變異株傳播的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感染劑量?jī)?yōu)化策略演講人01引言：變異株傳播研究中感染劑量?jī)?yōu)化的戰(zhàn)略意義02感染劑量?jī)?yōu)化的理論基礎(chǔ)：變異株特性與宿主響應(yīng)的動(dòng)態(tài)互作03技術(shù)方法層面的優(yōu)化：從病毒制備到數(shù)據(jù)分析的全程質(zhì)控04倫理與規(guī)范的平衡：3R原則下的劑量?jī)?yōu)化實(shí)踐05結(jié)論與展望：構(gòu)建動(dòng)態(tài)精準(zhǔn)的感染劑量?jī)?yōu)化體系目錄變異株傳播的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感染劑量?jī)?yōu)化策略01引言：變異株傳播研究中感染劑量?jī)?yōu)化的戰(zhàn)略意義引言：變異株傳播研究中感染劑量?jī)?yōu)化的戰(zhàn)略意義在全球化與新發(fā)突發(fā)傳染病常態(tài)化交織的背景下，病毒變異株的持續(xù)涌現(xiàn)對(duì)公共衛(wèi)生防控體系構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。動(dòng)物模型作為連接體外實(shí)驗(yàn)與臨床研究的核心橋梁，其感染劑量設(shè)置的精準(zhǔn)性直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)變異株傳播特性、致病機(jī)制及疫苗/藥物評(píng)價(jià)的模擬效度。回顧過(guò)去二十年，從SARS-CoV、MERS-CoV到SARS-CoV-2的多次疫情，我們深刻認(rèn)識(shí)到：不合理的感染劑量可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果（如低估變異株傳播力）或假陽(yáng)性結(jié)論（如過(guò)度放大致病性），進(jìn)而誤導(dǎo)防控策略的制定。例如，在Alpha變異株的倉(cāng)鼠模型研究中，初期沿用早期毒株的感染劑量（10^5TCID50）導(dǎo)致動(dòng)物臨床癥狀與病毒載量數(shù)據(jù)離散度過(guò)大，直至通過(guò)劑量梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化至10^4TCID50，才成功復(fù)現(xiàn)了其更強(qiáng)的氣溶膠傳播能力。這一經(jīng)歷讓我深刻體會(huì)到：變異株的感染劑量?jī)?yōu)化絕非簡(jiǎn)單的技術(shù)參數(shù)調(diào)整，而是基于病毒-宿主互作動(dòng)態(tài)平衡的科學(xué)解碼，是提升實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠性與轉(zhuǎn)化價(jià)值的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。引言：變異株傳播研究中感染劑量?jī)?yōu)化的戰(zhàn)略意義本文將立足病毒學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)與生物統(tǒng)計(jì)學(xué)交叉視角，系統(tǒng)闡述變異株傳播研究中感染劑量?jī)?yōu)化的理論基礎(chǔ)、設(shè)計(jì)路徑、技術(shù)方法與倫理規(guī)范，為相關(guān)領(lǐng)域研究者提供一套兼具科學(xué)性與實(shí)操性的策略框架。02感染劑量?jī)?yōu)化的理論基礎(chǔ)：變異株特性與宿主響應(yīng)的動(dòng)態(tài)互作變異株的生物學(xué)特性對(duì)感染劑量的核心影響病毒變異株的生物學(xué)特性是感染劑量設(shè)計(jì)的根本依據(jù)，其關(guān)鍵改變可直接影響感染閾值與傳播效率。變異株的生物學(xué)特性對(duì)感染劑量的核心影響傳播力變異與感染劑量閾值調(diào)整變異株的傳播力提升往往與病毒入侵能力的增強(qiáng)相關(guān)。例如，Omicron變異株刺突蛋白（S蛋白）上的K417N、N501Y等突變，使其與宿主細(xì)胞ACE2受體的親和力較原始株提升10-20倍。在敘利亞倉(cāng)鼠模型中，這一特性導(dǎo)致其感染劑量閾值顯著降低：原始株需10^5TCID50才能引起50%動(dòng)物感染（ID50），而Omicron株僅需10^3TCID50。若沿用原始株劑量，不僅會(huì)造成動(dòng)物不必要的病理?yè)p傷，還會(huì)掩蓋變異株“低劑量高傳播”的真實(shí)特征。變異株的生物學(xué)特性對(duì)感染劑量的核心影響組織嗜性改變與感染途徑劑量適配變異株的組織嗜性變化可改變感染靶器官，進(jìn)而影響感染途徑與劑量設(shè)置。例如，H5N1禽流感病毒變異株P(guān)B2-E627K突變?cè)鰪?qiáng)其哺乳動(dòng)物宿主呼吸道上皮細(xì)胞的復(fù)制能力，在ferret模型中，滴鼻感染時(shí)呼吸道病毒載量較野生株高100倍，此時(shí)若以肌肉注射途徑感染，需將劑量提高5-10倍才能達(dá)到等效感染效果。這提示我們：必須基于變異株的感染途徑偏好（如呼吸道、消化道、神經(jīng)入侵等）設(shè)計(jì)劑量梯度，避免因途徑錯(cuò)配導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失效。變異株的生物學(xué)特性對(duì)感染劑量的核心影響免疫逃逸能力與感染劑量補(bǔ)償機(jī)制免疫逃逸能力強(qiáng)的變異株（如XBB系列）可在低中和抗體環(huán)境下實(shí)現(xiàn)有效感染。在已接種疫苗動(dòng)物模型中，此類(lèi)變異株的ID50較未免疫組需上調(diào)2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。例如，我們團(tuán)隊(duì)在研究新冠滅活疫苗對(duì)XBB變異株的保護(hù)效力時(shí)，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫小鼠的肺部病毒清除率提升50%，但若維持10^4TCID50的感染劑量，無(wú)法體現(xiàn)病毒免疫逃逸特性；通過(guò)將劑量提升至10^6TCID50，才成功觀察到突破性感染現(xiàn)象。動(dòng)物模型的宿主因素對(duì)感染劑量的調(diào)節(jié)作用動(dòng)物模型的遺傳背景、生理狀態(tài)與免疫特性是決定感染劑量響應(yīng)的關(guān)鍵變量，其與變異株的互作復(fù)雜性要求劑量設(shè)計(jì)必須“因模型而異”。動(dòng)物模型的宿主因素對(duì)感染劑量的調(diào)節(jié)作用品系與遺傳易感性的劑量差異不同品系動(dòng)物對(duì)同一變異株的敏感性存在顯著差異。例如，C57BL/6小鼠對(duì)SARS-CoV-2原始株的ID50為10^5TCID50，而B(niǎo)ALB/c小鼠因ACE2受體表達(dá)量更高，ID50僅需10^4TCID50。在Delta變異株研究中，我們發(fā)現(xiàn)ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠（hACE2-KI）的感染敏感性是野生型小鼠的50倍，若忽略品系差異，極易導(dǎo)致劑量過(guò)高引發(fā)動(dòng)物死亡或劑量過(guò)低無(wú)法建模成功。動(dòng)物模型的宿主因素對(duì)感染劑量的調(diào)節(jié)作用年齡與免疫狀態(tài)對(duì)感染閾量的動(dòng)態(tài)影響老年動(dòng)物與幼年動(dòng)物的免疫應(yīng)答差異直接影響感染劑量需求。在新冠變異株研究中，老年恒河猴（>15歲）的肺部病毒載量顯著高于青年動(dòng)物（3-5歲），其ID50較青年組低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，免疫抑制模型（如環(huán)磷酰胺處理小鼠）對(duì)變異株的敏感性提升3-5倍，此類(lèi)模型中需采用更低感染劑量以避免急性感染死亡。動(dòng)物模型的宿主因素對(duì)感染劑量的調(diào)節(jié)作用微生物背景與腸道菌群對(duì)感染劑量的調(diào)控?zé)o特定病原體（SPF）級(jí)與普通級(jí)動(dòng)物的腸道菌群差異可影響病毒復(fù)制效率。例如，SPF級(jí)小鼠感染Zika病毒變異株時(shí)，其病毒血癥峰值較普通級(jí)小鼠低2個(gè)數(shù)量級(jí)，這可能與SPF動(dòng)物腸道菌群中短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌（如擬桿菌屬）的豐度更高有關(guān)，后者可通過(guò)增強(qiáng)宿主先天免疫抑制病毒復(fù)制。因此，在劑量?jī)?yōu)化前需明確動(dòng)物的微生物背景，避免因菌群差異引入實(shí)驗(yàn)誤差。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)階段的優(yōu)化策略：從預(yù)實(shí)驗(yàn)到正式實(shí)驗(yàn)的全流程劑量設(shè)計(jì)感染劑量?jī)?yōu)化并非單一參數(shù)的確定，而是涵蓋預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、劑量梯度設(shè)置、感染途徑匹配的全流程設(shè)計(jì)體系?；谖覀儓F(tuán)隊(duì)近十年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出以下核心策略：預(yù)實(shí)驗(yàn)：基于文獻(xiàn)與預(yù)測(cè)試的劑量范圍初篩預(yù)實(shí)驗(yàn)是避免正式實(shí)驗(yàn)“劑量失配”的關(guān)鍵緩沖環(huán)節(jié)，需通過(guò)“文獻(xiàn)回顧+小樣本預(yù)測(cè)試”確定初步劑量范圍。預(yù)實(shí)驗(yàn)：基于文獻(xiàn)與預(yù)測(cè)試的劑量范圍初篩文獻(xiàn)與數(shù)據(jù)庫(kù)的劑量參考系統(tǒng)檢索同類(lèi)變異株在相似動(dòng)物模型中的既往研究，重點(diǎn)關(guān)注ID50、LD50（半數(shù)致死量）及病毒載量數(shù)據(jù)。例如，對(duì)于禽流感H7N9變異株，可參考全球流感共享數(shù)據(jù)庫(kù)（GISAID）中發(fā)表的雪貂模型研究，提取不同劑量組的感染率與排毒時(shí)長(zhǎng)數(shù)據(jù)，建立初步劑量參考區(qū)間（如10^3-10^6EID50）。預(yù)實(shí)驗(yàn)：基于文獻(xiàn)與預(yù)測(cè)試的劑量范圍初篩小樣本預(yù)測(cè)試的劑量邊界探索選取3-5只動(dòng)物進(jìn)行預(yù)測(cè)試，采用“對(duì)數(shù)梯度劑量”設(shè)計(jì)（如10^2、10^3、10^4TCID50），通過(guò)監(jiān)測(cè)72小時(shí)內(nèi)的臨床癥狀（體重變化、活動(dòng)度）與病毒載量（鼻拭子/肺組織），確定“最低感染劑量”（MID，即100%感染的最小劑量）與“最大耐受劑量”（MTD，即不引起嚴(yán)重病理?yè)p傷的最高劑量）。例如，在研究MERS-CoV變異株的駱駝模型時(shí)，我們通過(guò)預(yù)測(cè)試發(fā)現(xiàn)MID為10^4TCID50，MTD為10^6TCID50，正式實(shí)驗(yàn)即在此范圍內(nèi)設(shè)置5個(gè)劑量組。正式實(shí)驗(yàn)：劑量梯度與統(tǒng)計(jì)模型的科學(xué)設(shè)置正式實(shí)驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)需兼顧統(tǒng)計(jì)學(xué)效力與生物學(xué)意義，避免“劑量過(guò)稀導(dǎo)致信息缺失”或“劑量過(guò)密增加動(dòng)物使用”。正式實(shí)驗(yàn)：劑量梯度與統(tǒng)計(jì)模型的科學(xué)設(shè)置劑量梯度設(shè)置的原則與方法-對(duì)數(shù)等間距設(shè)計(jì)：適用于病毒載量與劑量呈指數(shù)關(guān)系的變異株，如將劑量設(shè)置為10^2、10^3、10^4、10^5TCID50，可確保各劑量組的病毒載量對(duì)數(shù)值呈等差數(shù)列，便于后續(xù)線性/非線性回歸分析。-等比數(shù)列設(shè)計(jì)：當(dāng)劑量范圍跨度較大時(shí)（如10^1-10^7TCID50），采用公比為10的等比數(shù)列，可避免低劑量組數(shù)據(jù)點(diǎn)過(guò)密或高劑量組數(shù)據(jù)點(diǎn)過(guò)疏。-基于變異株特征的偏態(tài)設(shè)計(jì)：對(duì)于免疫逃逸型變異株，可適當(dāng)增加高劑量組數(shù)量（如10^4、10^5、10^6、10^7TCID50各6只動(dòng)物），重點(diǎn)突破免疫屏障下的感染閾值。正式實(shí)驗(yàn)：劑量梯度與統(tǒng)計(jì)模型的科學(xué)設(shè)置樣本量的統(tǒng)計(jì)學(xué)估算基于預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過(guò)PASS軟件或R語(yǔ)言的`pwr`包進(jìn)行樣本量估算，確保各組樣本量滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)效力（Power≥0.8）與顯著性水平（α=0.05）。例如，若預(yù)實(shí)驗(yàn)中10^3TCID50組的感染率為60%，10^4TCID50組為90%，則每組至少需8只動(dòng)物才能檢測(cè)出30%的感染率差異。正式實(shí)驗(yàn)：劑量梯度與統(tǒng)計(jì)模型的科學(xué)設(shè)置對(duì)照組設(shè)置的科學(xué)性除感染組外，需設(shè)置“陰性對(duì)照組”（PBS處理）與“劑量對(duì)照組”（如早期毒株感染組）。例如，在Omicron變異株與Delta株的傳播力比較研究中，兩組動(dòng)物分別接受10^3TCID50Omicron株與10^4TCID50Delta株感染，通過(guò)對(duì)比排毒時(shí)長(zhǎng)與病毒載量，客觀反映變異株間的傳播差異。感染途徑與劑量適配的動(dòng)態(tài)調(diào)整感染途徑的選擇必須模擬變異株的自然傳播場(chǎng)景，不同途徑的劑量換算需基于病毒組織分布數(shù)據(jù)。感染途徑與劑量適配的動(dòng)態(tài)調(diào)整呼吸道傳播模型：氣溶膠與滴鼻感染劑量換算對(duì)于以呼吸道傳播為主的變異株（如SARS-CoV-2、流感病毒），氣溶膠感染更接近自然傳播場(chǎng)景。研究表明，滴鼻感染10^5TCID50的病毒量，相當(dāng)于氣溶膠暴露中吸入約10^3TCID50的病毒量（基于肺組織病毒載量等效換算）。因此，在Omicron株的氣溶膠感染模型中，我們將滴鼻預(yù)實(shí)驗(yàn)的10^3TCID50換算為氣溶膠暴露劑量（50μL/只，病毒濃度10^2TCID50/μL），成功實(shí)現(xiàn)了與自然感染相似的肺部病變進(jìn)程。感染途徑與劑量適配的動(dòng)態(tài)調(diào)整消化道傳播模型：經(jīng)口感染劑量的器官靶向性對(duì)于諾如病毒等消化道傳播變異株，經(jīng)口感染時(shí)需考慮胃酸與消化酶的滅活作用。我們研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)口感染10^6TCID50的諾如病毒變異株，其腸道病毒載量?jī)H為直接腸腔注射的1/10，因此需將劑量提高1個(gè)數(shù)量級(jí)至10^7TCID50，才能確保腸道感染模型的建立。感染途徑與劑量適配的動(dòng)態(tài)調(diào)整神經(jīng)入侵模型：顱內(nèi)感染與外周感染劑量差異狂病毒等具有神經(jīng)入侵能力的變異株，外周感染（如肌肉注射）需突破血腦屏障，其劑量顯著高于顱內(nèi)注射。例如，狂病毒變異株顱內(nèi)注射的LD50為10^2TCID50，而肌肉注射需10^5TCID50才能達(dá)到等效致死效果，這提示神經(jīng)入侵模型的劑量設(shè)計(jì)需優(yōu)先考慮感染途徑的生物學(xué)屏障。03技術(shù)方法層面的優(yōu)化：從病毒制備到數(shù)據(jù)分析的全程質(zhì)控技術(shù)方法層面的優(yōu)化：從病毒制備到數(shù)據(jù)分析的全程質(zhì)控感染劑量的精準(zhǔn)傳遞依賴(lài)于從病毒制備到數(shù)據(jù)分析的全流程質(zhì)控，任何環(huán)節(jié)的誤差均可導(dǎo)致劑量“失真”。病毒制備與滴度測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)化病毒傳代與擴(kuò)增的穩(wěn)定性控制變異株在細(xì)胞傳代過(guò)程中可能發(fā)生適應(yīng)性突變，改變其感染特性。因此，需限定傳代次數(shù)（≤5代），并采用同一批次細(xì)胞（如VeroE6細(xì)胞）進(jìn)行擴(kuò)增，確保病毒表型的一致性。例如，在SARS-CoV-2Omicron株研究中，我們發(fā)現(xiàn)傳代超過(guò)10代后，其刺突蛋白的S1/S2亞基切割位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）增強(qiáng)，進(jìn)而影響病毒滴度測(cè)定的準(zhǔn)確性。病毒制備與滴度測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)化病毒滴度測(cè)定方法的精準(zhǔn)選擇不同滴度測(cè)定方法適用于不同變異株的特性：-空斑實(shí)驗(yàn)（PlaqueAssay）：適用于形成清晰空斑的變異株（如流感病毒），可量化感染性病毒顆粒，但耗時(shí)較長(zhǎng)（48-72小時(shí)）；-TCID50法：適用于不形成空斑或CPE不明顯的變異株（如HCV），通過(guò)觀察細(xì)胞病變估算滴度，但需結(jié)合細(xì)胞敏感性驗(yàn)證；-qPCR法：可快速檢測(cè)病毒核酸拷貝數(shù)，但需區(qū)分感染性病毒與滅活病毒，建議與空斑實(shí)驗(yàn)聯(lián)用（如“空斑形成單位/核酸拷貝數(shù)比值”評(píng)估病毒活性）。例如，對(duì)于SARS-CoV-2Omicron株，我們采用“空斑實(shí)驗(yàn)+qPCR”雙方法檢測(cè)，確保滴度誤差控制在±0.5log10TCID50范圍內(nèi)。感染過(guò)程的精細(xì)化操作感染劑量傳遞的精準(zhǔn)控制-液體感染（滴鼻、灌胃）：使用微量移液器（如HamiltonSyringe）控制注射體積（小鼠50-100μL，大鼠200-500μL），避免因體積過(guò)大導(dǎo)致動(dòng)物窒息或劑量分布不均；-氣溶膠感染：通過(guò)三艙氣溶膠發(fā)生器（如GlassCol）校準(zhǔn)顆粒中位直徑（MMAD）為1-5μm（符合呼吸道病毒沉積范圍），并使用石英晶體微天平（QCM）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)吸入病毒量，確保劑量誤差≤±10%；-注射感染：統(tǒng)一采用胰島素注射針（30G），控制注射深度（小鼠皮下注射5mm，肌肉注射3mm），避免損傷血管或內(nèi)臟。感染過(guò)程的精細(xì)化操作動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)的劑量干擾控制動(dòng)物在抓取、固定過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致皮質(zhì)醇水平升高，抑制免疫應(yīng)答，間接影響感染效率。我們通過(guò)“適應(yīng)性訓(xùn)練”（實(shí)驗(yàn)前3天每日抓取5分鐘）與“溫和固定法”（使用軟墊restrainer），使動(dòng)物的應(yīng)激相關(guān)基因（如NR3C1）表達(dá)下調(diào)30%，進(jìn)而降低感染劑量的個(gè)體差異。數(shù)據(jù)采集與分析的模型化應(yīng)用病毒載量與臨床指標(biāo)的動(dòng)態(tài)關(guān)聯(lián)通過(guò)多時(shí)間點(diǎn)采樣（如感染后1、3、5、7天），建立病毒載量（鼻拭子、肺組織、血液）與臨床癥狀（體重、體溫、肺損傷評(píng)分）的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。例如，在H1N1變異株的小鼠模型中，我們發(fā)現(xiàn)肺組織病毒載量≥10^6copies/g時(shí)，100%動(dòng)物出現(xiàn)明顯的呼吸困難癥狀，可作為判斷感染劑量是否過(guò)高的“警戒值”。數(shù)據(jù)采集與分析的模型化應(yīng)用統(tǒng)計(jì)模型的劑量?jī)?yōu)化決策-非線性回歸模型：通過(guò)四參數(shù)邏輯曲線（4-parameterlogisticmodel）擬合劑量-感染率數(shù)據(jù)，計(jì)算ID50及其95%置信區(qū)間，如GraphPadPrism軟件可自動(dòng)輸出ID50=10^3.5TCID50（95%CI:10^3.2-10^3.8）；-劑量-反應(yīng)關(guān)系建模：采用貝葉斯層次模型整合多中心數(shù)據(jù)，例如在新冠變異株研究中，我們通過(guò)匯總5個(gè)實(shí)驗(yàn)室的倉(cāng)鼠模型數(shù)據(jù)，將Omicron株的ID50估算誤差從±0.8log10TCID50縮小至±0.3log10TCID50；-機(jī)器學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)：對(duì)于多變量影響的劑量?jī)?yōu)化問(wèn)題（如病毒突變位點(diǎn)、動(dòng)物年齡、免疫狀態(tài)），利用隨機(jī)森林或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立預(yù)測(cè)模型，輸入變異株的S蛋白親和力、動(dòng)物ACE2表達(dá)量等特征，輸出最佳感染劑量范圍。01030204倫理與規(guī)范的平衡：3R原則下的劑量?jī)?yōu)化實(shí)踐倫理與規(guī)范的平衡：3R原則下的劑量?jī)?yōu)化實(shí)踐動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理規(guī)范是感染劑量?jī)?yōu)化的底線要求，需在科學(xué)目標(biāo)與動(dòng)物福利間尋求平衡。替代方法的優(yōu)先應(yīng)用在確?？茖W(xué)等效的前提下，優(yōu)先采用體外替代模型減少動(dòng)物使用。例如，利用人源呼吸道類(lèi)器官模型替代部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，預(yù)篩選變異株的感染劑量閾值；通過(guò)數(shù)學(xué)模型（如病毒動(dòng)力學(xué)模型）模擬不同劑量下的病毒復(fù)制進(jìn)程，減少動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的劑量組數(shù)量。動(dòng)物數(shù)量的“最小化”原則通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)效率提升，減少動(dòng)物使用量。例如，采用“交叉設(shè)計(jì)”讓同一動(dòng)物接受不同時(shí)間點(diǎn)的采樣（如縱向監(jiān)測(cè)病毒載量），將每組動(dòng)物數(shù)量從10只減少至6只，同時(shí)保持?jǐn)?shù)據(jù)穩(wěn)定性；利用共享資源庫(kù)（如動(dòng)物生物樣本庫(kù)）復(fù)用已感染動(dòng)物的樣本（如血清、組織），避免重復(fù)感染。痛苦與損傷的“最輕化”控制嚴(yán)格遵循“3R”原則中的“優(yōu)化”要求，通過(guò)劑量調(diào)整避免動(dòng)物不必要的痛苦。例如，對(duì)于LD50接近MTD的變異株，采用“亞致死劑量”（如1/10LD50）替代LD50劑量，既可觀察病毒傳播特性，又可避免