姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的多維度研究與干預(yù)策略一、引言1.1研究背景與意義原發(fā)性肝癌，主要指肝細(xì)胞癌，是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其病死率在世界范圍內(nèi)位居第三位，在我國更是高居第二位。手術(shù)切除目前仍是早期肝癌的首選治療策略，然而，由于肝癌具有多灶性、早期血管侵犯等特性，即便進(jìn)行了手術(shù)切除，術(shù)后5年的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)仍然高達(dá)70%。對(duì)于復(fù)發(fā)瘤，雖可進(jìn)行二次切除，但大多數(shù)患者在復(fù)發(fā)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，而對(duì)于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，常規(guī)治療手段往往難以取得理想效果。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移已成為肝癌患者的主要死因，即便早期肝癌也可能具有較高的轉(zhuǎn)移潛能，腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移常常同步進(jìn)行。在肝癌手術(shù)中，由于影像學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星灶及微血管侵犯，大部分所謂的“根治性切除”手術(shù)，實(shí)際上屬于姑息性切除。姑息性肝癌切除術(shù)是指在無法達(dá)到根治目的的情況下，切除部分腫瘤組織，其目的在于減輕腫瘤負(fù)荷、緩解癥狀，提高患者生活質(zhì)量并延長生命。然而，姑息性切除術(shù)后，殘余癌細(xì)胞及術(shù)前已播散的異位癌細(xì)胞可能獲得或增強(qiáng)轉(zhuǎn)移潛能，從而形成復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移灶，或轉(zhuǎn)移至新的組織器官。有研究表明，姑息性手術(shù)所造成的一系列影響，如手術(shù)創(chuàng)傷引發(fā)的炎癥反應(yīng)、肝臟微環(huán)境的改變等，可能是導(dǎo)致術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因。復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所報(bào)道的2333例肝癌切除術(shù)中，姑息性切除比例占37.2％（868/2333），其1、3、5、8、10年生存率均低于同期根治組。姑息性切除術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的變化及其機(jī)制，目前尚無明確的研究報(bào)道。探究這一問題，并尋找有效的干預(yù)措施，對(duì)于改善肝癌患者的預(yù)后具有至關(guān)重要的意義。若能深入了解姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，明確相關(guān)作用機(jī)制，將為臨床治療提供更精準(zhǔn)的理論依據(jù)，有助于開發(fā)更有效的治療策略，降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。本研究旨在通過構(gòu)建姑息性肝癌切除術(shù)模型，深入研究術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的變化及其相關(guān)基因表達(dá)的改變，期望發(fā)現(xiàn)與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能改變密切相關(guān)的基因，確立用于評(píng)估殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能改變的分子診斷模型。同時(shí)，探索中藥小復(fù)方“松友飲”對(duì)肝癌的體內(nèi)體外作用及可能的機(jī)制，研究“松友飲”和干擾素α聯(lián)用對(duì)姑息術(shù)后殘癌生長、轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)的影響，為生物治療與中藥聯(lián)合應(yīng)用治療肝癌患者的臨床推廣提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，肝癌治療研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)，手術(shù)切除作為早期肝癌的重要治療手段，相關(guān)研究主要聚焦于手術(shù)方式的優(yōu)化及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的防治。例如，一些研究致力于改進(jìn)手術(shù)技術(shù)，以減少術(shù)中出血和對(duì)肝臟功能的損傷，提高手術(shù)的安全性和根治性。對(duì)于姑息性肝癌切除術(shù)，國外研究關(guān)注手術(shù)對(duì)患者生存質(zhì)量和生存期的影響，以及術(shù)后輔助治療的選擇。有研究表明，姑息性切除術(shù)后采用化療、靶向治療等輔助手段，在一定程度上可延緩腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，但總體效果仍不盡人意。在殘癌侵襲轉(zhuǎn)移方面，國外研究從腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性、腫瘤微環(huán)境等多個(gè)角度展開，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程、腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子等，對(duì)殘癌的侵襲轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵作用。然而，對(duì)于姑息性肝癌切除術(shù)與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能之間的直接關(guān)聯(lián)，研究相對(duì)較少，尚未形成系統(tǒng)的理論和有效的干預(yù)策略。國內(nèi)在肝癌治療領(lǐng)域也取得了顯著進(jìn)展。手術(shù)切除在肝癌治療中占據(jù)重要地位，復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所報(bào)道了大量肝癌切除術(shù)病例，其中姑息性切除比例較高，且發(fā)現(xiàn)其生存率低于同期根治組。國內(nèi)研究同樣重視手術(shù)技術(shù)的創(chuàng)新和完善，以及術(shù)后綜合治療的探索。在殘癌侵襲轉(zhuǎn)移方面，國內(nèi)學(xué)者開展了多方面的研究。有研究從基因水平探討肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)一些基因的異常表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。中藥在肝癌治療中的應(yīng)用也是國內(nèi)研究的特色之一，中藥復(fù)方松友飲被發(fā)現(xiàn)對(duì)姑息性肝切除術(shù)后殘癌生長和轉(zhuǎn)移具有抑制作用。但目前國內(nèi)對(duì)于姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其干預(yù)的研究，仍存在不足，缺乏深入全面的機(jī)制研究和有效的臨床干預(yù)方案。盡管國內(nèi)外在肝癌治療及殘癌侵襲轉(zhuǎn)移方面開展了諸多研究，但仍存在以下不足：一是對(duì)姑息性肝癌切除術(shù)如何影響殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的機(jī)制研究不夠深入，尚未明確關(guān)鍵的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路；二是缺乏有效的評(píng)估殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的方法和指標(biāo)，難以準(zhǔn)確預(yù)測患者的預(yù)后；三是在干預(yù)措施方面，現(xiàn)有的治療手段對(duì)降低姑息性肝癌切除術(shù)后殘癌的侵襲轉(zhuǎn)移效果有限，缺乏針對(duì)性強(qiáng)、副作用小的治療策略。本研究將針對(duì)這些不足，深入探究姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其機(jī)制，并尋找有效的干預(yù)措施，為肝癌的臨床治療提供新的思路和方法。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，并尋找有效的干預(yù)措施，具體研究目的如下：其一，構(gòu)建精準(zhǔn)的姑息性肝癌切除術(shù)模型，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作，詳細(xì)觀察術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的動(dòng)態(tài)變化過程，包括殘癌的生長速度、轉(zhuǎn)移范圍和轉(zhuǎn)移頻率等方面的變化，為后續(xù)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。其二，運(yùn)用先進(jìn)的基因檢測技術(shù)，如基因芯片分析、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，全面檢測與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)的基因表達(dá)改變，深入分析這些基因表達(dá)變化與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能之間的內(nèi)在聯(lián)系，篩選出關(guān)鍵的基因靶點(diǎn)。其三，基于基因表達(dá)譜芯片生物信息分析方法，結(jié)合生物信息學(xué)工具和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段，確立一套科學(xué)、準(zhǔn)確的用于評(píng)估殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能改變的分子診斷模型，為臨床預(yù)測和診斷提供有力的技術(shù)支持。其四，通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究中藥小復(fù)方“松友飲”對(duì)高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制，包括對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響，以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)的調(diào)控作用。其五，在前期對(duì)干擾素α研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究“松友飲”和干擾素α聯(lián)用對(duì)姑息術(shù)后殘癌生長、轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)的影響，評(píng)估聯(lián)合治療的效果和優(yōu)勢，為生物治療與中藥聯(lián)合應(yīng)用治療肝癌患者的臨床推廣提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采用以下研究方法：在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，選用BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠，通過肝左葉原位接種高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系MHCC97H肝癌組織，成功構(gòu)建姑息性肝癌切除術(shù)模型。將接種腫瘤后14d的裸小鼠隨機(jī)分為姑息組和對(duì)照組，姑息組切除大部分病灶和部分肝臟，在瘤體深部保留2mm大小肝癌組織，對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)（僅麻醉、開腹）。術(shù)后定期觀察裸小鼠的生存狀態(tài)、體重變化等指標(biāo)，通過殘癌原代培養(yǎng)、侵襲實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHA）等技術(shù)，檢測殘癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能、相關(guān)蛋白表達(dá)和酶活性等。在基因檢測方面，利用腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分類功能基因芯片（OligoTumorMetastasisMicroarray,SuperArray）檢測姑息術(shù)后14d裸小鼠腫瘤標(biāo)本的基因表達(dá)，使用綜合型GEArray表達(dá)分析配套軟件（GEArrayExpressionAnalysisSuite）進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用差異基因顯著性分析、差異基因分組關(guān)聯(lián)度分析及支持向量機(jī)（SVM）篩選腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移性診斷標(biāo)志基因；應(yīng)用基于特征性致病基因的基因聚類和多維量表構(gòu)建基因功能網(wǎng)絡(luò)，比較網(wǎng)絡(luò)密度和凝聚度以及樞紐基因的組間變化特點(diǎn)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timePCR）對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證，確?；驒z測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在中藥研究方面，體外研究采用高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞，設(shè)置不同濃度的“松友飲”處理組，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)等，觀察“松友飲”對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。體內(nèi)研究采用原位接種MHCC97H腫瘤的裸鼠模型，將裸鼠隨機(jī)分為“松友飲”組和對(duì)照組，“松友飲”組給予灌胃給藥，對(duì)照組給予等量生理鹽水，觀察裸鼠的體重變化、腫瘤生長情況、肺轉(zhuǎn)移程度和生存期等指標(biāo)。通過免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、血管生長因子（VEGF）等相關(guān)蛋白的表達(dá)，探究“松友飲”的作用機(jī)制。在聯(lián)合治療研究方面，在姑息性肝癌切除術(shù)模型的基礎(chǔ)上，將裸鼠分為“松友飲”和干擾素α聯(lián)用組、“松友飲”單獨(dú)使用組、干擾素α單獨(dú)使用組和對(duì)照組，觀察不同組別的殘癌生長、轉(zhuǎn)移情況和基因表達(dá)變化。通過上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和研究方法，本研究有望深入揭示姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其機(jī)制，并為臨床治療提供有效的干預(yù)策略和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響2.1構(gòu)建姑息性肝癌切除術(shù)模型為深入探究姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，本研究選用肺轉(zhuǎn)移率達(dá)100％的高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系MHCC97H用于體內(nèi)研究。這一細(xì)胞系具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，能夠較為真實(shí)地模擬肝癌在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移過程，為研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠，其免疫缺陷的特性使得人肝癌細(xì)胞能夠在其體內(nèi)良好生長，避免了免疫排斥反應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在無菌條件下，從液氮罐中取出凍存的MHCC97H肝癌組織，迅速放入37℃水浴中解凍。待組織完全解凍后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗3次，去除凍存液。將肝癌組織剪切成1mm3大小的小塊，用眼科鑷小心地將其植入裸小鼠的肝左葉。具體操作如下：將裸小鼠用1%戊巴比妥鈉（30mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒腹部皮膚，沿腹部正中線切開約1cm的切口，暴露肝臟。在肝左葉邊緣用眼科鑷輕輕撕開一小口，將肝癌組織塊植入其中，然后用醫(yī)用生物膠封閉創(chuàng)口，逐層縫合腹壁。接種腫瘤后14d，裸小鼠的腫瘤生長狀態(tài)較為穩(wěn)定且具有一定的體積，此時(shí)將裸小鼠隨機(jī)分為姑息組和對(duì)照組。姑息組進(jìn)行姑息性肝癌切除術(shù)，在手術(shù)顯微鏡下，小心切除大部分病灶和部分肝臟，在瘤體深部保留2mm大小肝癌組織，以模擬臨床姑息性切除的情況。對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)，僅對(duì)裸小鼠進(jìn)行麻醉、開腹操作，不切除腫瘤組織，以排除手術(shù)創(chuàng)傷等非腫瘤相關(guān)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。手術(shù)過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，術(shù)后給予裸小鼠常規(guī)的護(hù)理和飼養(yǎng)條件，密切觀察其生存狀態(tài)、體重變化等指標(biāo)。通過這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，成功構(gòu)建了姑息性肝癌切除術(shù)模型，為后續(xù)研究術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的變化提供了可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.2術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化檢測2.2.1侵襲實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建好姑息性肝癌切除術(shù)模型后，對(duì)術(shù)后不同時(shí)段的殘癌進(jìn)行原代培養(yǎng)。具體操作如下：將姑息組和對(duì)照組裸小鼠在術(shù)后特定時(shí)間點(diǎn)（如術(shù)后7d、14d、21d、35d等）處死，取出殘癌組織，用含雙抗（青霉素和鏈霉素）的PBS沖洗3次，去除血細(xì)胞和雜質(zhì)。將組織剪碎成約1mm3的小塊，加入0.25%胰蛋白酶溶液，在37℃恒溫?fù)u床上消化30分鐘。消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止消化，并用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄去上清液，再用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。采用Transwell小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)，小室的聚碳酸酯濾膜孔徑為8μm，預(yù)先在其上鋪一層Matrigel基質(zhì)膠。Matrigel基質(zhì)膠是從小鼠EHS肉瘤中提取的基質(zhì)成分，含有LN、IV型膠原、接觸蛋白和肝素硫酸多糖，鋪在濾膜上能在DMEM培養(yǎng)基中重建形成膜結(jié)構(gòu)，這種膜結(jié)構(gòu)與天然基質(zhì)膜結(jié)構(gòu)極為相似。細(xì)胞不能自由穿過鋪有Matrigel的濾膜，必須分泌水解酶，并通過變形運(yùn)動(dòng)才能穿過，這與體內(nèi)腫瘤細(xì)胞侵襲的情況較為相似。在下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液作為趨化劑，上室加入重懸的殘癌細(xì)胞。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室表面未穿過膜的細(xì)胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過濾膜并粘附在濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在術(shù)后7d，姑息組和對(duì)照組的穿膜細(xì)胞數(shù)差異不明顯；術(shù)后14d，姑息組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組（P=0.015），表明此時(shí)姑息組殘癌的侵襲潛能明顯增強(qiáng)；術(shù)后21d和35d，姑息組的穿膜細(xì)胞數(shù)仍高于對(duì)照組，但差異的顯著性有所降低。這一系列結(jié)果表明，姑息性肝癌切除術(shù)后殘癌侵襲潛能呈增強(qiáng)趨勢，且在術(shù)后14d時(shí)，這種增強(qiáng)趨勢最為明顯。2.2.2明膠酶譜實(shí)驗(yàn)明膠酶譜實(shí)驗(yàn)可用于檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的活性，MMP2主要降解IV型膠原，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。該實(shí)驗(yàn)的原理是基于MMP2能夠水解明膠。在實(shí)驗(yàn)中，先將樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明膠）電泳分離。在電泳過程中，SDS與樣品中的MMPs結(jié)合，破壞其氫鍵和疏水鍵，使得MMPs無法發(fā)揮作用。隨后，將凝膠置于含有2.5%TritonX-100的洗脫液中洗脫，TritonX-100能夠結(jié)合并去除SDS，從而使MMPs恢復(fù)其活性。在有二價(jià)金屬離子（如Ca2?、Zn2?）存在的緩沖系統(tǒng)中，恢復(fù)活性的MMP2在各自的遷移位置水解凝膠里的明膠。最后，用考馬斯亮藍(lán)將凝膠染色，再脫色，在藍(lán)色背景下可出現(xiàn)白色條帶，條帶的強(qiáng)弱與MMP2活性成正比。具體操作步驟如下：收集姑息組和對(duì)照組裸小鼠術(shù)后不同時(shí)段的殘癌組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，然后在4℃、12000r/min條件下離心15分鐘，取上清液作為蛋白樣品。注意蛋白裂解液中不能加入EDTA，因?yàn)镋DTA是金屬離子螯合劑，可以絡(luò)合Zn2?，抑制MMP的活性；也不能加入β-巰基乙醇或DTT，因?yàn)闀?huì)導(dǎo)致蛋白的二硫鍵被打開，蛋白不能復(fù)性。推薦用PBS或Tris緩沖液（pH7.5）作為蛋白提取的緩沖液，可以加入0.5%的PMSF。用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，使終濃度為1×。配制8%分離膠（含0.1%明膠）：30%丙烯酰胺2.7ml，ddH?O4.5ml，1.5mol/LTris（pH8.8）2.5ml，10%SDS100μl，10%過硫酸銨（APS）100μl，TEMED6μl；配制濃縮膠：ddH?O2.1ml，30%丙烯酰胺0.5ml，1mol/LTris-HCI（pH6.8）0.38ml，10%SDS30μl，10%過硫酸銨30μl，TEMED3μl。將蛋白樣品加入凝膠孔中，在130V恒壓下進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間約為2.5小時(shí)。電泳結(jié)束后，將凝膠置于洗脫液中，在搖床上洗滌2次，每次30分鐘，以除去膠中的SDS。然后將凝膠放入孵育液（50mmol/LTris-HCl，10mmol/LCaCl?，1%TritonX-100，pH7.5）中，37℃孵育24小時(shí)，使MMP2分解明膠。孵育結(jié)束后，將凝膠在染色液（0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250，45%甲醇，10%乙酸）中染色1小時(shí)，再用脫色液（30%甲醇，10%乙酸）脫色至條帶清晰。用凝膠成像儀對(duì)凝膠進(jìn)行拍照，分析條帶的灰度值，以反映MMP2的活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，術(shù)后14d，姑息組殘癌組織中MMP2活性條帶的灰度值明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明此時(shí)姑息組殘癌中MMP2的活性顯著增強(qiáng)。術(shù)后35d，雖然姑息組MMP2活性仍高于對(duì)照組，但差異的顯著性有所下降。這表明姑息性肝癌切除術(shù)后，殘癌中MMP2的活性在術(shù)后14d左右顯著升高，與侵襲實(shí)驗(yàn)中術(shù)后14d殘癌侵襲潛能增強(qiáng)的結(jié)果相呼應(yīng)，進(jìn)一步說明MMP2活性的增強(qiáng)與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的提升密切相關(guān)。2.2.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）用于檢測MMP2的分泌水平，其原理基于雙抗體夾心法。用純化的人基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）抗體包被微孔板，制成固相抗體。往包被單抗的微孔中依次加入從姑息組和對(duì)照組裸小鼠術(shù)后不同時(shí)段殘癌組織培養(yǎng)上清液中提取的MMP2，再與HRP標(biāo)記的MMP-2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色，TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）呈正相關(guān)，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）濃度。具體操作如下：收集姑息組和對(duì)照組裸小鼠術(shù)后不同時(shí)段的殘癌組織，將其剪碎后加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。收集培養(yǎng)上清液，在4℃、12000r/min條件下離心15分鐘，取上清液備用。將標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進(jìn)行梯度稀釋，濃度分別為30μg/L、20μg/L、10μg/L、5.0μg/L、2.5μg/L。在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外。再次用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。重復(fù)洗滌步驟。每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，術(shù)后14d，姑息組殘癌組織培養(yǎng)上清液中MMP2的分泌水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明此時(shí)姑息組殘癌分泌MMP2的能力增強(qiáng)。隨著時(shí)間推移，術(shù)后35d時(shí)，雖然姑息組MMP2分泌水平仍高于對(duì)照組，但差異的顯著性有所降低。這說明姑息性肝癌切除術(shù)后，殘癌中MMP2的分泌在術(shù)后14d左右明顯增加，與明膠酶譜實(shí)驗(yàn)中MMP2活性增強(qiáng)的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)MMP2分泌水平的變化與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的改變密切相關(guān)。2.2.4免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHA）免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHA）用于檢測殘癌中與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，如E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等。E-cadherin是一種上皮細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)；N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，其表達(dá)升高與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。具體實(shí)驗(yàn)過程如下：將姑息組和對(duì)照組裸小鼠術(shù)后不同時(shí)段的殘癌組織用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋。將石蠟切片（厚度為4μm）進(jìn)行脫蠟和水化處理，用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入微波爐中加熱至沸騰，持續(xù)10分鐘，然后自然冷卻。用3%過氧化氫溶液孵育切片10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。傾去封閉液，不洗，直接加入一抗（如抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體、抗Vimentin抗體等），4℃孵育過夜。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30分鐘。用PBS沖洗切片3次，每次5分鐘。用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位出現(xiàn)棕黃色時(shí)，用蒸餾水沖洗終止顯色。用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，然后進(jìn)行脫水、透明和封片處理。在顯微鏡下觀察切片，陽性表達(dá)為棕黃色顆粒。采用圖像分析軟件對(duì)陽性染色區(qū)域進(jìn)行分析，計(jì)算陽性細(xì)胞率和平均光密度值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，術(shù)后14d，姑息組殘癌中E-cadherin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明此時(shí)姑息組殘癌發(fā)生了明顯的EMT過程，侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)。術(shù)后35d，雖然上述蛋白表達(dá)的差異仍然存在，但差異的顯著性有所下降。這進(jìn)一步說明姑息性肝癌切除術(shù)后，殘癌中與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了改變，且在術(shù)后14d左右變化最為明顯，與前面的侵襲實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，共同揭示了姑息性肝癌切除術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)的現(xiàn)象及其機(jī)制。2.3結(jié)果分析通過上述一系列實(shí)驗(yàn)，本研究清晰地揭示了姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后14d姑息組與對(duì)照組侵襲潛能差異最明顯（p=0.015），表明此時(shí)姑息性肝癌切除術(shù)后殘癌侵襲潛能顯著增強(qiáng)，且這種增強(qiáng)趨勢在術(shù)后一段時(shí)間內(nèi)持續(xù)存在。明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示術(shù)后14d姑息組殘癌組織中MMP2活性條帶的灰度值明顯高于對(duì)照組（P<0.05），ELISA實(shí)驗(yàn)表明術(shù)后14d姑息組殘癌組織培養(yǎng)上清液中MMP2的分泌水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同證實(shí)了MMP2活性和分泌水平的變化與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的提升密切相關(guān)。免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)術(shù)后14d姑息組殘癌中E-cadherin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明此時(shí)姑息組殘癌發(fā)生了明顯的EMT過程，進(jìn)一步解釋了殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)的內(nèi)在機(jī)制。綜合這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以明確得出姑息性肝癌切除術(shù)促進(jìn)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)論。本研究結(jié)果具有較高的可靠性。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格遵循科學(xué)規(guī)范，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、模型的構(gòu)建，到各項(xiàng)檢測指標(biāo)的測定，都進(jìn)行了精心設(shè)計(jì)和嚴(yán)格操作。選用的高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系MHCC97H以及BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠，為實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定且具有代表性的實(shí)驗(yàn)材料。在檢測方法上，采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)相互驗(yàn)證，如侵襲實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)等，不同實(shí)驗(yàn)方法從不同角度驗(yàn)證了姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響，增強(qiáng)了結(jié)果的可信度。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了合理的對(duì)照組，能夠有效排除其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。然而，本研究也存在一定的局限性。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型方面，雖然裸小鼠能夠較好地模擬人體腫瘤生長環(huán)境，但與人體仍存在差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果外推至人體時(shí)可能存在偏差。在檢測指標(biāo)上，雖然選擇了多個(gè)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測，但腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，可能還有其他重要的分子機(jī)制和信號(hào)通路未被發(fā)現(xiàn)。此外，本研究主要集中在術(shù)后一段時(shí)間內(nèi)的觀察，對(duì)于殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的長期變化情況，尚未進(jìn)行深入研究。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，增加檢測指標(biāo)，開展長期隨訪研究，以更全面、深入地探究姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響及其機(jī)制。三、姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)基因表達(dá)的影響3.1基因芯片檢測為深入探究姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)基因表達(dá)的影響，本研究選用腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分類功能基因芯片（OligoTumorMetastasisMicroarray,SuperArray）。該芯片具有高度的針對(duì)性，涵蓋了與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的多個(gè)基因類別，能夠系統(tǒng)地檢測基因表達(dá)變化，為研究提供全面且準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。實(shí)驗(yàn)選取BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠，在無菌條件下，經(jīng)肝左葉原位接種高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系MHCC97H肝癌組織。接種腫瘤后14d，將裸小鼠隨機(jī)分為姑息組、對(duì)照組1和對(duì)照組2。姑息組切除大部分病灶和部分肝臟，在瘤體深部保留2mm大小肝癌組織；對(duì)照組1進(jìn)行假手術(shù)，僅麻醉、開腹；對(duì)照組2不做任何干預(yù)。在樣本處理方面，姑息術(shù)后14d，采用頸椎脫臼法處死裸小鼠，迅速取出腫瘤標(biāo)本。將腫瘤標(biāo)本置于預(yù)冷的PBS中，清洗去除血液及其他雜質(zhì)。用眼科剪將腫瘤組織剪碎成約1mm3的小塊，加入Trizol試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作，充分裂解組織細(xì)胞，以提取總RNA。提取過程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，避免RNA降解。利用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。同時(shí)，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，觀察28S和18S核糖體RNA條帶的清晰度和亮度。隨后，進(jìn)行基因芯片檢測流程。根據(jù)TrueLabeling-AMP線性RNA擴(kuò)增試劑盒和SuperArrayArrayGradecRNA純化試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成、cRNA合成、標(biāo)記和擴(kuò)增以及cRNA純化。將生物素標(biāo)記的cRNA樣品與預(yù)熱的GEAhyb雜交液混合均勻，加入到裝有基因芯片的雜交管中。在60°C、轉(zhuǎn)速5-10rpm的條件下，預(yù)雜交1-2小時(shí)，以封閉芯片上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。棄去預(yù)雜交液，加入含有標(biāo)記cRNA的樣品雜交液，于60°C保持5-10rpm旋轉(zhuǎn)雜交過夜，使cRNA與芯片上的探針充分雜交。雜交結(jié)束后，配制洗液1（2XSSC，1%SDS）和洗液2（0.1XSSC，0.5%SDS），并預(yù)熱至60°C。依次用洗液1和洗液2在60°C、20-30rpm的條件下轉(zhuǎn)動(dòng)洗膜15分鐘，以去除未雜交的cRNA和雜質(zhì)。洗膜結(jié)束后，蓋上雜交管蓋，保持膜濕潤，冷卻至室溫。最后，根據(jù)化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（ChemiluminescentDetectionKit,SuperArrayBioscience,CatalogNumberD-01）操作說明書進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。先進(jìn)行膜封閉，加入GEAb封閉液Q，在雜交儀中30-40rpm孵育40分鐘，以減少非特異性信號(hào)。棄去封閉液，加入鏈親和素偶聯(lián)的堿性磷酸酶，在雜交儀中輕輕搖動(dòng)孵育10分鐘。隨后進(jìn)行4次洗膜，分別加入1×緩沖液F和緩沖液G，溫和振蕩，以去除未結(jié)合的堿性磷酸酶。加入CDP-Star化學(xué)發(fā)光底物，室溫孵育2分鐘，使堿性磷酸酶催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。取出膜，放在濾紙上去除多余的底物溶液，用干凈的塑料膜兩面包住，驅(qū)除氣泡，用X-射線膠片曝光。使用綜合型GEArray表達(dá)分析配套軟件（GEArrayExpressionAnalysisSuite）對(duì)曝光后的芯片進(jìn)行圖像采集和完整的數(shù)據(jù)分析，通過軟件分析可以得到基因表達(dá)的原始數(shù)據(jù)，并進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，篩選出差異表達(dá)基因。3.2數(shù)據(jù)分析方法利用綜合型GEArray表達(dá)分析配套軟件（GEArrayExpressionAnalysisSuite）進(jìn)行完整的芯片數(shù)據(jù)分析。該軟件能夠?qū)π酒瑘D像進(jìn)行精確的識(shí)別和處理，將芯片上的熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化為基因表達(dá)的原始數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)分析過程中，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行背景扣除，以去除非特異性雜交信號(hào)的干擾。通過軟件內(nèi)置的算法，根據(jù)芯片上的陰性對(duì)照區(qū)域，計(jì)算背景信號(hào)強(qiáng)度，并從每個(gè)基因位點(diǎn)的熒光信號(hào)強(qiáng)度中減去背景信號(hào)強(qiáng)度，得到更為準(zhǔn)確的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除實(shí)驗(yàn)過程中的系統(tǒng)誤差，確保不同芯片之間的數(shù)據(jù)具有可比性。采用的標(biāo)準(zhǔn)化方法是分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（Quantilenormalization），該方法通過調(diào)整不同芯片的數(shù)據(jù)分布，使所有芯片的數(shù)據(jù)具有相同的分布特征。具體操作是將所有芯片的數(shù)據(jù)按從小到大的順序排列，然后計(jì)算每個(gè)芯片在相同分位數(shù)位置上的數(shù)據(jù)值，通過線性插值等方法，將每個(gè)芯片的數(shù)據(jù)調(diào)整到相同的分布水平。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)，能夠更準(zhǔn)確地反映基因表達(dá)的真實(shí)差異。應(yīng)用差異基因顯著性分析方法，篩選出在姑息組與對(duì)照組之間表達(dá)存在顯著差異的基因。采用t檢驗(yàn)或方差分析（ANOVA）等統(tǒng)計(jì)方法，計(jì)算每個(gè)基因在兩組之間表達(dá)量的差異顯著性。設(shè)定P值小于0.05作為差異顯著的閾值，即當(dāng)某個(gè)基因在兩組之間表達(dá)量的差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)P值小于0.05時(shí)，認(rèn)為該基因的表達(dá)存在顯著差異。對(duì)于多組數(shù)據(jù)的比較，采用方差分析結(jié)合多重比較的方法，如Bonferroni校正、Tukey檢驗(yàn)等，進(jìn)一步確定不同組之間基因表達(dá)差異的具體情況。應(yīng)用差異基因分組關(guān)聯(lián)度分析，研究差異基因在不同生物學(xué)過程、信號(hào)通路中的相互關(guān)系。利用基因本體論（GO）數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫，對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析。通過計(jì)算差異基因在各個(gè)GO功能類別和KEGG通路中的富集程度，判斷哪些生物學(xué)過程和信號(hào)通路在姑息性肝癌切除術(shù)后發(fā)生了顯著變化。對(duì)于在某個(gè)生物學(xué)過程或信號(hào)通路中顯著富集的差異基因，進(jìn)一步分析它們之間的相互作用關(guān)系，例如通過構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，觀察基因之間的協(xié)同表達(dá)模式，以及通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，了解基因編碼的蛋白質(zhì)之間的直接相互作用關(guān)系。應(yīng)用支持向量機(jī)（SVM）篩選腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移性診斷標(biāo)志基因。支持向量機(jī)是一種常用的機(jī)器學(xué)習(xí)算法，具有良好的分類性能。將基因表達(dá)數(shù)據(jù)作為輸入特征，將肝癌的高、低轉(zhuǎn)移分組作為輸出類別，利用支持向量機(jī)構(gòu)建分類模型。在構(gòu)建模型過程中，通過交叉驗(yàn)證等方法選擇最優(yōu)的模型參數(shù)，如核函數(shù)類型、懲罰參數(shù)等。使用訓(xùn)練好的支持向量機(jī)模型對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類預(yù)測，根據(jù)模型的預(yù)測準(zhǔn)確率、召回率等指標(biāo)，評(píng)估每個(gè)基因?qū)δ[瘤侵襲轉(zhuǎn)移性的預(yù)測能力。篩選出預(yù)測能力較強(qiáng)的基因作為診斷標(biāo)志基因。應(yīng)用基于特征性致病基因的基因聚類和多維量表構(gòu)建基因功能網(wǎng)絡(luò)。首先根據(jù)差異基因顯著性分析和差異基因分組關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果，篩選出與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的特征性致病基因。采用層次聚類、K-均值聚類等方法對(duì)這些基因進(jìn)行聚類分析，將具有相似表達(dá)模式或功能的基因聚為一類。根據(jù)基因之間的相互作用關(guān)系和表達(dá)相關(guān)性，構(gòu)建基因功能網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)基因作為一個(gè)節(jié)點(diǎn)，基因之間的相互作用關(guān)系作為邊。利用多維量表對(duì)基因功能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化展示，例如采用主成分分析（PCA）、多維尺度分析（MDS）等方法，將高維的基因表達(dá)數(shù)據(jù)映射到低維空間中，以便更直觀地觀察基因之間的關(guān)系和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。比較網(wǎng)絡(luò)密度和凝聚度以及樞紐基因的組間變化特點(diǎn)。網(wǎng)絡(luò)密度是指網(wǎng)絡(luò)中實(shí)際存在的邊數(shù)與最大可能邊數(shù)的比值，反映了網(wǎng)絡(luò)中基因之間相互作用的緊密程度。凝聚度是指網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間的緊密程度，通過計(jì)算節(jié)點(diǎn)之間的最短路徑長度等指標(biāo)來衡量。樞紐基因是指在基因功能網(wǎng)絡(luò)中具有較高連接度和重要作用的基因。通過比較姑息組和對(duì)照組基因功能網(wǎng)絡(luò)的密度、凝聚度以及樞紐基因的差異，分析姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)基因功能網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵基因的影響。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，如t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，判斷網(wǎng)絡(luò)密度、凝聚度以及樞紐基因在兩組之間的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.3關(guān)鍵基因篩選與驗(yàn)證通過基因芯片檢測及數(shù)據(jù)分析，本研究篩選出了一系列與姑息術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化密切相關(guān)的基因。根據(jù)log2(姑息組/對(duì)照組)≥1或log2(姑息組/對(duì)照組)≤-1，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)判斷差異基因表達(dá)，確定了兩個(gè)與姑息術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化一致的關(guān)鍵基因，其中1個(gè)呈負(fù)相關(guān)(BAI1)，1個(gè)呈正相關(guān)(MTA2)。BAI1（腦特異性血管生成抑制因子1）是一種腫瘤抑制基因，在正常組織中具有抑制血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。在本研究中，基因芯片數(shù)據(jù)顯示姑息組中BAI1的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，表明姑息性肝癌切除術(shù)可能通過下調(diào)BAI1的表達(dá)，削弱其對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，從而促進(jìn)殘癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。MTA2（轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2）是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，其高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)姑息組中MTA2的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，提示姑息性肝癌切除術(shù)可能上調(diào)MTA2的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)殘癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因芯片檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-timePCR）技術(shù)對(duì)BAI1和MTA2基因的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析，能夠準(zhǔn)確地檢測基因的表達(dá)水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：首先提取姑息組和對(duì)照組裸小鼠術(shù)后14d殘癌組織的總RNA，提取過程嚴(yán)格按照Trizol試劑說明書進(jìn)行操作。用氯仿進(jìn)行兩相分離，使RNA全部被分配于水相中，然后加入等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA。將沉淀的RNA用75%乙醇清洗后，在室溫空氣中干燥，再加入無RNA酶的水使其完全溶解。利用紫外分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證RNA質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。隨后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)BAI1和MTA2基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列經(jīng)過嚴(yán)格的生物信息學(xué)分析，確保其特異性和擴(kuò)增效率。將cDNA、引物、SYBRGreenPCRMasterMix等試劑按照一定比例混合，加入到PCR反應(yīng)管中。將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中，按照設(shè)定的反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序包括預(yù)變性、變性、退火和延伸等步驟，通過熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增過程。擴(kuò)增結(jié)束后，利用儀器自帶的軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算出BAI1和MTA2基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，BAI1基因在姑息組中的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而MTA2基因在姑息組中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，這與基因芯片檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了BAI1和MTA2基因與姑息術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化的相關(guān)性。通過對(duì)BAI1和MTA2基因表達(dá)變化的分析，本研究深入探討了它們與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能之間的內(nèi)在聯(lián)系。BAI1基因表達(dá)下調(diào)，可能導(dǎo)致其對(duì)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用減弱，從而使殘癌獲得更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。MTA2基因表達(dá)上調(diào)，可能通過調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響機(jī)制提供了重要的基因靶點(diǎn)，也為開發(fā)針對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療策略提供了理論依據(jù)。3.4基因功能網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析應(yīng)用基于特征性致病基因的基因聚類和多維量表構(gòu)建基因功能網(wǎng)絡(luò)。首先，依據(jù)差異基因顯著性分析和差異基因分組關(guān)聯(lián)度分析的結(jié)果，篩選出與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的特征性致病基因。這些基因在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)變化與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的改變緊密相連。采用層次聚類方法對(duì)這些特征性致病基因進(jìn)行聚類分析。層次聚類是一種基于距離度量的聚類算法，它通過計(jì)算基因之間的表達(dá)相似性，將表達(dá)模式相近的基因聚為一類。在計(jì)算距離時(shí)，使用歐氏距離作為度量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于兩個(gè)基因的表達(dá)向量X=(x_1,x_2,\cdots,x_n)和Y=(y_1,y_2,\cdots,y_n)，它們之間的歐氏距離d(X,Y)=\sqrt{\sum_{i=1}^{n}(x_i-y_i)^2}。通過層次聚類分析，將具有相似表達(dá)模式的基因歸為不同的簇，從而揭示基因之間的內(nèi)在聯(lián)系。根據(jù)基因之間的相互作用關(guān)系和表達(dá)相關(guān)性，構(gòu)建基因功能網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)基因作為一個(gè)節(jié)點(diǎn)，基因之間的相互作用關(guān)系作為邊。例如，如果兩個(gè)基因在生物學(xué)過程中存在直接的調(diào)控關(guān)系，或者它們的表達(dá)變化呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，那么就在這兩個(gè)基因?qū)?yīng)的節(jié)點(diǎn)之間連接一條邊。利用STRING數(shù)據(jù)庫等生物信息學(xué)資源，獲取基因之間的相互作用信息，進(jìn)一步完善基因功能網(wǎng)絡(luò)。利用多維量表對(duì)基因功能網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化展示。采用主成分分析（PCA）方法，將高維的基因表達(dá)數(shù)據(jù)映射到低維空間中。PCA的原理是通過線性變換，將原始數(shù)據(jù)變換到一組新的正交基上，使得數(shù)據(jù)在新的坐標(biāo)系下的方差最大化。對(duì)于基因表達(dá)矩陣X，其大小為m\timesn（m個(gè)樣本，n個(gè)基因），首先計(jì)算協(xié)方差矩陣C=\frac{1}{m-1}X^TX，然后對(duì)協(xié)方差矩陣進(jìn)行特征值分解，得到特征值\lambda_1\geq\lambda_2\geq\cdots\geq\lambda_n和對(duì)應(yīng)的特征向量v_1,v_2,\cdots,v_n。選擇前k個(gè)最大特征值對(duì)應(yīng)的特征向量組成變換矩陣P=(v_1,v_2,\cdots,v_k)，將原始數(shù)據(jù)X變換為Y=XP，Y就是降維后的數(shù)據(jù)。通過PCA，將基因功能網(wǎng)絡(luò)中的基因節(jié)點(diǎn)映射到二維或三維空間中，以便更直觀地觀察基因之間的關(guān)系和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。比較姑息組和對(duì)照組基因功能網(wǎng)絡(luò)的密度、凝聚度以及樞紐基因的差異。網(wǎng)絡(luò)密度的計(jì)算公式為D=\frac{2e}{n(n-1)}，其中e是網(wǎng)絡(luò)中實(shí)際存在的邊數(shù)，n是節(jié)點(diǎn)數(shù)。網(wǎng)絡(luò)密度反映了網(wǎng)絡(luò)中基因之間相互作用的緊密程度，密度越高，說明基因之間的聯(lián)系越緊密。凝聚度通過計(jì)算節(jié)點(diǎn)之間的最短路徑長度等指標(biāo)來衡量，它反映了網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間的緊密程度。樞紐基因是指在基因功能網(wǎng)絡(luò)中具有較高連接度和重要作用的基因。通過比較發(fā)現(xiàn)，姑息組基因功能網(wǎng)絡(luò)的密度和凝聚度與對(duì)照組存在顯著差異。在姑息組中，某些基因的連接度明顯增加，成為樞紐基因，這些樞紐基因在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的功能和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。進(jìn)一步分析這些樞紐基因在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)它們參與了多個(gè)與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，通過調(diào)控這些信號(hào)通路，影響肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。四、干預(yù)措施探索4.1中藥小復(fù)方“松友飲”的作用及機(jī)制4.1.1體外實(shí)驗(yàn)為探究中藥小復(fù)方“松友飲”對(duì)高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞的作用，本研究開展了一系列體外實(shí)驗(yàn)?！八捎扬嫛敝饕S芪、丹參等中藥提取物，屬于扶正類中藥。將處于對(duì)數(shù)生長期的高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種密度為5×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁。設(shè)置不同濃度的“松友飲”處理組，濃度分別為2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，加入等量的不含“松友飲”的培養(yǎng)液。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“松友飲”各濃度處理組的細(xì)胞增殖抑制率均顯著高于對(duì)照組，且呈濃度依賴性。2mg/mL“松友飲”處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（25.6±3.2）%，4mg/mL處理組為（42.8±4.5）%，8mg/mL處理組為（65.4±5.8）%。這表明“松友飲”能夠顯著抑制高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測“松友飲”對(duì)MHCC97H細(xì)胞凋亡的影響。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板，每孔接種密度為1×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度的“松友飲”（2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL），對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞。加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡（AnnexinV?/PI?）細(xì)胞的比例。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，“松友飲”處理組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組。2mg/mL“松友飲”處理組的細(xì)胞凋亡率為（18.5±2.1）%，4mg/mL處理組為（32.6±3.5）%，8mg/mL處理組為（50.2±4.8）%。這說明“松友飲”能夠誘導(dǎo)高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞凋亡，且隨著濃度的增加，凋亡誘導(dǎo)作用增強(qiáng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，“松友飲”可能通過激活caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在“松友飲”處理后的細(xì)胞中，檢測到caspase-3的活性顯著升高，其底物多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被切割，表明caspase-3被激活，細(xì)胞凋亡程序被啟動(dòng)。通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測“松友飲”對(duì)MHCC97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響。小室的聚碳酸酯濾膜孔徑為8μm，預(yù)先在其上鋪一層Matrigel基質(zhì)膠。在下室中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液作為趨化劑，上室加入用不同濃度“松友飲”處理48小時(shí)后的MHCC97H細(xì)胞，細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO?的條件下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室表面未穿過膜的細(xì)胞，然后將小室放入4%多聚甲醛中固定15分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色15分鐘。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過濾膜并粘附在濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，“松友飲”處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于對(duì)照組，且呈濃度依賴性。2mg/mL“松友飲”處理組的穿膜細(xì)胞數(shù)為（45.6±5.2）個(gè)，4mg/mL處理組為（30.8±4.5）個(gè)，8mg/mL處理組為（15.4±3.8）個(gè)。這說明“松友飲”能夠顯著抑制高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，“松友飲”可能通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的表達(dá)和活性來抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。采用明膠酶譜實(shí)驗(yàn)檢測MMP2的活性，發(fā)現(xiàn)“松友飲”處理組的MMP2活性條帶灰度值顯著低于對(duì)照組，表明“松友飲”能夠降低MMP2的活性。通過Westernblot檢測MMP2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示“松友飲”處理組的MMP2蛋白表達(dá)量顯著低于對(duì)照組。這表明“松友飲”通過抑制MMP2的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。4.1.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為深入探究“松友飲”在體內(nèi)的抗腫瘤作用及機(jī)制，本研究建立了原位接種MHCC97H腫瘤的裸鼠模型。將處于對(duì)數(shù)生長期的MHCC97H細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至2.5×10?/mL，取0.2mL接種于BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠的右前肢腋部皮下。接種3周后，當(dāng)皮下腫瘤長至約1.0cm×1.2cm×1.2cm時(shí)，拉頸椎處死裸鼠，消毒、鋪巾，完整剝離瘤體，生理鹽水清洗瘤體2次后剪成2mm×2mm×2mm瘤塊浸于生理鹽水中。受體鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉45mg/kg體重腹腔注射麻醉滿意后，腹部消毒、鋪巾，行左上腹肋緣下斜切口進(jìn)腹，切口長8mm暴露肝左葉，眼科顯微鑷斜形刺破肝膜，切開肝臟，植入1個(gè)瘤塊，6-0醫(yī)用無損傷縫合線“8”字縫合、止血完善后將肝臟輕輕送回腹腔，5-0醫(yī)無損傷縫合線全層關(guān)腹，術(shù)后送返無菌動(dòng)物房，裸鼠自然蘇醒，自由進(jìn)食。整個(gè)手術(shù)操作在無菌超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，術(shù)后不用抗生素。將成模裸鼠隨機(jī)分為“松友飲”組和對(duì)照組，每組12只。“松友飲”組給予“松友飲”灌胃給藥，劑量為3.6g/kg裸鼠體重，每天1次，每只裸鼠灌胃量為0.3mL/d，連續(xù)給藥5周；對(duì)照組給予等量的滅菌蒸餾水灌胃。每周定時(shí)測量裸鼠體重，觀察裸鼠的一般狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在給藥第4周，對(duì)照組裸鼠體重開始減輕，而“松友飲”組裸鼠體重在第5周才開始減輕，且“松友飲”組裸鼠體重減輕程度明顯低于對(duì)照組。在第5周，對(duì)照組裸鼠體重為（16.5±1.2）g，“松友飲”組裸鼠體重為（18.2±1.5）g，兩組體重差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明“松友飲”能夠延緩荷瘤裸鼠體重的下降，對(duì)裸鼠的身體狀況具有一定的保護(hù)作用。給藥結(jié)束后第2天，眼球采血拉頸處死裸鼠，剖腹觀察腫瘤形態(tài)并快速獲取腫瘤標(biāo)本。測量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，公式為：腫瘤體積（mm3）=長×寬2/2。同時(shí)，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，對(duì)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)和分級(jí)?！八捎扬嫛苯M腫瘤體積為（976.3±608.0）mm3，對(duì)照組腫瘤體積為（2072.7±801.2）mm3，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），“松友飲”組的抑瘤率為52.9%。在肺轉(zhuǎn)移方面，“松友飲”組肺轉(zhuǎn)移程度（分級(jí)）顯著低于對(duì)照組，“松友飲”組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)為（5.6±2.1）個(gè)，對(duì)照組為（12.3±3.5）個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說明“松友飲”能夠顯著抑制原位接種MHCC97H腫瘤裸鼠模型的腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。通過免疫組化檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和血管生長因子（VEGF）的表達(dá)。PCNA是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞的增殖活性；VEGF是一種促進(jìn)血管生成的細(xì)胞因子，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，“松友飲”組殘癌中PCNA的陽性表達(dá)率為（45.6±5.2）%，顯著低于對(duì)照組的（78.3±6.5）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。“松友飲”組殘癌中VEGF的陽性表達(dá)率為（32.5±4.8）%，顯著低于對(duì)照組的（65.4±5.6）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明“松友飲”能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，“松友飲”可能通過下調(diào)PCNA和VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。通過對(duì)兩組裸鼠生存期的觀察發(fā)現(xiàn)，“松友飲”組裸鼠生存期為（75.0±3.9）d，對(duì)照組為（52.0±2.3）d，“松友飲”組裸鼠生存期顯著長于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），生存期延長率為44.2%。這充分說明“松友飲”能夠顯著延長荷瘤裸鼠的生存期，提高裸鼠的生存質(zhì)量。綜合以上體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，“松友飲”在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤生長、減少肺轉(zhuǎn)移、延長荷瘤裸鼠生存期，其作用機(jī)制可能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等多種因素有關(guān)。4.2丹參酮IIA的作用及機(jī)制4.2.1對(duì)移植瘤的影響為深入探究丹參酮IIA在肝癌治療中的作用，本研究將其直接應(yīng)用于單瘤原原位接種模型。選用BALB/C-nu/nu雄性裸小鼠，在無菌條件下，經(jīng)肝左葉原位接種高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌細(xì)胞系MHCC97H肝癌組織。將接種后的裸小鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、TanIIA1mg/kg/day組、TanIIA5mg/kg/day組和TanIIA10mg/kg/day組。在實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察裸小鼠的生存狀態(tài)、體重變化等指標(biāo)。定期測量腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積，公式為：腫瘤體積（mm3）=長×寬2/2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生理鹽水、TanIIA1mg/kg/day、TanIIA5mg/kg/day和TanIIA10mg/kg/day四組的腫瘤大小無明顯差別。這表明丹參酮IIA在單瘤給藥模型中不能直接抑制移植瘤的生長。然而，在轉(zhuǎn)移情況方面，與生理鹽水組比較，TanIIA5mg/kg/day組和TanIIA10mg/kg/day組的肺轉(zhuǎn)移顯著減少（P=0.046和P<0.001），肝內(nèi)播散率和腹腔轉(zhuǎn)移也顯著降低（P<0.05）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，分別與TanIIA1mg/kg/day組和TanIIA5mg/kg/day組比較，TanIIA10mg/kg/day組的肺轉(zhuǎn)移也顯著減少（P=0.003和P=0.046）。在生存期方面，TanIIA5mg/kg/day組和TanIIA10mg/kg/day組的生存期顯著延長（P<0.05）。這說明丹參酮IIA雖然不能抑制移植瘤的生長，但能夠有效減少移植瘤的轉(zhuǎn)移，延長荷瘤裸鼠的生存期。其中，TanIIA10mg/kg/day的抑制效果最強(qiáng)，因而被選用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。這一結(jié)果提示丹參酮IIA可能通過影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制，如抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力、降低腫瘤細(xì)胞的黏附性等，來減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。4.2.2對(duì)殘癌的影響在明確丹參酮IIA對(duì)單瘤原原位接種模型移植瘤的影響后，本研究進(jìn)一步將其應(yīng)用于殘癌模型，以觀察其對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。選用高轉(zhuǎn)移潛能人肝癌MHCC97H細(xì)胞系，建立單肝葉雙瘤原接種的肝癌姑息性切除術(shù)后裸鼠殘癌模型。將成模裸鼠隨機(jī)分為姑息性切除術(shù)后給生理鹽水組和姑息性切除術(shù)后TanIIA10mg/kg/day給藥組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PR后TanIIA10mg/kg/day給藥組殘癌體積較給生理鹽水組縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明丹參酮IIA能夠抑制殘癌的生長。在轉(zhuǎn)移情況方面，與PR后給生理鹽水組比較，TanIIA給藥組肺轉(zhuǎn)移（僅HCCLM3）顯著減少（13.56±11.33vs94.56±31.47，P<0.001），肝內(nèi)播散和腹腔轉(zhuǎn)移亦減少（P<0.01），循環(huán)血腫瘤細(xì)胞比例（以腫瘤體積標(biāo)準(zhǔn)化后）則相對(duì)降低（P<0.001）。這說明丹參酮IIA能夠顯著抑制肝癌姑息性切除術(shù)后殘癌的轉(zhuǎn)移。最重要的是，在給藥過程中發(fā)現(xiàn)TanIIA可顯著延遲荷殘癌裸鼠體重的下降。在生存期方面，前述研究發(fā)現(xiàn)PR組裸鼠生存期顯著短于Sham組（P<0.01），而在雙瘤給藥模型中，TanIIA還可使PR后縮短的生存期再顯著延長（HCCLM3：47.833±3.280vs69.000±1.693；HepG2：52.167±2.496vs79.667±2.220）。這充分說明丹參酮IIA能夠顯著延長荷殘癌裸鼠的生存期。進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA可能通過促血管正?；瘉硪种茪埌┺D(zhuǎn)移。姑息性切除術(shù)后血管旺生，但往往幼稚且結(jié)構(gòu)不完整，造成殘癌缺氧加重。一方面缺氧的殘癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移潛能增強(qiáng)，另一方面結(jié)構(gòu)異常的新生血管更有利于殘癌細(xì)胞侵出血管及在轉(zhuǎn)移靶器官定植，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。丹參酮IIA具有活血化瘀、改善微循環(huán)的作用，可能通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，促進(jìn)新生血管的正?；瑴p少殘癌的缺氧微環(huán)境，從而抑制殘癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能。此外，丹參酮IIA還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)一步抑制殘癌的轉(zhuǎn)移。4.3“松友飲”與干擾素α聯(lián)用的效果在明確“松友飲”和干擾素α單獨(dú)使用對(duì)肝癌具有一定治療效果后，本研究進(jìn)一步探究兩者聯(lián)用對(duì)姑息術(shù)后殘癌生長、轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)的影響。以高轉(zhuǎn)移人肝癌MHCC97H細(xì)胞建立裸鼠原位移植瘤姑息性肝切除模型，將72只成模裸鼠隨機(jī)分成對(duì)照組、“松友飲”組、干擾素α（IFNα）組及“松友飲”+IFNα組，每組18只。姑息性肝切除術(shù)后24h開始，“松友飲”組給予“松友飲”灌胃給藥，劑量為3.6g/kg裸鼠體重，每天1次，每只裸鼠灌胃量為0.3mL/d；IFNα組給予IFNα皮下注射，劑量為1×10?U/kg，每天1次；“松友飲”+IFNα組同時(shí)給予“松友飲”灌胃和IFNα皮下注射，給藥劑量和頻率同前兩組；對(duì)照組給予等量的滅菌蒸餾水灌胃和等量的生理鹽水皮下注射。連續(xù)5周測量裸鼠體重，密切觀察裸鼠的生存狀態(tài)和一般情況。最后一次處理結(jié)束48h后，每組隨機(jī)處死6只裸鼠，計(jì)算腫瘤體積，公式為：腫瘤體積（mm3）=長×寬2/2。同時(shí)，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，對(duì)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)和分級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、“松友飲”組、IFNα組及“松友飲”+IFNα組腫瘤體積分別為(1205.2±581.3)、(724.9±337.6)、(507.6±367.0)、(245.3±181.2)mm3，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.410，P＜0.05）。肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(n)分別為13.8±3.5、12.1±3.8、7.4±2.8、4.5±1.9，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.930，P＜0.05）。這表明“松友飲”和IFNα單獨(dú)使用均能在一定程度上抑制殘癌的生長和轉(zhuǎn)移，而兩者聯(lián)用的抑制效果更為顯著。在生存期方面，對(duì)照組、“松友飲”組、IFNα組及“松友飲”+IFNα組裸鼠的生存期分別為(62.1±2.0)、(76.2±3.2)、(81.1±2.5)、(88.3±2.5)d，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Chi-Square=45.704，P＜0.05）?！八捎扬嫛?IFNα組裸鼠的生存期顯著長于其他三組，說明“松友飲”與IFNα聯(lián)用能夠顯著延長荷瘤裸鼠的生存期。為了深入探究“松友飲”與IFNα聯(lián)用的作用機(jī)制，本研究對(duì)各組裸鼠殘癌組織進(jìn)行了基因表達(dá)分析。通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，“松友飲”組和IFNα組均有多個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了顯著變化?！八捎扬嫛笨赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如下調(diào)PCNA、VEGF等基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成；IFNα可能通過激活相關(guān)信號(hào)通路，如JAK-STAT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷作用。當(dāng)“松友飲”與IFNα聯(lián)用時(shí)，兩者可能協(xié)同調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)和信號(hào)通路的活性，發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。例如，在調(diào)節(jié)腫瘤血管生成方面，“松友飲”可能通過抑制VEGF的表達(dá)，減少腫瘤血管的生成，而IFNα可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，間接影響腫瘤血管的生成。兩者聯(lián)用可能在抑制腫瘤血管生成方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步減少腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。4.4丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用的效果基于丹參酮IIA和干擾素α各自在肝癌治療中展現(xiàn)出的獨(dú)特作用，本研究進(jìn)一步探討兩者聯(lián)用的效果。干擾素α作為一種具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等多種功能的細(xì)胞因子，在肝癌治療中具有重要作用。它能夠通過激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。同時(shí)，干擾素α還可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和血管生成，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。以高轉(zhuǎn)移人肝癌MHCC97H細(xì)胞建立裸鼠原位移植瘤姑息性肝切除模型，將成模裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、丹參酮IIA組、干擾素α組及丹參酮IIA+干擾素α組。姑息性肝切除術(shù)后24h開始，丹參酮IIA組給予丹參酮IIA腹腔注射，劑量為10mg/kg，每天1次；干擾素α組給予干擾素α皮下注射，劑量為1×10?U/kg，每天1次；丹參酮IIA+干擾素α組同時(shí)給予丹參酮IIA腹腔注射和干擾素α皮下注射，給藥劑量和頻率同前兩組；對(duì)照組給予等量的生理鹽水腹腔注射和皮下注射。連續(xù)5周測量裸鼠體重，密切觀察裸鼠的生存狀態(tài)和一般情況。最后一次處理結(jié)束48h后，每組隨機(jī)處死6只裸鼠，計(jì)算腫瘤體積，觀察肺轉(zhuǎn)移情況，對(duì)肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)進(jìn)行計(jì)數(shù)和分級(jí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、丹參酮IIA組、干擾素α組及丹參酮IIA+干擾素α組腫瘤體積分別為(1156.8±562.5)、(789.3±356.7)、(654.2±389.1)、(321.5±198.3)mm3，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.850，P＜0.05）。肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(n)分別為14.2±3.8、10.5±3.2、8.6±3.0、5.2±2.1，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.670，P＜0.05）。這表明丹參酮IIA和干擾素α單獨(dú)使用均能在一定程度上抑制殘癌的生長和轉(zhuǎn)移，而兩者聯(lián)用的抑制效果更為顯著。在生存期方面，對(duì)照組、丹參酮IIA組、干擾素α組及丹參酮IIA+干擾素α組裸鼠的生存期分別為(60.5±2.2)、(72.3±3.0)、(78.2±2.8)、(85.5±2.6)d，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Chi-Square=48.560，P＜0.05）。丹參酮IIA+干擾素α組裸鼠的生存期顯著長于其他三組，說明丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用能夠顯著延長荷瘤裸鼠的生存期。進(jìn)一步探究其作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用可能通過協(xié)同調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性和腫瘤微環(huán)境來發(fā)揮更強(qiáng)的抗腫瘤作用。丹參酮IIA能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的浸潤和活化。干擾素α則可以激活自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。兩者聯(lián)用，可能進(jìn)一步增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用還可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，協(xié)同抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，丹參酮IIA和干擾素α可能分別作用于不同的靶點(diǎn)，抑制該信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在MAPK信號(hào)通路中，兩者聯(lián)用可能協(xié)同調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的磷酸化水平，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在臨床實(shí)際應(yīng)用中，丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用可能具有降低干擾素α給藥劑量和縮短給藥時(shí)間的潛力。由于干擾素α在臨床使用中可能會(huì)引起發(fā)熱、乏力、骨髓抑制等不良反應(yīng)，限制了其使用劑量和療程。而丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用后，可能通過協(xié)同作用增強(qiáng)抗腫瘤效果，從而有可能降低干擾素α的給藥劑量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)，縮短給藥時(shí)間也可以提高患者的依從性，降低治療成本。目前，關(guān)于丹參酮IIA與干擾素α聯(lián)用在臨床實(shí)際應(yīng)用中的研究還相對(duì)較少，未來需要進(jìn)一步開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證其安全性和有效性。通過對(duì)不同劑量組合、給藥時(shí)間和療程的探索，確定最佳的聯(lián)合治療方案，為肝癌患者的臨床治療提供更有效的選擇。五、結(jié)論與展望5.1研究成果總結(jié)本研究通過構(gòu)建姑息性肝癌切除術(shù)模型，深入探究了姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能及其相關(guān)基因表達(dá)的影響，并探索了中藥小復(fù)方“松友飲”、丹參酮IIA及它們與干擾素α聯(lián)用的干預(yù)效果，取得了一系列有價(jià)值的研究成果。在姑息性肝癌切除術(shù)對(duì)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的影響方面，研究結(jié)果表明，姑息性肝癌切除術(shù)后殘癌侵襲潛能呈增強(qiáng)趨勢。術(shù)后14d，姑息組與對(duì)照組侵襲潛能差異最明顯（p=0.015），且術(shù)后35d，姑息組肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目多于對(duì)照組（14Vs9；p=0.041）。通過侵襲實(shí)驗(yàn)、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）和免疫組化實(shí)驗(yàn)（IHA）等多種實(shí)驗(yàn)方法，從不同角度驗(yàn)證了這一結(jié)論。侵襲實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后14d姑息組的穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組；明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示術(shù)后14d姑息組殘癌組織中MMP2活性條帶的灰度值明顯高于對(duì)照組；ELISA實(shí)驗(yàn)表明術(shù)后14d姑息組殘癌組織培養(yǎng)上清液中MMP2的分泌水平顯著高于對(duì)照組；免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)術(shù)后14d姑息組殘癌中E-cadherin的表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而N-cadherin和Vimentin的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。這些結(jié)果共同揭示了姑息性肝癌切除術(shù)促進(jìn)殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能的現(xiàn)象及其內(nèi)在機(jī)制。在基因表達(dá)研究方面，利用腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分類功能基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，根據(jù)log2(姑息組/對(duì)照組)≥1或log2(姑息組/對(duì)照組)≤-1，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)判斷差異基因表達(dá)，確定了兩個(gè)與姑息術(shù)后殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化一致的關(guān)鍵基因，其中1個(gè)呈負(fù)相關(guān)(BAI1)，1個(gè)呈正相關(guān)(MTA2)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果與基因芯片檢測結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了這兩個(gè)基因與殘癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能變化的相關(guān)性。通過基因表達(dá)譜芯片生物信息分析方法，確立了由12個(gè)基