(10)申請公布號CN110849996A(21)申請?zhí)?01911203082.9(71)申請人云南綠新生物藥業(yè)有限公司地址655000云南省曲靖市沾益區(qū)城西工業(yè)園區(qū)(72)發(fā)明人王鉦霖劉勝貴馬海悅付彬彬李智高孔令羽(54)發(fā)明名稱一種工業(yè)大麻花葉中大麻色烯(CBC)含量的測定方法(57)摘要本發(fā)明涉及檢測技術領域，特別涉及一種工業(yè)大麻花葉中大麻色烯(CBC)的定量檢測方法。本方法包括以下步驟：將干燥后的大麻花葉粉渣重復用甲醇超聲提取一次，離心合并上清液，濃縮定容得到待測液，用高效液相色譜儀對待測液進行檢測。高效液相色譜儀的流動相為水和乙腈，等度洗脫。采用外標法定量得到待測液中大麻色烯(CBC)的含量。本方法操作簡單、分離度好，使大麻花葉中的大麻色烯(CBC21.一種工業(yè)大麻花葉中大麻色烯(以下簡稱CBC)含量的測定方法，其特征在于，包括如(1)將新鮮工業(yè)大麻花葉樣品于烘箱中60℃下干燥，粉碎機粉碎，混勻待測；(2)準確稱取花葉樣品于離心管中，加入有機溶劑，超聲提取，離心收集上清液，殘渣重(3)用高效液相色譜儀對待測液進行檢測，所述高效液相色譜儀流動相為水和乙腈，等度洗脫；(4)使用外標法定量：用CBC標準對照品配得系列對照品溶液，外標法測得大麻花葉待測液中大麻色烯CBC的含量。2.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于所述大麻花葉為9月采摘的成熟工業(yè)大麻的葉和花苞組合物，60℃干燥至水分小于5%,粉碎機粉碎至20目。3.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于所述有機溶劑為色譜純?nèi)軇?，為甲醇、乙醇、正己烷、乙酸乙酯中一種或兩種混合物，有機溶劑所用體積量與花葉樣品質(zhì)量比為5~4.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于超聲時間為5min~30min,超聲功率為250W,工作頻率為40kHz。5.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于所述離心的轉(zhuǎn)速為5000~10000轉(zhuǎn)/分6.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于所述高效液相色譜儀品牌型號為安捷倫1260;所述流動相乙腈為色譜純，水為去離子水，乙腈與水的比例為(60%~80%):(20%~40%),等度洗脫，流速為0.8mL/min~1.2mL/min;所述高效液相色譜儀進樣量為8uL～12uL;所述高效液相色譜儀柱溫為20℃~40℃;所述高效液相色譜儀檢測波長為210nm~7.根據(jù)權利要求1所述的測定方法，其特征在于所述CBC標準對照品溶液購自美國Sigma公司，配制成系列對照品溶液，進高效液相色譜儀檢測，以物為縱坐標繪制標準曲線。3技術領域[0001]本發(fā)明涉及檢測技術領域，特別涉及一種工業(yè)大麻花葉中大麻色烯(CBC)含量的測定方法。背景技術[0002]工業(yè)大麻是指四氫大麻酚(THC)含量低于0.3%的大麻，我國將工業(yè)大麻稱為漢麻，是大麻科大麻屬一年生草本植物，大麻中的主要活性成分是大麻素類化合物，目前已知天然大麻素有70種。[0003]其中大麻色烯(以下簡稱CBC)是僅次于大麻二酚(CBD)和四氫大麻酚(THC)最為常能，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MR-SA)顯現(xiàn)出殺菌活性；CBC對部分酵母菌、絲狀真菌、皮膚癬菌等各類真菌均有輕至中度的抗性；CBC自身有很好的抗炎作用，2010年研究發(fā)現(xiàn)，一個強大的抗腫瘤組合體；此外CBC還有抗抑郁和促進大腦細胞新生的作用，具有減少患老年癡呆癥的風險等藥用價值。[0004]目前，工業(yè)大麻醫(yī)用研究是新的熱點，雖然目前針對CBC的研究較CBD少，但目前的測定花葉原料中的大麻色烯含量十分重要。但目前尚未有權威的大麻色烯檢測標準，因此開發(fā)一種能夠準確測定工業(yè)大麻花葉中大麻色烯含量的檢測方法十分必要。發(fā)明內(nèi)容[0005]本發(fā)明使用甲醇超聲提取工業(yè)大麻花葉中的大麻色烯(CBC),用高效液相色譜儀[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：(1)本發(fā)明提供了一種工業(yè)大麻花葉中大麻色烯(CBC)含量的測定方法，包括如下步①將新鮮工業(yè)大麻花葉樣品于烘箱中60℃下干燥12小時(至水分小于5%),粉碎機粉碎[0007]②準確稱取花葉樣品于離心管中，加入有機溶劑，超聲提取，然后離心收集上清液，濾渣重復超聲提取一次，離心合并上清液，上清液濃縮定容過濾膜得到待測液。[0008]③用高效液相色譜儀對待測液進行檢測，高效液相色譜儀流動相為水和乙腈，等度洗脫。[0009]④使用外標法定量：用CBC標準對照品配得系列對照品溶液，外標法測得大麻花葉[0010](2)進一步的，步驟①中所述大麻花葉為9月采摘的成熟工業(yè)大麻的葉和花苞組合4乙酯中一種或兩種混合物，有機溶劑所用體積量與花葉樣品質(zhì)量比為5~20:1。[0012](4)優(yōu)選地，步驟②中所述有機溶劑為色譜純甲醇，甲醇體積與大麻花葉質(zhì)量比為[0013](5)進一步的，步驟②中所述超聲時間為5min~30min。[0014](6)優(yōu)選地，步驟②中所述超聲時間為20min,超聲功率為250W,工作頻率為40kHz。[0015](7)進一步的，步驟②中所述離心轉(zhuǎn)速為5000~10000轉(zhuǎn)/分鐘，時間為5~10分鐘。[0016](8)優(yōu)選地，步驟②中所述離心轉(zhuǎn)速為10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心時間為5分鐘。[0017](9)進一步的，步驟③中所述高效液相色譜儀品牌型號為安捷倫1260;所述流動相乙腈為色譜純，水為去離子水，乙腈與水的比例為(60%~80%):(20%~40%),等度洗脫，流速為0.8mL/min~1.2mL/min;所述高效液相色譜儀進樣量為8uL~12uL;所述高效液相色譜儀柱溫為20℃~40℃;所述高效液相色譜儀檢測波長為210nm~230nm。[0018](10)優(yōu)選地，步驟③乙腈與水的比例為65%:35%,流速為1mL/min;進樣量為10uL;色譜柱為AgilentZORBAXEclipsePlusC18,柱溫為30℃,檢測波長為220nm。[0019](11)進一步的，步驟④中所述CBC標準對照品溶液購自美國Sigma公司，濃度為檢測，以物質(zhì)濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。[0020]本發(fā)明的優(yōu)點：①本發(fā)明用甲醇進行超聲提取大麻花葉中的大麻色烯(CBC),實驗操作簡單，處理時間[0021]②本發(fā)明用去離子水和乙腈作為流動相、等度洗脫，目標物峰形好、分離度好。本發(fā)明流動相使用純水，無需配置緩沖鹽，能夠延長色譜柱等儀器部件的使用周期，儀器維護簡單。附圖說明[0022]圖1大麻色烯(CBC)標準對照品色譜圖。[0023]圖2大麻色烯(CBC)標準曲線。[0024]圖3實施例2大麻花葉樣品色譜圖。[0025]圖4實施例3大麻花葉樣品色譜圖。[0026]圖5實施例4大麻花葉樣品色譜圖。具體實施方式[0027]以下實施例僅是對本發(fā)明予以解釋說明，并未對本發(fā)明的保護范圍進行任何限制。對于本領域技術人員而言，凡未脫離本發(fā)明技術精神所作的同等實施方式或變更均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。[0028]實施例1(1)將新鮮工業(yè)大麻花葉樣品于60℃下干燥12小時(水分小于5%),粉碎機粉碎至20目，5混勻待測。[0029](2)準確稱取花葉樣品1.0g于離心管中，加入10mL甲醇，超聲提取20分鐘，然后用離心機10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至濃縮瓶中，殘渣用10mL甲醇重復超聲提取一次，離心，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(溫度40℃)濃縮除去部分溶劑，濃縮液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，甲醇定容，過0.22um有機濾膜得到待測液。[0030](3)高效液相色譜儀(安捷倫1260)儀器條件設置為：流動相色譜純乙腈與去離子水的比例為65%:35%,等度洗脫，流速為1mL/min;進樣量為10uL;色譜柱為AgilentZORBAXEclipsePlusC18,柱溫為30℃;檢測波長為220nm。[0031](4)系列對照品溶液配置：CBC標準品溶液購自美國Sigma公司，濃度為1mg/mL的CBC標準品溶液分別用色譜純甲醇稀釋為1ug/mL、2ug/mL、4ug/mL、8ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、100ug/mL的系列對照品溶液，以上述色譜條件進高效液相色譜儀檢測，以物質(zhì)濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。[0032](5)外標法定量：在上述色譜條件下，待測樣品用液相色譜進行檢測，對照CBC標準對照品的對應保留時間，記錄CBC的峰面積值，將峰面積帶入外標曲線，即可得到待測液中CBC的濃度，進而計算得大麻花葉樣品中CBC的含量。[0034]實施例2(1)將新鮮工業(yè)大麻花葉樣品于60℃下干燥12小時(水分小于5%),粉碎機粉碎至20目，混勻待測。[0035](2)準確稱取花葉樣品1.0g于離心管中，加入10mL乙醇，超聲提取20分鐘，然后用離心機10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至濃縮瓶中，殘渣用10mL乙醇重復超聲提取一次，離心，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(溫度40℃)濃縮除去部分溶劑，濃縮液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，乙醇定容，過0.22um有機濾膜得到待測液。[0036](3)高效液相色譜儀(安捷倫1260)儀器條件設置同實施例1。[0037](4)系列對照品溶液配置同實施例1。[0038](5)外標法定量同實施例1。[0040]實施例3(1)將新鮮工業(yè)大麻花葉樣品于60℃下干燥12小時(水分小于5%),粉碎機粉碎至20目，混勻待測。[0041](2)準確稱取花葉樣品1.0g于離心管中，加入10mL正己烷+乙酸乙酯混合液(體積比為9:1),超聲提取20分鐘，然后用離心機10000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至濃縮瓶中，殘渣用10mL正己烷+乙酸乙酯混合液重復超聲提取一次，離心，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(溫度40℃)濃縮除去部分溶劑，濃縮液轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，正己烷+乙酸乙酯混合液定容，過0.22um有機濾膜得到待測液。[0042](3)高效液相色譜儀(安捷倫1260)儀器條件設置同實施例1。[0043](4)系列對照品溶液配置同實施例1。[0044](5)外標法定量同實施例1。6[0046]由圖5可見而正己烷-乙酸乙酯作為提取溶劑，樣品在CBC標準品出峰處41.0min未出峰，且有雜峰干擾。圖3用甲醇作為提取劑色譜圖峰形對稱、不拖尾、分離度好，圖4用乙醇作為提取劑較甲醇峰面積少約10%,故優(yōu)選甲醇作為測定CBC的提取溶劑。[0047]實施例4重復性試驗按照實施例1的方法制備處理樣品。取同一個樣品做6份平行樣，按照供試品溶液制備方法，平行操作。重復做三天，考察重復性。結果見表1,日內(nèi)峰面積RSD均小于2%,日間峰面積RSD小于0.5%,表明本方法重復性良好。[0048]表1重復性試驗結果(峰面積)物質(zhì)時間日間以上實施例僅是對本發(fā)明予以解釋說明，并未對本發(fā)明的保護范圍進行任何限制。對于本領域技術人員而言，凡未脫離本發(fā)明技術精神所做的同等實施方式或變更均在本發(fā)明