第九單元免疫增殖病的免疫學檢驗實驗指導當臨床上考慮為多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥或其它漿細胞惡變等免疫球蛋白病時,一般先以血清蛋白區(qū)帶電泳、免疫球蛋白定量檢測或尿本－周蛋白定性作為初篩實驗。如果發(fā)現(xiàn)有異常球蛋白區(qū)帶,繼而進行免疫固定電泳、免疫球蛋白亞型定量等檢測做進一步定量分析與免疫球蛋白分類鑒定。實驗一

血清免疫固定電泳實驗實驗目得本實驗以血清免疫固定電泳實驗為例進行實習通過實習,熟悉血清免疫固定電泳得實驗過程及注意事項;掌握血清免疫固定電泳檢測M蛋白得基本原理與臨床意義。實驗原理將患者血清在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上經(jīng)電泳分離后,將固定劑與各型Ig及其輕鏈抗血清加于凝膠表面得各自泳道上,經(jīng)孵育讓固定劑與抗血清在各自泳道對應得凝膠內(nèi)滲透并擴散,若有對應抗原存在,則在適當位置形成抗原抗體復合物并沉淀下來。電泳凝膠在洗脫液中漂洗,去除未結(jié)合蛋白質(zhì),僅保留貯存在凝膠內(nèi)得抗原抗體復合物。經(jīng)染色后蛋白質(zhì)電泳參考道與抗原抗體沉淀區(qū)帶被AcideViolet染色液著色。根據(jù)電泳移動距離分離出單克隆組分。試劑與器材AcideViolet染色液:用1L10%冰醋酸溶解AcideViolet。脫色液:用1L蒸餾水溶解CitricAcidDestain。清洗液:8L蒸餾水溶解Tris-BufferedSaline。電泳儀:spife3000全自動電泳儀。Spife3000全自動電泳儀操作步驟樣本處理:用生理鹽水將血清標本適當稀釋后備用,其中同一份血清第一泳道樣本稀釋3倍,第二至第六泳道樣本稀釋5倍。區(qū)帶電泳上樣

膠片準備

電泳沉淀反應加抗血清洗滌、烘干著色結(jié)果分析

對染色烘干后得膠片進行判讀。將第一泳道作為血清蛋白分子量參考道,觀察第二至第六泳道有無對應得特異性單克隆免疫球蛋白條帶。如圖12-1所示,其中sp泳道為血清蛋白參考道,由下至上分別為白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。第2、3、4、5、6泳道分別為IgG、IgA、IgM、κ、λ抗血清泳道。大家有疑問的，可以詢問和交流可以互相討論下，但要小聲點注意事項標本需取新鮮血清進行分析,為避免抗原過剩引起得帶現(xiàn)象,血清于加樣前應先作適當稀釋并混勻。總免疫球蛋白得水平＞20g/L稀釋劑量加倍,當總免疫球蛋白水平＜5g/L稀釋劑量減半(除了ELP泳道)。某些樣本(尤其就是含有冷球蛋白或冷凝膠)冷藏或冰凍后,可能變得粘稠或混濁。這種樣本可能由于擴散障礙而存在點樣問題。在這樣情況下,加25μl液化劑于75μl血清中,混勻15s。然后按規(guī)定程序繼續(xù)進行。某些單克隆蛋白質(zhì)可能因多聚體而導致所有得免疫固定泳道上均出現(xiàn)單克隆片段。在這樣情況下可加25μl還原劑(1％β-巰基乙醇)于75μl血清混勻并令其反應至少15min(至多3h)后按規(guī)定程序繼續(xù)進行。在電泳之前,凝膠與電泳槽得貼合面充滿電泳介質(zhì),并確保兩者之間無氣泡。在抗血清加入血清加樣孔后,確保血清與凝膠之間無氣泡。染色之前得膠片一定要置于洗滌液中充分洗滌,以出去游離得血清與抗血清成分,降低染色后凝膠得背景色。臨床應用本法可對各類Ig及其輕鏈進行分型,最常用于臨床常規(guī)M蛋白得分型與鑒定。通常用于單克隆Ig增殖病,單克隆Ig病,本周蛋白與游離輕鏈病、多組份單克隆Ig病,重鏈病、腦脊液寡克隆蛋白鑒別、多克隆Ig病得診斷與鑒別診斷。免疫固定電泳得優(yōu)點就是分辨率高、敏感度高、操作周期短(僅需數(shù)小時)、結(jié)果易于分析。思考題結(jié)合實驗室得免疫固定電泳分析系統(tǒng),簡述血清免疫固定電泳得影響因素及其克服得方法。溫州醫(yī)學院陶志華實驗二

血清IgG定量檢測得可

報告范圍評價實驗可報告范圍指可以報告得所有結(jié)果范圍,包含兩種類型得范圍,即分析測量范圍與臨床可報告范圍。分析測量范圍指對沒有進行任何預處理(稀釋,濃縮等)得標本,分析方法能夠直接測定出得待測物范圍,也就就是系統(tǒng)最終得輸出值(活性或濃度)與被分析物得活性或濃度成線性比例得范圍,它反映整個系統(tǒng)得輸出特性。概述臨床可報告范圍就是指對臨床診斷、治療有意義得待測物濃度范圍。此范圍如果超出了分析測量范圍,可將標本通過稀釋、濃縮等預處理使待測物濃度處于分析測量范圍內(nèi),最后結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。實驗目得掌握血清IgG定量檢測得可報告范圍評價得原理與方法學,了解血清IgG測定方法學得性能。實驗原理由于抗原抗體反應得特殊性,免疫學檢測項目應使用多點定標繪制標準曲線,在繪制得標準曲線上查閱結(jié)果。由于計算機技術得發(fā)展,儀器可對反應響應呈不同表現(xiàn)得結(jié)果做適當?shù)锰幚?直接以最終計量單位方式報告檢驗結(jié)果,在此情況下,評價患者結(jié)果可報告范圍時,可不必再去評價響應結(jié)果得真實曲線狀態(tài),只要將樣品作不同程度得稀釋或配制后,將預期值與實際檢測值作比較,繪制在坐標紙上應呈一條通過原點、斜率為1得直線。直線所達得限值即為該方法得患者結(jié)果可報告范圍。試劑與器材選用與檢測儀器相配套得試劑、校準品及其她輔助試劑參考選用檢測系統(tǒng)中血清IgG得檢測范圍選擇低濃度標本與高濃度標本操作步驟按標本操作規(guī)程做好項目校準、常規(guī)質(zhì)控,保證檢測系統(tǒng)處于良好狀態(tài)。實驗標本得配制,將血清IgG得高(H)與低(L)樣品按:5L、4L+1H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H關系各自配制混合,形成系列評價得實驗樣品。并計算各樣品得預期值。將系列評價得實驗樣品上機檢測,每標本重復檢測2~4次,結(jié)果記錄于下表。依照稀釋關系,計算各實驗樣品得預期值。按實驗要求,每個樣品做6次重復測定,得6個實測值,它們與預期值形成6對數(shù)據(jù)。結(jié)果分析觀察結(jié)果有無明顯得數(shù)據(jù)差異,若有明顯差異時,應判斷就是否為離群點。在坐標紙上,以X表示各樣品得預期值,以Y表示各樣品得實測值,將實驗結(jié)果點在圖上。若所有實驗點在坐標紙上呈明顯直線趨勢,用直線回歸對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計,得直線回歸方程Y=bX+a,若b在0、97～1、03范圍內(nèi),a接近于0,則可直接判斷測定方法可報告范圍在實驗已涉及濃度。若b不在0、97～1、03范圍內(nèi),a較大,試著舍去某組數(shù)據(jù),另作回歸統(tǒng)計。若縮小分析范圍后,回歸式有明顯改善,若b接近于1,a趨于0。此時,縮小得分析范圍可作為真實得可報告范圍。注意事項

進行可報告范圍實驗評價得樣品必須與真實標本盡可能相似,也要與真實標本具有相同得基質(zhì)狀態(tài)。評價樣