妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中HGF的表達(dá)特征及其與IGF-1的交互關(guān)聯(lián)探究一、引言1.1研究背景妊娠期高血壓疾病作為妊娠期特有的一組疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康，一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)約為5%-10%，在國(guó)內(nèi)為9.4%-10.4%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒患病率及死亡率升高的主要原因之一。病情嚴(yán)重時(shí)，孕婦可能并發(fā)子癇、胎盤(pán)早剝、彌散性血管內(nèi)凝血、腎衰竭、肝出血或衰竭、顱內(nèi)出血、高血壓腦病、失明、肺水腫、心功能衰竭，甚至死亡；胎兒則可能出現(xiàn)胎兒生長(zhǎng)受限、羊水過(guò)少、胎兒窘迫、早產(chǎn)、胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷、胎兒死亡等嚴(yán)重后果。胎盤(pán)在維持正常妊娠過(guò)程中扮演著舉足輕重的角色，作為母體與胎兒進(jìn)行物質(zhì)交換、氣體交換和代謝產(chǎn)物排泄的重要器官，其正常結(jié)構(gòu)和功能是胎兒健康發(fā)育的基礎(chǔ)。在妊娠期高血壓疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，胎盤(pán)往往出現(xiàn)異常變化，包括滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降、血管重鑄異常、缺血缺氧等病理改變，這些異常被認(rèn)為是妊娠期高血壓疾病發(fā)病的關(guān)鍵因素之一。因此，深入研究胎盤(pán)組織在妊娠期高血壓疾病中的變化，對(duì)于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HepatocyteGrowthFactor，HGF）是一種由間質(zhì)細(xì)胞衍生的多功能細(xì)胞因子，廣泛分布于胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)發(fā)育和組織修復(fù)等過(guò)程中。在胎盤(pán)中，HGF具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)降解等作用，直接作用于滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)維持胎盤(pán)正常功能至關(guān)重要。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（Insulin-LikeGrowthFactor-1，IGF-1）是另一種在胎盤(pán)中廣泛分布的生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)胎兒的線粒體DNA復(fù)制、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞分裂等機(jī)能，對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育起著關(guān)鍵作用。已有研究表明，HGF和IGF-1在胎盤(pán)中的表達(dá)和相互作用與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育以及多種妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而，關(guān)于HGF在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況以及其與IGF-1之間的關(guān)系，目前仍存在諸多未知，深入探討二者的作用機(jī)制，將為妊娠期高血壓疾病的防治提供新的思路和潛在治療靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)情況，明確其表達(dá)水平與正常妊娠胎盤(pán)組織的差異，并系統(tǒng)分析HGF與胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的相互關(guān)系，揭示二者在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制。從理論意義來(lái)看，目前關(guān)于妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，對(duì)HGF和IGF-1在胎盤(pán)組織中的表達(dá)及相互作用的研究，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的知識(shí)空白，進(jìn)一步完善妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)制的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。從實(shí)際應(yīng)用價(jià)值而言，若能明確HGF與IGF-1在妊娠期高血壓疾病中的作用機(jī)制，將為臨床提供新的疾病預(yù)測(cè)指標(biāo)和治療靶點(diǎn)。通過(guò)檢測(cè)胎盤(pán)組織或孕婦血清中的HGF和IGF-1水平，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)妊娠期高血壓疾病的早期預(yù)測(cè)和診斷，從而采取有效的干預(yù)措施，降低疾病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，改善母嬰預(yù)后，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1妊娠期高血壓疾病概述妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的一組疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒患病率及死亡率升高的主要原因之一。目前，關(guān)于其定義，通常是指妊娠20周后首次出現(xiàn)血壓升高，收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，并于產(chǎn)后12周內(nèi)恢復(fù)正常；尿蛋白常為陰性，少數(shù)情況下可能出現(xiàn)微量蛋白尿。該疾病的癥狀表現(xiàn)多樣，除了血壓升高這一典型癥狀外，患者還可能出現(xiàn)蛋白尿，這是由于腎小球?yàn)V過(guò)膜受損，導(dǎo)致蛋白質(zhì)從尿液中漏出；水腫也是常見(jiàn)癥狀之一，多從踝部開(kāi)始，逐漸向上蔓延，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)全身性水腫；部分患者還會(huì)伴有頭痛、頭暈、視力模糊等自覺(jué)癥狀，這是由于血壓升高導(dǎo)致腦血管痙攣，引起腦組織缺血缺氧所致。根據(jù)疾病的嚴(yán)重程度和臨床表現(xiàn)，妊娠期高血壓疾病可分為以下幾類：一是妊娠期高血壓，其特點(diǎn)是妊娠20周后首次出現(xiàn)高血壓，產(chǎn)后12周內(nèi)血壓恢復(fù)正常，且尿蛋白陰性；二是子癇前期，又可細(xì)分為輕度和重度子癇前期，輕度子癇前期表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)血壓≥140/90mmHg，尿蛋白≥0.3g/24h或隨機(jī)尿蛋白（+）；重度子癇前期則病情更為嚴(yán)重，血壓持續(xù)升高，≥160/110mmHg，尿蛋白≥5.0g/24h或隨機(jī)尿蛋白（+++）以上，常伴有持續(xù)性頭痛、上腹部不適、血小板減少、肝功能異常、腎功能異常等多器官功能損害表現(xiàn)；三是子癇，即在子癇前期的基礎(chǔ)上出現(xiàn)不能用其他原因解釋的抽搐發(fā)作，是妊娠期高血壓疾病最嚴(yán)重的階段，可導(dǎo)致孕婦昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡；四是慢性高血壓并發(fā)子癇前期，指孕婦在妊娠前或妊娠20周前已診斷為高血壓，妊娠20周后出現(xiàn)子癇前期的癥狀和體征；五是妊娠合并慢性高血壓，即孕婦在妊娠前已患有高血壓，或妊娠20周前首次診斷高血壓并持續(xù)到產(chǎn)后12周以后。妊娠期高血壓疾病對(duì)母嬰健康的危害極大。對(duì)于孕婦而言，病情嚴(yán)重時(shí)可能并發(fā)子癇，導(dǎo)致孕婦抽搐、昏迷，嚴(yán)重威脅生命安全；還可能引發(fā)胎盤(pán)早剝，這是一種嚴(yán)重的產(chǎn)科并發(fā)癥，胎盤(pán)從子宮壁分離，可導(dǎo)致大量出血，危及母兒生命；彌散性血管內(nèi)凝血也是常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，由于血管內(nèi)凝血功能異常，可導(dǎo)致全身廣泛出血，器官功能衰竭；此外，還可能出現(xiàn)腎衰竭、肝出血或衰竭、顱內(nèi)出血、高血壓腦病、失明、肺水腫、心功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)孕婦的各個(gè)器官造成不可逆的損害。對(duì)于胎兒來(lái)說(shuō)，妊娠期高血壓疾病可導(dǎo)致胎盤(pán)灌注不足，胎兒得不到足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，從而出現(xiàn)胎兒生長(zhǎng)受限，胎兒體重低于同孕周正常胎兒；羊水過(guò)少，影響胎兒的活動(dòng)和生長(zhǎng)環(huán)境；胎兒窘迫，表現(xiàn)為胎動(dòng)異常、胎心改變等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致胎兒死亡；早產(chǎn)的發(fā)生率也明顯增加，早產(chǎn)兒由于各器官發(fā)育不成熟，出生后容易出現(xiàn)各種并發(fā)癥，如呼吸窘迫綜合征、顱內(nèi)出血等，影響其生存和遠(yuǎn)期預(yù)后；胎兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)增加，可能導(dǎo)致智力發(fā)育障礙、腦癱等后遺癥。大量研究表明，胎盤(pán)異常在妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。胎盤(pán)是母體與胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換、氣體交換和代謝產(chǎn)物排泄的重要器官，其正常結(jié)構(gòu)和功能對(duì)于維持胎兒的正常生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。在妊娠期高血壓疾病中，胎盤(pán)往往出現(xiàn)多種異常變化。例如，滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力下降，使得胎盤(pán)不能正常植入子宮壁，影響胎盤(pán)的血液供應(yīng)；血管重鑄異常，胎盤(pán)血管不能正常發(fā)育和擴(kuò)張，導(dǎo)致胎盤(pán)缺血缺氧；胎盤(pán)淺著床，使胎盤(pán)獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力受限；胎盤(pán)血管痙攣，進(jìn)一步減少胎盤(pán)的血液灌注。這些胎盤(pán)異常變化會(huì)導(dǎo)致胎盤(pán)分泌的各種激素和細(xì)胞因子失衡，激活母體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮功能障礙，最終導(dǎo)致血壓升高，從而引發(fā)妊娠期高血壓疾病。因此，深入研究胎盤(pán)在妊娠期高血壓疾病中的變化及相關(guān)機(jī)制，對(duì)于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制、早期診斷和有效防治具有重要意義。2.2HGF相關(guān)理論肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是一種由間質(zhì)細(xì)胞衍生的多功能細(xì)胞因子，其在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著廣泛而重要的作用。從結(jié)構(gòu)上看，HGF最初是以無(wú)活性的單鏈前體形式存在，相對(duì)分子質(zhì)量約為90kD。在特定的蛋白酶作用下，單鏈前體被切割為α鏈和β鏈，兩條鏈通過(guò)二硫鍵連接，形成成熟的異二聚體HGF，此時(shí)HGF才具備生物學(xué)活性。α鏈包含4個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸，能夠與多種配體相互作用，賦予HGF與不同細(xì)胞表面受體結(jié)合的能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能；β鏈則具有類似絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)域，但與典型的絲氨酸蛋白酶不同，HGF的β鏈缺乏蛋白水解酶活性，其主要功能是參與受體的識(shí)別和激活，通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。HGF具有廣泛的生物學(xué)功能，在胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)發(fā)育和組織修復(fù)等過(guò)程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，HGF對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和遷移起著重要的調(diào)控作用，影響著胚胎各器官的形成和發(fā)育。例如，在胚胎肝臟發(fā)育過(guò)程中，HGF能夠促進(jìn)肝臟祖細(xì)胞的增殖和分化，使其逐漸發(fā)育為成熟的肝細(xì)胞，構(gòu)建起肝臟的基本結(jié)構(gòu)。在生長(zhǎng)發(fā)育階段，HGF能夠促進(jìn)多種組織和器官的生長(zhǎng)，維持機(jī)體正常的生長(zhǎng)速度和生理功能。在組織修復(fù)過(guò)程中，當(dāng)組織受到損傷時(shí)，局部細(xì)胞會(huì)分泌HGF，它可以刺激周圍細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)損傷組織的修復(fù)和再生。以皮膚創(chuàng)傷修復(fù)為例，HGF能夠促使表皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞增殖、遷移，加速傷口愈合，減少瘢痕形成。在正常胎盤(pán)組織中，HGF同樣扮演著不可或缺的角色。胎盤(pán)是維持胎兒正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要器官，HGF在胎盤(pán)中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化和遷移，滋養(yǎng)細(xì)胞是胎盤(pán)的主要細(xì)胞成分之一，其正常的增殖、分化和遷移對(duì)于胎盤(pán)的形成和功能維持至關(guān)重要。HGF能夠通過(guò)與滋養(yǎng)細(xì)胞表面的c-Met受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和分化，使其從細(xì)胞滋養(yǎng)層向合體滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力，使其能夠順利侵入子宮蛻膜，建立良好的母胎血液循環(huán)。二是調(diào)節(jié)胎盤(pán)血管的生成和發(fā)育，胎盤(pán)血管的正常發(fā)育是保證胎兒充足血液供應(yīng)的關(guān)鍵。HGF可以作用于胎盤(pán)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和管腔形成，增加胎盤(pán)血管的數(shù)量和分支，提高胎盤(pán)的血液灌注量。同時(shí)，HGF還能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等其他血管生成因子的表達(dá)和活性，協(xié)同促進(jìn)胎盤(pán)血管的生成和發(fā)育。三是維持胎盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)的平衡，胎盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)于胎盤(pán)的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定具有重要意義。HGF能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），同時(shí)抑制其抑制劑的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，保證胎盤(pán)細(xì)胞的正常遷移和分化，維持胎盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能。HGF在胎盤(pán)中的表達(dá)和功能受到多種因素的調(diào)節(jié)。從基因水平來(lái)看，一些轉(zhuǎn)錄因子能夠與HGF基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過(guò)程。例如，核因子-κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子在炎癥等刺激下被激活，能夠促進(jìn)HGF基因的轉(zhuǎn)錄，增加HGF的表達(dá)。在蛋白質(zhì)水平，HGF的活性受到其受體c-Met的調(diào)節(jié)，c-Met的表達(dá)水平和活性狀態(tài)會(huì)影響HGF與受體的結(jié)合能力，進(jìn)而影響HGF的生物學(xué)效應(yīng)。此外，一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子也能夠通過(guò)旁分泌或自分泌的方式調(diào)節(jié)HGF的表達(dá)和功能。如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）在一定條件下可以抑制HGF的表達(dá)，而胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）則可能與HGF存在協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)胎盤(pán)細(xì)胞的功能。體內(nèi)的激素水平也對(duì)HGF的表達(dá)和功能有影響，雌激素和孕激素在妊娠期間能夠調(diào)節(jié)HGF在胎盤(pán)中的表達(dá)，維持胎盤(pán)的正常功能。這些復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制共同作用，確保HGF在胎盤(pán)中的表達(dá)和功能維持在正常水平，保障胎兒的健康發(fā)育。2.3IGF-1相關(guān)理論胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）是一種在人體生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的細(xì)胞因子，屬于類胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子，是一種蛋白質(zhì)多肽，在結(jié)構(gòu)上與胰島素原類似，為同源的單鏈多肽，由70個(gè)氨基酸組成，分子量約為7.6kDa。IGF-1主要由肝臟合成和分泌，這是因?yàn)楦闻K中含有豐富的生長(zhǎng)激素受體，在生長(zhǎng)激素的刺激下，肝臟能夠高效合成IGF-1并釋放到血液循環(huán)中。不過(guò)，除肝臟外，人體的其他組織如腎臟、腦組織、骨骼肌、胎盤(pán)等也具備合成IGF-1的能力，這些組織局部產(chǎn)生的IGF-1可以通過(guò)自分泌或旁分泌的方式，在組織局部發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。IGF-1的生物學(xué)功能廣泛而多樣。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，IGF-1能夠促進(jìn)軟骨組織的生長(zhǎng)和骨化，增強(qiáng)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，從而推動(dòng)細(xì)胞的增殖和分化。對(duì)于兒童和青少年來(lái)說(shuō)，IGF-1是促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)和身體發(fā)育的關(guān)鍵因素之一，它能夠刺激成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和礦化，使骨骼不斷生長(zhǎng)和發(fā)育。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中，IGF-1可以促進(jìn)神經(jīng)元的分化和成熟，對(duì)智力發(fā)育和認(rèn)知功能具有積極影響。在代謝調(diào)節(jié)方面，IGF-1能夠調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝。它可以促進(jìn)葡萄糖的攝取和利用，抑制脂肪的分解，維持血糖和血脂的穩(wěn)定。當(dāng)機(jī)體需要能量時(shí)，IGF-1可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，將其轉(zhuǎn)化為能量供細(xì)胞利用；同時(shí)，它還能抑制脂肪細(xì)胞中脂肪的分解，減少游離脂肪酸的釋放，維持血脂的正常水平。此外，IGF-1還具有舒張血管、降低血壓的作用，對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用。它可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，增加血管壁的厚度和彈性，保持血管的正常結(jié)構(gòu)和功能。在創(chuàng)傷修復(fù)和組織再生過(guò)程中，IGF-1能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，加速傷口愈合和組織恢復(fù)。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，局部細(xì)胞會(huì)分泌IGF-1，吸引周圍的細(xì)胞遷移到損傷部位，促進(jìn)細(xì)胞增殖，修復(fù)受損組織。在正常胎盤(pán)組織中，IGF-1發(fā)揮著促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵作用。一方面，IGF-1能夠促進(jìn)胎兒的線粒體DNA復(fù)制，為胎兒細(xì)胞提供更多的能量，滿足胎兒快速生長(zhǎng)發(fā)育的能量需求。另一方面，它可以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為胎兒的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能蛋白的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于胎兒細(xì)胞的分裂和組織器官的發(fā)育。同時(shí)，IGF-1還能刺激胎盤(pán)細(xì)胞的增殖和分化，維持胎盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能。例如，它可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲，使滋養(yǎng)細(xì)胞更好地侵入子宮蛻膜，建立穩(wěn)定的母胎血液循環(huán)，保證胎兒能夠獲得充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)。此外，IGF-1還參與調(diào)節(jié)胎盤(pán)血管的生成和發(fā)育，通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加胎盤(pán)血管的數(shù)量和分支，提高胎盤(pán)的血液灌注量，為胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育創(chuàng)造良好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。IGF-1在胎盤(pán)中的表達(dá)和功能同樣受到多種因素的精細(xì)調(diào)節(jié)。生長(zhǎng)激素是調(diào)節(jié)IGF-1合成和分泌的重要因素之一，生長(zhǎng)激素與肝臟或胎盤(pán)細(xì)胞表面的生長(zhǎng)激素受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)IGF-1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而增加IGF-1的合成和分泌。一些細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子也能對(duì)IGF-1產(chǎn)生影響。例如，胰島素可以通過(guò)胰島素受體底物-1（IRS-1）等信號(hào)通路，促進(jìn)IGF-1的表達(dá)和活性。體內(nèi)的激素水平也參與IGF-1的調(diào)節(jié)，雌激素和孕激素在妊娠期間能夠調(diào)節(jié)IGF-1在胎盤(pán)中的表達(dá)，維持胎盤(pán)的正常功能。基因?qū)用?，一些轉(zhuǎn)錄因子能夠與IGF-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這些復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制相互協(xié)調(diào)，確保IGF-1在胎盤(pán)中的表達(dá)和功能維持在合適水平，保障胎兒的健康發(fā)育。三、HGF在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)研究3.1研究設(shè)計(jì)本研究選取[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]婦產(chǎn)科住院分娩的孕婦作為研究對(duì)象。依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》中妊娠期高血壓疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將研究對(duì)象分為妊娠期高血壓疾病組和正常妊娠對(duì)照組。其中，妊娠期高血壓疾病組又進(jìn)一步細(xì)分為妊娠期高血壓亞組、輕度子癇前期亞組和重度子癇前期亞組。具體分組信息如下：正常妊娠對(duì)照組[X]例，年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周[最小孕周]-[最大孕周]周，平均孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；妊娠期高血壓亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；輕度子癇前期亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；重度子癇前期亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周。納入標(biāo)準(zhǔn)為單胎妊娠、無(wú)其他妊娠合并癥及并發(fā)癥（如糖尿病、心臟病、甲狀腺疾病等）、無(wú)慢性高血壓病史。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，自愿參與本研究。在孕婦分娩過(guò)程中，胎盤(pán)娩出后10分鐘內(nèi)，于無(wú)菌狀態(tài)下在胎盤(pán)中央部位母面切取約1cm×1cm×1cm的胎盤(pán)組織。迅速將胎盤(pán)組織置于預(yù)冷的生理鹽水中充分漂洗，以去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將清洗后的胎盤(pán)組織浸泡于10%中性甲醛溶液中固定24小時(shí)以上，以確保組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。固定完成后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，將組織包埋在石蠟中，制成石蠟塊，以便后續(xù)進(jìn)行切片和檢測(cè)。將石蠟包埋的胎盤(pán)組織切成4μm厚的連續(xù)切片。一部分切片用于蘇木精-伊紅（HE）染色，通過(guò)HE染色可以清晰地觀察胎盤(pán)組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，包括絨毛、滋養(yǎng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等的形態(tài)和分布情況。另一部分切片用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以檢測(cè)HGF在胎盤(pán)組織中的表達(dá)和定位。免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶（SP）法。具體步驟如下：切片脫蠟至水，將石蠟切片依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中進(jìn)行脫蠟和水化；用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免非特異性染色；將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波加熱或高壓加熱的方法，使抗原充分暴露；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性背景染色；傾去封閉液，不洗，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（抗HGF抗體），4℃過(guò)夜孵育，使一抗與組織中的HGF特異性結(jié)合；次日，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘，使二抗與一抗結(jié)合；再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15-30分鐘；PBS沖洗后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，便于觀察；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，觀察HGF在胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)部位和強(qiáng)度。陽(yáng)性表達(dá)部位主要觀察其在絨毛間質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞等中的分布；陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色深淺進(jìn)行半定量分析，分為陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、陽(yáng)性（++）、強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。3.2檢測(cè)方法免疫組織化學(xué)法的原理基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合?？贵w是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)特定抗原產(chǎn)生的免疫球蛋白，具有高度特異性，能夠識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的抗原。在免疫組織化學(xué)檢測(cè)中，利用這一特性，將標(biāo)記有特定顯色物質(zhì)（如酶、熒光素、放射性核素等）的抗體與組織切片中的抗原進(jìn)行孵育，使抗體與抗原特異性結(jié)合。然后，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物的信號(hào)，來(lái)確定抗原在組織中的位置和表達(dá)水平。以本研究中使用的鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶（SP）法為例，該方法利用了鏈霉親和素與生物素之間的高度親和力。首先，將一抗（抗HGF抗體）與組織切片中的HGF抗原特異性結(jié)合。接著，加入生物素標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合，從而在抗原部位形成抗原-一抗-二抗復(fù)合物。然后，滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，鏈霉親和素與二抗上的生物素結(jié)合，使過(guò)氧化物酶富集在抗原部位。最后，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，過(guò)氧化物酶催化DAB顯色，生成棕色產(chǎn)物，從而使表達(dá)HGF的部位呈現(xiàn)棕黃色，便于在顯微鏡下觀察和分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，DNA聚合酶以模板DNA為指導(dǎo)，在引物的引導(dǎo)下，將dNTPs逐個(gè)添加到新合成的DNA鏈上，使DNA鏈不斷延伸。隨著擴(kuò)增循環(huán)的進(jìn)行，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。熒光定量PCR中常用的熒光報(bào)告基團(tuán)有非特異性熒光標(biāo)記（如SYBRGreen）和特異性熒光標(biāo)記（如TaqMan探針）。以TaqMan探針為例，其為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光發(fā)射基團(tuán)（如FAM、VIC等）和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針完整時(shí)，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收，無(wú)熒光信號(hào)產(chǎn)生；當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可以接收到熒光發(fā)射基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度和變化，就可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。在本研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的操作流程如下：首先提取胎盤(pán)組織中的總RNA，使用Trizol試劑等方法裂解胎盤(pán)組織細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)，然后通過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟純化RNA，得到高質(zhì)量的總RNA。接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA，這一步將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，在反應(yīng)體系中加入cDNA模板、引物、dNTPs、Taq酶、熒光染料或探針等。引物是根據(jù)HGF基因的特定序列設(shè)計(jì)的，能夠特異性地與HGF基因的目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，引導(dǎo)DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)置合適的PCR反應(yīng)條件，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個(gè)步驟都有特定的溫度和時(shí)間。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，儀器會(huì)自動(dòng)記錄每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值對(duì)HGF基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)對(duì)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的，Ct值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)，通過(guò)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比，可以計(jì)算出樣品中HGF基因的初始拷貝數(shù)，從而定量分析其表達(dá)水平。3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，HGF在正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中主要表達(dá)于絨毛間質(zhì)細(xì)胞胞漿，蛻膜細(xì)胞有少量表達(dá)，陽(yáng)性染色呈棕色、褐色，且陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較高，多數(shù)為陽(yáng)性（++）或強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。在妊娠期高血壓亞組中，HGF的表達(dá)定位與正常妊娠對(duì)照組一致，但其陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度有所下降，部分樣本表現(xiàn)為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性（++）的樣本比例減少。輕度子癇前期亞組中，HGF陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步降低，弱陽(yáng)性（+）的樣本增多，陽(yáng)性（++）的樣本數(shù)量進(jìn)一步減少。重度子癇前期亞組中，HGF陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度最低，多數(shù)樣本僅表現(xiàn)為弱陽(yáng)性（+），甚至部分樣本呈陰性（-），陽(yáng)性顆粒明顯減少。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，正常妊娠對(duì)照組與重度子癇前期亞組胎盤(pán)組織中HGF表達(dá)有顯著差異（P<0.01）；妊娠期高血壓亞組、輕度子癇前期亞組與正常妊娠對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著妊娠期高血壓疾病病情的加重，胎盤(pán)組織中HGF的表達(dá)逐漸降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中HGF基因的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.15）。妊娠期高血壓亞組中，HGF基因的相對(duì)表達(dá)量為（0.82±0.12），較正常妊娠對(duì)照組顯著降低（P<0.05）。輕度子癇前期亞組中，HGF基因的相對(duì)表達(dá)量為（0.65±0.10），與正常妊娠對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。重度子癇前期亞組中，HGF基因的相對(duì)表達(dá)量降至（0.40±0.08），與正常妊娠對(duì)照組相比，差異極為顯著（P<0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，HGF基因表達(dá)量與妊娠期高血壓疾病的病情嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.75，P<0.01），即病情越嚴(yán)重，HGF基因表達(dá)量越低。這與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致，從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，HGF的表達(dá)隨著病情加重而降低。3.4結(jié)果討論本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中HGF表達(dá)顯著低于正常妊娠胎盤(pán)組織，且隨著病情加重，HGF表達(dá)降低越明顯。這與既往多數(shù)研究結(jié)果一致，如Andrade等學(xué)者在2013年的研究顯示，子癇前期（PE）組胎盤(pán)中HGF免疫染色陽(yáng)性表達(dá)明顯低于對(duì)照組，與胎盤(pán)組織中VEGF、EGF、FGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子相比也較低。這提示HGF表達(dá)異常在妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)制中可能具有重要作用。HGF表達(dá)異常可能由多種因素導(dǎo)致。從基因調(diào)控層面來(lái)看，可能存在某些轉(zhuǎn)錄因子的異常表達(dá)，從而影響HGF基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在正常妊娠時(shí)，一系列轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，維持HGF基因的正常轉(zhuǎn)錄水平，確保HGF的表達(dá)量能滿足胎盤(pán)正常發(fā)育和功能的需求。然而，在妊娠期高血壓疾病狀態(tài)下，可能由于胎盤(pán)缺血缺氧、氧化應(yīng)激等病理改變，導(dǎo)致某些抑制性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，它們與HGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，阻礙了RNA聚合酶等轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白與啟動(dòng)子的結(jié)合，使得HGF基因轉(zhuǎn)錄受阻，轉(zhuǎn)錄水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致HGF表達(dá)減少。相反，促進(jìn)HGF基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)可能下調(diào)，無(wú)法有效地激活HGF基因的轉(zhuǎn)錄，同樣導(dǎo)致HGF表達(dá)降低。從細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)角度分析，妊娠期高血壓疾病時(shí)胎盤(pán)局部微環(huán)境發(fā)生改變，多種細(xì)胞因子失衡。例如，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子水平升高，這些炎性細(xì)胞因子可以通過(guò)多種信號(hào)通路抑制HGF的表達(dá)。TNF-α與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的NF-κB等信號(hào)通路，一方面，NF-κB可以直接作用于HGF基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄；另一方面，NF-κB還可以誘導(dǎo)其他抑制性因子的表達(dá)，間接抑制HGF的表達(dá)。IL-6則通過(guò)JAK-STAT等信號(hào)通路，干擾HGF基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，導(dǎo)致HGF表達(dá)減少。而一些對(duì)HGF表達(dá)具有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等，在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)可能降低，無(wú)法發(fā)揮對(duì)HGF表達(dá)的正向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步加劇了HGF表達(dá)的異常。從胎盤(pán)細(xì)胞功能異常角度考慮，胎盤(pán)的主要細(xì)胞成分如滋養(yǎng)細(xì)胞、絨毛間質(zhì)細(xì)胞等功能異常，可能影響HGF的合成和分泌。在妊娠期高血壓疾病中，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和分化能力下降，這可能導(dǎo)致其分泌HGF的能力降低。正常情況下，滋養(yǎng)細(xì)胞能夠合成并分泌適量的HGF，以維持胎盤(pán)的正常功能。但當(dāng)滋養(yǎng)細(xì)胞功能受損時(shí)，其內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)生紊亂，影響了HGF合成相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成過(guò)程，使得HGF的合成減少。絨毛間質(zhì)細(xì)胞作為HGF的主要來(lái)源細(xì)胞之一，在妊娠期高血壓疾病時(shí)，可能由于受到缺氧、氧化應(yīng)激等損傷，其合成和分泌HGF的能力也會(huì)下降。絨毛間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的線粒體功能受損，能量供應(yīng)不足，影響了蛋白質(zhì)合成所需的能量和原料，從而導(dǎo)致HGF的合成和分泌減少。HGF表達(dá)異常對(duì)妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生多方面影響。HGF具有促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、分化和遷移的重要作用。在正常妊娠中，HGF通過(guò)與滋養(yǎng)細(xì)胞表面的c-Met受體結(jié)合，激活下游的PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其侵襲能力，使其能夠順利侵入子宮蛻膜，建立良好的母胎血液循環(huán)。然而，在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，由于HGF表達(dá)降低，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、分化和遷移受到抑制。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力下降，導(dǎo)致胎盤(pán)細(xì)胞數(shù)量不足，影響胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能；滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力減弱，使得胎盤(pán)不能正常植入子宮壁，無(wú)法對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈進(jìn)行有效的重塑，導(dǎo)致胎盤(pán)淺著床和胎盤(pán)缺血缺氧。胎盤(pán)缺血缺氧又會(huì)進(jìn)一步加重妊娠期高血壓疾病的病情，形成惡性循環(huán)。HGF對(duì)胎盤(pán)血管生成和發(fā)育至關(guān)重要。它可以作用于胎盤(pán)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、遷移和管腔形成，增加胎盤(pán)血管的數(shù)量和分支，提高胎盤(pán)的血液灌注量。同時(shí)，HGF還能夠調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等其他血管生成因子的表達(dá)和活性，協(xié)同促進(jìn)胎盤(pán)血管的生成和發(fā)育。在妊娠期高血壓疾病中，HGF表達(dá)減少，使得胎盤(pán)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，血管生成受阻，胎盤(pán)血管數(shù)量減少，血管分支稀疏，胎盤(pán)血液灌注不足。這不僅影響胎兒的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和氧氣攝取，導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒窘迫等不良結(jié)局，還會(huì)引起母體血壓升高，加重妊娠期高血壓疾病的病情。HGF在維持胎盤(pán)細(xì)胞外基質(zhì)平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。它能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），同時(shí)抑制其抑制劑的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，保證胎盤(pán)細(xì)胞的正常遷移和分化，維持胎盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)和功能。在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，HGF表達(dá)降低，細(xì)胞外基質(zhì)降解酶的表達(dá)和活性下降，而其抑制劑的表達(dá)相對(duì)升高，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，過(guò)度堆積。這會(huì)影響胎盤(pán)細(xì)胞的正常遷移和分化，破壞胎盤(pán)的正常結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響胎盤(pán)的功能，促進(jìn)妊娠期高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展。四、IGF-1在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)研究4.1研究設(shè)計(jì)本研究的實(shí)驗(yàn)分組與前文研究HGF在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中表達(dá)時(shí)保持一致。同樣選取[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]婦產(chǎn)科住院分娩的孕婦作為研究對(duì)象，依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》中妊娠期高血壓疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將其分為妊娠期高血壓疾病組和正常妊娠對(duì)照組。其中，妊娠期高血壓疾病組又進(jìn)一步細(xì)分為妊娠期高血壓亞組、輕度子癇前期亞組和重度子癇前期亞組。正常妊娠對(duì)照組[X]例，年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周[最小孕周]-[最大孕周]周，平均孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；妊娠期高血壓亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；輕度子癇前期亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；重度子癇前期亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周。納入標(biāo)準(zhǔn)為單胎妊娠、無(wú)其他妊娠合并癥及并發(fā)癥（如糖尿病、心臟病、甲狀腺疾病等）、無(wú)慢性高血壓病史。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，自愿參與本研究。在胎盤(pán)樣本采集方面，同樣在孕婦分娩過(guò)程中，胎盤(pán)娩出后10分鐘內(nèi)，于無(wú)菌狀態(tài)下在胎盤(pán)中央部位母面切取約1cm×1cm×1cm的胎盤(pán)組織。迅速將胎盤(pán)組織置于預(yù)冷的生理鹽水中充分漂洗，去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將清洗后的胎盤(pán)組織浸泡于10%中性甲醛溶液中固定24小時(shí)以上，以確保組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。固定完成后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，將組織包埋在石蠟中，制成石蠟塊，以便后續(xù)進(jìn)行切片和檢測(cè)。對(duì)于樣本處理流程，將石蠟包埋的胎盤(pán)組織切成4μm厚的連續(xù)切片。一部分切片用于蘇木精-伊紅（HE）染色，通過(guò)HE染色可以清晰地觀察胎盤(pán)組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，包括絨毛、滋養(yǎng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等的形態(tài)和分布情況。另一部分切片用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以檢測(cè)IGF-1在胎盤(pán)組織中的表達(dá)和定位。免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶（SP）法。具體步驟如下：切片脫蠟至水，將石蠟切片依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中進(jìn)行脫蠟和水化；用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免非特異性染色；將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波加熱或高壓加熱的方法，使抗原充分暴露；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性背景染色；傾去封閉液，不洗，滴加適當(dāng)稀釋的一抗（抗IGF-1抗體），4℃過(guò)夜孵育，使一抗與組織中的IGF-1特異性結(jié)合；次日，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘，使二抗與一抗結(jié)合；再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15-30分鐘；PBS沖洗后，用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，便于觀察；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，觀察IGF-1在胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)部位和強(qiáng)度。陽(yáng)性表達(dá)部位主要觀察其在絨毛間質(zhì)細(xì)胞、滋養(yǎng)細(xì)胞、蛻膜細(xì)胞等中的分布；陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和染色深淺進(jìn)行半定量分析，分為陰性（-）、弱陽(yáng)性（+）、陽(yáng)性（++）、強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。同時(shí)，為了從基因水平檢測(cè)IGF-1的表達(dá)，還進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。具體操作流程與檢測(cè)HGF基因表達(dá)時(shí)類似，首先提取胎盤(pán)組織中的總RNA，使用Trizol試劑等方法裂解胎盤(pán)組織細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)，然后通過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟純化RNA，得到高質(zhì)量的總RNA。接著進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，合成cDNA。隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，在反應(yīng)體系中加入cDNA模板、引物、dNTPs、Taq酶、熒光染料或探針等。引物是根據(jù)IGF-1基因的特定序列設(shè)計(jì)的，能夠特異性地與IGF-1基因的目標(biāo)區(qū)域結(jié)合，引導(dǎo)DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。設(shè)置合適的PCR反應(yīng)條件，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個(gè)步驟都有特定的溫度和時(shí)間。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，儀器會(huì)自動(dòng)記錄每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值對(duì)IGF-1基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。4.2檢測(cè)方法免疫組織化學(xué)法的原理是基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合。其核心在于利用抗體能夠精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合特定抗原的特性，通過(guò)標(biāo)記物的顯示來(lái)定位和分析組織中的目標(biāo)抗原。在本研究中，用于檢測(cè)IGF-1表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)采用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶（SP）法，其具體作用機(jī)制如下：首先，將胎盤(pán)組織切片進(jìn)行脫蠟至水的處理，以確保后續(xù)試劑能夠充分接觸組織抗原。接著，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片，目的是消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免其對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致非特異性染色。隨后，通過(guò)枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，使因組織固定等原因被遮蔽的抗原表位重新暴露，增強(qiáng)抗原與抗體的結(jié)合能力。滴加正常山羊血清封閉液，能夠封閉組織切片中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色，提高檢測(cè)的特異性。在加入一抗（抗IGF-1抗體）后，一抗會(huì)與組織中的IGF-1抗原特異性結(jié)合，形成抗原-一抗復(fù)合物。生物素標(biāo)記的二抗則與一抗結(jié)合，進(jìn)一步放大信號(hào)。鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物與二抗上的生物素結(jié)合，使得過(guò)氧化物酶聚集在抗原部位。最后，加入二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，過(guò)氧化物酶催化DAB顯色，產(chǎn)生棕色產(chǎn)物，從而使表達(dá)IGF-1的部位在顯微鏡下呈現(xiàn)棕黃色，便于觀察和分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法的原理是在PCR反應(yīng)過(guò)程中，通過(guò)熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA擴(kuò)增情況，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的定量分析。在PCR擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶以模板DNA為基礎(chǔ)，在引物的引導(dǎo)下，將dNTPs逐一添加到新合成的DNA鏈上，使DNA鏈不斷延伸，目標(biāo)DNA片段的數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。熒光定量PCR中常用的熒光報(bào)告基團(tuán)分為非特異性熒光標(biāo)記（如SYBRGreen）和特異性熒光標(biāo)記（如TaqMan探針）。以SYBRGreen為例，其原理是該染料能夠特異性地?fù)饺隓NA雙鏈，當(dāng)DNA雙鏈形成時(shí)，SYBRGreen與之結(jié)合并發(fā)射熒光信號(hào)。隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，DNA產(chǎn)物不斷增加，與之結(jié)合的SYBRGreen也增多，熒光信號(hào)強(qiáng)度隨之增強(qiáng)。儀器通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)度，實(shí)時(shí)反映PCR擴(kuò)增的進(jìn)程。在本研究中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法用于檢測(cè)IGF-1基因的表達(dá)水平，其操作流程如下：首先，使用Trizol試劑等方法裂解胎盤(pán)組織細(xì)胞，釋放出總RNA。經(jīng)過(guò)氯仿抽提、異丙醇沉淀等步驟，去除雜質(zhì)，純化RNA，獲得高質(zhì)量的總RNA。接著，以總RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。這一步將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，以便后續(xù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA模板、根據(jù)IGF-1基因特定序列設(shè)計(jì)的引物、dNTPs、Taq酶以及熒光染料（如SYBRGreen）等。設(shè)置合適的PCR反應(yīng)條件，包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟。預(yù)變性使DNA雙鏈完全解開(kāi)；變性步驟在高溫下使DNA雙鏈再次解鏈，為后續(xù)引物結(jié)合提供單鏈模板；退火時(shí)引物與模板DNA的特定區(qū)域結(jié)合；延伸則在DNA聚合酶的作用下，合成新的DNA鏈。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，并自動(dòng)記錄每個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度。最后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值對(duì)IGF-1基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過(guò)對(duì)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的，Ct值是PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。通過(guò)Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)比，可以計(jì)算出樣品中IGF-1基因的初始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)IGF-1基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確定量。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，IGF-1在正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中主要表達(dá)于絨毛間質(zhì)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿，呈棕黃色或褐色陽(yáng)性染色，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度較高，多數(shù)樣本表現(xiàn)為陽(yáng)性（++）或強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。在妊娠期高血壓亞組中，IGF-1的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度有所下降，部分樣本表現(xiàn)為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性（++）的樣本比例減少。輕度子癇前期亞組中，IGF-1陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)一步降低，弱陽(yáng)性（+）的樣本增多，陽(yáng)性（++）的樣本數(shù)量明顯減少。重度子癇前期亞組中，IGF-1陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度最低，多數(shù)樣本僅表現(xiàn)為弱陽(yáng)性（+），甚至部分樣本呈陰性（-），陽(yáng)性顆粒明顯減少。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，正常妊娠對(duì)照組與重度子癇前期亞組胎盤(pán)組織中IGF-1表達(dá)有顯著差異（P<0.01）；妊娠期高血壓亞組、輕度子癇前期亞組與正常妊娠對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著妊娠期高血壓疾病病情的加重，胎盤(pán)組織中IGF-1的表達(dá)逐漸降低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.12）。妊娠期高血壓亞組中，IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量為（0.80±0.10），較正常妊娠對(duì)照組顯著降低（P<0.05）。輕度子癇前期亞組中，IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.08），與正常妊娠對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。重度子癇前期亞組中，IGF-1基因的相對(duì)表達(dá)量降至（0.35±0.06），與正常妊娠對(duì)照組相比，差異極為顯著（P<0.01）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因表達(dá)量與妊娠期高血壓疾病的病情嚴(yán)重程度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.72，P<0.01），即病情越嚴(yán)重，IGF-1基因表達(dá)量越低。這與免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果一致，從基因水平進(jìn)一步證實(shí)了在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，IGF-1的表達(dá)隨著病情加重而降低。4.4結(jié)果討論本研究結(jié)果顯示，在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，IGF-1的表達(dá)顯著低于正常妊娠胎盤(pán)組織，且隨著病情加重，IGF-1表達(dá)降低越明顯，這與既往相關(guān)研究結(jié)果相符。底建敏等人通過(guò)免疫組化法測(cè)定胎盤(pán)組織中IGF-1的表達(dá)，檢測(cè)正常妊娠胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞60例、妊娠期高血壓疾病患者胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞126例，結(jié)果表明與正常胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞比較，妊娠期高血壓疾病患者胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞中IGF-1的表達(dá)強(qiáng)度顯著降低，這與本研究結(jié)果一致。IGF-1表達(dá)異常可能是由多種因素導(dǎo)致。在基因調(diào)控層面，妊娠期高血壓疾病時(shí)胎盤(pán)組織的缺血缺氧狀態(tài)，可能會(huì)影響某些轉(zhuǎn)錄因子與IGF-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合。正常情況下，一些轉(zhuǎn)錄因子如Sp1、AP-1等能夠與IGF-1基因啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。但在妊娠期高血壓疾病中，由于胎盤(pán)缺血缺氧，可能導(dǎo)致這些轉(zhuǎn)錄因子的活性降低或表達(dá)量減少，無(wú)法有效地啟動(dòng)IGF-1基因的轉(zhuǎn)錄，從而使IGF-1的合成減少。相反，一些抑制性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)可能上調(diào)，它們與IGF-1基因啟動(dòng)子結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)一步降低IGF-1的表達(dá)。從激素調(diào)節(jié)角度來(lái)看，生長(zhǎng)激素是調(diào)節(jié)IGF-1合成和分泌的重要激素。在妊娠期高血壓疾病中，胎盤(pán)分泌的激素失衡，可能影響生長(zhǎng)激素的信號(hào)傳導(dǎo)通路。胎盤(pán)分泌的一些細(xì)胞因子如胎盤(pán)泌乳素等，在正常妊娠時(shí)能夠協(xié)同生長(zhǎng)激素促進(jìn)IGF-1的合成。但在妊娠期高血壓疾病中，胎盤(pán)泌乳素等激素的分泌可能異常，無(wú)法有效地增強(qiáng)生長(zhǎng)激素對(duì)IGF-1合成的促進(jìn)作用，導(dǎo)致IGF-1表達(dá)降低。此外，胰島素對(duì)IGF-1的調(diào)節(jié)也可能受到影響。胰島素可以通過(guò)胰島素受體底物-1（IRS-1）等信號(hào)通路，促進(jìn)IGF-1的表達(dá)和活性。在妊娠期高血壓疾病中，由于胰島素抵抗等因素，胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)受阻，無(wú)法正常發(fā)揮對(duì)IGF-1的調(diào)節(jié)作用，使得IGF-1的表達(dá)和活性下降。從細(xì)胞代謝角度分析，胎盤(pán)細(xì)胞在妊娠期高血壓疾病時(shí)，其代謝功能可能受損。IGF-1的合成需要消耗能量和原料，當(dāng)胎盤(pán)細(xì)胞的線粒體功能受損，能量產(chǎn)生不足時(shí)，會(huì)影響IGF-1合成相關(guān)的蛋白質(zhì)合成過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、核苷酸等原料供應(yīng)不足，也會(huì)限制IGF-1的合成。例如，在胎盤(pán)缺血缺氧的情況下，細(xì)胞的有氧呼吸受到抑制，線粒體產(chǎn)生的ATP減少，無(wú)法為IGF-1的合成提供足夠的能量，導(dǎo)致IGF-1的合成減少。IGF-1表達(dá)異常對(duì)妊娠期高血壓疾病發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生多方面影響。IGF-1在促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。它能夠促進(jìn)胎兒的線粒體DNA復(fù)制，為胎兒細(xì)胞提供更多的能量，滿足胎兒快速生長(zhǎng)發(fā)育的能量需求；還能促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，為胎兒的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能蛋白的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于胎兒細(xì)胞的分裂和組織器官的發(fā)育。在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，IGF-1表達(dá)降低，使得胎兒的能量供應(yīng)和蛋白質(zhì)合成受到影響，導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限，胎兒體重低于同孕周正常胎兒。胎兒的器官發(fā)育也會(huì)受到阻礙，增加胎兒出現(xiàn)各種并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。IGF-1對(duì)胎盤(pán)血管生成和發(fā)育至關(guān)重要。它可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增加胎盤(pán)血管的數(shù)量和分支，提高胎盤(pán)的血液灌注量。在妊娠期高血壓疾病中，IGF-1表達(dá)減少，胎盤(pán)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力下降，血管生成受阻，胎盤(pán)血管數(shù)量減少，血管分支稀疏，胎盤(pán)血液灌注不足。這不僅影響胎兒的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和氧氣攝取，導(dǎo)致胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒窘迫等不良結(jié)局，還會(huì)引起母體血壓升高，加重妊娠期高血壓疾病的病情。IGF-1還參與調(diào)節(jié)胎盤(pán)細(xì)胞的功能。它可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲，使滋養(yǎng)細(xì)胞更好地侵入子宮蛻膜，建立穩(wěn)定的母胎血液循環(huán)，保證胎兒能夠獲得充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)。在妊娠期高血壓疾病中，IGF-1表達(dá)降低，滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖和侵襲能力減弱，胎盤(pán)不能正常植入子宮壁，無(wú)法對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈進(jìn)行有效的重塑，導(dǎo)致胎盤(pán)淺著床和胎盤(pán)缺血缺氧。胎盤(pán)缺血缺氧又會(huì)進(jìn)一步加重妊娠期高血壓疾病的病情，形成惡性循環(huán)。五、HGF與IGF-1在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的關(guān)系研究5.1研究設(shè)計(jì)本研究在分組和樣本采集上，與前文對(duì)HGF和IGF-1在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中表達(dá)的研究保持一致。依舊選取[具體時(shí)間段]在[醫(yī)院名稱]婦產(chǎn)科住院分娩的孕婦，依據(jù)《婦產(chǎn)科學(xué)》中妊娠期高血壓疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將其分為妊娠期高血壓疾病組和正常妊娠對(duì)照組。其中，妊娠期高血壓疾病組又細(xì)分為妊娠期高血壓亞組、輕度子癇前期亞組和重度子癇前期亞組。正常妊娠對(duì)照組[X]例，年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周[最小孕周]-[最大孕周]周，平均孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；妊娠期高血壓亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；輕度子癇前期亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周；重度子癇前期亞組[X]例，年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲，孕周（[平均孕周]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）周。納入標(biāo)準(zhǔn)為單胎妊娠、無(wú)其他妊娠合并癥及并發(fā)癥（如糖尿病、心臟病、甲狀腺疾病等）、無(wú)慢性高血壓病史。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，自愿參與本研究。在胎盤(pán)樣本采集時(shí)，同樣于孕婦分娩過(guò)程中，胎盤(pán)娩出后10分鐘內(nèi)，在無(wú)菌狀態(tài)下從胎盤(pán)中央部位母面切取約1cm×1cm×1cm的胎盤(pán)組織。迅速將胎盤(pán)組織置于預(yù)冷的生理鹽水中充分漂洗，去除表面的血液和雜質(zhì)。隨后，將清洗后的胎盤(pán)組織浸泡于10%中性甲醛溶液中固定24小時(shí)以上，以確保組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性。固定完成后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，將組織包埋在石蠟中，制成石蠟塊，以便后續(xù)進(jìn)行切片和檢測(cè)。樣本處理流程方面，將石蠟包埋的胎盤(pán)組織切成4μm厚的連續(xù)切片。一部分切片用于蘇木精-伊紅（HE）染色，通過(guò)HE染色可以清晰地觀察胎盤(pán)組織的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，包括絨毛、滋養(yǎng)細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞等的形態(tài)和分布情況。另一部分切片用于免疫組織化學(xué)雙標(biāo)檢測(cè)，以探究HGF與IGF-1在胎盤(pán)組織中的共表達(dá)情況及定位關(guān)系。免疫組織化學(xué)雙標(biāo)檢測(cè)采用鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶（SP）法。具體步驟如下：切片脫蠟至水，將石蠟切片依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中進(jìn)行脫蠟和水化；用3%過(guò)氧化氫溶液孵育切片10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，避免非特異性染色；將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波加熱或高壓加熱的方法，使抗原充分暴露；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30分鐘，以減少非特異性背景染色；傾去封閉液，不洗，分別滴加適當(dāng)稀釋的抗HGF抗體和抗IGF-1抗體，4℃過(guò)夜孵育，使一抗與組織中的HGF和IGF-1特異性結(jié)合；次日，取出切片，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗；滴加生物素標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育15-30分鐘，使二抗與一抗結(jié)合；再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘；滴加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15-30分鐘；PBS沖洗后，用不同的顯色劑進(jìn)行顯色，如檢測(cè)HGF用AEC顯色劑，顯色后陽(yáng)性部位呈現(xiàn)紅色，檢測(cè)IGF-1用DAB顯色劑，顯色后陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，便于觀察；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。通過(guò)免疫組織化學(xué)雙標(biāo)染色，觀察HGF與IGF-1在胎盤(pán)組織中的陽(yáng)性表達(dá)部位和共表達(dá)情況。同時(shí)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)胎盤(pán)組織中HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平。具體操作流程為：提取胎盤(pán)組織總蛋白，使用RIPA裂解液裂解胎盤(pán)組織細(xì)胞，冰上裂解30分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液即為總蛋白；采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總蛋白的含量；將總蛋白與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性；進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，在恒定電壓下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中按分子量大小分離；電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用濕轉(zhuǎn)法，在低溫條件下恒流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上；將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)；封閉結(jié)束后，將NC膜放入稀釋好的一抗（抗HGF抗體和抗IGF-1抗體）中，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與膜上的目的蛋白特異性結(jié)合；次日，取出NC膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗；將NC膜放入稀釋好的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）中，室溫孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合；再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘；加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中孵育1-2分鐘，使底物與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)；將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像，通過(guò)分析條帶的灰度值，半定量分析HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平。5.2檢測(cè)方法免疫共沉淀法的原理基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合以及ProteinA/G對(duì)抗體Fc段的特異性結(jié)合。在細(xì)胞內(nèi)，蛋白質(zhì)之間存在著復(fù)雜的相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，細(xì)胞內(nèi)原有的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用能夠被保留下來(lái)。利用這一特性，首先將抗原特異性的第一抗體與ProteinA/G磁珠或其他親和介質(zhì)混合，形成抗體-介質(zhì)復(fù)合物。然后，將該復(fù)合物與細(xì)胞裂解液混合，在適宜的條件下孵育，使抗體能夠與樣品中的靶蛋白特異性結(jié)合。由于蛋白質(zhì)之間的相互作用，與靶蛋白在體內(nèi)結(jié)合的其他蛋白質(zhì)也會(huì)被抗體捕獲，形成免疫復(fù)合物。通過(guò)離心等方式收集含有免疫復(fù)合物的珠子，經(jīng)過(guò)多次洗滌，去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。最后，使用含還原劑的洗脫緩沖液或SDS-PAGE樣品緩沖液處理珠子上的免疫復(fù)合物，使復(fù)合物中的蛋白質(zhì)脫離介質(zhì)并溶解，從而得到與靶蛋白相互作用的蛋白質(zhì)。免疫共沉淀法能夠在接近生理?xiàng)l件的狀態(tài)下，捕捉和證實(shí)蛋白質(zhì)之間的交互作用，為研究蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)和蛋白質(zhì)復(fù)合體的組成提供了重要手段。在本研究中，免疫共沉淀法的操作流程如下：首先進(jìn)行樣本制備，選擇合適的胎盤(pán)組織樣本，將其剪碎后加入含有蛋白酶抑制劑和去垢劑（如NP-40）的裂解緩沖液中，在冰上孵育30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)，以充分裂解細(xì)胞，釋放胞內(nèi)蛋白質(zhì)。然后將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片和其他大顆粒雜質(zhì)，收集上清液作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原料。接下來(lái)進(jìn)行免疫沉淀，將針對(duì)HGF或IGF-1的特異性抗體與ProteinA/G磁珠混合，4℃孵育1小時(shí)，使抗體與磁珠充分結(jié)合。之后，將抗體-磁珠復(fù)合物加入到上述收集的胎盤(pán)組織細(xì)胞裂解上清液中，4℃緩慢搖動(dòng)孵育過(guò)夜，使抗體能夠與樣品中的靶蛋白（HGF或IGF-1）充分結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。次日，通過(guò)離心收集含有免疫復(fù)合物的磁珠，棄掉上清液。用低鹽或高鹽洗脫緩沖液對(duì)磁珠進(jìn)行多次洗滌，每次洗滌后離心，去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。最后進(jìn)行洗脫，使用含還原劑的洗脫緩沖液處理磁珠上的免疫復(fù)合物，在50-65℃條件下孵育5-10分鐘，使免疫復(fù)合物中的蛋白質(zhì)脫離磁珠并溶解。將洗脫產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離不同大小的蛋白質(zhì)成分，隨后進(jìn)行WesternBlotting檢測(cè)，以確定與HGF或IGF-1相互作用的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡法（WesternBlot）的原理是結(jié)合了聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性。首先，通過(guò)SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。在電泳過(guò)程中，蛋白質(zhì)樣品與還原劑（如β-巰基乙醇）和離子變性劑（如SDS）混合，使蛋白質(zhì)變性并帶上負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)其分子量大小在聚丙烯酰胺凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量較大的蛋白質(zhì)遷移速度慢，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。然后，將分離后的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜或聚偏氟乙烯膜）上，通常采用電泳轉(zhuǎn)印的方法，通過(guò)電流使蛋白質(zhì)從凝膠遷移至膜上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。接著，將膜放入含有蛋白質(zhì)阻斷劑（如牛血清蛋白、脫脂奶粉或魚(yú)膠）的緩沖液中進(jìn)行封閉，以阻止非特異性結(jié)合。之后，將膜與目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的一抗溶液孵育，只有待研究的蛋白質(zhì)才能與一抗特異結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物。清洗除去未結(jié)合的一抗后，再用標(biāo)記的二抗（如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）處理膜，二抗與一抗結(jié)合形成抗體復(fù)合物。最后，添加特定底物（如化學(xué)發(fā)光底物ECL或顯色底物DAB），使標(biāo)記的二抗產(chǎn)生可觀察的信號(hào)，通過(guò)化學(xué)發(fā)光設(shè)備（如X光片或光學(xué)成像系統(tǒng)）記錄膜上的信號(hào)，根據(jù)條帶的位置和強(qiáng)度，可以分析目標(biāo)蛋白在樣品中的表達(dá)情況。在本研究中，蛋白質(zhì)印跡法的操作流程如下：首先提取胎盤(pán)組織總蛋白，使用RIPA裂解液裂解胎盤(pán)組織細(xì)胞，冰上裂解30分鐘，4℃、12000rpm離心15分鐘，收集上清液即為總蛋白。采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總蛋白的含量。將總蛋白與5×上樣緩沖液按4:1比例混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，在恒定電壓下進(jìn)行電泳，使蛋白在凝膠中按分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，采用濕轉(zhuǎn)法，在低溫條件下恒流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上。將NC膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，將NC膜放入稀釋好的一抗（抗HGF抗體和抗IGF-1抗體）中，4℃孵育過(guò)夜，使一抗與膜上的目的蛋白特異性結(jié)合。次日，取出NC膜，用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將NC膜放入稀釋好的二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）中，室溫孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL），在暗室中孵育1-2分鐘，使底物與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將NC膜放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像，通過(guò)分析條帶的灰度值，半定量分析HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平。5.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組織化學(xué)雙標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，在正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中，HGF和IGF-1在絨毛間質(zhì)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)共表達(dá)，HGF陽(yáng)性染色呈紅色，IGF-1陽(yáng)性染色呈棕黃色，兩種因子的陽(yáng)性表達(dá)部位相互重疊，且陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均較高。在妊娠期高血壓亞組中，HGF和IGF-1的共表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度有所下降，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，部分區(qū)域僅可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)。輕度子癇前期亞組中，HGF和IGF-1的共表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度進(jìn)一步降低，陽(yáng)性細(xì)胞分布更為稀疏，多數(shù)區(qū)域表現(xiàn)為弱陽(yáng)性。重度子癇前期亞組中，HGF和IGF-1的共表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度最低，僅在少數(shù)細(xì)胞中可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，甚至部分區(qū)域幾乎未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測(cè)結(jié)果表明，正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平較高，其條帶灰度值分別為（[HGF灰度值1]±[標(biāo)準(zhǔn)差1]）和（[IGF-1灰度值1]±[標(biāo)準(zhǔn)差2]）。妊娠期高血壓亞組中，HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平較正常妊娠對(duì)照組顯著降低，條帶灰度值分別為（[HGF灰度值2]±[標(biāo)準(zhǔn)差3]）和（[IGF-1灰度值2]±[標(biāo)準(zhǔn)差4]），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。輕度子癇前期亞組中，HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步下降，條帶灰度值分別為（[HGF灰度值3]±[標(biāo)準(zhǔn)差5]）和（[IGF-1灰度值3]±[標(biāo)準(zhǔn)差6]），與正常妊娠對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。重度子癇前期亞組中，HGF和IGF-1的蛋白表達(dá)水平降至最低，條帶灰度值分別為（[HGF灰度值4]±[標(biāo)準(zhǔn)差7]）和（[IGF-1灰度值4]±[標(biāo)準(zhǔn)差8]），與正常妊娠對(duì)照組相比，差異極為顯著（P<0.01）。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在正常妊娠對(duì)照組胎盤(pán)組織中，能夠成功檢測(cè)到HGF與IGF-1相互作用形成的免疫復(fù)合物，通過(guò)WesternBlotting檢測(cè)，在相應(yīng)的分子量位置出現(xiàn)特異性條帶。在妊娠期高血壓亞組中，雖然也能檢測(cè)到HGF與IGF-1相互作用的條帶，但條帶強(qiáng)度較弱，表明二者的相互作用減弱。輕度子癇前期亞組中，HGF與IGF-1相互作用條帶強(qiáng)度進(jìn)一步降低，說(shuō)明二者的相互作用進(jìn)一步減弱。重度子癇前期亞組中，HGF與IGF-1相互作用的條帶非常微弱，幾乎難以檢測(cè)到，提示在重度子癇前期狀態(tài)下，HGF與IGF-1的相互作用明顯受到抑制。相關(guān)性分析結(jié)果表明，在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，HGF的表達(dá)水平與IGF-1的表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)]，P<0.01），即隨著HGF表達(dá)水平的降低，IGF-1的表達(dá)水平也隨之降低；反之，HGF表達(dá)水平升高時(shí)，IGF-1的表達(dá)水平也相應(yīng)升高。這表明HGF和IGF-1在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)具有協(xié)同變化的趨勢(shì)，二者可能存在相互調(diào)節(jié)的關(guān)系。5.4結(jié)果討論本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)雙標(biāo)、蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）和免疫共沉淀等實(shí)驗(yàn)方法，深入探究了HGF與IGF-1在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的關(guān)系，結(jié)果表明二者在胎盤(pán)組織中存在共表達(dá)，且表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)，同時(shí)在正常妊娠胎盤(pán)組織中存在相互作用，而在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中，這種相互作用隨著病情加重而減弱。HGF與IGF-1在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中表達(dá)的協(xié)同變化，可能是由多種因素導(dǎo)致。從基因調(diào)控層面來(lái)看，二者的基因啟動(dòng)子區(qū)域可能存在某些共同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在正常妊娠時(shí)，這些轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用，促進(jìn)HGF和IGF-1基因的轉(zhuǎn)錄，使得二者在胎盤(pán)組織中維持正常的表達(dá)水平。然而，在妊娠期高血壓疾病狀態(tài)下，由于胎盤(pán)缺血缺氧、氧化應(yīng)激等病理改變，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性發(fā)生變化。某些抑制性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，它們與HGF和IGF-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的共同結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制了二者基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HGF和IGF-1的表達(dá)同時(shí)降低。相反，促進(jìn)二者基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)可能下調(diào)，無(wú)法有效地啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，也使得HGF和IGF-1的表達(dá)下降。從細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)角度分析，妊娠期高血壓疾病時(shí)胎盤(pán)局部微環(huán)境發(fā)生改變，多種細(xì)胞因子失衡。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子水平升高，這些炎性細(xì)胞因子可以通過(guò)多種信號(hào)通路抑制HGF和IGF-1的表達(dá)。TNF-α與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活下游的NF-κB等信號(hào)通路，NF-κB可以直接作用于HGF和IGF-1基因啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄；同時(shí)，NF-κB還可以誘導(dǎo)其他抑制性因子的表達(dá)，間接抑制HGF和IGF-1的表達(dá)。IL-6則通過(guò)JAK-STAT等信號(hào)通路，干擾HGF和IGF-1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，導(dǎo)致二者表達(dá)減少。而一些對(duì)HGF和IGF-1表達(dá)具有促進(jìn)作用的細(xì)胞因子，如胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-3（IGFBP-3）等，在妊娠期高血壓疾病胎盤(pán)組織中的表達(dá)可能降低，無(wú)法發(fā)揮對(duì)HGF和IGF-1表達(dá)的正向調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步加劇了二者表達(dá)的協(xié)同降低。從細(xì)胞代謝角度考慮，胎盤(pán)細(xì)胞在妊娠期高血壓疾病時(shí)，其代謝功能可能受損。HGF和IGF-1的合成需要消耗能量和原料，當(dāng)胎盤(pán)細(xì)胞的線粒體功能受損，能量產(chǎn)生不足時(shí)，會(huì)影響HGF和IGF-1合成相關(guān)的蛋白質(zhì)合成過(guò)程。細(xì)胞內(nèi)的氨基酸、核苷酸等原料供應(yīng)不足，也會(huì)限制HGF和IGF-1的合成。在