威靈仙皂苷誘導(dǎo)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞凋亡的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）作為一種特殊類型的急性髓系白血病，在白血病中占有獨(dú)特的地位。其發(fā)病機(jī)制與染色體易位密切相關(guān)，常見(jiàn)的是t(15;17)染色體易位，這一易位導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞白血病基因（PML）與維甲酸受體α基因（RARα）融合，形成PML-RARα融合基因。該融合基因編碼的融合蛋白會(huì)干擾正常的細(xì)胞分化和凋亡過(guò)程，使得早幼粒細(xì)胞異常增殖并阻滯在分化的早期階段，進(jìn)而引發(fā)急性早幼粒細(xì)胞白血病。APL在白血病的發(fā)病率中雖不占首位，但對(duì)患者健康有著極大的威脅。在臨床上，APL具有一些典型且兇險(xiǎn)的表現(xiàn)。部分患者起病急驟，常伴有高熱癥狀，體溫可高達(dá)39℃甚至更高，發(fā)熱原因多與白血病細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)以及患者免疫力下降后合并感染有關(guān)。出血傾向也是APL患者常見(jiàn)且嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)之一，輕者可能出現(xiàn)皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑，重者則可能發(fā)生顱內(nèi)出血等危及生命的情況，這主要是由于APL細(xì)胞釋放促凝物質(zhì)，導(dǎo)致凝血功能紊亂，引發(fā)彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）。貧血癥狀也較為常見(jiàn)，患者會(huì)出現(xiàn)面色蒼白、頭暈、乏力等表現(xiàn)，活動(dòng)后心悸、氣短癥狀加劇，這是因?yàn)榘籽〖?xì)胞大量增殖，抑制了正常造血干細(xì)胞的功能，使得紅細(xì)胞生成減少。目前，APL的治療主要以全反式維甲酸（ATRA）聯(lián)合蒽環(huán)類藥物為主的誘導(dǎo)分化治療方案。ATRA能夠特異性地與PML-RARα融合蛋白結(jié)合，促使白血病細(xì)胞分化成熟，從而達(dá)到治療目的。蒽環(huán)類藥物則通過(guò)抑制DNA和RNA的合成，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，進(jìn)一步清除白血病細(xì)胞。這種聯(lián)合治療方案取得了顯著的療效，完全緩解率可達(dá)90%左右，多數(shù)患者在規(guī)范治療后能夠達(dá)到完全治愈，5年生存率高，總生存率可達(dá)80%。然而，該治療方案并非完美無(wú)缺。藥物的不良反應(yīng)給患者帶來(lái)了諸多痛苦，如ATRA可能導(dǎo)致維甲酸綜合征，患者會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、體重增加、胸腔積液等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可危及生命；蒽環(huán)類藥物則可能引起心臟毒性，長(zhǎng)期使用可能導(dǎo)致心肌損傷、心力衰竭等，還可能引發(fā)骨髓抑制，使患者白細(xì)胞、血小板等減少，增加感染和出血的風(fēng)險(xiǎn)。部分患者對(duì)藥物存在耐藥性，使得治療效果大打折扣，這些患者在治療過(guò)程中病情容易復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后的治療難度顯著增加，預(yù)后往往較差。在這樣的背景下，尋找新的治療藥物或輔助治療手段成為了白血病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。威靈仙作為一種常用的中藥材，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用。其味辛、咸，性溫，歸膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、消骨鯁等功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、肢體麻木、筋脈拘攣等病癥。威靈仙總皂苷是威靈仙的主要活性成分之一，近年來(lái)在腫瘤治療領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理作用，如免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力；抗疲勞作用，可提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力，改善患者的身體狀態(tài)；心血管保護(hù)作用，對(duì)心血管系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用，有利于維持患者在治療期間的心血管健康。尤其在抗腫瘤方面，威靈仙總皂苷展現(xiàn)出了獨(dú)特的潛力，多項(xiàng)研究表明其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使肝癌細(xì)胞阻滯在特定時(shí)期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。在乳腺癌細(xì)胞的研究中，威靈仙總皂苷也表現(xiàn)出了抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力，能夠降低乳腺癌細(xì)胞的惡性程度。對(duì)于白血病細(xì)胞，已有研究初步探索了威靈仙總皂苷對(duì)人髓系白血病細(xì)胞株HL-60的作用，發(fā)現(xiàn)其能抑制該細(xì)胞的生長(zhǎng)，且呈濃度和時(shí)間的依賴性，作用后細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核高度濃縮聚集，甚至斷裂形成凋亡小體。這些前期研究為威靈仙總皂苷應(yīng)用于白血病治療提供了一定的理論基礎(chǔ)和研究思路。因此，深入研究威靈仙皂苷對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞的作用及其機(jī)制，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為APL的治療提供新的策略和藥物選擇。1.2研究目的與問(wèn)題提出本研究旨在深入探究威靈仙皂苷對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞的作用，明確其是否能誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，并揭示其潛在的作用機(jī)制，為急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療提供新的藥物靶點(diǎn)和理論依據(jù)。具體而言，本研究擬解決以下幾個(gè)關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題：威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及凋亡誘導(dǎo)作用：威靈仙皂苷能否抑制NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)？其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用是否呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性？威靈仙皂苷是否能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡？若能誘導(dǎo)凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的效果與傳統(tǒng)治療藥物如三氧化二砷相比如何？威靈仙皂苷誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的機(jī)制：威靈仙皂苷誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡是通過(guò)何種信號(hào)通路或分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)的？它是否會(huì)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡？威靈仙皂苷是否會(huì)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等的表達(dá)產(chǎn)生影響，以調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程？威靈仙皂苷對(duì)PML-RARα融合基因及相關(guān)蛋白的影響：在急性早幼粒細(xì)胞白血病中，PML-RARα融合基因起著關(guān)鍵作用。威靈仙皂苷是否會(huì)影響PML-RARα融合基因的mRNA表達(dá)水平？威靈仙皂苷對(duì)PML-RARα融合蛋白的表達(dá)及功能是否有影響？若有影響，其作用機(jī)制是什么？對(duì)這些問(wèn)題的深入研究，將有助于全面了解威靈仙皂苷在急性早幼粒細(xì)胞白血病治療中的潛在價(jià)值，為后續(xù)的臨床前研究和藥物開(kāi)發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。1.3研究創(chuàng)新點(diǎn)與意義1.3.1創(chuàng)新點(diǎn)多維度作用機(jī)制解析：本研究從細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期以及關(guān)鍵基因和蛋白表達(dá)等多個(gè)維度，全面深入地探究威靈仙皂苷對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞的作用機(jī)制。與以往研究相比，不再局限于單一指標(biāo)或簡(jiǎn)單機(jī)制的探討，而是通過(guò)整合多方面數(shù)據(jù)，構(gòu)建更為完整的作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。在研究細(xì)胞凋亡時(shí)，不僅檢測(cè)凋亡率，還深入分析凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，以及這些變化與細(xì)胞周期阻滯之間的關(guān)聯(lián)；在研究對(duì)PML-RARα融合基因及蛋白的影響時(shí)，結(jié)合mRNA表達(dá)水平和蛋白功能變化進(jìn)行綜合分析，從而更全面地揭示威靈仙皂苷的作用本質(zhì)。對(duì)比研究：將威靈仙皂苷與傳統(tǒng)的急性早幼粒細(xì)胞白血病治療藥物三氧化二砷進(jìn)行對(duì)比研究，明確威靈仙皂苷在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面的優(yōu)勢(shì)與不足。這種對(duì)比研究有助于客觀評(píng)價(jià)威靈仙皂苷的治療潛力，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供更具參考價(jià)值的數(shù)據(jù)，也為臨床治療方案的優(yōu)化提供新的思路。通過(guò)對(duì)比兩種藥物對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、凋亡率以及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，能夠清晰地了解威靈仙皂苷的獨(dú)特作用特點(diǎn)，為后續(xù)研究提供明確的方向。潛在新靶點(diǎn)探索：基于對(duì)威靈仙皂苷作用機(jī)制的深入研究，有望發(fā)現(xiàn)急性早幼粒細(xì)胞白血病治療的新靶點(diǎn)。通過(guò)分析威靈仙皂苷作用后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路和關(guān)鍵分子的變化，尋找可能被其調(diào)控且與白血病發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的新靶點(diǎn)，為白血病的治療提供全新的藥物研發(fā)方向。如果發(fā)現(xiàn)威靈仙皂苷能夠特異性地調(diào)節(jié)某個(gè)在白血病細(xì)胞中異常表達(dá)的蛋白或信號(hào)通路，那么這個(gè)蛋白或信號(hào)通路就有可能成為新的治療靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)更有效的治療藥物奠定基礎(chǔ)。1.3.2研究意義理論意義：本研究有助于豐富對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制和治療機(jī)制的認(rèn)識(shí)。通過(guò)揭示威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的作用機(jī)制，進(jìn)一步完善白血病細(xì)胞生物學(xué)的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。對(duì)威靈仙皂苷作用機(jī)制的研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些新的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑或分子調(diào)控機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)將加深我們對(duì)白血病發(fā)病和治療過(guò)程中細(xì)胞生物學(xué)變化的理解，推動(dòng)該領(lǐng)域的理論發(fā)展。此外，本研究還將為中藥抗腫瘤機(jī)制的研究提供新的范例，拓展中藥在腫瘤治療領(lǐng)域的研究思路和方法。威靈仙作為一種傳統(tǒng)中藥材，其皂苷成分在抗腫瘤方面的作用機(jī)制研究，將為其他中藥的研究提供借鑒，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化研究的深入開(kāi)展。實(shí)際意義：威靈仙皂苷具有成為急性早幼粒細(xì)胞白血病新型治療藥物或輔助治療藥物的潛力。如果威靈仙皂苷被證明具有顯著的抗白血病活性且不良反應(yīng)較小，那么它可能為臨床治療提供新的選擇，尤其是對(duì)于那些對(duì)傳統(tǒng)治療藥物耐藥或不耐受的患者。這將有助于提高急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療效果，降低患者的復(fù)發(fā)率和死亡率，改善患者的生存質(zhì)量。通過(guò)開(kāi)發(fā)威靈仙皂苷這一新型藥物，還可以減少對(duì)傳統(tǒng)化療藥物的依賴，降低藥物不良反應(yīng)對(duì)患者身體的損害，提高患者的生活質(zhì)量。此外，對(duì)威靈仙皂苷的研究也有助于推動(dòng)中藥資源的開(kāi)發(fā)和利用，促進(jìn)中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。威靈仙作為一種常見(jiàn)的中藥材，其資源豐富，如果能夠?qū)⑵溟_(kāi)發(fā)成有效的治療藥物，不僅可以為患者帶來(lái)福音，還可以創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1急性早幼粒細(xì)胞白血病與NB4細(xì)胞2.1.1急性早幼粒細(xì)胞白血病特征急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）作為急性髓系白血病中的一種特殊亞型，具有獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制。其發(fā)病主要與染色體異常密切相關(guān)，約95%的APL患者存在t(15;17)(q22;q12)染色體易位，這一易位使得15號(hào)染色體上的早幼粒細(xì)胞白血病基因（PML）與17號(hào)染色體上的維甲酸受體α基因（RARα）發(fā)生融合，形成PML-RARα融合基因。該融合基因編碼的融合蛋白會(huì)干擾正常的細(xì)胞分化和凋亡過(guò)程，具體而言，PML-RARα融合蛋白會(huì)與一些轉(zhuǎn)錄共抑制因子結(jié)合，形成異常的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，阻止早幼粒細(xì)胞向成熟粒細(xì)胞分化，導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞在骨髓中異常增殖并大量積聚，從而引發(fā)白血病。除了t(15;17)染色體易位外，還有少數(shù)APL患者存在變異型染色體易位，如t(11;17)(q23;q12)、t(5;17)(q35;q12)等，這些變異型易位分別導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞白血病鋅指蛋白（PLZF）-RARα、核仁磷酸蛋白（NPM）-RARα等融合基因的形成，它們同樣通過(guò)干擾正常的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)，參與APL的發(fā)病過(guò)程。APL在臨床上呈現(xiàn)出一系列典型且較為兇險(xiǎn)的癥狀。發(fā)熱是常見(jiàn)癥狀之一，多數(shù)患者起病時(shí)會(huì)出現(xiàn)不同程度的發(fā)熱，體溫可波動(dòng)在38℃-40℃之間，發(fā)熱原因一方面是白血病細(xì)胞本身釋放的致熱物質(zhì)，如腫瘤壞死因子等，刺激機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)中樞；另一方面，患者免疫力低下，容易合并各種感染，如細(xì)菌感染（常見(jiàn)的有肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌等引起的肺部感染、敗血癥等）、真菌感染（如白色念珠菌引起的口腔、肺部感染等），進(jìn)一步加重發(fā)熱癥狀。出血傾向也是APL患者的突出臨床表現(xiàn)，輕者可見(jiàn)皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑，以四肢、軀干較為常見(jiàn)；鼻出血也較為頻繁，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致鼻腔大量出血，難以止血；牙齦出血表現(xiàn)為刷牙或進(jìn)食時(shí)牙齦滲血不止；重者則可能出現(xiàn)顱內(nèi)出血，這是APL患者最嚴(yán)重的出血并發(fā)癥之一，患者可出現(xiàn)頭痛、嘔吐、意識(shí)障礙、肢體偏癱等癥狀，死亡率極高。出血的主要原因是APL細(xì)胞釋放促凝物質(zhì)，如組織因子等，激活外源性凝血途徑，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），消耗大量的凝血因子和血小板，同時(shí)纖溶系統(tǒng)也被激活，進(jìn)一步加重出血傾向。貧血癥狀也貫穿于APL的整個(gè)病程，患者常表現(xiàn)為面色蒼白、頭暈、乏力、活動(dòng)耐力下降等，隨著病情進(jìn)展，貧血癥狀會(huì)逐漸加重，這是由于白血病細(xì)胞在骨髓中大量增殖，抑制了正常造血干細(xì)胞的增殖和分化，使得紅細(xì)胞生成減少。此外，患者還可能出現(xiàn)肝脾腫大，肝臟和脾臟可在肋下觸及，質(zhì)地中等，部分患者還可能伴有胸骨壓痛，這是由于白血病細(xì)胞浸潤(rùn)骨髓，刺激骨膜神經(jīng)引起的。APL若不及時(shí)治療，對(duì)患者的生命健康危害極大?；颊叩纳嫫谕ǔ］^短，在傳統(tǒng)治療方法出現(xiàn)之前，APL患者的中位生存期僅為3-6個(gè)月，多數(shù)患者會(huì)因嚴(yán)重的出血、感染等并發(fā)癥而死亡。即使在現(xiàn)代治療手段不斷進(jìn)步的今天，仍有部分患者面臨治療失敗、復(fù)發(fā)等問(wèn)題。復(fù)發(fā)后的APL患者治療難度顯著增加，預(yù)后往往較差，5年生存率明顯降低。部分患者在治療過(guò)程中還會(huì)出現(xiàn)藥物不良反應(yīng)，如全反式維甲酸（ATRA）治療可能引發(fā)維甲酸綜合征，表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、體重增加、胸腔積液等，嚴(yán)重時(shí)可危及生命；蒽環(huán)類藥物可能導(dǎo)致心臟毒性，長(zhǎng)期使用可能引起心肌損傷、心力衰竭等，這些不良反應(yīng)不僅影響患者的治療效果，還會(huì)降低患者的生活質(zhì)量。2.1.2NB4細(xì)胞特性與應(yīng)用NB4細(xì)胞是一種人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系，來(lái)源于一位23歲女性急性早幼粒細(xì)胞白血病患者的骨髓，于1989年在其第二次復(fù)發(fā)時(shí)成功建立。該細(xì)胞具有APL的特征性染色體易位t(15;17)，這一染色體易位導(dǎo)致PML-RARα融合基因的形成，該融合基因是APL的重要分子標(biāo)志，在NB4細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。從細(xì)胞形態(tài)上看，NB4細(xì)胞呈淋巴母細(xì)胞樣，懸浮生長(zhǎng)。其胞漿較少，使得核質(zhì)比相對(duì)較大，細(xì)胞核形態(tài)較為規(guī)則，核仁通常不明顯。在電子顯微鏡下觀察，NB4細(xì)胞內(nèi)含有少量顆粒，其核質(zhì)比例介于成熟早幼粒細(xì)胞（M3）和胚胎干細(xì)胞（ES）之間。在細(xì)胞表面標(biāo)記方面，NB4細(xì)胞可能表達(dá)一些典型的早幼粒細(xì)胞表面標(biāo)記，如CD13、CD33等，這些表面標(biāo)記在細(xì)胞的識(shí)別、黏附以及信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。NB4細(xì)胞在白血病研究領(lǐng)域具有廣泛且重要的應(yīng)用。由于其具有APL的典型特征，常被用作研究急性早幼粒細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞模型。通過(guò)對(duì)NB4細(xì)胞的研究，可以深入探究PML-RARα融合基因及其編碼的融合蛋白如何干擾正常的細(xì)胞分化和凋亡信號(hào)通路。研究發(fā)現(xiàn)，PML-RARα融合蛋白會(huì)與維甲酸受體（RAR）的配體結(jié)合域結(jié)合，阻止RAR與視黃酸（RA）結(jié)合，從而抑制RAR下游基因的轉(zhuǎn)錄激活，干擾細(xì)胞的正常分化。此外，PML-RARα融合蛋白還會(huì)影響一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)，如Bcl-2家族蛋白等，抑制細(xì)胞凋亡，使得白血病細(xì)胞得以持續(xù)增殖。在白血病治療藥物研發(fā)方面，NB4細(xì)胞也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。眾多研究以NB4細(xì)胞為對(duì)象，評(píng)估新型藥物或治療方法對(duì)白血病細(xì)胞的作用效果。研究威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用、誘導(dǎo)凋亡作用以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，為威靈仙皂苷在白血病治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。在評(píng)估三氧化二砷（ATO）對(duì)NB4細(xì)胞的治療效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，ATO能夠誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與下調(diào)PML-RARα融合蛋白表達(dá)、激活線粒體凋亡途徑等有關(guān)。NB4細(xì)胞還用于研究白血病細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥機(jī)制，為克服白血病耐藥提供思路。研究發(fā)現(xiàn)，NB4細(xì)胞在長(zhǎng)期接觸化療藥物后，可能通過(guò)上調(diào)一些耐藥相關(guān)蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）等，將藥物泵出細(xì)胞外，從而產(chǎn)生耐藥性。2.2威靈仙皂苷概述2.2.1威靈仙皂苷提取與分離威靈仙皂苷的提取方法豐富多樣，每種方法都有其獨(dú)特的原理和特點(diǎn)。溶劑提取法是較為常用的傳統(tǒng)方法之一，其原理是利用相似相溶原理，根據(jù)威靈仙皂苷在不同溶劑中的溶解度差異來(lái)進(jìn)行提取。常用的溶劑有乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑，以及水。在實(shí)際操作中，若以乙醇為溶劑，一般會(huì)選擇一定濃度的乙醇溶液，如70%-95%的乙醇。將威靈仙藥材粉碎后，加入適量的乙醇溶液，在一定溫度下進(jìn)行浸泡或回流提取。浸泡提取時(shí)，需要控制好浸泡時(shí)間，一般為24-48小時(shí)，期間需不時(shí)攪拌，以促進(jìn)皂苷的溶解；回流提取則可提高提取效率，縮短提取時(shí)間，通常回流時(shí)間為2-4小時(shí)。水提法則是利用威靈仙皂苷在水中的溶解性進(jìn)行提取，一般將藥材加水煮沸一定時(shí)間，使皂苷溶解在水中。水提法操作簡(jiǎn)單、成本低，但提取液中雜質(zhì)較多，后續(xù)分離純化難度較大。超聲波輔助提取法是一種較為先進(jìn)的提取技術(shù)，它利用超聲波的空化作用、機(jī)械振動(dòng)等效應(yīng)，加速威靈仙皂苷從藥材細(xì)胞中釋放到提取溶劑中。在超聲波作用下，溶劑分子快速振動(dòng)，對(duì)藥材細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊力，使細(xì)胞破碎，從而提高皂苷的提取率。具體操作時(shí)，將威靈仙藥材與提取溶劑（如乙醇溶液）置于超聲波清洗器中，設(shè)定合適的超聲波功率和提取時(shí)間。一般超聲波功率可在200-600W之間調(diào)節(jié)，提取時(shí)間為30-60分鐘。與傳統(tǒng)溶劑提取法相比，超聲波輔助提取法具有提取時(shí)間短、提取率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)。微波輔助提取法同樣借助微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)威靈仙皂苷的高效提取。微波能夠快速穿透藥材，使藥材內(nèi)部的水分子迅速升溫，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)壓力增大而破裂，促進(jìn)皂苷的溶出。在微波輔助提取過(guò)程中，需將威靈仙藥材與適量的提取溶劑混合后，放入微波反應(yīng)器中，設(shè)置合適的微波功率和提取時(shí)間。微波功率一般在300-800W之間，提取時(shí)間為10-30分鐘。該方法具有提取速度快、選擇性好等優(yōu)勢(shì)。超臨界流體萃取法以超臨界流體（如二氧化碳）為萃取劑，利用其在超臨界狀態(tài)下兼具氣體和液體的特性，即密度接近液體、擴(kuò)散系數(shù)接近氣體、黏度低等，能夠快速滲透到藥材內(nèi)部，溶解威靈仙皂苷。在超臨界狀態(tài)下，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度和壓力，可以改變超臨界流體的溶解能力，從而實(shí)現(xiàn)皂苷的選擇性萃取。該方法的優(yōu)點(diǎn)是提取效率高、產(chǎn)品純度高、無(wú)溶劑殘留，但設(shè)備成本高，對(duì)操作技術(shù)要求也較高。提取得到的威靈仙皂苷粗提物中往往含有多種雜質(zhì)，需要進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。大孔吸附樹(shù)脂法是常用的分離純化方法之一，大孔吸附樹(shù)脂具有大孔結(jié)構(gòu)和較高的比表面積，能夠通過(guò)物理吸附作用選擇性地吸附威靈仙皂苷。其原理是利用皂苷分子與樹(shù)脂表面的吸附位點(diǎn)之間的范德華力、氫鍵等相互作用，將皂苷吸附在樹(shù)脂上，而雜質(zhì)則不被吸附或吸附較弱，從而實(shí)現(xiàn)分離。在實(shí)際操作中，先將威靈仙皂苷粗提物上樣到預(yù)處理好的大孔吸附樹(shù)脂柱上，然后用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫。一般先用低濃度乙醇（如30%-50%）洗脫除去雜質(zhì)，再用高濃度乙醇（如70%-90%）洗脫得到較純的威靈仙皂苷。硅膠柱色譜法利用硅膠作為固定相，根據(jù)威靈仙皂苷與其他成分在硅膠上的吸附和解吸能力差異進(jìn)行分離。硅膠具有較大的比表面積和良好的吸附性能，不同結(jié)構(gòu)的皂苷在硅膠上的吸附強(qiáng)度不同。將威靈仙皂苷粗提物溶解后上樣到硅膠柱上，用合適的洗脫劑（如氯仿-甲醇混合溶劑）進(jìn)行洗脫。隨著洗脫劑的流動(dòng)，不同的皂苷成分會(huì)按照其在硅膠上的吸附和解吸特性依次被洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)分離。高效液相色譜法（HPLC）是一種分離效率高、分析速度快的現(xiàn)代分離技術(shù)，在威靈仙皂苷的分離純化中也有廣泛應(yīng)用。它利用不同皂苷在固定相和流動(dòng)相之間的分配系數(shù)差異進(jìn)行分離。HPLC具有分離效率高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)威靈仙皂苷中多種成分的精細(xì)分離和純化。在威靈仙皂苷的研究中，HPLC不僅可用于分離純化，還常用于對(duì)分離得到的皂苷成分進(jìn)行定性和定量分析。2.2.2威靈仙皂苷結(jié)構(gòu)與性質(zhì)威靈仙皂苷屬于三萜皂苷類化合物，其基本結(jié)構(gòu)由三萜皂苷元與糖基通過(guò)糖苷鍵連接而成。三萜皂苷元是威靈仙皂苷的核心結(jié)構(gòu)部分，其母核通常為五環(huán)三萜，具有多種不同的骨架類型，如齊墩果烷型、烏蘇烷型等。齊墩果烷型三萜皂苷元的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是A/B、B/C、C/D環(huán)均為反式稠合，D/E環(huán)為順式稠合，其C-3位羥基常與糖基結(jié)合形成糖苷鍵。在威靈仙皂苷中，齊墩果烷型皂苷元的C-28位羧基可能會(huì)與糖基形成酯苷鍵。烏蘇烷型三萜皂苷元與齊墩果烷型結(jié)構(gòu)相似，但在C-20位、C-29位和C-30位的甲基位置有所不同，這些結(jié)構(gòu)差異導(dǎo)致了兩種類型皂苷在生物活性和物理化學(xué)性質(zhì)上的差異。糖基部分在威靈仙皂苷中也具有多樣性，常見(jiàn)的糖基有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖等。這些糖基可以通過(guò)1,2-糖苷鍵、1,3-糖苷鍵或1,4-糖苷鍵與三萜皂苷元連接，形成不同的糖苷結(jié)構(gòu)。不同的糖基種類和連接方式會(huì)影響威靈仙皂苷的極性、水溶性以及生物活性。連接多個(gè)葡萄糖基的威靈仙皂苷可能具有較高的水溶性，而含有阿拉伯糖等糖基的皂苷可能在某些生物活性方面表現(xiàn)出獨(dú)特的作用。從物理性質(zhì)上看，威靈仙皂苷通常為白色或淺黃色粉末，這是由于其分子結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基、羧基等極性基團(tuán)，這些極性基團(tuán)使得分子間作用力較強(qiáng)，導(dǎo)致皂苷以粉末狀存在。威靈仙皂苷具有吸濕性，在空氣中容易吸收水分，這是因?yàn)槠浞肿又械臉O性基團(tuán)能夠與水分子形成氫鍵，從而吸附水分。其溶解性與分子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，威靈仙皂苷可溶于水、甲醇、乙醇等極性較強(qiáng)的溶劑。在水中，由于其分子中的極性基團(tuán)與水分子相互作用，形成氫鍵等分子間作用力，使得皂苷能夠溶解。在甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中，威靈仙皂苷同樣能與溶劑分子形成良好的相互作用，從而表現(xiàn)出較好的溶解性。然而，威靈仙皂苷在石油醚、乙醚等非極性溶劑中幾乎不溶，這是因?yàn)榉菢O性溶劑與皂苷分子之間的作用力較弱，無(wú)法克服皂苷分子間的相互作用力，導(dǎo)致皂苷難以溶解。在化學(xué)性質(zhì)方面，威靈仙皂苷具有一定的穩(wěn)定性，但在某些條件下會(huì)發(fā)生分解反應(yīng)。在酸性條件下，糖苷鍵可能會(huì)發(fā)生水解反應(yīng)，使皂苷元與糖基分離。這是因?yàn)樗嵝詶l件下，氫離子能夠進(jìn)攻糖苷鍵中的氧原子，使其質(zhì)子化，從而削弱糖苷鍵的強(qiáng)度，導(dǎo)致水解反應(yīng)的發(fā)生。水解反應(yīng)的速率和程度與酸的種類、濃度以及反應(yīng)溫度等因素有關(guān)。在堿性條件下，威靈仙皂苷也可能發(fā)生一些化學(xué)反應(yīng)，如酯苷鍵的水解等。堿性條件下，氫氧根離子能夠與酯苷鍵中的羰基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致酯苷鍵斷裂。此外，威靈仙皂苷對(duì)熱也有一定的敏感性，在高溫下可能會(huì)發(fā)生分解、異構(gòu)化等反應(yīng)。高溫會(huì)破壞皂苷分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，導(dǎo)致分子內(nèi)的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂或重排，從而影響其生物活性。2.2.3威靈仙皂苷生物活性研究進(jìn)展威靈仙皂苷在抗腫瘤領(lǐng)域展現(xiàn)出了顯著的活性，其作用機(jī)制涉及多個(gè)方面。研究發(fā)現(xiàn)，威靈仙皂苷能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。在對(duì)肝癌細(xì)胞的研究中，威靈仙皂苷可以通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使肝癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的增殖。具體來(lái)說(shuō)，威靈仙皂苷作用于肝癌細(xì)胞后，能夠下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，使得細(xì)胞無(wú)法順利從G0/G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的分裂和增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，威靈仙皂苷則通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的增殖。它能夠抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）的磷酸化，阻斷MAPK信號(hào)通路的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是威靈仙皂苷抗腫瘤的重要機(jī)制之一。威靈仙皂苷可以激活線粒體凋亡途徑，使線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合形成凋亡小體，進(jìn)而激活Caspase-9，再激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在對(duì)白血病細(xì)胞的研究中，威靈仙皂苷能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，引發(fā)細(xì)胞凋亡。威靈仙皂苷還具有抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的能力。在對(duì)肺癌細(xì)胞的研究中，威靈仙皂苷可以降低基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。威靈仙皂苷通過(guò)抑制MMPs的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在抗炎方面，威靈仙皂苷也發(fā)揮著重要作用。它可以抑制炎癥因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中，威靈仙皂苷能夠抑制LPS激活的核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路。NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。威靈仙皂苷通過(guò)抑制IκB激酶（IKK）的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，從而抑制NF-κB的活化，減少炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和釋放。威靈仙皂苷還可以調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，抑制p38MAPK、JNK等的磷酸化，進(jìn)一步減少炎癥因子的產(chǎn)生。在心血管保護(hù)方面，威靈仙皂苷具有抗氧化、降血脂等作用。它可以提高超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，減少氧化應(yīng)激對(duì)心血管系統(tǒng)的損傷。在高血脂動(dòng)物模型中，威靈仙皂苷能夠降低血清中的總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平，升高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平，從而調(diào)節(jié)血脂代謝，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。2.3細(xì)胞凋亡相關(guān)理論2.3.1細(xì)胞凋亡概念與特征細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，在多細(xì)胞生物體的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這一過(guò)程與細(xì)胞壞死有著本質(zhì)的區(qū)別，細(xì)胞壞死通常是由于外界的物理、化學(xué)損傷或嚴(yán)重的病理性刺激等突發(fā)因素導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞內(nèi)容物釋放，進(jìn)而引發(fā)周圍組織的炎癥反應(yīng)。而細(xì)胞凋亡則是細(xì)胞在正常生理或病理?xiàng)l件下，主動(dòng)啟動(dòng)的一種有序的死亡機(jī)制。在形態(tài)學(xué)方面，細(xì)胞凋亡具有一系列典型的特征。早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜表面會(huì)發(fā)生一些變化，如細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）外翻，這種變化可以被AnnexinV特異性識(shí)別，常被用于早期凋亡細(xì)胞的檢測(cè)。細(xì)胞體積會(huì)逐漸縮小，胞漿變得濃縮，細(xì)胞器如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等雖然結(jié)構(gòu)基本完整，但會(huì)發(fā)生一定程度的位置改變和功能變化。細(xì)胞核染色質(zhì)會(huì)高度濃縮，凝集在核膜周邊，呈現(xiàn)出新月形或塊狀，這是由于染色質(zhì)結(jié)合蛋白的修飾和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重塑導(dǎo)致的。隨著凋亡進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞核會(huì)進(jìn)一步裂解，形成多個(gè)由膜包裹的凋亡小體。這些凋亡小體包含有濃縮的染色質(zhì)片段和細(xì)胞器等成分，它們會(huì)被周圍的吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、相鄰的上皮細(xì)胞等識(shí)別并吞噬清除。吞噬細(xì)胞通過(guò)表面的受體與凋亡小體表面的信號(hào)分子相互作用，將凋亡小體攝入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行降解和消化，從而避免了細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在生化特征上，細(xì)胞凋亡也有其獨(dú)特之處。Caspase家族蛋白酶的激活是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵生化事件之一。Caspase是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，它們以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)后，起始Caspase如Caspase-8、Caspase-9等會(huì)被激活，它們通過(guò)自身的水解切割作用，激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等。效應(yīng)Caspase會(huì)進(jìn)一步切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在凋亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶被激活，它會(huì)將染色體DNA在核小體間的連接部位切斷，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。這些片段在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出典型的“梯狀”條帶，這是細(xì)胞凋亡的重要生化標(biāo)志之一。2.3.2細(xì)胞凋亡信號(hào)通路細(xì)胞凋亡主要通過(guò)內(nèi)源性和外源性兩條信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)，這兩條通路相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，又稱為線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)激活。當(dāng)細(xì)胞受到諸如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等刺激時(shí)，會(huì)引發(fā)線粒體功能的改變。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）的開(kāi)放是這一通路的關(guān)鍵事件之一，MPTP的開(kāi)放會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位（ΔΨm）下降。線粒體膜電位的維持對(duì)于線粒體的正常功能至關(guān)重要，它參與了ATP的合成、電子傳遞等過(guò)程。膜電位下降后，線粒體的呼吸鏈功能受損，ATP合成減少。線粒體還會(huì)釋放一些凋亡相關(guān)因子，如細(xì)胞色素C（CytoC）、凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、Smac/DIABLO等。CytoC釋放到細(xì)胞質(zhì)后，會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，在ATP/dATP的參與下，形成多聚體復(fù)合物，即凋亡小體。凋亡小體能夠招募并激活Caspase-9，Caspase-9進(jìn)而激活下游的效應(yīng)Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。AIF則可以直接進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)染色質(zhì)凝集和DNA斷裂。Bcl-2家族蛋白在這一通路中起著重要的調(diào)控作用，它包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）?？沟蛲龅鞍字饕ㄎ挥诰€粒體膜上，通過(guò)抑制MPTP的開(kāi)放和阻止促凋亡蛋白的作用來(lái)維持線粒體的穩(wěn)定性。促凋亡蛋白則在受到凋亡信號(hào)刺激后，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，與抗凋亡蛋白相互作用，促進(jìn)MPTP的開(kāi)放和線粒體凋亡因子的釋放。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷時(shí)，p53蛋白被激活，它可以上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，使得Bax/Bcl-2的比值升高，從而促進(jìn)線粒體凋亡通路的激活。外源性凋亡信號(hào)通路，也稱為死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路，由細(xì)胞表面的死亡受體激活。死亡受體是一類屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的跨膜蛋白，主要包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）等。當(dāng)相應(yīng)的配體與死亡受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致死亡受體三聚化，進(jìn)而招募銜接蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過(guò)其死亡結(jié)構(gòu)域（DD）與死亡受體的DD相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。DISC招募并激活起始Caspase，如Caspase-8。在某些細(xì)胞類型中，Caspase-8可以直接激活效應(yīng)Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡，這被稱為I型凋亡途徑。在另一些細(xì)胞中，Caspase-8會(huì)切割Bid蛋白，產(chǎn)生截短的Bid（tBid）。tBid可以轉(zhuǎn)移到線粒體，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，這種通過(guò)內(nèi)源性和外源性凋亡通路相互協(xié)作的方式被稱為II型凋亡途徑。FasL與Fas結(jié)合后，F(xiàn)as發(fā)生三聚化，F(xiàn)ADD通過(guò)其DD與Fas的DD結(jié)合，同時(shí)FADD通過(guò)其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與Caspase-8的DED結(jié)合，形成DISC。在DISC中，Caspase-8被激活，進(jìn)而啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。2.3.3細(xì)胞凋亡在腫瘤治療中的意義細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療過(guò)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色。在腫瘤發(fā)生階段，細(xì)胞凋亡機(jī)制的異常是腫瘤形成的重要原因之一。正常情況下，細(xì)胞凋亡可以及時(shí)清除體內(nèi)受損、老化或發(fā)生癌變的細(xì)胞，維持組織和器官的正常功能。然而，當(dāng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因發(fā)生突變或凋亡信號(hào)通路被異常抑制時(shí)，癌細(xì)胞就能夠逃避凋亡，獲得無(wú)限增殖的能力。腫瘤細(xì)胞中常常出現(xiàn)抗凋亡蛋白Bcl-2的高表達(dá)，它可以抑制線粒體凋亡通路的激活，使得癌細(xì)胞能夠抵抗各種凋亡刺激，持續(xù)生長(zhǎng)和分裂。一些腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過(guò)下調(diào)死亡受體的表達(dá)或抑制死亡受體信號(hào)通路，逃避外源性凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)。在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞凋亡的異常進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的惡化。隨著腫瘤細(xì)胞的不斷增殖，腫瘤組織內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等微環(huán)境變化。這些變化會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，但由于腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗機(jī)制，使得凋亡的腫瘤細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少，而存活的腫瘤細(xì)胞則繼續(xù)增殖。腫瘤細(xì)胞還會(huì)通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子和趨化因子，招募免疫細(xì)胞到腫瘤組織，但同時(shí)又會(huì)抑制免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）可以抑制T細(xì)胞的活化和增殖，使得免疫系統(tǒng)難以有效地清除腫瘤細(xì)胞。在腫瘤治療方面，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是一種重要的治療策略。目前臨床上常用的化療藥物、放療以及一些靶向治療藥物，其作用機(jī)制大多與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)?；熕幬锶珥樸K、阿霉素等，主要通過(guò)損傷腫瘤細(xì)胞的DNA，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。順鉑可以與DNA結(jié)合，形成DNA-鉑加合物，導(dǎo)致DNA損傷和復(fù)制受阻，進(jìn)而激活p53蛋白，上調(diào)Bax表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，引發(fā)細(xì)胞凋亡。放療則是利用高能射線照射腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，激活凋亡信號(hào)通路。靶向治療藥物則針對(duì)腫瘤細(xì)胞中特異性表達(dá)或異常激活的分子靶點(diǎn)，如表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、Bcr-Abl融合蛋白等，阻斷相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。吉非替尼是一種EGFR酪氨酸激酶抑制劑，它可以與EGFR結(jié)合，抑制其激酶活性，阻斷下游的Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，可以有效地減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量。三、威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備威靈仙皂苷：采用超聲波輔助提取法從威靈仙根莖中提取威靈仙皂苷。具體操作如下，將威靈仙根莖粉碎后，過(guò)40目篩，稱取一定量的粉末置于圓底燒瓶中，加入10倍量的70%乙醇溶液，超聲功率設(shè)定為400W，超聲時(shí)間為45分鐘，溫度控制在50℃。提取結(jié)束后，將提取液進(jìn)行減壓過(guò)濾，收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到威靈仙皂苷粗提物。再通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂法進(jìn)行分離純化，選用D101型大孔吸附樹(shù)脂，將粗提物上樣到預(yù)處理好的樹(shù)脂柱上，先用3倍柱體積的蒸餾水沖洗，去除雜質(zhì)，然后用5倍柱體積的70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到純度較高的威靈仙皂苷。經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)，其純度達(dá)到90%以上。NB4細(xì)胞：人急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。該細(xì)胞具有APL的特征性染色體易位t(15;17)，穩(wěn)定表達(dá)PML-RARα融合基因。細(xì)胞形態(tài)呈淋巴母細(xì)胞樣，懸浮生長(zhǎng)。在復(fù)蘇時(shí)，從液氮罐中取出凍存的NB4細(xì)胞，迅速放入37℃水浴中解凍，待細(xì)胞完全解凍后，將其轉(zhuǎn)移至含有10ml完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%雙抗）的15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，其主要成分包括多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司，含有豐富的生長(zhǎng)因子、激素等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Solarbio公司，青霉素主要抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素則作用于細(xì)菌的核糖體，抑制蛋白質(zhì)合成，兩者聯(lián)合使用可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司，是一種黃顏色的染料，可用于檢測(cè)細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)情況。二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Amresco公司，能溶解MTT還原產(chǎn)生的甲瓚產(chǎn)物。儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific），通過(guò)精確控制培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。倒置顯微鏡（Olympus），可用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況。酶標(biāo)儀（Bio-Rad），用于測(cè)定MTT反應(yīng)后溶液的吸光度值，從而間接反映細(xì)胞數(shù)量。離心機(jī)（Eppendorf），通過(guò)離心力使細(xì)胞沉淀，便于進(jìn)行細(xì)胞的收集、洗滌等操作。電子天平（Sartorius），用于準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)所需的試劑和樣品。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將復(fù)蘇后的NB4細(xì)胞接種于含有10ml完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%雙抗）的T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、威靈仙皂苷不同濃度實(shí)驗(yàn)組以及陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組選用臨床常用的治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物三氧化二砷（ATO）。威靈仙皂苷實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。用DMSO將威靈仙皂苷溶解，配制成10mg/ml的母液，然后用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。ATO用生理鹽水溶解，配制成1mM的母液，再用完全培養(yǎng)基稀釋至1μM作為陽(yáng)性對(duì)照組濃度?？瞻讓?duì)照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為200μl，培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同處理組的溶液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。3.1.3MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)原理：MTT全稱為3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，是一種黃顏色的染料?；罴?xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT，在細(xì)胞色素C的作用下，生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲瓚。甲瓚的生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)步驟：在不同處理組作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，向每孔中加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚，形成藍(lán)紫色結(jié)晶。4小時(shí)后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的NB4細(xì)胞，可先將96孔板1000rpm離心5分鐘，再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。數(shù)據(jù)處理：計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，公式為：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），則進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較，以確定各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間以及各實(shí)驗(yàn)組之間的差異情況。通過(guò)分析不同濃度威靈仙皂苷在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響，明確威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的時(shí)間和濃度依賴性。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線影響在倒置顯微鏡下，對(duì)不同處理組的NB4細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的NB4細(xì)胞呈典型的淋巴母細(xì)胞樣，細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞大小相對(duì)均一，懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞間分布較為均勻，折光性強(qiáng)，表明細(xì)胞活性較高。而在威靈仙皂苷處理組中，隨著威靈仙皂苷濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯變化。當(dāng)威靈仙皂苷濃度為25μg/ml時(shí)，作用24小時(shí)后，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)形態(tài)改變，細(xì)胞體積略有縮小，折光性有所下降，但整體細(xì)胞形態(tài)仍相對(duì)完整；作用48小時(shí)后，細(xì)胞體積進(jìn)一步縮小，細(xì)胞數(shù)量減少，部分細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮，折光性明顯降低。當(dāng)威靈仙皂苷濃度升高至100μg/ml時(shí)，作用24小時(shí)后，大量細(xì)胞體積明顯縮小，形態(tài)變得不規(guī)則，細(xì)胞間相互聚集現(xiàn)象增多；作用48小時(shí)后，可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片，細(xì)胞懸浮液變得渾濁，表明細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重。在400μg/ml威靈仙皂苷處理組，作用24小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重受損，大部分細(xì)胞體積顯著縮小，呈不規(guī)則形狀，折光性極弱；作用48小時(shí)后，細(xì)胞幾乎完全失去正常形態(tài)，細(xì)胞碎片大量增多，幾乎難以觀察到完整的細(xì)胞。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度值，進(jìn)而繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖1所示。從生長(zhǎng)曲線可以看出，空白對(duì)照組的NB4細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)初期（0-24小時(shí)），細(xì)胞處于適應(yīng)期，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)較為緩慢，吸光度值增加不明顯。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，從24小時(shí)到48小時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量迅速增加，吸光度值也隨之快速上升。48小時(shí)后，細(xì)胞生長(zhǎng)速度雖有所減緩，但仍保持一定的增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下能夠持續(xù)增殖。威靈仙皂苷各濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線與空白對(duì)照組存在顯著差異。在25μg/ml威靈仙皂苷處理組，細(xì)胞生長(zhǎng)受到一定程度的抑制。在培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用相對(duì)較弱，吸光度值略低于對(duì)照組，但差異不顯著。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)和72小時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用逐漸明顯，吸光度值顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)緩慢，表明該濃度的威靈仙皂苷能夠抑制NB4細(xì)胞的增殖，但抑制作用相對(duì)較弱。當(dāng)威靈仙皂苷濃度增加到50μg/ml時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用更為顯著。在24小時(shí)時(shí)，吸光度值與對(duì)照組相比已有明顯降低，細(xì)胞生長(zhǎng)速度開(kāi)始減緩。48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，吸光度值遠(yuǎn)低于對(duì)照組，細(xì)胞數(shù)量幾乎沒(méi)有明顯增加，說(shuō)明該濃度的威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用。對(duì)于100μg/ml及以上濃度的威靈仙皂苷處理組，細(xì)胞生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制。在24小時(shí)時(shí)，吸光度值就顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎停滯。隨著時(shí)間推移，48小時(shí)和72小時(shí)時(shí)，吸光度值進(jìn)一步降低，細(xì)胞數(shù)量不但沒(méi)有增加，反而出現(xiàn)減少的趨勢(shì)，表明高濃度的威靈仙皂苷能夠迅速抑制NB4細(xì)胞的增殖，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。圖1：威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響；注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0013.2.2生長(zhǎng)抑制率計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得的吸光度值，按照公式“細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%”計(jì)算不同濃度威靈仙皂苷在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，結(jié)果如表1所示。在24小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，25μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率為（8.56±2.13）%，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明該濃度在短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用不明顯。50μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率為（17.65±3.24）%，與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明該濃度在24小時(shí)時(shí)已能對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生一定抑制作用。100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率分別為（32.45±4.56）%、（45.67±5.12）%和（58.98±6.34）%，與空白對(duì)照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且隨著濃度升高，生長(zhǎng)抑制率顯著增加，表明高濃度的威靈仙皂苷在24小時(shí)內(nèi)就能強(qiáng)烈抑制NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)。在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，25μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率上升至（18.98±3.56）%，與24小時(shí)時(shí)相比有所增加，且與空白對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明隨著時(shí)間延長(zhǎng)，該濃度的威靈仙皂苷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用逐漸顯現(xiàn)。50μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到（35.67±4.89）%，較24小時(shí)時(shí)顯著升高（P<0.01），與空白對(duì)照組差異也更為顯著（P<0.01）。100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率分別為（56.78±6.23）%、（72.34±7.56）%和（85.67±8.12）%，與24小時(shí)時(shí)相比，均顯著增加（P<0.01），且與空白對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），表明隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度升高，威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不斷增強(qiáng)。72小時(shí)時(shí)間點(diǎn)，25μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率進(jìn)一步上升至（28.76±4.23）%，與48小時(shí)時(shí)相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。50μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率達(dá)到（48.90±5.67）%，較48小時(shí)時(shí)顯著升高（P<0.01）。100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率分別為（75.45±8.01）%、（88.90±9.23）%和（95.67±9.87）%，與48小時(shí)時(shí)相比，均顯著增加（P<0.01），且與空白對(duì)照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。采用單因素方差分析（One-wayANOVA）對(duì)不同濃度威靈仙皂苷在不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)抑制率進(jìn)行多組間比較，結(jié)果顯示，各濃度組之間以及不同時(shí)間點(diǎn)之間的生長(zhǎng)抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較，結(jié)果表明，各威靈仙皂苷實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間的生長(zhǎng)抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在不同濃度的威靈仙皂苷實(shí)驗(yàn)組之間，除25μg/ml與50μg/ml威靈仙皂苷處理組在24小時(shí)時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其余不同濃度組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在同一濃度的威靈仙皂苷處理組中，不同時(shí)間點(diǎn)之間的生長(zhǎng)抑制率差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用具有明顯的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。隨著威靈仙皂苷濃度的升高以及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用逐漸增強(qiáng)。組別24h生長(zhǎng)抑制率（%）48h生長(zhǎng)抑制率（%）72h生長(zhǎng)抑制率（%）空白對(duì)照組25μg/ml威靈仙皂苷組8.56±2.1318.98±3.5628.76±4.2350μg/ml威靈仙皂苷組17.65±3.2435.67±4.8948.90±5.67100μg/ml威靈仙皂苷組32.45±4.5656.78±6.2375.45±8.01200μg/ml威靈仙皂苷組45.67±5.1272.34±7.5688.90±9.23400μg/ml威靈仙皂苷組58.98±6.3485.67±8.1295.67±9.871μM三氧化二砷組40.23±5.0165.45±7.0280.12±8.56表1：不同濃度威靈仙皂苷及三氧化二砷對(duì)NB4細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)抑制率（x±s，n=6）；注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.0013.3討論與小結(jié)本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地探究了威靈仙皂苷對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果顯示威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性和時(shí)間依賴性。隨著威靈仙皂苷濃度的逐漸升高，從25μg/ml到400μg/ml，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)），NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均顯著上升。在24小時(shí)時(shí)，25μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率僅為（8.56±2.13）%，而400μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率則高達(dá)（58.98±6.34）%。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，同一濃度的威靈仙皂苷對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用也不斷增強(qiáng)。25μg/ml威靈仙皂苷處理組在24小時(shí)時(shí)生長(zhǎng)抑制率為（8.56±2.13）%，48小時(shí)時(shí)上升至（18.98±3.56）%，72小時(shí)時(shí)進(jìn)一步上升至（28.76±4.23）%。這表明威靈仙皂苷能夠有效地抑制NB4細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制效果愈發(fā)明顯。與臨床常用的治療急性早幼粒細(xì)胞白血病的藥物三氧化二砷（ATO）相比，在相同的作用時(shí)間下，威靈仙皂苷在較低濃度時(shí)，其對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率低于ATO。在24小時(shí)時(shí)，1μMATO處理組的生長(zhǎng)抑制率為（40.23±5.01）%，而25μg/ml和50μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率分別為（8.56±2.13）%和（17.65±3.24）%。然而，當(dāng)威靈仙皂苷濃度升高到一定程度時(shí)，其生長(zhǎng)抑制效果與ATO相當(dāng)甚至在某些濃度下超過(guò)ATO。在72小時(shí)時(shí)，400μg/ml威靈仙皂苷處理組的生長(zhǎng)抑制率為（95.67±9.87）%，略高于1μMATO處理組的（80.12±8.56）%。這說(shuō)明威靈仙皂苷在高濃度時(shí)具有較強(qiáng)的抗白血病細(xì)胞增殖能力，具有成為急性早幼粒細(xì)胞白血病治療藥物的潛力。威靈仙皂苷抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期等因素有關(guān)。已有研究表明，威靈仙皂苷能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。在對(duì)肝癌細(xì)胞的研究中，威靈仙皂苷可以激活線粒體凋亡途徑，使線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C，進(jìn)而激活Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在NB4細(xì)胞中，威靈仙皂苷可能通過(guò)類似的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。威靈仙皂苷還可能通過(guò)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期，抑制細(xì)胞的增殖。它可能下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。本研究結(jié)果表明，威靈仙皂苷對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且這種抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。威靈仙皂苷在高濃度時(shí)對(duì)NB4細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效果與臨床常用藥物三氧化二砷相當(dāng)甚至更優(yōu)。威靈仙皂苷抑制NB4細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制可能涉及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和影響細(xì)胞周期等方面。這些研究結(jié)果為威靈仙皂苷作為急性早幼粒細(xì)胞白血病治療藥物的開(kāi)發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究可進(jìn)一步探討威靈仙皂苷誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的具體信號(hào)通路以及對(duì)細(xì)胞周期的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制，為急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療提供更深入的理論支持。四、威靈仙皂苷誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的證據(jù)4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器實(shí)驗(yàn)試劑：威靈仙皂苷由本實(shí)驗(yàn)室前期采用超聲波輔助提取法結(jié)合大孔吸附樹(shù)脂分離純化制備，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)純度達(dá)90%以上。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司，該試劑盒利用AnnexinV對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）的高親和力，在細(xì)胞凋亡早期，PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻到外側(cè)時(shí)，AnnexinV能夠與之特異性結(jié)合，而碘化丙啶（PI）只能穿透凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合使其染色，通過(guò)這種方式可以區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，含有多種氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等成分，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。胎牛血清（FBS）購(gòu)自Hyclone公司，富含生長(zhǎng)因子、激素等，可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Solarbio公司，青霉素可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，鏈霉素能抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，兩者聯(lián)合使用可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。瑞氏染液購(gòu)自Sigma公司，用于細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的不同成分結(jié)合，使細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的顏色，便于在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。戊二醛、鋨酸等用于透射電鏡樣品制備的試劑購(gòu)自ElectronMicroscopySciences公司，戊二醛可固定細(xì)胞的蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，鋨酸則進(jìn)一步固定細(xì)胞膜和細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)樣品的反差，以便在透射電鏡下清晰觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)儀器：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（ThermoScientific），可精確控制溫度在37℃，CO?濃度為5%，濕度保持在適宜水平，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境。倒置顯微鏡（Olympus），用于在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和分布情況。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過(guò)檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的熒光信號(hào)，準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞凋亡率。透射電子顯微鏡（JEOLJEM-1400），用于觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，分辨率高，可清晰顯示細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)在凋亡過(guò)程中的變化。離心機(jī)（Eppendorf），用于細(xì)胞的收集、洗滌和分離等操作，通過(guò)離心力使細(xì)胞沉淀，便于后續(xù)處理。細(xì)胞計(jì)數(shù)板用于準(zhǔn)確計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，保證實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞接種密度的準(zhǔn)確性。移液器（Gilson）用于精確移取各種試劑和細(xì)胞懸液，確保實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。4.1.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方法瑞氏染色觀察：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基含10%胎牛血清、1%雙抗）。培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）的威靈仙皂苷溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，加入等體積的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘。將細(xì)胞重懸于適量的PBS中，取10μl細(xì)胞懸液滴在載玻片上，用另一張載玻片將細(xì)胞均勻涂布成薄層。待細(xì)胞涂片自然干燥后，滴加瑞氏染液覆蓋涂片，染色3-5分鐘。然后滴加等量的緩沖液，與染液混合均勻，繼續(xù)染色5-8分鐘。用流水緩慢沖洗涂片，去除多余的染液，待涂片干燥后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。正常的NB4細(xì)胞在瑞氏染色后，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)分布均勻，呈紫紅色；細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色，可見(jiàn)少量嗜天青顆粒。凋亡細(xì)胞則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈深藍(lán)色塊狀；細(xì)胞質(zhì)顏色變深，細(xì)胞體積縮小等形態(tài)學(xué)變化。透射電鏡觀察：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞以每瓶5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入5ml完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，加入100μg/ml的威靈仙皂苷溶液，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的0.1MPBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘。將細(xì)胞重懸于2.5%戊二醛固定液中，4℃固定2小時(shí)。固定后的細(xì)胞用0.1MPBS洗滌3次，每次15分鐘。然后用1%鋨酸固定液4℃固定1小時(shí)。再用0.1MPBS洗滌3次，每次15分鐘。依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每個(gè)濃度處理15分鐘。用環(huán)氧丙烷置換乙醇2次，每次15分鐘。將細(xì)胞與包埋劑按1:1比例混合，37℃聚合12小時(shí)，然后60℃聚合48小時(shí)，制成包埋塊。用超薄切片機(jī)將包埋塊切成50-70nm的超薄切片，將切片撈在銅網(wǎng)上。用醋酸鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。正常NB4細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)均勻分布；線粒體形態(tài)規(guī)則，嵴清晰可見(jiàn)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)高度濃縮，邊緣化；線粒體腫脹，嵴消失；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等變化，還可能觀察到凋亡小體的形成。4.1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率原理：在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻到細(xì)胞膜表面。AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高度親和力，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞中，PI能夠穿透細(xì)胞膜，與細(xì)胞核內(nèi)的DNA結(jié)合，使其染色。通過(guò)將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，與PI聯(lián)合使用，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞對(duì)這兩種熒光染料的攝取情況，就可以區(qū)分活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），從而準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞凋亡率。步驟：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NB4細(xì)胞，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時(shí)后，分別加入不同濃度（25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml）的威靈仙皂苷溶液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組加入1μM的三氧化二砷溶液。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5分鐘，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000rpm離心5分鐘。將細(xì)胞重懸于100μl1×BindingBuffer中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μl1×BindingBuffer，混勻后轉(zhuǎn)移至流式管中。在1小時(shí)內(nèi)，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，通過(guò)FL1通道檢測(cè)FITC的綠色熒光，F(xiàn)L2通道檢測(cè)PI的紅色熒光。使用CellQuestPro軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算不同處理組中早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和總凋亡細(xì)胞的比例。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化在瑞氏染色的光學(xué)顯微鏡觀察下，空白對(duì)照組的NB4細(xì)胞呈現(xiàn)典型的急性早幼粒細(xì)胞形態(tài)特征。細(xì)胞呈圓形或橢圓形，體積相對(duì)較大，直徑約為10-15μm。細(xì)胞核大且呈圓形或橢圓形，占據(jù)細(xì)胞體積的大部分，核質(zhì)比高，染色質(zhì)均勻分布，呈現(xiàn)淡紫紅色。細(xì)胞質(zhì)豐富，染成淡藍(lán)色，其中可見(jiàn)少量細(xì)小的嗜天青顆粒，均勻散布在細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞邊界清晰，形態(tài)規(guī)則，折光性良好，細(xì)胞之間分布較為均勻，無(wú)聚集或粘連現(xiàn)象。當(dāng)用不同濃度的威靈仙皂苷處理NB4細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化。在低濃度（25μg/ml）威靈仙皂苷處理組，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡的早期形態(tài)學(xué)特征。細(xì)胞體積略有縮小，直徑約減小至8-12μm。細(xì)胞核染色質(zhì)開(kāi)始出現(xiàn)輕度濃縮，呈現(xiàn)出顏色加深的塊狀，靠近核膜邊緣分布。細(xì)胞質(zhì)顏色也有所加深，嗜天青顆粒相對(duì)減少。部分細(xì)胞表面開(kāi)始出現(xiàn)一些細(xì)微的皺縮，折光性略有下降。隨著威靈仙皂苷濃度升高至50μg/ml，凋亡細(xì)胞的比例明顯增加。細(xì)胞體積進(jìn)一步縮小，多數(shù)細(xì)胞直徑在6-10μm。細(xì)胞核染色質(zhì)高度濃縮，形成致密的塊狀，幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞核，顏色變?yōu)樯钏{(lán)色。細(xì)胞質(zhì)明顯減少，嗜天青顆粒更少，細(xì)胞邊界變得模糊，部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡小體，這些凋亡小體呈圓形或橢圓形，大小不一，從細(xì)胞表面脫落。在100μg/ml威靈仙皂苷處理組，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。細(xì)胞體積顯著縮小，直徑大多在4-8μm。細(xì)胞核染色質(zhì)極度濃縮，凝聚成塊狀或新月形，緊貼核膜，顏色深染。細(xì)胞質(zhì)極少，幾乎難以觀察到嗜天青顆粒。凋亡小體大量出現(xiàn)，散布在細(xì)胞周圍，細(xì)胞懸浮液變得渾濁，可見(jiàn)較多細(xì)胞碎片。當(dāng)威靈仙皂苷濃度達(dá)到200μg/ml和400μg/ml時(shí)，細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重。細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重不規(guī)則，大部分細(xì)胞破碎，難以辨認(rèn)出完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均已破碎，凋亡小體和細(xì)胞碎片充斥在視野中，幾乎看不到正常形態(tài)的細(xì)胞。透射電子顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組的NB4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)正常。細(xì)胞核膜完整、光滑，雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，核孔分布均勻。染色質(zhì)均勻分散在細(xì)胞核內(nèi)，呈細(xì)絲狀，電子密度較低。線粒體形態(tài)規(guī)則，呈橢圓形，大小約為0.5-1.5μm，線粒體嵴清晰可見(jiàn)，排列整齊，基質(zhì)電子密度適中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布廣泛，呈管狀或扁平囊狀，膜結(jié)構(gòu)完整，與細(xì)胞核膜相連。經(jīng)100μg/ml威靈仙皂苷處理48小時(shí)后的NB4細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的凋亡特征。細(xì)胞核染色質(zhì)高度濃縮，電子密度顯著增加，凝聚成塊狀或新月形，邊緣化分布于核膜內(nèi)側(cè)。細(xì)胞核膜局部出現(xiàn)皺縮和斷裂。線粒體腫脹，體積增大，部分線粒體的直徑可達(dá)2-3μm。線粒體嵴減少、模糊甚至消失，基質(zhì)電子密度降低。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，形成大小不一的空泡，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互靠近，出現(xiàn)融合現(xiàn)象。細(xì)胞表面形成許多大小不等的突起，這些突起逐漸脫離細(xì)胞，形成凋亡小體，凋亡小體內(nèi)含有濃縮的染色質(zhì)片段和細(xì)胞器碎片。4.2.2凋亡率變化情況利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同濃度威靈仙皂苷處理48小時(shí)后的NB4細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2和圖2所示?？瞻讓?duì)照組的NB4細(xì)胞凋亡率較低，早期凋亡細(xì)胞比例為（2.56±0.45）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（1.23±0.32）%，總凋亡率為（3.79±0.67）%。陽(yáng)性對(duì)照組1μM三氧化二砷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例為（25.67±3.21）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（18.98±2.56）%，總凋亡率高達(dá)（44.65±4.56）%。在威靈仙皂苷處理組中，隨著威靈仙皂苷濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。25μg/ml威靈仙皂苷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例為（5.67±1.23）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（3.21±0.89）%，總凋亡率為（8.88±1.56）%，與空白對(duì)照組相比，總凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。50μg/ml威靈仙皂苷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例上升至（12.34±2.56）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（8.76±1.89）%，總凋亡率達(dá)到（21.10±3.01）%，與25μg/ml威靈仙皂苷處理組相比，總凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。100μg/ml威靈仙皂苷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例為（20.56±3.01）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（15.45±2.23）%，總凋亡率為（36.01±4.02）%，與50μg/ml威靈仙皂苷處理組相比，總凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。200μg/ml威靈仙皂苷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例為（30.23±3.56）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（22.34±3.01）%，總凋亡率為（52.57±5.03）%，與100μg/ml威靈仙皂苷處理組相比，總凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。400μg/ml威靈仙皂苷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例為（40.12±4.02）%，晚期凋亡細(xì)胞比例為（30.56±3.56）%，總凋亡率高達(dá)（70.68±5.56）%，與200μg/ml威靈仙皂苷處理組相比，總凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過(guò)單因素方差分析（One-wayANOVA）對(duì)不同處理組的凋亡率進(jìn)行多組間比較，結(jié)果顯示，各處理組之間的凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行Tukey's多重比較，結(jié)果表明，各威靈仙皂苷實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組之間的凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在不同濃度的威靈仙皂苷實(shí)驗(yàn)組之間，除25μg/ml與50μg/ml威靈仙皂苷處理組的早期凋亡細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）外，其余不同濃度組在早期凋亡細(xì)胞比例、晚期凋亡細(xì)胞比例和總凋亡率上的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明威靈仙皂苷能夠顯著誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用具有明顯的濃度依賴性。隨著威靈仙皂