ICS 65.020.3054CCSB4354西 藏 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB54/T0562—2026牦牛片形吸蟲病防控技術(shù)規(guī)程2026-1-4發(fā)布 2026-2-4實施西藏自治區(qū)市場監(jiān)督管理局??發(fā)布DB54/T0562DB54/T0562—2026PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1診斷 1實驗室診斷 2防控 2治療 3附 錄 A （資料性）片形吸蟲蟲卵形態(tài)及感染牦牛肝臟 4附 錄 B （規(guī)范性）實驗室檢測方法 5前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村標準化技術(shù)委員會提出并歸口。本文件起草單位：西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所、佛山大學(xué)。本文件主要起草人：唐文強、黃福強、趙霞玲、石斌、馬弘財、韓海玉、何小國、任曉麗。DB54/T0562DB54/T0562—2026PAGEPAGE1牦牛片形吸蟲病防控技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牦牛片形吸蟲病的臨床診斷、實驗室診斷、防控和治療等技術(shù)要求。本文件適用于牦牛片形吸蟲病的診斷、預(yù)防和治療。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件?！吨腥A人民共和國獸藥典》（2020版）NY/T1950-2010片形吸蟲病診斷技術(shù)規(guī)范GB19489-2008實驗室生物安全通用要求術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。片形吸蟲片形吸蟲病聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）一種在體外擴增DNA片段的方法。當(dāng)存在模板DNA、底物、上下游引物和耐熱的DNA聚合酶時，經(jīng)過多次“變性-退火-延伸”反應(yīng)，模板可擴增至數(shù)百萬倍。診斷流行病學(xué)臨床癥狀急性期慢性期病理變化急性病例比較少見，主要變化為可視黏膜蒼白，剖檢可見腹腔中充滿血水，含幼小蟲體；肝臟腫大和充血，呈急性肝炎病變。慢性病例實驗室診斷樣本采集病原學(xué)檢查糞便蟲卵檢查檢測糞便中的片形吸蟲蟲卵，見附錄A的圖A.1和附錄B的B.1。肝臟蟲體檢查剖檢肝臟查看片形吸蟲蟲體，見附錄A的圖A.2和附錄B的B.2。分子生物學(xué)（PCR）檢查取新鮮糞便進行聚合酶鏈式反應(yīng)，擴增出特異性目的片段，只出現(xiàn)約250bp的特異性條帶為肝片吸蟲，只出現(xiàn)約500bp的特異性條帶為大片吸蟲，同時出現(xiàn)約250bp和500bp條帶為“中間型”片形吸蟲，見附錄B的B.3。防控預(yù)防性驅(qū)蟲驅(qū)蟲時間每年春、冬兩季定期驅(qū)蟲，牛群發(fā)病可隨時驅(qū)蟲。驅(qū)蟲藥物選擇驅(qū)蟲藥多使用高效、低毒且能驅(qū)殺各發(fā)育階段蟲體的藥物，推薦使用三氯苯達唑。驅(qū)蟲方法防控中間宿主結(jié)合草原或農(nóng)田基本建設(shè)、興修水利和填補與改造低洼沼澤地帶等措施，控制椎實螺生存的環(huán)境。具備條件的，可用飼養(yǎng)的水禽、鴨、鵝等生物方法滅螺。糞便無害化處理加強飼養(yǎng)衛(wèi)生管理治療附 錄 A（資料性）片形吸蟲蟲卵形態(tài)及感染牦牛肝臟圖A.1片形吸蟲蟲卵 圖A.2感染片形吸蟲牦牛肝臟附 錄 B（規(guī)范性）糞便蟲卵檢查（水洗沉淀法）材料200mL玻璃杯，60目網(wǎng)篩，玻璃棒，鑷子，膠帽吸管，載玻片和蓋玻片，天平，顯微鏡。方法取新鮮糞便10g放入玻璃杯中，先加10mL水?dāng)嚦珊隣?，然后再繼續(xù)加水20倍。經(jīng)充分混合后，用60目網(wǎng)篩3010（不加蓋玻片，用低倍顯微鏡檢查），統(tǒng)計全部蟲卵數(shù)。結(jié)果判定116m～13m×6μ～8μm150μm～190μm×75μm～90μm。由于西藏地區(qū)存在中間型片形吸蟲，因此無法通過蟲卵形態(tài)區(qū)別出所檢PCR（按B.3進行進行（genus別端，而同盤吸蟲的胚細胞在蟲卵中部偏后。肝臟蟲體檢查材料解剖刀，組織剪，挑蟲針，無齒鑷，搪瓷盆，搪瓷盤，搪瓷缸，大平皿，載玻片。蟲體采集a）按一般剖檢術(shù)式摘出肝臟，再剪斷膽管與十二指腸連接部位，要注意觀察斷端有無蟲體流出。b）將肝臟放搪瓷盤中。首先分離膽囊，單放在大平皿中，剪開囊壁，將膽汁用清水稀釋，等自然沿肝臟的大膽管及其分支剪開，如發(fā)現(xiàn)蟲體取出放在盛有清水的平皿中。再沿著與膽管垂直的方向?qū)⒏谓M織切成數(shù)大塊，注意斷面有無蟲體或病灶。用手壓擠，看是否有蟲體被壓出。將肝塊浸入盛有多量水的搪瓷盆中，用手撕成小塊，再擠每個小肝塊，洗凈后取出。向搪瓷盆內(nèi)再加些水進行反復(fù)水洗沉淀，檢查沉淀物，用無齒鑷挑出蟲體。挑出的蟲體用生理鹽水洗凈，再放在常溫自來水中使蟲體松弛。有些蟲體的腸管內(nèi)含有大量食物，可在生理鹽水中放置過夜，待其食物消化或排出。蟲體固定蟲體染色標本制作步驟（硼砂卡紅染色）體色 保于70酒內(nèi)標直取投硼卡4硼NaBO)液100L，加入卡紅染粉1g，加熱使其溶解，再加入70％酒精100mL，放冷，過濾，濾液即為硼砂卡紅染液）染色液中染色。保存于福爾馬林液內(nèi)的蟲體標本，應(yīng)先取出水洗1～2h，爾后循序通過30％，50％，70％的酒精各0.5～1h，再投入染液中，在染液中過夜，使蟲體染成深紅色。蟲體脫色 自染液中取出蟲體放入1%酸酒精中褪（1%酸酒精是以70％酒精99mL加濃鹽酸1mL，根據(jù)情況也可以使用2%或3%的酸酒精），使顏色深淺分明，即蟲體外層呈淡紅色，內(nèi)部構(gòu)造呈深紅色。蟲體脫水 將脫色好的蟲體移入80%，95％和100%酒（2次中各0.5～1h（如果脫水不充分制作出的標本會有一層霧狀膜，原因就是浸泡時間不夠或最后一步就酒精使用過程中已不是無水酒精，建議更換新的無水酒精）蟲體透明將蟲體先經(jīng)1:1的100%酒精和二甲苯混合液中透明30min，再取出放入純二甲苯中，蟲體封片已透明的蟲體，移至載玻片上，加適量滴加拿大樹膠，加蓋玻片封固，封固時切忌留有氣泡在內(nèi)，待干后放入標本盒內(nèi)。結(jié)果判定表B.1肝片形吸蟲與大片形吸蟲成蟲的形態(tài)鑒別鑒別要點肝片吸蟲大片吸蟲體形較狹長，有明顯的肩部，末端較尖呈“V”形狹長，肩不明顯，兩側(cè)平，末端鈍圓呈“U”形大小21～41mm×9～14mm25～75mm×5～12mm體長：體寬2:1～3:1左右3:1以上吸盤腹吸盤稍大于口吸盤腹吸盤約為口吸盤的1.5倍腸管內(nèi)側(cè)支分支少內(nèi)側(cè)支分支復(fù)雜睪丸分支區(qū)域約占蟲體的2/3分支區(qū)域約占蟲體的1/2PCR試劑糞便基因組DNA提取試劑盒，TaqPCRMix（2X,含藍染料），1.5%瓊脂糖凝膠，50×TAE電DL2000NAMarerDN10n/μ，條引物序列及配置的母液濃度見表B.2。表B.2引物序列及濃度引物名稱引物序列母液濃度（μM）Fh-pepck-F5’-GATTGCACCGTTAGGTTAGC-3’100Fg-pepck-F5’-AAAGTTTCTATCCCGAACGAAG-3’100Fcmn-pepck-R5’-CGAAAATTATGGCATCAATGGG-3’100耗材離心管（15mL、50mL、1.5mL），藥匙，稱量紙，0.2mL薄壁PCR管，500mL量筒，500mL錐形瓶，槍頭（10μL、200μL、1000μL），記號筆。儀器設(shè)備分析天平，PCR擴增儀，臺式低溫高速離心機，水平電泳儀，紫外凝膠成像系統(tǒng)，可調(diào)移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL），恒溫水浴鍋或金屬浴。實驗步驟牦牛糞便樣品采集和處理采集待檢測牦牛200mg左右的糞便，放入一個1.5mL離心管中，供PCR檢查用，每頭牦牛采的糞便樣品不少于2管；采集的樣品宜當(dāng)天處理和檢測，若不能當(dāng)天檢測，應(yīng)暫時放于冰箱冷凍室-20℃保存，若需長期保存，應(yīng)放置于-80℃超低溫冰箱；使用糞便基因組DNA提取試劑盒提取糞便樣品中的全基因組；提取好的全基因組置于4℃保存，若不能當(dāng)天檢測，應(yīng)放于冰箱冷凍室-20℃保存。PCR反應(yīng)體系：30μL，體系組成見表B.3。設(shè)置至少兩個平行樣品，設(shè)立陰性、陽性及空白提取對照。表B.3PCR擴增反應(yīng)體系試劑名稱用量（μL）TaqPCRMix預(yù)混液（2X,含藍染料）15Fh-pepck-F3Fg-pepck-F3Fcmn-pepck-R3DNA模版2ddH2O補足至30PCR擴增條件：95℃預(yù)變性90s；95℃變性30s，61℃復(fù)性30s，72℃延伸60s，30個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。PCR用TAE電泳緩沖液配制成1.5%瓊脂凝膠。將瓊脂凝膠放入電泳槽中