蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)用戶手冊一、系統(tǒng)概述蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)是用于分離制備蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的科學(xué)儀器，適用于化學(xué)、生物學(xué)、林學(xué)、材料科學(xué)及生物制藥等領(lǐng)域，支持中試工藝開發(fā)和實(shí)驗(yàn)室分析。系統(tǒng)采用模塊化設(shè)計(jì)并整合緩沖液試劑盒，可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)純化和脫鹽流程。主流產(chǎn)品包括伯樂Profinia?、寧波艾純PPS-HD系列等，配置雙柱塞泵，制備流速≥80ml/min（壓力≥6MPa），分析流速≥20ml/min（壓力≥23MPa）。集成連續(xù)波長紫外檢測器（190-740nm）、電導(dǎo)檢測器（0-500mS/cm），支持多波長同步監(jiān)測。方形收集器可按時(shí)間、滴數(shù)或峰值模式自動(dòng)收集樣本，控制軟件內(nèi)置層析方法數(shù)據(jù)庫并自動(dòng)生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。兼容凝膠過濾、離子交換、親和層析等技術(shù)，流路采用生物相容性材料，可串聯(lián)多柱完成復(fù)雜分離流程。二、技術(shù)參數(shù)2.1泵系統(tǒng)采用雙柱塞，雙泵設(shè)計(jì)，雙流速雙壓力平臺(tái)制備平臺(tái)：流速≥80ml/min時(shí)壓力≥6MPa分析平臺(tái)：流速≥20ml/min時(shí)壓力≥23MPa支持緩沖液線性梯度洗脫功能配備2個(gè)高壓進(jìn)樣閥，可用于逆流洗脫、雙柱并聯(lián)切換及三柱串聯(lián)洗脫2.2檢測器連續(xù)波長紫外檢測器：波長范圍190-740nm，支持4波長同時(shí)檢測電導(dǎo)檢測器：檢測范圍0～500mS/cm，滿足高離子強(qiáng)度檢測需求支持蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的在線檢測與分析2.3收集系統(tǒng)采用X-Y軸控制的方形收集器，確保收集準(zhǔn)確性支持按時(shí)間、滴數(shù)、峰值和時(shí)間窗口四種收集方式收集器可獨(dú)立使用，適用于不同規(guī)格收集管2.4控制軟件具備完整的層析方法模板數(shù)據(jù)庫，支持簡易編程內(nèi)置專家輔助軟件，提供實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指導(dǎo)數(shù)據(jù)自動(dòng)處理功能，可自動(dòng)生成實(shí)驗(yàn)報(bào)告支持方法保存與調(diào)用，便于實(shí)驗(yàn)條件重現(xiàn)三、系統(tǒng)組件與安裝3.1主要組件主機(jī)系統(tǒng)（含雙柱塞泵、梯度混合器）紫外檢測器與電導(dǎo)檢測器自動(dòng)收集器控制電腦與軟件層析柱及連接管路進(jìn)樣閥與切換閥組緩沖液瓶與樣品瓶3.2安裝步驟環(huán)境準(zhǔn)備：將系統(tǒng)放置在水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，確保通風(fēng)良好，遠(yuǎn)離水源和火源，環(huán)境溫度保持在15-30℃，相對(duì)濕度≤75%。主機(jī)安裝：將主機(jī)放置在實(shí)驗(yàn)臺(tái)合適位置，調(diào)整水平腳使主機(jī)平穩(wěn)。連接主機(jī)電源線，確保接地良好。檢測器連接：將紫外檢測器和電導(dǎo)檢測器安裝在主機(jī)指定位置，連接信號(hào)線至主機(jī)接口，確保連接牢固。收集器安裝：將自動(dòng)收集器放置在主機(jī)下方或側(cè)面，連接收集器控制線至主機(jī)對(duì)應(yīng)接口。管路連接：按照系統(tǒng)流程圖連接緩沖液管路、樣品管路和層析柱管路，注意管路走向應(yīng)避免彎曲和纏繞。電腦連接：使用專用數(shù)據(jù)線連接主機(jī)與控制電腦，安裝控制軟件并進(jìn)行驅(qū)動(dòng)配置。系統(tǒng)檢查：安裝完成后檢查各部件連接是否正確，管路是否通暢，電源是否正常。四、操作流程4.1開機(jī)與系統(tǒng)自檢開機(jī)順序：先打開儀器主電源，再打開電腦電源，待儀器自檢完畢（主機(jī)控制面板白燈常亮）。軟件啟動(dòng)：雙擊桌面上控制軟件圖標(biāo)（如UNICORN），進(jìn)入操作界面。系統(tǒng)檢查：在軟件界面檢查各模塊狀態(tài)是否正常，包括泵、檢測器、收集器等。參數(shù)校準(zhǔn)：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行流速、壓力和檢測器校準(zhǔn)，確保系統(tǒng)處于最佳工作狀態(tài)。4.2實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備4.2.1緩沖液制備根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案配制所需緩沖液，包括平衡緩沖液、洗脫緩沖液等。所有緩沖液需經(jīng)0.22μm或0.45μm濾膜過濾，去除顆粒物。緩沖液使用前需進(jìn)行超聲脫氣10-15分鐘，避免氣泡進(jìn)入系統(tǒng)。標(biāo)記所有緩沖液瓶，注明名稱、濃度、pH值和制備日期。如需儲(chǔ)存，將緩沖液置于4℃冰箱保存，使用前需恢復(fù)至室溫并重新脫氣。4.2.2樣品預(yù)處理樣品需進(jìn)行預(yù)處理，去除雜質(zhì)和顆粒物：細(xì)胞裂解液需13000rpm離心10分鐘，取上清上清液經(jīng)0.22μm濾膜過濾對(duì)于粘稠樣品，可適當(dāng)稀釋以降低粘度樣品濃度應(yīng)控制在μg/mL～mg/mL范圍，避免過稀或過濃根據(jù)需要添加蛋白酶抑制劑（如PMSF）、還原劑（如DTT）和金屬螯合劑（如EDTA）樣品處理過程應(yīng)在冰浴中進(jìn)行，避免蛋白質(zhì)變性4.2.3層析柱準(zhǔn)備根據(jù)純化目標(biāo)選擇合適的層析柱（如離子交換柱、親和層析柱、凝膠過濾柱等）檢查層析柱保存液，如為乙醇溶液需用平衡緩沖液沖洗至無乙醇?xì)埩粲涗泴游鲋幪?hào)、規(guī)格、最大耐受壓力和推薦流速等參數(shù)按照層析柱說明書進(jìn)行預(yù)處理，確保柱效符合實(shí)驗(yàn)要求4.3系統(tǒng)操作步驟4.3.1管路清洗與排氣將A1管道入口放入純水中，B1管道入口放入純水中在systemcontrol窗口點(diǎn)擊工具欄內(nèi)的manual，選擇executemanualinstructions→pump→pumpAwash和pumpBwash選中A1和B1入口，點(diǎn)擊execute，進(jìn)行泵洗，泵洗完成后自動(dòng)停止檢查管路中是否有氣泡，如有氣泡，重復(fù)清洗步驟分別對(duì)A、B管路進(jìn)行單獨(dú)排氣：設(shè)置B路起始濃度為100%，流速0.1ml/min，壓力限制0.3MPa啟動(dòng)泵，打開泵出口堵頭，用專用抽氣針管抽氣待氣泡排盡后關(guān)閉泵，安裝好堵頭4.3.2層析柱安裝在manualinstructions里選擇pump→systemflow，輸入流速1ml/min選擇Alarms→alarmprecolumnpressure，設(shè)置highalarm（根據(jù)層析柱說明書設(shè)置耐受壓力）待InjectionValve的1號(hào)位管道流出溶液后，將管路接入柱子的上端稍微擰緊后將柱下端的堵頭卸掉接入管道，連上紫外流動(dòng)池確保連接緊密，無漏液，同時(shí)避免管路彎曲打折4.3.3系統(tǒng)平衡選擇檢測波長：Monitors→Wavelength→UV1,UV2,UV3（可選擇1-4個(gè)波長）將A1管道入口放入平衡緩沖液中，B1管道入口放入洗脫緩沖液中設(shè)置流速為層析柱推薦流速的50%，開始平衡層析柱觀察UV、COND數(shù)值變化趨勢，待基線平穩(wěn)（通常需要5倍柱體積緩沖液）紫外調(diào)零：選擇Monitors→autozeroUV，execute4.3.4樣品上樣方法一：樣品環(huán)上樣將樣品吸進(jìn)注射器，推掉氣泡，從injectionValve的3號(hào)口推入推好后不要取下注射器在manualinstructions里選擇flowpath→injectionValve→inject，execute樣品進(jìn)入層析柱后，保持注射器連接直至上樣完成方法二：泵上樣將A2入口放入樣品中在manualinstructions里選擇flowpath→Ainlet→A2，insertflowpath→injectmark，insert，execute待樣品上完后，選擇flowpath→Ainlet→A1，使用平衡緩沖液繼續(xù)清洗柱子4.3.5洗脫過程上樣后用平衡緩沖液沖洗至穿透峰回到基線在manualinstructions里選擇pump→gradient，設(shè)置洗脫參數(shù)：TargetB：設(shè)置最終洗脫緩沖液濃度（0-100%）Length：設(shè)置梯度長度（通常為10-20個(gè)柱體積）Flowrate：設(shè)置洗脫流速（根據(jù)層析柱推薦值）啟動(dòng)梯度洗脫程序，開始收集數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)監(jiān)測UV吸收峰和電導(dǎo)變化，必要時(shí)調(diào)整收集參數(shù)4.3.6樣品收集固定體積收集選擇Fractioncollection→Fractionation選擇收集管tubetype，輸入每管收集體積execute開始收集結(jié)束收集：選擇Fractioncollection→Stopfractionation，execute峰收集選擇Fractioncollection→PeakfractionationParameters→UVLevel設(shè)定峰收集的閾值參數(shù)選擇Fractioncollection→Peakfractionation，設(shè)定每管收集體積execute開始收集結(jié)束收集：選擇Fractioncollection→Stoppeakfractionation，execute4.4實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理4.4.1系統(tǒng)清洗將A1和B1入口放入純水中啟動(dòng)pumpwash功能沖洗A泵和B泵及整個(gè)管路（至少3個(gè)柱體積）再將A1和B1入口放入20％乙醇中同樣操作讓乙醇充滿整個(gè)管路（至少2個(gè)柱體積）4.4.2層析柱拆卸與保存給系統(tǒng)一個(gè)慢流速（0.5ml/min），設(shè)置系統(tǒng)保護(hù)壓力先拆柱子的下端接頭，在滴水的狀態(tài)下將堵頭擰上再拆柱子上端接頭，擰上上端堵頭將層析柱垂直放置于4℃冰箱保存，注意防止氣泡進(jìn)入層析柱4.4.3關(guān)機(jī)流程從軟件任一窗口File命令欄中點(diǎn)擊退出關(guān)閉主機(jī)電源關(guān)閉電腦電源清理實(shí)驗(yàn)臺(tái)面，處理廢液填寫儀器使用記錄五、層析技術(shù)應(yīng)用指南5.1離子交換層析原理：基于蛋白質(zhì)表面電荷與層析介質(zhì)上帶電基團(tuán)之間的靜電相互作用進(jìn)行分離緩沖液選擇：陽離子交換：通常使用pH低于目標(biāo)蛋白pI的緩沖液（如磷酸緩沖液pH6.0）陰離子交換：通常使用pH高于目標(biāo)蛋白pI的緩沖液（如Tris-HCl緩沖液pH8.0）上樣條件：樣品緩沖液離子強(qiáng)度應(yīng)低于平衡緩沖液（通常<20mM）洗脫方式：線性梯度：0-100%洗脫緩沖液，10-20個(gè)柱體積階梯梯度：逐步增加鹽濃度（如20mM,50mM,100mM,200mM,500mMNaCl）再生條件：使用1-2MNaCl溶液沖洗，然后平衡緩沖液平衡5.2親和層析原理：利用目標(biāo)蛋白與固定化配體之間的特異性相互作用進(jìn)行分離常見類型：金屬螯合親和層析（如Ni-NTA柱，用于His標(biāo)簽蛋白）抗體親和層析（如ProteinA/G柱，用于抗體純化）生物素-親和素親和層析上樣條件：根據(jù)親和配體特性調(diào)整緩沖液（如Ni-NTA柱常用PBS緩沖液含5-20mM咪唑）洗脫方式：競爭性洗脫：使用過量游離配體（如咪唑、生物素）改變pH值：如ProteinA柱使用pH2.5-3.0的glycine-HCl緩沖液改變離子強(qiáng)度：高鹽溶液破壞靜電相互作用再生條件：根據(jù)層析柱說明書進(jìn)行，通常使用0.5-1MNaOH或鹽酸胍溶液5.3凝膠過濾層析原理：根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行分離，大分子先流出，小分子后流出緩沖液選擇：通常使用中性pH的緩沖液（如PBS、Tris-HCl），含適當(dāng)鹽濃度（100-150mMNaCl）上樣體積：一般為柱體積的1-5%，最大不超過10%流速設(shè)置：根據(jù)層析柱說明書推薦，通常較低（0.5-1ml/min）注意事項(xiàng)：樣品需離心過濾，無顆粒物避免過載，影響分離效果不需要梯度洗脫，使用單一緩沖液5.4疏水層析原理：基于蛋白質(zhì)表面疏水性與介質(zhì)疏水基團(tuán)之間的相互作用緩沖液選擇：高離子強(qiáng)度緩沖液（如含1-2M(NH4)2SO4的磷酸緩沖液）上樣條件：樣品需在高離子強(qiáng)度條件下，可通過添加硫酸銨或氯化鈉實(shí)現(xiàn)洗脫方式：線性梯度：降低鹽濃度（1.5M至0M(NH4)2SO4）階梯梯度：逐步降低鹽濃度可添加少量有機(jī)溶劑（如乙醇、異丙醇）輔助洗脫再生條件：使用含8M尿素或6M鹽酸胍的溶液沖洗，然后平衡緩沖液平衡六、系統(tǒng)維護(hù)與保養(yǎng)6.1日常維護(hù)每日檢查：檢查管路連接是否緊密，有無漏液檢查緩沖液液位，及時(shí)補(bǔ)充清潔儀器表面，去除液漬每周維護(hù)：用純水沖洗整個(gè)系統(tǒng)，去除殘留鹽檢查泵頭密封圈是否磨損，必要時(shí)更換清潔紫外檢測器流通池每月維護(hù)：校準(zhǔn)紫外檢測器（使用標(biāo)準(zhǔn)溶液）檢查所有管路是否有老化、裂紋清潔收集器托盤和管路6.2泵系統(tǒng)維護(hù)泵頭維護(hù)：每使用50次或1個(gè)月，檢查泵頭密封圈如發(fā)現(xiàn)漏液或壓力不穩(wěn)，及時(shí)更換密封圈長期不用時(shí)，泵頭需充滿20%乙醇保存單向閥維護(hù)：每3個(gè)月或壓力異常時(shí)，拆卸單向閥清洗使用超聲清洗10分鐘（純水中）安裝時(shí)注意方向正確密封圈更換步驟：關(guān)閉泵電源，拆卸泵頭取出舊密封圈，用純水清潔泵頭安裝新密封圈，注意位置正確重新安裝泵頭，檢查是否漏液6.3檢測器維護(hù)紫外檢測器維護(hù)：每周用純水沖洗流通池每月校準(zhǔn)一次波長精度避免強(qiáng)光直射檢測池如檢測池污染，可用10%硝酸溶液浸泡30分鐘，然后純水沖洗電導(dǎo)檢測器維護(hù)：每月校準(zhǔn)一次電導(dǎo)值長期不用時(shí)，保持檢測池濕潤避免高濃度鹽溶液長時(shí)間停留6.4層析柱維護(hù)短期保存（1周內(nèi)）：離子交換柱：保存于含20%乙醇的平衡緩沖液中親和層析柱：保存于含20%乙醇的PBS中凝膠過濾柱：保存于含0.02%疊氮化鈉的緩沖液中疏水層析柱：保存于含20%乙醇的高鹽緩沖液中長期保存（1個(gè)月以上）：用適當(dāng)保存液沖洗層析柱（通常為20%乙醇）兩端密封，垂直放置于4℃冰箱避免凍結(jié)，防止層析介質(zhì)破裂層析柱再生：離子交換柱：用2-3倍柱體積的1MNaCl沖洗，然后平衡緩沖液平衡親和層析柱：根據(jù)說明書使用再生緩沖液（如0.5MNaOH）疏水層析柱：用含8M尿素的緩沖液沖洗，然后平衡緩沖液平衡七、安全注意事項(xiàng)7.1操作安全個(gè)人防護(hù)：操作時(shí)必須佩戴實(shí)驗(yàn)服、手套和護(hù)目鏡處理有毒或腐蝕性試劑時(shí)，需佩戴防毒面具避免直接接觸緩沖液和樣品電氣安全：確保儀器接地良好避免濕手操作電源開關(guān)儀器運(yùn)行時(shí)，禁止打開電源箱或電子元件蓋板化學(xué)品安全：所有緩沖液和試劑需正確標(biāo)記，注明名稱、濃度、日期有毒有害試劑需單獨(dú)存放，符合安全規(guī)范廢棄試劑需分類處理，不可隨意傾倒7.2系統(tǒng)安全壓力安全：嚴(yán)格按照層析柱說明書設(shè)置壓力限制系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)，禁止拆卸管路和接頭如出現(xiàn)超壓報(bào)警，立即停止系統(tǒng)運(yùn)行，檢查原因流速控制：啟動(dòng)泵時(shí)，應(yīng)緩慢增加流速，避免壓力突變更換層析柱時(shí)，需降低流速至推薦值的50%禁止超過層析柱最大耐受流速運(yùn)行樣品安全：生物樣品需進(jìn)行適當(dāng)處理，防止交叉污染感染性樣品需在生物安全柜內(nèi)操作樣品處理后，立即清潔工作臺(tái)面7.3緊急情況處理漏液處理：立即停止系統(tǒng)運(yùn)行，關(guān)閉電源用吸水紙吸干漏液，避免液體擴(kuò)散檢查漏液位置，重新連接或更換部件系統(tǒng)故障：如出現(xiàn)異常聲音或異味，立即關(guān)閉電源記錄故障現(xiàn)象，聯(lián)系技術(shù)支持不要擅自拆卸維修儀器核心部件化學(xué)灼傷：立即用大量清水沖洗受影響部位如試劑進(jìn)入眼睛，立即用水沖洗15分鐘，并就醫(yī)記錄所用化學(xué)試劑，便于醫(yī)生處理八、常見問題troubleshooting8.1壓力異常壓力過高：可能原因：管路堵塞、層析柱堵塞、流速設(shè)置過高解決方法：檢查管路是否彎曲打折檢查層析柱是否堵塞，必要時(shí)反沖或更換降低流速，檢查壓力是否恢復(fù)正常壓力過低或無壓力：可能原因：管路連接松動(dòng)、泵頭有氣泡、密封圈磨損解決方法：檢查所有連接，確保密封良好對(duì)泵進(jìn)行排氣操作檢查泵頭密封圈，必要時(shí)更換8.2基線問題基線漂移：可能原因：系統(tǒng)未平衡好、溫度變化、緩沖液混合不均解決方法：延長平衡時(shí)間，確保系統(tǒng)穩(wěn)定保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度恒定充分混合緩沖液，確保均一基線噪音過大：可能原因：檢測器污染、管路有氣泡、電源干擾解決方法：清潔檢測器流通池排除管路氣泡檢查電源接地，避免電磁干擾8.3峰形異常峰拖尾：可能原因：樣品過載、柱效下降、pH不合適解決方法：減少上樣量再生或更換層析柱調(diào)整緩沖液pH值峰分裂：可能原因：樣品溶液與流動(dòng)相不匹配、柱頭塌陷解決方法：調(diào)整樣品緩沖液組成更換層析柱或進(jìn)行柱頭修復(fù)峰展寬：可能原因：流速不當(dāng)、柱效下降、系統(tǒng)體積過大解決方法：調(diào)整流速至最佳值再生或更換層析柱減少連接管路長度，優(yōu)化系統(tǒng)8.4回收率低可能原因：目標(biāo)蛋白未結(jié)合或結(jié)合不牢固洗脫條件不當(dāng)?shù)鞍自诩兓^程中變性沉淀收集不完全解決方法：調(diào)整上樣條件（pH、離子強(qiáng)度）優(yōu)化洗脫緩沖液組成和梯度添加適當(dāng)添加劑（如還原劑、穩(wěn)定劑）檢查收集器工作狀態(tài)，確保收集完全8.5樣品污染可能原因：緩沖液污染系統(tǒng)清洗不徹底層析柱殘留操作環(huán)境不潔凈解決方法：使用新鮮制備的緩沖液，過濾除菌加強(qiáng)系統(tǒng)清洗，必要時(shí)進(jìn)行消毒處理徹底再生層析柱，去除殘留樣品在潔凈工作臺(tái)操作，減少污染風(fēng)險(xiǎn)九、軟件操作指南9.1軟件界面介紹主界面：包含菜單欄、工具欄、系統(tǒng)狀態(tài)顯示區(qū)、實(shí)時(shí)監(jiān)測區(qū)和方法編輯區(qū)菜單欄：文件、編輯、視圖、運(yùn)行、方法、報(bào)告、工具、幫助工具欄：常用功能快捷鍵，如新建方法、運(yùn)行、暫停、停止、保存等系統(tǒng)狀態(tài)顯示區(qū)：顯示各模塊工作狀態(tài)，如泵、檢測器、收集器等實(shí)時(shí)監(jiān)測區(qū)：顯示UV、電導(dǎo)等實(shí)時(shí)檢測曲線方法編輯區(qū)：用于編輯和顯示層析方法參數(shù)9.2方法建立與編輯新建方法：點(diǎn)擊工具欄"新建方法"按鈕選擇層析類型（離子交換、親和、凝膠過濾等）選擇層析柱類型和規(guī)格系統(tǒng)自動(dòng)生成方法模板參數(shù)設(shè)置：流速設(shè)置：根據(jù)層析柱推薦值設(shè)置梯度設(shè)置：選擇梯度類型（線性、階梯），設(shè)置起始和終點(diǎn)濃度，梯度時(shí)間檢測參數(shù)：選擇檢測波長、靈敏度收集參數(shù)：選擇收集方式（時(shí)間、體積、峰值），設(shè)置收集參數(shù)方法保存與調(diào)用：點(diǎn)擊"保存"按鈕，輸入方法名稱和描述調(diào)用方法：從方法庫中選擇已保存方法，點(diǎn)擊"加載"9.3數(shù)據(jù)采集與處理數(shù)據(jù)采集：運(yùn)行方法前，設(shè)置數(shù)據(jù)保存路徑和文件名點(diǎn)擊"運(yùn)行"按鈕，開始數(shù)據(jù)采集實(shí)時(shí)顯示UV吸收曲線、電導(dǎo)曲線等實(shí)驗(yàn)過程中可添加事件標(biāo)記數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，自動(dòng)生成色譜圖峰識(shí)別：自動(dòng)或手動(dòng)識(shí)別色譜峰積分計(jì)算：自動(dòng)計(jì)算峰面積、峰高、保留時(shí)間等參數(shù)純度分析：計(jì)算目標(biāo)峰占總峰面積百分比報(bào)告生成：點(diǎn)擊"生成報(bào)告"按鈕，選擇報(bào)告模板報(bào)告內(nèi)容包括：實(shí)驗(yàn)條件、色譜圖、峰參數(shù)、純度分析等支持導(dǎo)出為PDF、Excel等格式可自定義報(bào)告格式和內(nèi)容9.4系統(tǒng)診斷與維護(hù)系統(tǒng)自檢：在"工具"菜單中選擇"系統(tǒng)自檢"系統(tǒng)自動(dòng)檢查各模塊工作狀態(tài)生成自檢報(bào)告，提示異常模塊校準(zhǔn)功能：紫外檢測器校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行波長和吸光度校準(zhǔn)流速校準(zhǔn)：使用稱重法或體積法校準(zhǔn)泵流速壓力校準(zhǔn)：使用標(biāo)準(zhǔn)壓力計(jì)校準(zhǔn)壓力傳感器維護(hù)提醒：軟件自動(dòng)記錄各部件使用次數(shù)和時(shí)間到達(dá)維護(hù)周期時(shí)，彈出提醒窗口顯示維護(hù)項(xiàng)目和操作指南十、應(yīng)用實(shí)例10.1重組蛋白純化（His標(biāo)簽）層析柱選擇：Ni-NTA親和層析柱（5ml）緩沖液配制：平衡緩沖液：PBS緩沖液（pH7.4）含20mM咪唑洗脫緩沖液：PBS緩沖液（pH7.4）含500mM咪唑樣品制備：細(xì)菌裂解液經(jīng)13000rpm離心10分鐘上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾加入PMSF（終濃度1mM）和DTT（終濃度5mM）純化步驟：系統(tǒng)平衡：平衡緩沖液以1ml/min流速平衡層析柱（5個(gè)柱體積）上樣：樣品以1ml/min流速上樣洗滌：平衡緩沖液洗至UV基線平穩(wěn)（3-5個(gè)柱體積）洗脫：0-100%洗脫緩沖液線性梯度洗脫（20個(gè)柱體積）收集：按UV峰值收集洗脫峰（280nm檢測）再生步驟：用500mM咪唑洗脫緩沖液沖洗（3個(gè)柱體積）用PBS緩沖液平衡（5個(gè)柱體積）用含20%乙醇的PBS緩沖液保存層析柱10.2抗體純化（ProteinA）層析柱選擇：ProteinA親和層析柱（1ml）緩沖液配制：平衡緩沖液：PBS緩沖液（pH7.4）洗脫緩沖液：0.1Mglycine-HCl（pH2.7）中和緩沖液：1MTris-HCl（pH8.0）樣品制備：細(xì)胞培養(yǎng)上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾用1MHCl調(diào)節(jié)pH至7.0-7.4純化步驟：系統(tǒng)平衡：平衡緩沖液以0.5ml/min流速平衡層析柱（5個(gè)柱體積）上樣：樣品以0.5ml/min流速上樣洗滌：平衡緩沖液洗至UV基線平穩(wěn)（5個(gè)柱體積）洗脫：洗脫緩沖液以0.5ml/min流速洗脫收集：按UV峰值收集洗脫峰，每管加入50μl中和緩沖液再生步驟：用0.1Mglycine-HCl（pH2.0）沖洗（3個(gè)柱體積）用平衡緩沖液平衡（5個(gè)柱體積）用含0.02%疊氮化鈉的PBS緩沖液保存10.3蛋白質(zhì)脫鹽層析柱選擇：凝膠過濾脫鹽柱（如PD-10或HiPrep26/10Desalting）緩沖液配制：平衡緩沖液：目標(biāo)緩沖液（如PBS、Tris-HCl等）樣品制備：濃縮樣品至適當(dāng)體積（PD-10柱通常為2.5ml）離心去除沉淀（13000rpm，5分鐘）純化步驟：系統(tǒng)平衡：平衡緩沖液以5ml/min流速平衡層析柱（3個(gè)柱體積）上樣：將樣品小心加至柱床表面中央洗脫：用平衡緩沖液洗脫，流速5ml/min收集：按固定體積收集（通常每管1ml）注意事項(xiàng)：上樣時(shí)避免擾動(dòng)柱床表面樣品體積不超過柱床體積的1/3收集液需檢測蛋白峰（280nm）和鹽峰（電導(dǎo)檢測）10.4蛋白質(zhì)分子量測定層析柱選擇：凝膠過濾層析柱（如Superdex20010/300GL）緩沖液配制：流動(dòng)相：PBS緩沖液（pH7.4）含150mMNaCl標(biāo)準(zhǔn)品與樣品制備：標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物：包含已知分子量的蛋白質(zhì)（如甲狀腺球蛋白669kDa，鐵蛋白440kDa，醛縮酶158kDa，卵清蛋白44kDa，溶菌酶14.4kDa）樣品：純化的目標(biāo)蛋白（濃度1-2mg/ml）測定步驟：系統(tǒng)平衡：流動(dòng)相以0.5ml/min流速平衡層析柱（2個(gè)柱體積）標(biāo)準(zhǔn)品上樣：注入50μl標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物洗脫：流動(dòng)相以0.5ml/min流速洗脫，記錄各標(biāo)準(zhǔn)蛋白保留時(shí)間樣品上樣：注入50μl樣品溶液洗脫：同標(biāo)準(zhǔn)品洗脫條件數(shù)據(jù)分析：以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量對(duì)數(shù)對(duì)保留體積作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)樣品保留體積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算分子量比較樣品峰與標(biāo)準(zhǔn)品峰，評(píng)估樣品純度和均一性十一、附錄11.1常用緩沖液配制表緩沖液名稱濃度配制方法PBS緩沖液0.01M