原理與過程

基因表達載體的構(gòu)建；2024江西卷：基因表達載體的構(gòu)建

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用；2024浙江卷：PCR擴增的原理與過程

電泳鑒定；2024山東卷：PCR擴增的原理與過程；2024吉林卷：PCR擴增的原理與過程

電泳鑒定；2024湖南卷：基因突變

PCR擴增的原理與過程；2024天津卷：基因工程的操作程序綜合

電泳鑒定；2024福建卷：PCR擴增的原理與過程

基因表達載體的構(gòu)建

將目的基因?qū)胧荏w細胞

胚胎移植技術；2024重慶卷：基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定

基因工程的操作程序綜合；2024貴州卷：PCR擴增的原理與過程

基因表達載體的構(gòu)建

將目的基因?qū)胧荏w細胞；2024北京卷：細胞的分化

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定；2024全國甲卷：PCR擴增的原理與過程

DNA重組技術的基本工具

將目的基因?qū)胧荏w細胞

目的基因的檢測與鑒定；2024吉林卷：DNA的粗提取及鑒定

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定

蛋白質(zhì)工程原理及操作流程；2024新課標卷：PCR擴增的原理與過程

DNA重組技術的基本工具

基因表達載體的構(gòu)建

基因編輯技術；2023遼寧卷：基因表達載體的構(gòu)建；2023浙江卷：遺傳信息的翻譯

PCR擴增的原理與過程；2023河北卷：PCR擴增的原理與過程

基因表達載體的構(gòu)建

篩選、獲取合適的目的基因；2023江蘇卷：微生物的接種方法

PCR擴增的原理與過程

DNA重組技術的基本工具

目的基因的檢測與鑒定；2023山東卷：PCR擴增的原理與過程

DNA重組技術的基本工具

基因表達載體的構(gòu)建

目的基因的檢測與鑒定；考點3基因工程和蛋白質(zhì)工程的應用2025全國卷：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及多樣性

蛋白質(zhì)工程原理及操作流程；2025云南卷：微生物的接種方法

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用；2025重慶卷：自然選擇與適應的形成

基因表達載體的構(gòu)建

將目的基因?qū)胧荏w細胞

蛋白質(zhì)工程原理及操作流程；2025浙江卷：DNA的粗提取及鑒定

PCR擴增的原理與過程

目的基因的檢測與鑒定

蛋白質(zhì)工程原理及操作流程；2024天津卷：蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸

內(nèi)分泌系統(tǒng)的組成和功能

基因表達載體的構(gòu)建

蛋白質(zhì)工程原理及操作流程；2024河北卷：基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用

基因工程的操作程序綜合

疫苗；2024上海卷：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及多樣性

基因突變

人類基因組計劃

基因診斷和基因治療；2023天津卷：基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用

動物體細胞核移植技術和克隆

胚胎移植技術；2023廣東卷：細胞癌變的原因及防治

基因突變

基因診斷和基因治療；2023北京卷：DNA分子的復制過程、特點及意義

基因工程在農(nóng)牧業(yè)、制藥及環(huán)境等方面的應用；考點01基因工程的基本工具1．（2025·云南·高考真題）冬瓜果面有蠟粉可提高果實抗病、耐日灼和耐儲性。為探究冬瓜果面蠟粉的遺傳方式并對蠟粉基因（用“A”“a”表示）進行定位，科研人員進行了一系列雜交實驗，結(jié)果如表。群體植株總數(shù)/株果面有蠟粉株數(shù)/株果面無蠟粉株數(shù)/株P130300P230030F15235230F2574430144注：F1為P1和P2雜交后代，F(xiàn)2為F1自交后代。回答下列問題：(1)根據(jù)雜交結(jié)果可知，果面蠟粉的遺傳遵循基因的定律，依據(jù)是。(2)實驗證明蠟粉性狀的改變是由基因突變引起的，突變基因上出現(xiàn)了一個限制酶H的切割位點，可用于在苗期篩選出果實表面有蠟粉的植株，據(jù)此設計引物后進行植株基因型鑒定的步驟為：提取基因組DNA→目的DNA片段→限制酶H切割擴增產(chǎn)物→電泳。結(jié)果顯示P1植株為1條條帶，P2植株為2條條帶，則F2中有蠟粉的植株為條條帶，限制酶H的切割位點位于（填“A”“a”或“A和a”）上。(3)用表中材料設計實驗，驗證（1）中得到的結(jié)論，寫出所選材料及遺傳圖解?！敬鸢浮?1)分離F2中出現(xiàn)3:1的性狀分離比，符合一對等位基因的遺傳規(guī)律(2)PCR擴增1或3a(3)選用材料：F1植株和P2植株遺傳圖解【分析】基因分離定律：在生物的體細胞中，控制同一性狀的遺傳因子成對存在，不相融合；在形成配子時，成對的遺傳因子發(fā)生分離，分離后的遺傳因子分別進入不同的配子中，隨配子遺傳給后代?！驹斀狻浚?）根據(jù)雜交結(jié)果可知，果面蠟粉的遺傳遵循基因的分離定律，因為F1自交得到的F2中，果面有蠟粉株數(shù)與果面無蠟粉株數(shù)之比約為3：1（430：144≈3：1），符合基因分離定律中雜合子自交后代性狀分離比3：1的比值。（2）要進行植株基因型鑒定，在提取基因組DNA后，需要通過PCR擴增目的DNA片段。P1植株為1條條帶，P2植株為2條條帶，說明P1為純合子且其基因不能被限制酶H切割（假設P1基因型為AA），P2為純合子且其基因能被限制酶H切割（假設P2基因型為aa），限制酶H的切割位點位于a上。F1基因型為Aa，F(xiàn)2中有蠟粉的植株基因型為AA或Aa。AA只有1條條帶（不能被切割），Aa會有3條條帶（A不能被切割為1條，a被切割為2條），所以F2中有蠟粉的植株為1條或3條條帶。（3）驗證分離定律，采用測交的方法，所選材料：F1Aa與P2aa（測交實驗可以驗證基因的分離定律）。2．（2025·山東·高考真題）種子休眠是抵御穗發(fā)芽的一種機制。通過對Ti質(zhì)粒的改造，利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Ti質(zhì)粒上的TDNA隨機整合到小麥基因組中，篩選到2個種子休眠相關基因的插入失活純合突變體。與野生型相比，突變體種子的萌發(fā)率降低。小麥基因組序列信息已知。(1)Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復制能力相關的結(jié)構(gòu)為。選用圖甲中的SmaI對抗除草劑基因X進行完全酶切，再選擇SmaI和對Ti質(zhì)粒進行完全酶切，將產(chǎn)生的黏性末端補平，補平時使用的酶是。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補平的Ti質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；經(jīng)卡那霉素篩選并提取質(zhì)粒后再選用限制酶進行完全酶切并電泳檢測，若電泳結(jié)果呈現(xiàn)一長一短2條帶，較短的條帶長度近似為bp，則一定為正向重組質(zhì)粒。(2)為證明這兩個突變體是由于TDNA插入到小麥基因組中同一基因?qū)е碌模崛』蚪MDNA，經(jīng)酶切后產(chǎn)生含有TDNA的基因組片段（圖乙）。在此酶切過程中，限于后續(xù)PCR難以擴增大片段DNA，最好使用識別序列為（填“4”“6”或“8”）個堿基對的限制酶，且TDNA中應不含該酶的酶切位點。需首先將圖乙的片段，才能利用引物P1和P2成功擴增未知序列。PCR擴增出未知序列后，進行了一系列操作，其中可以判斷出2條片段的未知序列是否屬于同一個基因的操作為（填“瓊脂糖凝膠電泳”或“測序和序列比對”）。(3)通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的含有野生型基因的表達載體轉(zhuǎn)入突變植株，如果檢測到野生型基因，（填“能”或“不能”）確定該植株的表型為野生型。【答案】(1)復制原點XbaIDNA聚合酶SmaI和SpeI550bp(2)4環(huán)化測序和序列比對(3)不能【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成；（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞；（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因DNA分子雜交技術；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA分子雜交技術；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原抗體雜交技術；個體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！驹斀狻浚?）DNA復制的起點是復制原點，因此Ti質(zhì)粒上與其在農(nóng)桿菌中的復制能力相關的結(jié)構(gòu)為復制原點。根據(jù)SmaI限制酶識別序列可知，酶切形成的是平末端，若質(zhì)粒僅用SmaI酶切，抗除草劑基因和質(zhì)?？梢哉蚪尤胍部梢苑聪蚪尤?，且無法區(qū)分，為了確定是否是正向重組質(zhì)粒，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒時需要用到另一種限制酶，抗除草劑因需要插入到啟動子和終止子之間，因此不能選擇BamHI，因為該限制酶會破壞終止子，因此可選擇XbaI和SmaI進行酶切，XbaI酶切會形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脫氧核糖核苷酸單體將產(chǎn)生的黏性末端補平（可使重組質(zhì)粒最小，同時PstI酶切后產(chǎn)生的黏性末端無法用DNA聚合酶抹平，因為DNA聚合酶只能從3'延伸子鏈）。利用DNA連接酶將酶切后的包含抗除草劑基因X的片段與酶切并補平的Ti質(zhì)粒進行連接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。重組的TDNA片段上含有一個SmaI酶切位點和一個SpeI酶切位點，可以選擇用SmaI和SpeI進行酶切，轉(zhuǎn)錄的方向是從模板的3'→5'，和質(zhì)粒對應的方向相同，經(jīng)過兩種酶的酶切后并電泳呈現(xiàn)一長一短2條帶，較短的條帶長度近似為550bp，若反向接，較短的條帶長度近似為200bp。（2）由于后續(xù)PCR難以擴增大片段DNA，所以最好選擇識別序列為4個堿基的限制酶，原因是識別序列越短，酶切位點越多，切割產(chǎn)生的片段可能越小，更有利于后續(xù)的PCR擴增。由于引物是根據(jù)已知序列設計的，但此時需要擴增未知序列，因此可以將圖乙的片段環(huán)化，這樣就可以利用現(xiàn)有引物擴增出未知序列。為了確定未知序列是否是同一基因，需要準確比對其上的堿基序列，因此對同一個基因的操作為測序和序列比對。（3）突變植株成功導入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表達，因此不能確定該植株的表型為野生型。3．（2024·湖南·高考真題）某同學將質(zhì)粒DNA進行限制酶酶切時，發(fā)現(xiàn)DNA完全沒有被酶切，分析可能的原因并提出解決方法。下列敘述錯誤的是（）A．限制酶失活，更換新的限制酶B．酶切條件不合適，調(diào)整反應條件如溫度和酶的用量等C．質(zhì)粒DNA突變導致酶識別位點缺失，更換正常質(zhì)粒DNAD．酶切位點被甲基化修飾，換用對DNA甲基化不敏感的限制酶【答案】B【分析】酶是活細胞產(chǎn)生的具有催化作用的有機物，大多數(shù)是蛋白質(zhì)，少部分是RNA，酶具有特異性、高效性、易受環(huán)境因素影響等特點。限制酶特異性識別并切割DNA上的特定位點。【詳解】A、限制酶失活會使DNA完全不被酶切，此時應更換新的限制酶，A正確；B、酶切條件不合適通常會使切割效果下降，調(diào)整反應條件如溫度和PH等，調(diào)整酶的用量沒有作用，B錯誤；C、質(zhì)粒DNA突變會導致限制酶識別位點缺失，進而造成限制酶無法進行切割，此時應更換為正常質(zhì)粒，C正確；D、質(zhì)粒DNA上酶切位點被甲基化修飾，會導致對DNA甲基化敏感的限制酶無法進行酶切，此時應換用對DNA甲基化不敏感的限制酶，D正確。故選B。4．（2024·安徽·高考真題）下列關于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是（

）A．實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低B．利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNAC．DNA在不同濃度NaC1溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物D．將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)【答案】D【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色?！驹斀狻緼、研磨液有利于DNA的溶解，換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低，A正確；B、DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可分離DNA，B正確；C、DNA在NaCl溶液中的溶解度隨著NaCl濃度的變化而改變，因此可用不同濃度的NaCl溶液對DNA進行粗提取，C正確；D、在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，二苯胺試劑用于鑒定DNA，D錯誤。故選D。5．（2024·山東·高考真題）關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗，下列說法正確的是（）A．整個提取過程中可以不使用離心機B．研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，應充分搖勻再倒入燒杯中C．鑒定過程中DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變D．僅設置一個對照組不能排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾【答案】A【分析】DNA的粗提取與鑒定的實驗原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同，利用這一特點可以選擇適當濃度的鹽溶液可以將DNA溶解或析出，從而達到分離的目的;②DNA不溶于酒精溶液，細胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶解于酒精，利用這一原理可以將蛋白質(zhì)和DNA進一步分離;③在沸水浴的條件下DNA遇二苯胺會呈現(xiàn)藍色?！驹斀狻緼、在DNA的粗提取與鑒定實驗中，可將獲得的研磨液用紗布過濾后，在4℃的冰箱中放置幾分鐘，再取上清液，也可以直接將研磨液用離心機進行離心后取上清液，A正確；B、研磨液在4℃冰箱中放置幾分鐘后，DNA在上清液中，應取上清液倒入燒杯中，B錯誤；C、鑒定過程中用沸水浴加熱，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，C錯誤；D、加入二苯胺試劑后沸水浴處理的時間要在5分鐘以上，且要等到冷卻后再觀察結(jié)果，這樣才可以觀察到較為明顯的顯色反應，僅設置一個對照組可以排除二苯胺加熱后可能變藍的干擾，D錯誤。故選A。6．（2024·山東·高考真題）研究發(fā)現(xiàn)基因L能夠通過脫落酸信號途徑調(diào)控大豆的逆境響應。利用基因工程技術編輯基因L，可培育耐鹽堿大豆品系。在載體上的限制酶BsaI切點處插入大豆基因L的向?qū)NA序列，將載體導入大豆細胞后，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可引導核酸酶特異性結(jié)合基因組上的目標序列并發(fā)揮作用。載體信息、目標基因L部分序列及相關結(jié)果等如圖所示。(1)用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目標基因L時，所用的引物越短，引物特異性越（填“高”或“低”）。限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，理論上可產(chǎn)生的黏性末端最多有種。載體信息如圖甲所示，經(jīng)BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5'3'和5'3'。(2)重組載體通過農(nóng)桿菌導入大豆細胞，使用抗生素篩選到具有該抗生素抗性的植株①～④。為了鑒定基因編輯是否成功，以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，部分序列信息及可選用的酶切位點如圖乙所示，PCR產(chǎn)物完全酶切后的電泳結(jié)果如圖丙所示。據(jù)圖可判斷選用的限制酶是，其中純合的突變植株是（填序號）。(3)實驗中獲得1株基因L成功突變的純合植株，該植株具有抗生素抗性，檢測發(fā)現(xiàn)其體細胞中只有1條染色體有TDNA插入。用抗生素篩選這個植株的自交子代，其中突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例為，篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育?！敬鸢浮?1)低2565'CAAT3'5'GTTT3'(2)卡那霉素SacⅠ④(3)1/4【分析】【關鍵能力】（1）信息獲取與加工題干關鍵信息所學知識信息加工黏性末端的種類基因工程的工具BsaI切割產(chǎn)生的黏性末端是NNNN，四個堿基最多可能有256種排列順序抗生素篩選目的基因的檢測與鑒定重組載體通過農(nóng)桿菌導入大豆細胞當中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株（2）邏輯推理與論證【詳解】（1）引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。由此可知，在利用PCR技術從大豆基因組DNA中擴增目的基因時，所用的引物越短，則引物的特異性就越低。根據(jù)題意可知，限制酶在切開DNA雙鏈時，形成的單鏈突出末端為黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因組DNA，圖中給出的只是載體信息，大豆基因組無法從圖中看出。只能根據(jù)理論來推測，BsaI切割產(chǎn)生的黏性末端是NNNN，四個堿基最多可能有256種排列順序，故答案應為256。根據(jù)圖甲所示的載體信息，經(jīng)BsaI酶切后，載體上保留的黏性末端序列應為5'CAAT3'、5'GTTT3'。（2）根據(jù)圖示信息可知，重組載體通過農(nóng)桿菌導入大豆細胞當中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通過使用卡那霉素篩選到具有該抗生素抗性的植株。根據(jù)圖甲可知，目標基因L的目標序列跟突變序列之間的差異只有在SacⅠ酶切位點上存在差異，BamHⅠ和EcoRⅠ這兩個酶切位點完全相同，根據(jù)圖丙及題意可知，所展示的電泳結(jié)果可知，要以上述抗性植株的DNA為模板，通過PCR擴增目標基因L，并對PCR產(chǎn)物完全酶切后進行電泳從而判斷植株含有的是目標序列還是突變序列，因此只能選用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突變序列存在酶切位點，但是目標序列沒有，因此經(jīng)過該酶酶切后突變序列的電泳條帶會出現(xiàn)兩條，目標序列是一條帶，根據(jù)圖丙結(jié)果可知，只有④為純和突變的植株。（3）根據(jù)題意可知，在實驗當中獲得了一株基因l成功突變的純合之中，已知該植株具有抗生素抗性，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)其體細胞中只有一條染色體含有TDNA插入。根據(jù)圖示可知，抗生素抗性基因在TDNA片段上，因此如果用抗生素來篩選該植株進行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例為1/2，不含TDNA（對抗生素敏感）的配子比例為1/2，因此突變位點純合且對抗生素敏感的植株所占比例應該為1/2×1/2=1/4，純突變位點純合且具有抗生素抗性的植株所占比例應該為3/4，可以篩選出的敏感植株可用于后續(xù)的品種選育。7．（2023·福建·高考真題）關于“DNA片段的擴增及電泳鑒定”(實驗I)和“DNA的粗提取與鑒定”(實驗Ⅱ)的實驗操作，下列相關敘述正確的是（

）A．實驗I中，PCR實驗所需的移液器、槍頭、蒸餾水等必須進行高壓滅菌處理B．實驗I中，將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，加樣前應先接通電源C．實驗Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNAD．實驗Ⅱ中，將白色絲狀物直接加入到二苯胺試劑中并進行沸水浴，用于鑒定DNA【答案】C【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色。【詳解】A、實驗Ⅰ中，PCR實驗所需的槍頭、蒸餾水等必須進行高壓滅菌處理，移液器不需要進行高壓蒸汽滅菌處理，A錯誤；B、實驗Ⅰ中，將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，應先加樣后接通電源，B錯誤；C、實驗Ⅱ中，取洋蔥研磨液的上清液，由于DNA不溶于酒精溶液，加入等體積冷酒精后析出粗提取的DNA，C正確；D、實驗Ⅱ中，將絲狀物溶于2mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺試劑，在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色，用于鑒定DNA，D錯誤。故選C。8．（2023·重慶·高考真題）某小組通過PCR（假設引物長度為8個堿基短于實際長度）獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切（下圖），再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是（

）A．其中一個引物序列為5＇TGCGCAGT3＇B．步驟①所用的酶是SpeI和CfoIC．用步驟①的酶對載體進行酶切，至少獲得了2個片段D．酶切片段和載體連接時，可使用E．coli連接酶或T4連接酶【答案】BE.coliDNAE.coliDNA連接酶只能連接黏性末端；T4DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端?！驹斀狻緼、由于引物只能引導子鏈從5＇到3＇，根據(jù)堿基互補配對原則，其中一個引物序列為5＇TGCGCAGT3＇，A正確；B、根據(jù)三種酶的酶切位點，左側(cè)的黏性末端是使用NheI切割形成的，右邊的黏性末端是用CfoI切割形成的，B錯誤；C、用步驟①的酶對載體進行酶切，使用了NheI和CfoI進行切割，根據(jù)他們的識別位點以及原本DNA的序列，切割之后至少獲得了2個片段，C正確；D、圖中形成的是黏性末端，而E.coliDNA連接酶能連接黏性末端；T4DNA連接酶既可連接平末端，又可連接黏性末端，D正確。故選B。9．（2023·湖北·高考真題）用氨芐青霉素抗性基因（AmpR）、四環(huán)素抗性基因（TetR）作為標記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達載體（重組質(zhì)粒），并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯誤的是（）A．若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因C．若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D．若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落【答案】D【分析】圖中質(zhì)粒內(nèi)，氨芐青霉素抗性基因（AmpR）內(nèi)含有AcaI和PvuI的酶切位點，四環(huán)素抗性基因（TetR）內(nèi)含有HindIII、SphI和SalI的酶切位點?！驹斀狻緼、若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確。B、若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因（TetR），因此在含Tet（四環(huán)素）培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；C、DNA凝膠電泳技術可以分離不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；D、SphⅠ的酶切位點位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因（AmpR），因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp（氨芐青霉素）的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯誤。故選D。10．（2023·廣東·高考真題）“DNA粗提取與鑒定”實驗的基本過程是：裂解→分離→沉淀→鑒定。下列敘述錯誤的是（

）A．裂解：使細胞破裂釋放出DNA等物質(zhì)B．分離：可去除混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等C．沉淀：可反復多次以提高DNA的純度D．鑒定：加入二苯胺試劑后即呈現(xiàn)藍色【答案】D【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：1、DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同（DNA在0.14mol/L的氯化鈉中溶解度最低）；DNA不溶于酒精溶液，但細胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精。2、DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性不同。3、DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會被染成藍色?！驹斀狻緼、裂解是加蒸餾水讓細胞吸水漲破，釋放出DNA等物質(zhì)，A正確；B、DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液，將溶液過濾，即可將混合物中的多糖、蛋白質(zhì)等與DNA分離，B正確；C、DNA不溶于酒精，而某些蛋白質(zhì)溶于酒精，可以反復多次用酒精沉淀出DNA，提高DNA純度，C正確；D、將DNA溶解于NaCl，加入二苯胺試劑，沸水浴五分鐘，待冷卻后，能呈現(xiàn)藍色，D錯誤。故選D。11．（2023·山西·高考真題）某同學擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點）和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（

）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接【答案】C【分析】DNA連接酶：（1）根據(jù)酶的來源不同分為兩類：E.coliDNA連接酶、T4DNA連接酶。這二者都能連接黏性末端，此外T4DNA連接酶還可以連接平末端，但連接平末端時的效率比較低。（2）DNA連接酶連接的是兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵?！驹斀狻緼、酶3切割后得到的是平末端，應該用T4DNA連接酶連接，A錯誤；B、質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B錯誤；C、質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C正確；D、若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選，D錯誤。故選C。考點02基因工程的基本操作程序1．（2025·全國卷·高考真題）瓊脂糖凝膠電泳常用于核酸樣品的分析，樣品1～4的電泳結(jié)果如圖所示（“+”“”分別代表電泳槽的陽極和陰極）。已知樣品1和2中的DNA分子分別是甲和乙，甲只有限制酶R的一個酶切位點，樣品3和4中有一個樣品是甲的酶切產(chǎn)物。下列敘述錯誤的是（

）A．配制瓊脂糖凝膠時需選用適當?shù)木彌_溶液B．該實驗條件下甲、乙兩種DNA分子均帶負電荷C．甲、乙兩種DNA分子所含堿基對的數(shù)量可能不同D．據(jù)圖推測樣品3可能是甲被酶R完全酶切后的產(chǎn)物【答案】D【分析】限制酶酶切其基本原理是利用限制酶對DNA上特定序列的識別，來確定切割位點并實現(xiàn)切割，從而獲得所需的特定序列。【詳解】A、配制瓊脂糖凝膠時選用適當緩沖溶液，可維持電泳過程中體系的pH穩(wěn)定，保證核酸分子正常泳動，A正確；B、電泳時，樣品向+極移動，說明在該實驗條件下甲、乙兩種DNA分子均帶負電荷，符合核酸分子在電泳中的帶電特性，B正確；C、電泳中，DNA分子的遷移速率與分子大小、電荷的多少等多種因素有關。甲、乙電泳條帶位置雖然相同，但影響DNA分子的遷移速率的因素很多，所以堿基對的數(shù)量可能不同，C正確；D、甲只有限制酶R的一個酶切位點，若被酶R完全酶切，只會得到2種DNA片段（2個條帶），這兩個條帶的堿基數(shù)量比甲要少，電泳跑的距離要比甲更遠，所以據(jù)圖推測樣品4才是甲被酶R完全酶切后的產(chǎn)物，D錯誤。故選D。2．（2025·廣東·高考真題）Solexa測序是一種將PCR與熒光檢測相結(jié)合的高通量測序技術。為了確保該PCR過程中，DNA聚合酶催化一個脫氧核苷酸單位完成聚合反應后，DNA鏈不繼續(xù)延伸，應保護底物中脫氧核糖結(jié)構(gòu)上的（

）A．1'堿基 B．2'氫 C．3'羥基 D．5'磷酸基團【答案】C【分析】在DNA復制過程中，在DNA聚合酶的催化作用下，將一個個的脫氧核苷酸連接形成磷酸二酯鍵，使子鏈延伸，但是DNA聚合酶催化延伸子鏈方向只能從5′→3′?！驹斀狻恳阎狣NA聚合酶催化延伸子鏈方向只能從5′→3′，原因是脫氧核苷酸的3'碳有羥基，可以結(jié)合下一個脫氧核苷酸的5′碳的磷酸基團，故為了DNA聚合酶催化一個脫氧核苷酸單位完成聚合反應后，DNA鏈不繼續(xù)延伸，應保護底物中脫氧核糖結(jié)構(gòu)上的3'羥基，使其不能結(jié)合下一個脫氧核苷酸的5′碳的磷酸基團，C正確。故選C。3．（2025·安徽·高考真題）質(zhì)粒K中含有β半乳糖苷酶基因，將該質(zhì)粒導入大腸桿菌細胞后，其編碼的酶可分解Xgal，產(chǎn)生藍色物質(zhì)，進而形成藍色菌落，如圖所示。科研小組以該質(zhì)粒作為載體，采用基因工程技術實現(xiàn)人源干擾素基因在大腸桿菌中的高效表達。下列敘述錯誤的是（

）A．使用氯化鈣處理大腸桿菌以提高轉(zhuǎn)化效率，可增加篩選平板上白色和藍色菌落數(shù)B．如果篩選平板中僅含卡那霉素，生長出的白色菌落不可判定為含目的基因的菌株C．因質(zhì)粒K中含兩個標記基因，篩選平板中長出的白色菌落即為表達目標蛋白的菌株D．若篩選平板中藍色菌落偏多，原因可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導入了大腸桿菌【答案】C【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成；（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等；（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣；（4）目的基因的檢測與鑒定?！驹斀狻緼、使用氯化鈣處理大腸桿菌，可使其處于感受態(tài)，提高轉(zhuǎn)化效率，即更多的大腸桿菌能吸收質(zhì)粒，無論吸收的是含目的基因的重組質(zhì)粒（可能形成白色菌落）還是未重組的質(zhì)粒K（形成藍色菌落），都可增加篩選平板上白色和藍色菌落數(shù)，A正確；B、由于僅含卡那霉素，未添加Xgal，無論導入的是重組質(zhì)粒還是空白質(zhì)粒，因不含Xgal，無法產(chǎn)生藍色物質(zhì)，故生長出的菌落均為白色，B正確；C、篩選平板中長出的白色菌落，可能是導入了重組質(zhì)粒（含目的基因），但也可能是雖然導入了質(zhì)粒但目的基因沒有成功表達目標蛋白，不能僅僅因為是白色菌落就判定為表達目標蛋白的菌株，C錯誤；D、若篩選平板中藍色菌落偏多，原因可能是質(zhì)粒K經(jīng)酶切后自身環(huán)化并導入了大腸桿菌，因為自身環(huán)化的質(zhì)粒K中β半乳糖苷酶基因完整，能表達活性β半乳糖苷酶，分解Xgal形成藍色菌落，D正確。故選C。4．（多選·2025·河北·高考真題）X染色體上的D基因異?？蓪е氯梭w患病，在男性中發(fā)病率為1/3500，某患病男孩（其母親沒有患病）X染色體上的基因D和H內(nèi)各有一處斷裂，斷裂點間的染色體片段發(fā)生顛倒重接。研究者對患兒和母親的DNA進行了PCR檢測，所用引物和擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖。不考慮其他變異，下列分析錯誤的是（

）注：引物組合S1和S2，R1和R2可分別用于對正?；駾和H序列的擴增檢測A．該病患者中男性顯著多于女性，女性中攜帶者的占比為1/3500B．用R1和R2對母親和患兒DNA進行PCR檢測的結(jié)果相同C．與正常男性相比，患病男孩X染色體上的基因排列順序發(fā)生改變D．利用S1和S2進行PCR檢測，可診斷母親再次孕育的胎兒是否患該病【答案】AB【分析】分析題意可知，某患病男孩（其母親沒有患?。染色體上的基因D和H內(nèi)各有一處斷裂，斷裂點間的染色體片段發(fā)生顛倒重接，故出現(xiàn)染色體倒位?！驹斀狻緼、某患病男孩其母親沒有患病，可知該病為伴X染色體隱性遺傳病，該病患者中男性顯著多于女性，在男性中發(fā)病率為1/3500，則該致病基因d頻率為1/3500，正?；駾基因頻率為3499/3500，女性中攜帶者的占比為2×1/3500×3499/3500，A錯誤；B、該男孩的母親為攜帶者，基因型為XDXd，該男孩基因型為XdY，該男孩的染色體倒位，故用R1和R2不能擴增出產(chǎn)物來，母親有正常的H基因，有產(chǎn)物，故對母親和患兒DNA進行PCR檢測的結(jié)果不同，B錯誤；C、該男孩的染色體倒位，故與正常男性相比，患病男孩X染色體上的基因排列順序發(fā)生改變，C正確；D、利用S1和S2進行PCR檢測，有產(chǎn)物則含有正常D基因，若無產(chǎn)物，則含有致病基因，故可診斷母親再次孕育的胎兒是否患該病，D正確。故選AB。5．（2025·河南·高考真題）卡拉膠是一類源于海洋紅藻的大分子多糖，可被某些細菌降解為具有多種應用前景的卡拉膠寡糖。某研究小組擬篩選具有高活性卡拉膠酶（CG）的菌種用于生產(chǎn)卡拉膠寡糖。回答下列問題：(1)選擇海藻和海泥作為樣本篩選卡拉膠降解菌的原因是。將培養(yǎng)后的菌液混勻并充分，再接種至微孔板中，經(jīng)培養(yǎng)和篩選獲得了CG活性最高的菌種。(2)為構(gòu)建攜帶cg（CG的編碼基因）的大腸桿菌表達載體（圖1），對cg的PCR擴增產(chǎn)物和質(zhì)粒進行雙酶切，隨后用E.coliDNA連接酶連接。為保證連接準確性和效率，cg轉(zhuǎn)錄模板鏈的5'端最好含有酶切位點。另有兩組同學選用了各不相同的雙酶切組合和T4DNA連接酶重復上述實驗，獲得的部分重組質(zhì)粒分子大小符合預期，但均無法使用各自構(gòu)建表達載體的雙酶切組合進行切割，其原因是。限制酶的識別序列和切割位點如下：(3)為將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，需要先用Ca2+處理大腸桿菌細胞，目的是，隨后在含和的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，根據(jù)菌落周圍有無水解透明圈篩選目的菌株。(4)已知空間上鄰近的兩個半胱氨酸易形成二硫鍵，從而提升蛋白質(zhì)的耐熱性。為提高CG的耐熱性，研究人員分析了五個氨基酸位點的空間距離和保守度（保守度值越大表明該位點對酶的功能越關鍵），如圖2所示。根據(jù)分析結(jié)果，選擇第位的氨基酸替換成半胱氨酸最合適，原因是。【答案】(1)在富含卡拉膠的環(huán)境中，存在能夠分解卡拉膠的微生物的可能性較大稀釋(2)BamHI重組質(zhì)粒連接處的序列不再是原來的限制酶識別序列(3)使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)卡拉膠四環(huán)素(4)44該位點的氨基酸空間上離半胱氨酸更近，容易形成二硫鍵，而且保守度低，替換后對酶功能的影響較小【分析】基因工程的基本操作步驟主要包括四步：①目的基因的獲?。虎诨虮磉_載體的構(gòu)建；③將目的基因?qū)胧荏w細胞；④目的基因的檢測與表達。其中，基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心?！驹斀狻浚?）卡拉膠是一類源于海洋紅藻的大分子多糖，可被某些細菌降解為具有多種應用前景的卡拉膠寡糖。由于在富含卡拉膠的環(huán)境中，存在能夠分解卡拉膠的微生物的可能性較大，因此可選擇海藻和海泥作為樣本篩選卡拉膠降解菌。將培養(yǎng)后的菌液混勻并充分稀釋，再接種至微孔板中，經(jīng)培養(yǎng)和篩選獲得了CG活性最高的菌種。（2）E.coliDNA連接酶只能連接具有黏性末端的片段，因此切割質(zhì)粒和目的基因時不能選擇切成平末端的限制酶，即不能選擇EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶與XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若選擇SpeⅠ酶與XbaⅠ酶切割，會出現(xiàn)質(zhì)粒和目的基因的自連、甚至目的基因倒接，因此切割質(zhì)粒時SpeⅠ酶與XbaⅠ酶中只能選擇一個，而另一個限制酶需要選擇BamHⅠ酶，又由于轉(zhuǎn)錄的方向是由啟動子→終止子，且mRNA形成的方向是5’→3’，且mRNA與DNA的模板鏈方向相反，因此基因模板鏈的3’應靠近啟動子，故為保證連接準確性和效率，cg轉(zhuǎn)錄模板鏈的5'端最好含有BamHI酶切位點。T4DNA連接酶既可以連接平末端，也可連接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA連接酶連接，由于限制酶的識別序列具有專一性，若連接后的序列不存在最初限制酶的識別序列，則可能導致重組質(zhì)粒無法使用各自構(gòu)建表達載體的雙酶切組合進行切割。故另有兩組同學選用了各不相同的雙酶切組合和T4DNA連接酶重復上述實驗，獲得的部分重組質(zhì)粒分子大小符合預期，但均無法使用各自構(gòu)建表達載體的雙酶切組合進行切割，其原因是重組質(zhì)粒連接處的序列不再是原來的限制酶識別序列。（3）為將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，需要先用Ca2+處理大腸桿菌細胞，目的是使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，便于重組DNA進入受體細胞。由于具有高活性卡拉膠酶（CG）的菌種可分解卡拉膠，使其菌落周圍形成透明圈，且重組質(zhì)粒上含有四環(huán)素抗性基因，因此導入目的基因的大腸桿菌可接種在含卡拉膠和四環(huán)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，根據(jù)菌落周圍有無水解透明圈篩選目的菌株。（4）據(jù)圖可知，虛線長度代表氨基酸間的空間距離，由于第44位點的氨基酸空間上離半胱氨酸更近，容易形成二硫鍵，而且保守度低，替換后對酶功能的影響較小，因此選擇第44位的氨基酸替換成半胱氨酸最合適。6．（2025·廣東·高考真題）大腸桿菌是重要工業(yè)菌株之一，其培養(yǎng)過程可分為快速生長期和生長穩(wěn)定期兩個階段。為了通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與降解速率來動態(tài)調(diào)控代謝途徑關鍵酶的蛋白量，使細胞適配不同階段的生產(chǎn)需求，研究者設計了兩種質(zhì)粒，并以穩(wěn)定性好的紅色熒光蛋白mKate2為模式蛋白。測試質(zhì)粒功能?；卮鹣铝袉栴}：(1)研究者首先構(gòu)建質(zhì)粒①（圖a）用于在細胞內(nèi)表達C末端帶SsrA短肽的mKate2，將質(zhì)粒導入感受態(tài)細胞后，在添加抗生素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)基上菌落的生長狀況，結(jié)合PCR及檢測，篩選獲得重組菌株W1。(2)將W1在適宜條件下進行搖瓶培養(yǎng)，定時取樣檢測培養(yǎng)液中細胞密度，方法有（答一種）。接種前需檢測液體培養(yǎng)基的熒光強度，其作用是。培養(yǎng)結(jié)果（圖b）表明，進入生長穩(wěn)定期后熒光強度快速下降，原因是。(3)研究者選用啟動子PX、X基因（編碼阻遏蛋白X，阻遏PX開啟轉(zhuǎn)錄），重新構(gòu)建質(zhì)粒②（圖a），導入野生型大腸桿菌中獲得重組菌株W2。在適宜條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，W2的生長趨勢不變，培養(yǎng)期間熒光強度的變化趨勢為。(4)莽草酸是一種重要工業(yè)化學品，其胞內(nèi)合成代謝途徑見圖c。由于野生型大腸桿菌胞內(nèi)酶A活性弱，且莽草酸會被快速轉(zhuǎn)化為細胞生長必需物，因此細胞中無法大量積累莽草酸。為了保證細胞正常生長，并在生長穩(wěn)定期實現(xiàn)莽草酸的大量積累，利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能，結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造，提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路：。【答案】(1)熒光(2)稀釋涂布平板法、顯微鏡直接計數(shù)法排除培養(yǎng)基本身熒光對實驗結(jié)果的干擾PGro在生長穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄，且?guī)в蠸srA短肽的mKate2被降解(3)快速生長期無熒光，生長穩(wěn)定期熒光強度先上升后保持穩(wěn)定(4)先敲除野生菌株中的酶B基因，再將質(zhì)粒①中的mKate2基因替換為酶B基因，將質(zhì)粒②中的mKate2基因替換為酶A基因，并將兩種質(zhì)粒導入野生菌株中【分析】1、基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測與鑒定。2、引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。引物能使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。用于PCR的引物長度通常為20—30個核苷酸。3、啟動子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，緊挨轉(zhuǎn)錄的起始位點，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達出人類需要的蛋白質(zhì)?！驹斀狻浚?）在基因工程中，篩選重組菌株時，常用的檢測方法除了PCR，根據(jù)質(zhì)粒中存在紅色熒光蛋白基因，可利用熒光檢測，篩選獲得重組菌株W1。（2）檢測培養(yǎng)液中細胞密度常用的方法有稀釋涂布平板法（通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)來估算細胞數(shù)量，進而得到細胞密度）、顯微鏡直接計數(shù)法（利用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接對細胞進行計數(shù)）。接種前檢測液體培養(yǎng)基的熒光強度，是為了排除培養(yǎng)基本身熒光對實驗結(jié)果的干擾，作為空白對照。進入生長穩(wěn)定期后，由于PGro在生長穩(wěn)定期停止基因轉(zhuǎn)錄，所以不再合成帶有SsrA短肽的mKate2，同時C末端帶有SsrA短肽的蛋白質(zhì)可被大腸桿菌內(nèi)源蛋白酶系統(tǒng)特異性識別并以一定速率降解，導致熒光強度快速下降。（3）在重組菌株W2中，啟動子PX被阻遏蛋白X阻遏轉(zhuǎn)錄。在細胞快速生長階段，阻遏蛋白X阻遏mKate2基因的表達；隨著細胞進入生長穩(wěn)定器，阻遏蛋白X停止表達并被降解，對PX啟動子的阻遏作用降低，mKate2基因開始表達，熒光強度開始上升，由于原料的限制，最后保持穩(wěn)定，所以培養(yǎng)期間熒光強度的變化趨勢為快速生長期無熒光，生長穩(wěn)定期熒光強度先上升后保持穩(wěn)定。（4）為了保證細胞正常生長，并在生長穩(wěn)定期實現(xiàn)莽草酸的大量積累，利用上述兩種質(zhì)粒的調(diào)控功能，結(jié)合野生型菌株遺傳物質(zhì)的改造，提出重組生產(chǎn)菌株構(gòu)建思路是：首先對野生型大腸桿菌進行改造，敲除酶B基因；然后將質(zhì)粒①中的mKate2基因替換為酶B基因，使相關代謝途徑關鍵酶在快速生長期正常表達以保證細胞正常生長，進入生長穩(wěn)定期后該酶降解，減少對莽草酸的轉(zhuǎn)化；同時將質(zhì)粒②中的mKate2基因替換為酶A基因，利用其調(diào)控機制在生長穩(wěn)定期實現(xiàn)莽草酸合成相關基因的穩(wěn)定表達，從而大量積累莽草酸，最后將兩種質(zhì)粒導入野生菌株。7．（2025·黑吉遼蒙卷·高考真題）香樹脂醇具有抗炎等功效，從植物中提取難度大、產(chǎn)率低。通過在酵母菌中表達外源香樹脂醇合酶基因N，可高效生產(chǎn)香樹脂醇。回答下列問題。(1)可從中查詢基因N的編碼序列，設計特定引物。如圖1所示，a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，為保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接，需在引物1和引物2的5'端分別引入和限制酶識別序列。PCR擴增基因N，特異性酶切后，利用連接DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應部分大小基本不變。(2)進一步篩選構(gòu)建的質(zhì)粒，以14號菌株中提取的質(zhì)粒為模板，使用引物1和引物2進行PCR擴增，電泳PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2。在第5組的PCR反應中，使用無菌水代替實驗組的模板DNA，目的是檢驗PCR反應中是否有的污染。初步判斷實驗組（從“1~4”中選填）的質(zhì)粒中成功插入了基因N，理由是。(3)為提高香樹脂醇合酶催化效率，將編碼第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的堿基序列替換為編碼丙氨酸的堿基序列，丙氨酸的密碼子有GCA等。a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物（GCA為誘變序列），b、c、d其中一條是誘變第243位苯丙氨酸的引物，其配對模板與a的配對模板相同。據(jù)此分析，丙氨酸的密碼子除GCA外，還有。a：5'…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3'b：5'…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3'c：5'…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3'd：5'…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3'(4)進一步檢測轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵得到的含量并進行比較，可以選出最優(yōu)的香樹脂醇合酶基因的改造方案。【答案】(1)基因數(shù)據(jù)庫/序列數(shù)據(jù)庫XhoⅠXbaⅠDNA連接酶(2)外源DNA1目的基因N大小為2.3kb(3)GCC(4)香樹脂醇【分析】PCR原理：在解旋酶作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實際上就是在體外模擬細胞內(nèi)DNA的復制過程。DNA的復制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈。PCR反應過程是：變性→復性→延伸?！驹斀狻浚?）GenBank是目前國際上廣泛使用的序列數(shù)據(jù)庫之一，它的數(shù)據(jù)主要是各國的實驗室、測序機構(gòu)等發(fā)布的序列信息。利用這個數(shù)據(jù)庫，我們可以便捷地檢索到基因和蛋白質(zhì)的序列信息；故可從序列數(shù)據(jù)庫或基因數(shù)據(jù)庫中查詢基因N的編碼序列，設計特定引物。保證基因N與質(zhì)粒pYL正確連接，需要使用雙酶切法，為了目的基因能正確表達，目的基因需要插入質(zhì)粒的啟動子和終止子之間，且質(zhì)粒和目的基因需要使用相同的酶或能產(chǎn)生相同黏性末端的酶；分析圖1可知，質(zhì)粒pYL應該選用SpeⅠ和XhoⅠ酶切，由于目的基因N含有SpeⅠ識別序列，故N基因不能使用SpeⅠ酶切，但XbaⅠ與其具有相同的黏性末端，基因N酶切時可以用XbaⅠ替換SpeⅠ，即N基因兩端應該含有XbaⅠ和XhoⅠ識別序列；題干信息：N基因a鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈，才有引物1和引物2擴增N基因，則擴增后模板鏈的5'端含有引物1序列，而編碼鏈的5'端含有引物2序列，結(jié)合質(zhì)粒pYL上的啟動子和終止子方向，可知應該在引物2需要5'端添加XbaⅠ、引物15'端添加XhoⅠ識別序列。PCR擴增基因N，特異性酶切后，利用DNA連接酶連接DNA片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應部分大小基本不變。（2）構(gòu)建重組質(zhì)粒，大小約9.5kb（kb為千堿基對），假設構(gòu)建重組質(zhì)粒前后，質(zhì)粒pYL對應部分大小基本不變，而質(zhì)粒pYL本身7.2kb，可知目的基因N大小為2.3kb；分析電泳圖可知，初步判斷實驗組1的質(zhì)粒中成功插入了基因N。在第5組的PCR反應中，使用無菌水代替實驗組的模板DNA，目的是檢驗PCR反應體系是否存在污染，即檢驗PCR反應中是否有外源DNA污染。（3）編碼第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的堿基序列替換為編碼丙氨酸的堿基序列，丙氨酸的密碼子有GCA；密碼子位于mRNA上，mRNA上的序列與編碼鏈序列相似，而a是誘變第240位脯氨酸編碼序列的引物（GCA為誘變序列），可知a引物延伸后的序列為編碼鏈；b、c、d其中一條是誘變第243位苯丙氨酸的引物，其配對模板與a的配對模板相同，分析題圖bcd序列可知c是誘變第243位苯丙氨酸的引物，且c引物延伸后的序列為編碼鏈，根據(jù)a引物5'端首位GCA為240位，則c引物5'端GCC為243位，故據(jù)此分析，丙氨酸的密碼子除GCA外，還有GCC。（4）題干研究目的是通過在酵母菌中表達外源香樹脂醇合酶基因N，可高效生產(chǎn)香樹脂醇；由此可知，進一步檢測轉(zhuǎn)基因酵母菌發(fā)酵得到的香樹脂醇含量并進行比較，可以選出最優(yōu)的香樹脂醇合酶基因的改造方案。8．（2025·河北·高考真題）為治理水體中對生物有毒害的鎘污染，研究者構(gòu)建了分泌信號肽SP7、鎘離子結(jié)合蛋白CADR、定位于細胞壁的蛋白GP1和黃色熒光蛋白YFP編碼序列融合表達的載體，轉(zhuǎn)入單細胞衣藻，實現(xiàn)CADR大量合成、分泌并定位于細胞壁，以吸附水體中的鎘離子?；卮鹣铝袉栴}：(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脫氧核苷酸中，隨著PCR反應進行，分子數(shù)量逐漸減少的是和。模板與引物在PCR反應的階段開始結(jié)合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，其原因為。(2)載體中可用的酶切位點信息和擬構(gòu)建載體的部分結(jié)構(gòu)如圖1所示。在將CADR、GP1和YFP基因逐個構(gòu)建到載體時，為避免錯誤連接，需向以上三個基因的兩端分別添加限制酶識別序列，其中GPl兩端應添加（填兩種限制酶）的識別序列。用DNA連接酶連接時，可催化載體和目的基因之間形成鍵。(3)若在熒光顯微鏡下觀察到轉(zhuǎn)基因衣藻表現(xiàn)為，初步表明融合蛋白表達成功。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，若轉(zhuǎn)基因衣藻細胞壁比野生型衣藻細胞壁的鎘離子含量，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。(4)將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻在不同鎘離子濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后，檢測細胞密度，結(jié)果見圖2。轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長均優(yōu)于野生型衣藻的原因可能是。240μmol·L1鎘離子濃度下，轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長均被明顯抑制的原因可能是。(5)轉(zhuǎn)基因衣藻可用于水體鎘污染治理，與施加化學藥物法相比，能體現(xiàn)出其環(huán)境治理優(yōu)勢的兩個特性是和。（填標號）①衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖②衣藻生長速率受鎘離子濃度影響③衣藻可吸收水體中能引起富營養(yǎng)化的物質(zhì)④衣藻吸附的鎘可沿食物鏈傳遞【答案】(1)脫氧核苷酸引物復性PCR反應需要在高溫條件下進行變性步驟（9095℃使雙鏈DNA解旋為單鏈），普通的DNA聚合酶在高溫下會變性失活，而耐高溫的DNA聚合酶能在高溫環(huán)境中保持活性，保證PCR反應的正常進行。(2)SmaⅠ和EcoRⅠ磷酸二酯鍵(3)細胞表面發(fā)出黃色熒光高(4)轉(zhuǎn)基因衣藻表達的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對衣藻的毒害作用鎘離子濃度過高，超出了融合蛋白的吸附能力，對衣藻產(chǎn)生了嚴重的毒害作用(5)①③【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術擴增和人工合成。（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。（4）目的基因的檢測與鑒定?！驹斀狻浚?）在PCR反應中，原料是脫氧核苷酸，隨著反應進行不斷被消耗，分子數(shù)量逐漸減少；引物在PCR過程中會結(jié)合到模板DNA上參與子鏈合成，也會逐漸減少，所以分子數(shù)量逐漸減少的是引物和脫氧核苷酸。模板與引物在PCR的復性階段開始結(jié)合。在復性過程中，溫度降低，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高溫，是因為PCR反應需要在高溫條件下進行變性步驟（9095℃使雙鏈DNA解旋為單鏈），普通的DNA聚合酶在高溫下會變性失活，而耐高溫的DNA聚合酶能在高溫環(huán)境中保持活性，保證PCR反應的正常進行。（2）觀察圖1，要避免錯誤連接，GPI兩端應添加SmaⅠ和EcoRⅠ的識別序列。因為將CADR、GP1和YFP基因逐個構(gòu)建到載體時，使用這兩種限制酶切割可以產(chǎn)生不同的黏性末端，能保證目的基因準確插入載體。又因為NbeⅠ和XbaⅠ限制酶切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，所以這兩種限制酶只能選一個，按照連接的順序在將GPl連接到載體時應該用SmaⅠ和EcoRⅠ。DNA連接酶連接時，可催化載體和目的基因之間形成磷酸二酯鍵，從而將載體和目的基因連接起來。（3）若在熒光顯微鏡下觀察到細胞表面發(fā)出黃色熒光，初步表明融合蛋白表達成功，因為融合蛋白中有黃色熒光蛋白YFP，其表達后會發(fā)出黃色熒光。將轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻置于含鎘離子的培養(yǎng)液中培養(yǎng)一段時間后，若轉(zhuǎn)基因衣藻細胞壁比野生型衣藻細胞壁的鎘離子含量高，則表明融合蛋白能結(jié)合鎘離子。因為融合蛋白中的CADR可吸附水體中的鎘離子，若融合蛋白發(fā)揮作用，會使細胞壁鎘離子含量升高。（4）轉(zhuǎn)基因衣藻在含有不同濃度鎘離子的培養(yǎng)液中生長均優(yōu)于野生型衣藻的原因可能是轉(zhuǎn)基因衣藻表達的融合蛋白能結(jié)合鎘離子，降低了鎘離子對衣藻的毒害作用。240μmol?L?1鎘離子濃度下，轉(zhuǎn)基因衣藻和野生型衣藻生長均被明顯抑制的原因可能是鎘離子濃度過高，超出了融合蛋白的吸附能力，對衣藻產(chǎn)生了嚴重的毒害作用。（5）轉(zhuǎn)基因衣藻可用于水體鎘污染治理，與施加化學藥物相比，能體現(xiàn)出其環(huán)境治理優(yōu)勢的兩個特性是①和③。①衣藻作為生物材料在水體中可自我繁殖，能夠持續(xù)發(fā)揮作用；③衣藻可吸收水體中能引起富營養(yǎng)化的物質(zhì)，便于后續(xù)處理，而化學藥物可能存在二次污染等問題。9．（2024·江西·高考真題）γ氨基丁酸在醫(yī)藥等領域有重要的應用價值。利用L谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如圖方法將釀酒酵母S的L谷氨酸脫羧酶基因（gadB）導入生產(chǎn)菌株E．coliA，構(gòu)建了以L谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ氨基丁酸的菌株E．coliB。下列敘述正確的是（

）A．上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB．E．coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ氨基丁酸時，L谷氨酸鈉的作用是供能C．E．coliA和E．coliB都能高效降解γ氨基丁酸D．可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)?！敬鸢浮緼【分析】基因工程技術的基本步驟：（1）目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術擴增和人工合成；（2）基因表達載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達載體包括目的基因、啟動子、終止子和標記基因等，標記基因可便于目的基因的鑒定和篩選。（3）將目的基因?qū)胧荏w細胞：根據(jù)受體細胞不同，導入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱游锛毎钣行У姆椒ㄊ秋@微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛毎姆椒ㄊ荂a2+轉(zhuǎn)化法；（4）目的基因的檢測與鑒定：包括分子水平上的檢測和個體水平上的鑒定。【詳解】A、上圖表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadB，A正確。B、題意顯示，用L谷氨酸脫羧酶（GadB）催化L谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ氨基丁酸的重要途徑之一，E．coliB中能表達L谷氨酸脫羧酶（GadB），因此可用E．coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ氨基丁酸，該過程中L谷氨酸鈉的作用不是供能，B錯誤；C、E．coliA中沒有L谷氨酸脫羧酶（GadB），因而不能降解L谷氨酸，而E．coliB中含有該酶的基因，因而能高效降解L谷氨酸，高效生產(chǎn)γ氨基丁酸，C錯誤；D、圖中質(zhì)粒下方括號內(nèi)備注含多克隆位點，表明質(zhì)粒上含有多種限制酶的識別序列，但無法判斷能否用其他酶代替，D錯誤。故選A。（2024·浙江·高考真題）閱讀下列材料，完成下面小題。瘧疾是一種嚴重危害人類健康的紅細胞寄生蟲病，可用氯喹治療。瘧原蟲pfcrt基因編碼的蛋白，在第76位發(fā)生了賴氨酸到蘇氨酸的改變，從而獲得了對氯喹的抗性。對患者進行抗性篩查，區(qū)分氯喹敏感患者和氯喹抗性患者，以利于分類治療。研究人員根據(jù)pfcrt基因的序列，設計了F1、F2、R1和R2等4種備選引物，用于擴增目的片段，如圖甲所示。為選出正確和有效的引物，以瘧原蟲基因組DNA為模板進行PCR，產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖乙所示。10．下列關于引物F1、F2、R1和R2的敘述，錯誤的是（

）A．F1R1引物可用于特異性地擴增目的片段B．F1R2引物不能用于特異性地擴增目的片段C．F2為無效引物，沒有擴增功能，無法使用D．R2引物可用于特異性地擴增目的片段11．為了篩查瘧原蟲感染者，以及區(qū)分對氯喹的敏感性?，F(xiàn)有6份血樣，處理后進行PCR。產(chǎn)物用限制酶ApoⅠ消化，酶解產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖所示。1~6號血樣中，來自于氯喹抗性患者的是（

）A．1號和6號 B．2號和4號C．3號和5號 D．1號、2號、4號和6號【答案】10．D11．B【分析】引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，用于PCR的引物長度通常為20~30個核苷酸。10．A、根據(jù)圖乙結(jié)果顯示可知，F(xiàn)1R1引物只擴增出一條片段,說明能夠用于特異性擴增目的片段，A正確；B、根據(jù)圖乙信息可知，F(xiàn)1R2引物擴增條帶為三條，說明其不能用于特異性擴增目的片段，B正確；C、根據(jù)圖乙信息可知，F(xiàn)1R1能擴增目的1條帶，F(xiàn)2R1無法擴增目的條帶，所以F2為無效引物，沒有擴增功能，無法使用，C正確；D、根據(jù)圖乙顯示可知，F(xiàn)1R1引物只擴增出一條片段，F(xiàn)1R2引物擴增條帶為三條，說明R2引物無法特異性的擴增目的條帶，D錯誤。故選D。11．根據(jù)題干信息可知，瘧原蟲pfcrt基因編碼的蛋白，在第76位發(fā)生了賴氨酸到蘇氨酸的改變，從而獲得了對氯喹的抗性。根據(jù)酶切位點可知，在具有氯喹抗性的基因組沒有ApoⅠ酶切位點，而敏感性基因組中具有該酶切位點，因此對6份血樣處理后進行PCR，產(chǎn)物用限制酶ApoⅠ消化，酶解產(chǎn)物的電泳出現(xiàn)兩條帶則為敏感型，只有一條帶的為抗性，所以1~6號血樣中，來自于氯喹抗性患者的是2號和4號，B正確，ACD錯誤。故選B。12．（2024·山東·高考真題）制備熒光標記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP）的反應管①~④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有（）反應管加入的單鏈DNA①

5'GCCGATCTTTATA3'3'GACCGGCTAGAAA5'②5'AGAGCCAATTGGC3'③5'ATTTCCCGATCCG3'

3'AGGGCTAGGCATA5'④5'TTCACTGGCCAGT3'A．①② B．②③ C．①④ D．③④【答案】D【分析】子鏈的延伸方向為5'→3'，由題意可知，在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)，要能得到帶有熒光標記的DNA探針，需要能根據(jù)所提供的模板進行擴增，且擴增子鏈種含有A?！驹斀狻糠治龇磻堍佟苤蟹謩e加入的適量單鏈DNA可知，①中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，但雙鏈DNA區(qū)之外的3'端無模板，因此無法進行DNA合成，不能得到帶有熒光標記的DNA探針；②中單鏈DNA分子內(nèi)具有自身互補的序列，由于在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)，故一條單鏈DNA分子不發(fā)生自身環(huán)化，但兩條鏈可以形成雙鏈DNA區(qū)，由于DNA合成的鏈中不含堿基A，不能得到帶有熒光標記的DNA探針；③中兩條單鏈DNA分子之間具有互補的序列，且雙鏈DNA區(qū)之外的3'端有模板和堿基T，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標記的DNA探針；④中單鏈DNA分子內(nèi)具有自身互補的序列，一條單鏈DNA分子不發(fā)生自身環(huán)化，兩條鏈可以形成雙鏈DNA區(qū)，且雙鏈DNA區(qū)之外的3'端有模板和堿基T，因此進行DNA合成能得到帶有熒光標記的DNA探針。綜上，能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有③④。故選D。13．（2024·吉林·高考真題）關于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實驗，下列敘述正確的是（

）A．瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小B．凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指示DNA分子的具體位置C．在同一電場作用下，DNA片段越長，向負極遷移速率越快D．瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測出來【答案】A【分析】瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的原理主要基于DNA分子在電場作用下的遷移行為以及瓊脂糖凝膠的特性?！驹斀狻緼、瓊脂糖凝膠的濃度會影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據(jù)所需分離的DNA片段大小來選擇的。對于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質(zhì)粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因為它們需要更大的孔徑來有效遷移。而對于較小的DNA片段，比如PCR產(chǎn)物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確；B、凝膠載樣緩沖液指示劑通常是一種顏色較深的染料，可以作為電泳進度的指示分子，當溴酚藍到凝膠2/3處時(可看藍色條帶)，則停止電泳，B錯誤；C、在瓊脂糖凝膠電泳中，當電場作用時，DNA片段實際上是向正極遷移的，而不是向負極遷移。同時，DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長，遷移速率越慢，C錯誤；D、瓊脂糖凝膠中的DNA分子需染色后，才可在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來，D錯誤。故選A。14．（多選·2024·湖南·高考真題）最早的雙脫氧測序法是PCR反應體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP），子鏈延伸時，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補配對原則，以加入ddATP的體系為例：若配對的為ddATP，延伸終止；若配對的為脫氧腺苷三磷酸（dATP），繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測。通過該方法測序某疾病患者及對照個體的一段序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是（）A．上述PCR反應體系中只加入一種引物B．電泳時產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢C．5'CTACCCGTGAT3'為對照個體的一段序列D．患者該段序列中某位點的堿基C突變?yōu)镚【答案】AC【分析】1、PCR技術：（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈式反應，是一項在生物體外復制特定DNA的核酸合成技術。（2）原理：DNA復制。（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序以便合成一對引物。（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）。（5）過程：①高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動解開）；低溫復性：引物結(jié)合到互補鏈DNA上；③中溫延伸：合成子鏈。2、雙脫氧測序法的原理：在DNA聚合酶、引物、四種單脫氧核苷酸（dNTP）存在的情況下，如果在四管反應系統(tǒng)中再分別加入四種雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP），DNA鏈合成反應過程中ddNTP與dNTP處于一種競爭狀態(tài)，即新合成DNA鏈既可能摻入正常dNTP，也可能摻入ddNTP并使新合成鏈終止延伸。這樣在每個反應系統(tǒng)中形成的產(chǎn)物是一系列長度不等的多核苷酸片段，這些片段具有相同的起點，即引物的5'端，但有不同的ddNTP終端。在結(jié)束反應后，用四個泳道進行電泳，分別分離各組反應體系中不同長度的DNA片段，檢測DNA片段終止末端位置的堿基種類，從自顯影圖譜中直接讀取到與模板相匹配的新的鏈序。【詳解】A、利用雙脫氧測序法時，PCR反應體系中加入的模板是待測的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A正確；B、電泳時，產(chǎn)物的片段越大，遷移速率越慢。B錯誤；C、依據(jù)分析中雙脫氧測序法的原理，可以確定每個泳道中的條帶（DNA片段）的3'終端的堿基，如+ddATP的泳道中出現(xiàn)的條帶（DNA片段）的3'終端堿基就是A。另外由于每個片段的起始點相同，但終止點不同，因此可以通過比較片段的長度來確定DNA序列中每個位置上的堿基；圖示電泳方向為從上→下，即對應的DNA片段為長→短，則對應的DNA測序結(jié)果為3'→5'，如對照個體的電泳結(jié)果最短的條帶為+ddCTP泳道組的條帶，則說明該DNA片段5'端第一個堿基為C；因此對照個體的測序結(jié)果為5'CTACCCGTGAT3'，患者的測序結(jié)果為5'CTACCTGTGAT3'，C正確；D、對比患者和對照個體的測序結(jié)果可知，患者該段序列中某位點的堿基C突變?yōu)門，D錯誤。故選AC。15．（2024·天津·高考真題）金黃色葡萄球菌（簡稱Sa）是人體重要致病細菌、不規(guī)范使用抗生素易出現(xiàn)多重抗藥性Sa。(1)Sa產(chǎn)生抗藥性可遺傳變異的來源有（至少答出2點）。(2)推測Sa產(chǎn)生頭孢霉素抗性與其R基因有關。為驗證該推測，以圖1中R基因的上、下游片段和質(zhì)粒1構(gòu)建質(zhì)粒2，然后通過同源重組（質(zhì)粒2中的上、下游片段分別與Sa基因組中R基因上、下游片段配對，并發(fā)生交換）敲除Sa的R基因。①根據(jù)圖1信息，簡述質(zhì)粒2的構(gòu)建過程（需包含所選引物和限制酶）：，然后回收上、下游片段，再與SacII酶切質(zhì)粒1所得大片段連接，獲得質(zhì)粒2。②用質(zhì)粒2轉(zhuǎn)化臨床分離的具有頭孢霉素抗性、對氯霉素敏感的Sa，然后涂布在含的平板上，經(jīng)培養(yǎng)獲得含質(zhì)粒2的Sa單菌落。③將②獲得的單菌落多次傳代以增加同源重組敲除R基因的幾率，隨后稀釋涂布在含