原核表達(dá)技術(shù)操作步驟詳述原核表達(dá)技術(shù)依托大腸桿菌等原核宿主的生長優(yōu)勢與成熟表達(dá)系統(tǒng)，成為重組蛋白制備、功能研究及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的核心手段。其核心流程涵蓋表達(dá)載體構(gòu)建、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化四大環(huán)節(jié)，各步驟的精準(zhǔn)操作直接決定蛋白表達(dá)效率與質(zhì)量。本文系統(tǒng)詳述原核表達(dá)技術(shù)的關(guān)鍵操作步驟，為科研與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供實(shí)用參考。一、材料準(zhǔn)備（一）試劑與耗材載體與菌株：表達(dá)載體（如pET-28a、pET-32a等，含T7啟動(dòng)子及His等標(biāo)簽）；宿主菌（BL21(DE3)用于常規(guī)表達(dá)，Rosetta(DE3)適配稀有密碼子基因，Origami(DE3)優(yōu)化二硫鍵形成）；克隆菌（DH5α）用于載體構(gòu)建。酶與試劑：限制性內(nèi)切酶（如BamHI、HindIII，依載體多克隆位點(diǎn)選擇）、T4DNA連接酶、高保真PCR酶、IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、抗生素（卡那霉素、氨芐青霉素等，依載體抗性）、Ni-NTA瓊脂糖樹脂、SDS試劑（丙烯酰胺、Tris緩沖液等）。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（菌液培養(yǎng)）、SOC培養(yǎng)基（轉(zhuǎn)化復(fù)蘇）、含抗生素的LB平板（陽性克隆篩選）。（二）儀器設(shè)備PCR儀、恒溫?fù)u床、高速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)、超聲破碎儀、蛋白純化系統(tǒng)（或重力柱）、凝膠成像系統(tǒng)、分光光度計(jì)（測OD???）。二、操作步驟詳解（一）表達(dá)載體的構(gòu)建1.目的基因獲取通過PCR擴(kuò)增目的基因（或酶切質(zhì)粒/基因組）。引物設(shè)計(jì)需在5’端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（如BamHI和HindIII），并添加≥2個(gè)保護(hù)堿基（保證酶切效率）。PCR體系含模板、高保真酶、dNTPs、引物及緩沖液，擴(kuò)增條件依基因長度優(yōu)化（如95℃預(yù)變性，95℃/55-65℃/72℃循環(huán)25-35次，72℃延伸）。2.載體與目的基因酶切選擇2種不同內(nèi)切酶對(duì)載體（如pET-28a）和目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切（避免載體自連）。酶切體系含載體/PCR產(chǎn)物、內(nèi)切酶、緩沖液，37℃孵育2-4h。酶切后經(jīng)瓊脂糖電泳分離，膠回收試劑盒純化線性化載體與目的基因。3.連接與轉(zhuǎn)化將目的基因與載體按摩爾比3:1~5:1混合，加T4連接酶和緩沖液，16℃過夜連接（或22℃連接2-4h）。取5-10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)：冰浴30min→42℃熱激90s→冰浴2min→加SOC復(fù)蘇1h→涂含抗生素的LB平板，37℃培養(yǎng)12-16h。4.陽性克隆鑒定挑取單菌落培養(yǎng)后，通過菌落PCR（載體通用引物或目的基因特異性引物）初篩；提取質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證（雙酶切后電泳觀察目的片段）；最終測序確認(rèn)序列及讀碼框正確性。（二）重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌1.感受態(tài)細(xì)胞處理表達(dá)宿主菌（如BL21(DE3)）感受態(tài)可自行制備（氯化鈣法）或使用商品化產(chǎn)品。自行制備時(shí)，對(duì)數(shù)期菌液冰浴離心，預(yù)冷0.1MCaCl?重懸，冰浴后離心，含甘油的CaCl?重懸，-80℃凍存；商品化感受態(tài)直接冰浴融化。2.轉(zhuǎn)化操作取5μL重組質(zhì)粒（或100μL連接產(chǎn)物）加至100μL感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min→42℃熱激90s→冰浴2min→加SOC復(fù)蘇1h→涂含抗生素的LB平板，37℃培養(yǎng)12-16h。3.種子液培養(yǎng)與驗(yàn)證挑取陽性單菌落至5mL含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)8-12h（OD???=0.8-1.0）。取1mL菌液保存（種子液），剩余菌液離心收集菌體，SDS或Westernblot驗(yàn)證質(zhì)粒穩(wěn)定性與表達(dá)框架正確性。（三）重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)1.擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)前處理取1mL種子液轉(zhuǎn)接至100mL含抗生素的LB（或TB）培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???=0.6-0.8（約2-3h）。若追求可溶性蛋白，可降溫至16-25℃預(yù)培養(yǎng)30min；若允許包涵體，保持37℃。2.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)加入IPTG至終濃度0.1-1mM（低濃度如0.1mM可減少包涵體），于設(shè)定溫度振蕩培養(yǎng)4-16h（膜蛋白4h，可溶性蛋白16h）。誘導(dǎo)后期可加1%葡萄糖（抑制本底表達(dá)）或0.5mMZnSO?（穩(wěn)定金屬結(jié)合蛋白）。3.表達(dá)形式分析取1mL誘導(dǎo)菌液，8000rpm離心2min收集菌體，PBS重懸后超聲破碎（功率30%，工作3s/間隔5s，共10-20次），____rpm離心10min，取上清（可溶性）和沉淀（包涵體），經(jīng)SDS電泳（考馬斯亮藍(lán)染色）觀察表達(dá)位置與可溶性比例。（四）重組蛋白的分離純化（以His標(biāo)簽為例）1.菌體破碎與上清制備誘導(dǎo)菌液4℃、8000rpm離心10min收集菌體，用BindingBuffer（含20mM咪唑，pH8.0）重懸（體積為原菌液的1/10），超聲破碎后____rpm離心30min（4℃），上清經(jīng)0.45μm濾膜過濾。2.鎳柱平衡與上樣Ni-NTA樹脂裝填于柱中，5倍柱體積BindingBuffer平衡，流速1mL/min。上清上柱（流速0.5mL/min），收集流穿液（留樣檢測結(jié)合效率）。3.洗雜與洗脫10倍柱體積WashBuffer（含50mM咪唑，pH8.0）洗雜，至流出液OD???基線。ElutionBuffer（含250mM咪唑，pH8.0）洗脫，分管收集，SDS檢測純度。4.蛋白濃縮與透析純度合格的蛋白用超濾管濃縮（截留分子量依蛋白大?。b入透析袋，于PBS或目標(biāo)緩沖液中透析過夜（4℃），BCA法測濃度，-80℃凍存或直接使用。三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)載體構(gòu)建：酶切位點(diǎn)需避開目的基因內(nèi)部，引物讀碼框需通過在線工具驗(yàn)證（如ExPASy）。轉(zhuǎn)化效率：感受態(tài)需新鮮（-80℃保存≤6個(gè)月），轉(zhuǎn)化全程冰浴，熱激時(shí)間嚴(yán)格控制（90s）。誘導(dǎo)優(yōu)化：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置IPTG濃度（0.1/0.5/1mM）、溫度（16/25/37℃）、時(shí)間（4/8/16h）梯度，繪制“表達(dá)量-可溶性”曲線，選擇最優(yōu)條件。純化條件：BindingBufferpH穩(wěn)定在8.0（His標(biāo)簽與鎳結(jié)合最適pH），洗雜咪唑濃度可逐步優(yōu)化（20→50mM），避免目的蛋白提前洗脫。四、常見問題及解決策略表達(dá)量極低：檢查啟動(dòng)子-宿主匹配性（T7啟動(dòng)子需DE3溶原菌），確認(rèn)抗生素濃度（過高抑制生長），更換宿主菌（如Rosetta解決密碼子偏好）。蛋白不溶（包涵體）：降低誘導(dǎo)溫度（16℃）、減少IPTG濃度（0.1mM）、延長誘導(dǎo)時(shí)間，或添加分子伴侶（GroEL/GroES），誘導(dǎo)后梯度透析復(fù)性。純化雜帶多：增加洗雜咪唑濃度（7