武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)應(yīng)用IHC經(jīng)過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面或細(xì)胞間正?；虍惓Ｎ镔|(zhì)，以研究組織細(xì)胞正常生理、代謝及疾病病因、發(fā)病機(jī)理，廣泛用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表示水平檢測(cè)，細(xì)胞屬性判定、淋巴細(xì)胞免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡研究，以及細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究等。第1頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室試驗(yàn)名稱鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-PeroxidaseConjugatedMethod,簡(jiǎn)稱S-P法)檢測(cè)胃癌組織CK／Vimentin蛋白表示第2頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室S-P法原理示意圖過氧化物酶鏈酶親和素生物素生物素化二抗特異性一抗待測(cè)抗原第3頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)基本試驗(yàn)流程組織、細(xì)胞標(biāo)本

抗原修復(fù)

阻斷內(nèi)源性過氧化物酶

正常血清封閉

滴加特異性一抗滴加二抗

滴加三抗顯色復(fù)染封片

第4頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室詳細(xì)步驟以下：1．石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，以0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；2．全部組織均采取微波修復(fù)抗原；3．室溫冷卻后，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；4．滴加50μl過氧化物酶阻斷液（試劑A），37℃濕盒孵育10min；5．0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；6．滴加非免疫性動(dòng)物血清（試劑B），37℃濕盒孵育10min；第5頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室7．甩去多出血清，分別滴加２種抗體，4℃濕盒孵育過夜，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；8．滴加生物素標(biāo)識(shí)二抗（試劑C），37℃濕盒孵育15min，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；9．滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液（試劑D），37℃濕盒孵育15min，甩去多出液體；10．每片滴加新鮮配制二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間（約為1-5min），自來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染；11．常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片并鏡檢分析；12．陽性對(duì)照采取已知陽性片為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照采取PBS取代第一抗體，其余步驟相同。第6頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室試驗(yàn)流程中注意事項(xiàng)內(nèi)源性過氧化物酶滅活血清封閉沖洗抗體選擇及一抗孵育時(shí)間檢測(cè)及顯色系統(tǒng)復(fù)染第7頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理

－取材、脫水、浸蠟組織及時(shí)固定

固定劑選擇：10%中性緩沖福爾馬林4%多聚甲醛常規(guī)下固定8-二十四小時(shí)取材厚度：2mm第8頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理

－預(yù)防脫片常選取多聚耐氨酸（poly-L-lysine）注意：1）應(yīng)嚴(yán)格控制使用次數(shù)2）玻片潔凈度第9頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理

－包埋與切片

包埋：選擇低熔點(diǎn)石蠟，溫度不超出62℃切片：厚度

3-4μm

烤片：溫度60℃，時(shí)間1小時(shí)；或60℃2小時(shí)（邁新）；或60℃過夜第10頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理

－切片保留切片不宜長(zhǎng)時(shí)間在常溫下保留第11頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室染色前處理

－脫臘標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化脫蠟試劑應(yīng)與常規(guī)HE脫蠟分開第12頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室試驗(yàn)操作中應(yīng)用抗原修復(fù)試驗(yàn)操作中注意事項(xiàng)第13頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室抗原修復(fù)影響染色結(jié)果最關(guān)鍵原因抗原修復(fù)方法分類1）酶消化法2）加熱法（高壓法?水煮法?微波法）抗原修復(fù)液選擇

1）檸檬酸鹽緩沖液（PH7.2-7.4）2）Tris（PH7-8）3）EDTA（PH8.0）

第14頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室內(nèi)源性過氧化物酶滅活存在部位：紅細(xì)胞、橫紋肌細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肝細(xì)胞及腎細(xì)胞消除方法：3%H2O2浸泡10分鐘第15頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室血清封閉目標(biāo)：降低非特異性著色時(shí)間：普通在加載一抗之前使用第16頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室沖洗普通采取PBS（PH7.4-7.6）充分沖洗增加效果可加入Tween20第17頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室一抗孵育時(shí)間及抗體選擇應(yīng)選擇信譽(yù)高、質(zhì)量好試劑企業(yè)抗體切忌重復(fù)凍融一抗為濃縮液時(shí)，需選擇最正確稀釋濃度按說明書可采取37℃1-2小時(shí)或4℃冰箱過夜第18頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室檢測(cè)及顯色系統(tǒng)普通采取以生物素標(biāo)識(shí)辣根過氧化物酶為基礎(chǔ)檢測(cè)方法。如SP、LSABC、ABC等顯色方法：經(jīng)常采取辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測(cè)第19頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室顯色系統(tǒng)慣用酶1.辣根過氧化物酶(HRP)A:顯色底物DAB-----棕黃色敏感度高、定位清楚、易于觀察、保留B:顯色底物AEC-----磚紅色2.堿性磷酸酶(AP)顯色底物:BCIP/NBT----藍(lán)紫色第20頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室復(fù)染標(biāo)準(zhǔn)：注意二者之間對(duì)比，突出陽性信號(hào)第21頁(yè)武漢大學(xué)病理教研室試驗(yàn)對(duì)照設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)：全部檢測(cè)指標(biāo)均設(shè)陽性