第十一章植物生殖工程第一節(jié)概述一、植物生殖工程概念

植物生殖工程：是通過(guò)控制和利用植物有性生殖過(guò)程而改良植物的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，主要指在離體條件下以生殖細(xì)胞和原生質(zhì)體為對(duì)象所進(jìn)行的遺傳操作，包括整個(gè)有性生殖過(guò)程的控制和利用。與體細(xì)胞工程比優(yōu)點(diǎn)：

①有性生殖是大多數(shù)植物的自然生殖過(guò)程，是一種阻力較少的途徑。②生殖過(guò)程中提供了許多基因操作的機(jī)會(huì)．如花粉管是引導(dǎo)雄配子完成受精作用的運(yùn)載工具，具有作為外源基因載體的功能。③植物生殖系統(tǒng)中擁有許多天然的單倍體細(xì)胞，可以直接制備單倍體原生質(zhì)體。④生殖系統(tǒng)中豐富多樣的細(xì)胞類型可用于不同研究途。⑤單倍性的生殖細(xì)胞經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂發(fā)生了各種形式的遺傳重組，具有極大的遺傳變異性，因此通過(guò)生殖工程操作可以直接獲得各種類型的新個(gè)體。植物生殖工程包括二大生殖系統(tǒng)：雄性生殖系統(tǒng)和雌性生殖系統(tǒng)兩種操作方式；活體操作和離體操作；三個(gè)研究水平：即器官、細(xì)胞和原生質(zhì)體水平。二、植物生殖工程的基本操作

1、器官水平操作

A、試管授粉試管授粉或試管受精是指為了克服交配的不親和性，離體培養(yǎng)子房或胚珠而在試管中完成受精過(guò)程。B、子房和胚珠培養(yǎng)

受精子房和胚珠培養(yǎng)的目的也是在于克服雜交或自交胚的敗育。未受精子房和胚珠培養(yǎng)既是誘導(dǎo)卵器細(xì)胞形成單倍體植株進(jìn)行單倍體育種的途徑，又是研究人工誘導(dǎo)無(wú)融合生殖和實(shí)驗(yàn)生殖生物學(xué)的好方法。C、胚和胚乳培養(yǎng)

胚培養(yǎng)是克服遠(yuǎn)緣雜交困難經(jīng)常采用的方法。胚乳是極核受精的產(chǎn)物，一般多為3n。因此進(jìn)行胚乳培養(yǎng)的目的之一，在于培養(yǎng)三倍體植株以獲得無(wú)籽的瓜果，如無(wú)籽西瓜、無(wú)籽柑桔和無(wú)籽枇杷等。D、花藥培養(yǎng)

離體培養(yǎng)花藥是大量獲得單倍體進(jìn)行單倍體育種和遺傳學(xué)研究的重要技術(shù)，也是研究雄核發(fā)育等生殖生物學(xué)問(wèn)題的良好方法。2、細(xì)胞水平的操作

（1）大孢子母細(xì)胞、大孢子和胚囊的分離（2）花粉培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是：A、可以直接研究花粉細(xì)胞的發(fā)育、脫分化與再分化過(guò)程。B、體細(xì)胞組織來(lái)源的愈傷組織或胚狀體形成的植株及混倍體的頻率均可大幅度降低。C、可以減少體細(xì)胞對(duì)花粉細(xì)胞發(fā)育的競(jìng)爭(zhēng)和抑制作用，提高花粉誘導(dǎo)頻率和成苗率。3、原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)

它包括卵及其他胚囊分子的分離、花粉原生質(zhì)體的分離與培養(yǎng)、生殖細(xì)胞與精細(xì)胞的分離與培養(yǎng)、配子—體細(xì)胞融合的研究、受精工程的嘗試等等。第二節(jié)未受精子房和胚珠培養(yǎng)

一、概述SanNoeum(1976)首次利用大麥未受精子房培養(yǎng)出單倍體植株，該項(xiàng)研究成功的意義在于開(kāi)辟了單倍體育種的另一途徑，這對(duì)于花粉培養(yǎng)尚未獲成功的物種尤為重要.二、未受精子房和胚珠培養(yǎng)技術(shù)

①選擇基因型材料；②確定接種期；③選擇培養(yǎng)基；④采用一定的接種方式，如固體培養(yǎng)、液體漂浮培養(yǎng)、平放或直插等；⑤保溫培養(yǎng)；⑥染色體鑒定；⑦染色體加倍；⑧胚囊植株及其后代觀察。三、胚囊植株的起源

①卵細(xì)胞孤雌生殖為主②助細(xì)胞的無(wú)配子生殖③反足細(xì)胞無(wú)配子生殖④其他類型四、胚囊植株的遺傳表現(xiàn)

胚囊植株中的單倍體比例較高，二倍體比例較低，混倍體較少。而且胚囊植株綠苗率高(可達(dá)89．3％)，白化苗率低(8．8％)，與花粉植株白化苗率高的特點(diǎn)呈鮮明的對(duì)比，構(gòu)成了子房培養(yǎng)的一個(gè)十分突出而且十分有意義的特點(diǎn)。

五、植物遺傳工程的受體—胚囊

①胚囊內(nèi)的卵細(xì)胞、助細(xì)胞和中央細(xì)胞在子房成熟時(shí)期呈現(xiàn)部分無(wú)壁的狀態(tài)②單倍體③世代交替的轉(zhuǎn)折期與再生潛能④胚囊體積大，胚囊壁結(jié)構(gòu)特殊第三節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)

一、花藥和花粉培養(yǎng)的意義花藥和花粉培養(yǎng)最易大批量地獲得單倍體，并且從花藥或花粉獲得的單倍體植株可以經(jīng)自發(fā)或誘發(fā)染色體加倍而形成純合二倍體，因此應(yīng)用得最為廣泛。此外，花藥內(nèi)花粉數(shù)量多，本身為單倍體細(xì)胞，離散性好，發(fā)育同步性高，因此在遺傳操作中具重要作用。二、花藥培養(yǎng)的基本技術(shù)和影響因素

基本過(guò)程包括：

①挑選適宜的基因型作材料；②確定花粉發(fā)育時(shí)期；③材料的預(yù)處理；④誘導(dǎo)培養(yǎng)；⑤分化培養(yǎng)；⑥染色體數(shù)觀察和染色體數(shù)加倍；⑦花粉植株當(dāng)代及后代觀察鑒定。影響因素：

1、材料基因型：茄科、禾本科、十字花科的植物所占比例較大。2、材料的預(yù)處理：①低溫預(yù)處理；②離心預(yù)處理；③高溫預(yù)處理或預(yù)培養(yǎng)。

三、雄核發(fā)育途徑、饑餓與花粉二型性

1、雄核發(fā)育的途徑①營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育；②小孢子發(fā)育；③營(yíng)養(yǎng)核、生殖核共同發(fā)育；④生殖核發(fā)育；⑤其他發(fā)育類型。2、花粉的二型性：指同一花藥中存在兩類不同的花粉。一類為正?；ǚ郏鼈兊募?xì)胞質(zhì)較濃，發(fā)育較一致，染色較深；另一類為異?；ǚ郏@類花粉較小，它們的細(xì)胞質(zhì)較淡、染色較淺，發(fā)育落后。

Sunderland等在研究花藥培養(yǎng)的發(fā)育途徑中發(fā)現(xiàn)后一類花粉具有雄核發(fā)育能力，形成花粉胚，因此特稱為胚性花粉或E花粉.從曼陀羅、煙草等植物中觀察到花藥(粉)培養(yǎng)誘導(dǎo)率與這種E花粉的多少有關(guān)，因此認(rèn)為選擇E花粉多的材料，是花藥和花粉培養(yǎng)的關(guān)鍵。小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制在煙草花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，胚胎發(fā)生的小孢子的蛋白質(zhì)和RNA含量?jī)H及無(wú)胚胎發(fā)生的花粉粒的六分之一。某些物質(zhì)的虧缺即“饑餓”被看作是胚胎發(fā)生啟動(dòng)的重要條件。蔗糖饑餓四、花粉培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)是以游離花粉粒進(jìn)行直接培養(yǎng)藥壁組織對(duì)小孢子的啟動(dòng)發(fā)育可能提供重要的促進(jìn)物質(zhì)，稱為花藥因子。作用：①在花粉去分化中藥壁組織向花粉提供了必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。②藥壁組織吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)，起著花粉代謝庫(kù)的作用。Chuong和Beversdorf(1985)在油菜游離花粉培養(yǎng)中也獲得重大進(jìn)展，在一定條件下高頻率地誘導(dǎo)出胚狀體，最高使每個(gè)花藥的花粉形成54個(gè)胚狀體。①將適期花藥的花粉離散出來(lái)，先在32℃下培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入25℃下培養(yǎng)3-4星期。②用13％蔗糖改良Nitsch培養(yǎng)基加入lmg／LNAA和0．5mg／LBA進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

五、花粉植株的遺傳研究

花藥培養(yǎng)產(chǎn)生的花粉植株常出現(xiàn)染色體數(shù)和染色體倍數(shù)性的各種變異類型。煙草花藥培養(yǎng)通過(guò)胚狀體途徑形成的花粉植株幾乎全是單倍體。禾本科植物花藥培養(yǎng)主要經(jīng)愈傷組織途徑形成植株，染色體倍性比較復(fù)雜。水稻和小麥花粉植株中以單倍體為主，也有少數(shù)二倍體。在小麥中發(fā)現(xiàn)有多倍體、混倍體或非整倍體如缺體等。玉米、大麥花粉植株中多數(shù)為混倍體，典型單倍件與二倍體植株卻較少。禾本科花藥培養(yǎng)的另一障礙是產(chǎn)生白化苗。在水稻中產(chǎn)生白苗的趨勢(shì)是野生稻>秈稻>粳稻。對(duì)水稻白苗的一系列研究表明，白化苗產(chǎn)生是由于葉綠體不能正常形成，而葉綠體的異常是由于存在于細(xì)胞質(zhì)中的rRNA缺失。第四節(jié)胚囊類細(xì)胞的分離

一、意義胚囊類細(xì)胞是大孢子母細(xì)胞、大孢子、胚囊的細(xì)胞的合稱。胚囊分離技術(shù)的建立，對(duì)于研究和利用胚囊類細(xì)胞具有十分重要的意義。①胚囊細(xì)胞是天然單倍體②可以直接研究生活胚囊③進(jìn)行雌性生殖系統(tǒng)的再生與發(fā)育研究④提供離散的卵⑤用活胚囊為受體進(jìn)行遺傳操作與基因轉(zhuǎn)化研究二、分離方法

1、酶解涂抹法：用果膠酶處理雀稗屬(Paspalum)的幾個(gè)種的子房，使子房壁離解疏松，然后挑出離解的子房置于玻片上進(jìn)行涂抹，觀察到成熟胚囊的基本結(jié)構(gòu)。2、酶解振蕩法：將固定或活體的胚珠置于含有纖維素酶、果膠酶或蝸牛酶及一定滲透穩(wěn)定劑、膜穩(wěn)定劑的酶液中，在小型振蕩器上保溫(28--30℃)連續(xù)振蕩酶解，使珠被組織離散，再經(jīng)過(guò)離心分離、清洗純化，獲得較清凈的胚囊類細(xì)胞，最后進(jìn)行顯微觀察和細(xì)胞學(xué)研究。3、酶解壓片分離法①獲得無(wú)菌胚珠②酶解：將生活胚珠放入酶液中28℃黑暗條件下處理3．5-4h.③清洗：用0.6mol／L甘露醇洗凈酶液④壓片：滴一滴含有酶解后胚珠的液體于載玻片上，加上蓋玻片。⑤觀察：制好的壓片用石蠟封邊后在相差顯微鏡下觀察。。④壓片：滴一滴含有酶解后胚珠的液三、問(wèn)題

①胚囊壁及胚囊周圍組織的結(jié)構(gòu)特異性。②酶類的應(yīng)用：木質(zhì)化或栓質(zhì)化的組織，采用目前應(yīng)用的酶類去分離則比較困難。③胚囊數(shù)少第五節(jié)植物性細(xì)胞原生質(zhì)體

的分離、培養(yǎng)和融合

與體細(xì)胞相比，性細(xì)胞具有其獨(dú)自的特色：第一，它們具單倍性基因組，遺傳組成單一。第二，它們經(jīng)歷兩性分化與一系列的發(fā)育程序，產(chǎn)生形態(tài)與生理各異的多種細(xì)胞類型。第三，它們適應(yīng)于有性生殖，能通過(guò)傳粉受精，繁殖種子與后代。一、原生質(zhì)體分離

1、花粉原生質(zhì)體的分離

花粉具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、單倍體遺傳組成、發(fā)育同步、數(shù)量眾多、參與傳粉受精作用等特點(diǎn)。三條技術(shù)路線：化學(xué)藥品降解花粉壁非酶脫壁酶解法一步酶解法花粉置于酶液中，通過(guò)水合膨脹，使外壁沿萌發(fā)溝裂開(kāi)，內(nèi)壁大面積地暴露在酶的作用之下而分解，釋放出原生質(zhì)體。

水合-酶解二步法第一步，花粉在蔗糖液內(nèi)充分水合，使外壁裂開(kāi)。第二步，轉(zhuǎn)入酶液，降解內(nèi)壁，獲得原生質(zhì)體。甘藍(lán)型油菜與紫菜苔、凌霄花萌發(fā)-酶解二步法第一步是將成熟花粉置于花粉萌發(fā)培養(yǎng)基中，待花粉大量萌發(fā)，長(zhǎng)出短花粉管，及時(shí)轉(zhuǎn)入第二步，在酶液中酶解。

由于花粉管尖端的壁為果膠質(zhì)與纖維素所組成，酶液由此處開(kāi)始降解花粉管壁，再擴(kuò)展至降解花粉內(nèi)壁，從而釋放出原生質(zhì)體。煙草。影響分離效果的因素

(1)植物種類

(2)花粉發(fā)育時(shí)期

(3)酶的種類

(4)酶液滲透壓

(5)新鮮與保存花粉2、生殖細(xì)胞與精細(xì)胞的分離細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞器稀少，核質(zhì)比很高。類似天然的單倍性的核質(zhì)體，在植物性細(xì)胞工程中有特殊作用。生殖細(xì)胞的分離

(1)一步滲透壓沖擊法花粉置于低滲蔗糖溶液中保溫一段時(shí)間后，花粉自行破裂，生殖細(xì)胞隨營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞質(zhì)流出。棉花

(2)二步滲透壓沖擊法花粉置于等滲蔗糖溶液中培養(yǎng)，當(dāng)大部分花粉開(kāi)始萌發(fā)時(shí)，加入蒸餾水使?jié)B透壓驟降，導(dǎo)致花粉破裂釋放生殖細(xì)胞。石蒜、風(fēng)雨花、玉簾、煙草、鳳仙花、蠶豆

(3)低酶法花粉在低濃度酶(一般為0．1％纖維素酶與0．1％果膠酶)與低滲蔗糖溶液中保溫，促使花粉破裂釋放生殖細(xì)胞。黃花菜、韭菜、朱頂紅、唐菖蒲、鳶尾

(4)花粉原生質(zhì)體釋放法首先分離出花粉原生質(zhì)體，然后用滲透壓沖擊法或機(jī)械法，使花粉原生質(zhì)體破裂，獲得生殖細(xì)胞。鳶尾、唐菖蒲、朱頂紅、風(fēng)雨花等。精細(xì)胞的分離三細(xì)胞花粉二細(xì)胞花粉(1)三細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離方法研磨法：用玻璃勻漿器輕輕研磨花粉懸浮液，使花粉壁破碎，釋放出精細(xì)胞。甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、紫菜苔、非洲菊、菠菜滲透壓沖擊法：將花粉置于低滲溶液中，使花粉自行破裂。白花丹、玉米、小麥、甜菜

(2)二細(xì)胞花粉的精細(xì)胞分離活體--離體法：將花粉授于柱頭上，切下一定長(zhǎng)度的花柱插入液體培養(yǎng)基中。當(dāng)花粉管由花柱切口中長(zhǎng)出后，用滲透壓沖擊或酶液處理，促使花粉管尖端破裂釋放精細(xì)胞。杜鵑花、唐菖蒲、鳶尾、棉花、朱頂紅、煙草、黃花菜、萱草、離體萌發(fā)法：花粉置于培養(yǎng)基中人工萌發(fā)，待生殖細(xì)胞在花粉管中已分裂形成精細(xì)胞之后，用滲透壓沖擊等方法使花粉管破裂，釋放出精細(xì)胞。3、胚囊內(nèi)成員細(xì)胞的分離一般先用人工解剖法除去子房壁，然后以胚珠為單位分離出胚囊，再由胚囊分離出其成員細(xì)胞。酶法胚珠置于酶液中酶解，使珠被與珠心細(xì)胞離散，裸露出胚囊。一般需在酶解的基礎(chǔ)上，適當(dāng)輔加機(jī)械處理，如吸打、壓片或解剖，以提高分離胚囊的效果。解剖法應(yīng)用顯微操作器直接解剖胚囊及其成員細(xì)胞，技術(shù)上較難，效率較低。二、原生質(zhì)體體培養(yǎng)1、花粉原生質(zhì)體的培養(yǎng)花粉原生質(zhì)體也有配子體發(fā)育與孢子體發(fā)育兩條途徑。成熟花粉原生質(zhì)體培養(yǎng)能夠萌發(fā)出花粉管，其中生殖細(xì)胞分裂形成精細(xì)胞，表現(xiàn)出配子體發(fā)育的趨勢(shì)。2、生殖細(xì)胞培養(yǎng)吳新莉與周嫦將分離的黃花菜生殖細(xì)胞在含多種附加物以及花藥作為飼養(yǎng)物的MS瓊脂培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)，部分細(xì)胞發(fā)生1-2次核分裂，形成2—4核的細(xì)胞。平均分裂率為3．27％，最高分裂率達(dá)11．46％。3、胚囊與卵細(xì)胞培養(yǎng)最近，Holm等培養(yǎng)大麥?zhǔn)芫穆鸭?xì)胞，發(fā)生了細(xì)胞分裂。單獨(dú)的受精卵培養(yǎng)能夠發(fā)育到小愈傷組織；用大麥小孢子作飼養(yǎng)物，受精卵能發(fā)育成胚狀體，最后達(dá)到成熟植株，開(kāi)花結(jié)實(shí)。三、原生質(zhì)體融合1、性細(xì)胞與體細(xì)胞之間的融合

1986年首次報(bào)道粘毛煙草四分體原生質(zhì)體和普通煙草硝酸還原酶缺陷型的葉肉原生質(zhì)體的融合及其融合體再生植株。最近，在幼嫩花粉原生質(zhì)體分離成功的基礎(chǔ)上，游離時(shí)期的花粉原生質(zhì)體與體細(xì)胞原生質(zhì)體的融合獲得成功。李昌功等青菜幼嫩花粉原生質(zhì)體*甘藍(lán)型油菜下胚軸原生質(zhì)體融合了小植株。2、性細(xì)胞與性細(xì)胞之間的融合性性融合有多種組合，其中以精卵融合工作進(jìn)展最快，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

Kranz等曾首次報(bào)道用微電融合技術(shù)誘導(dǎo)了玉米單個(gè)精細(xì)胞與單個(gè)卵細(xì)胞成對(duì)融合，融合體在離體條件下發(fā)生細(xì)胞分裂，形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。由28個(gè)融合體培養(yǎng)再生了11個(gè)植株.

一個(gè)新的發(fā)展趨勢(shì)是采用非電融合誘導(dǎo)精卵融合。非電融合方式，比較接近體內(nèi)受精條件，有利于研究受精理論。低濃度CaCl25mmol溶液進(jìn)行玉米精卵融合。融合率達(dá)79．7％。他們用玉米卵細(xì)胞、精細(xì)胞與葉肉原生質(zhì)體為材料，做了各種組合的融合試驗(yàn)。結(jié)果，精卵融合率最高即79．7％，表明精卵細(xì)胞之間的融合是有特異性的。顯微注射用顯微操作器將分離的精細(xì)胞或精核注入胚囊，是體外受精的另一種嘗試。最近，Mathys-Rochon等將玉米分離的精細(xì)胞核注入分離胚囊的卵細(xì)胞與中央細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞