家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因的克隆與表達機制探究一、緒論1.1細小病毒概述1.1.1細小病毒的特征及分類細小病毒是一類體型微小的病毒，其病毒粒子呈圓形或六邊形，直徑范圍在18-26nm之間，不具備囊膜結(jié)構(gòu)，衣殼呈現(xiàn)出典型的二十面體對稱形態(tài)，由32個長約3-4nm的殼粒組成。在核酸類型方面，細小病毒為單股線狀DNA，大小通常在5kb左右。細小病毒在病毒分類學(xué)中屬于細小病毒科，該科又進一步分為細小病毒亞科和濃核病毒亞科。其中，細小病毒亞科主要感染脊椎動物，而濃核病毒亞科則主要感染昆蟲等無脊椎動物。分類的主要依據(jù)包括病毒的宿主范圍、基因組結(jié)構(gòu)以及抗原性等差異。例如，犬細小病毒屬于細小病毒亞科、細小病毒屬，專門感染犬科動物；而黑胸大蠊?jié)夂瞬《緞t屬于濃核病毒亞科、雙義濃核病毒屬，特異性地感染黑胸大蠊。1.1.2細小病毒的基因組特征細小病毒的基因組為單鏈DNA，其基因排列較為緊湊，通常包含兩個主要的開放閱讀框（ORF）。其中一個ORF主要編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，如NS1、NS2等，這些非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及調(diào)控等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。另一個ORF則編碼結(jié)構(gòu)蛋白，如VP1、VP2等，它們是構(gòu)成病毒衣殼的主要成分，對病毒粒子的組裝和感染性起著決定性作用。在基因組的兩端，存在著反向重復(fù)序列（ITRs），這些序列能夠形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，對于病毒基因組的復(fù)制起始、終止以及包裝等過程至關(guān)重要。以犬細小病毒為例，其基因組大小約為5.2kb，兩端的ITRs參與了病毒DNA的復(fù)制起始，通過與病毒自身編碼的蛋白以及宿主細胞的相關(guān)因子相互作用，啟動病毒基因組的復(fù)制。1.1.3細小病毒的復(fù)制細小病毒的復(fù)制過程起始于病毒粒子與宿主細胞表面的特異性受體結(jié)合，這個過程具有高度的特異性，決定了病毒的宿主范圍和組織嗜性。例如，犬細小病毒主要通過與犬轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）結(jié)合，從而侵入犬的細胞。吸附完成后，病毒通過內(nèi)吞作用進入細胞，隨后在細胞內(nèi)發(fā)生脫殼，釋放出病毒基因組。在基因組復(fù)制階段，由于細小病毒為單鏈DNA病毒，其復(fù)制過程較為復(fù)雜。首先，以病毒的單鏈DNA為模板，在宿主細胞的DNA聚合酶以及病毒自身編碼的相關(guān)蛋白（如NS1）的作用下，合成互補鏈，形成雙鏈DNA中間體。這個雙鏈DNA中間體作為模板，進行大量的病毒基因組復(fù)制。在復(fù)制過程中，病毒基因組兩端的反向重復(fù)序列發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們通過形成特殊的結(jié)構(gòu)，引導(dǎo)DNA聚合酶準確地識別復(fù)制起始位點，保證復(fù)制的順利進行。隨著基因組復(fù)制的進行，病毒的結(jié)構(gòu)蛋白也在宿主細胞的核糖體上合成。這些結(jié)構(gòu)蛋白與新合成的病毒基因組在細胞核內(nèi)進行裝配，形成完整的病毒粒子。裝配完成的病毒粒子通過裂解宿主細胞或者出芽等方式釋放到細胞外，繼續(xù)感染其他細胞，從而完成病毒的復(fù)制周期。1.2濃核病毒的研究1.2.1濃核病毒的特征濃核病毒（Densonucleosisvirus，DNV）屬于細小病毒科濃核病毒亞科，是一類專一感染無脊椎動物的小型單鏈DNA病毒。其病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑范圍在18-26nm之間，沒有囊膜包裹。在電子顯微鏡下觀察，濃核病毒粒子表面具有獨特的形態(tài)特征，例如黑胸大蠊?jié)夂瞬《荆≒fDNV）表面較為光滑，在三重軸上存在小刺狀突起但無釘狀突起，五重軸上沒有五重軸通道和峽谷區(qū)，不過有類似于三重軸上的小刺狀結(jié)構(gòu)，兩重軸上還存在酒窩樣凹陷，這些結(jié)構(gòu)特征使其區(qū)別于其他細小病毒。濃核病毒的核酸為單鏈DNA，基因組大小一般在4-7kb左右，根據(jù)基因組的編碼策略和病毒粒子的特性，可分為多個屬，不同屬的濃核病毒在基因組成和蛋白表達等方面存在一定差異。1.2.2濃核病毒的感染特性濃核病毒主要通過口器攝入、傷口感染等途徑侵入宿主。例如，昆蟲宿主可能在取食過程中攝入含有病毒的食物或水分，從而感染濃核病毒。其感染范圍具有一定的宿主特異性，通常只感染特定種類的無脊椎動物，如黑胸大蠊?jié)夂瞬《局桓腥竞谛卮篌?，而家蠶濃核病毒則主要感染家蠶。濃核病毒侵入宿主細胞后，會在細胞核內(nèi)進行復(fù)制和裝配。在感染早期，病毒利用宿主細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯機制，表達自身的非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白參與病毒基因組的復(fù)制和調(diào)控。隨著感染的進行，病毒開始大量合成結(jié)構(gòu)蛋白，與復(fù)制后的基因組組裝成新的病毒粒子。感染濃核病毒的宿主通常會出現(xiàn)一系列病理變化，如食欲不振、生長發(fā)育受阻、身體麻痹甚至死亡等。這些癥狀的出現(xiàn)與病毒對宿主細胞的破壞以及對宿主生理代謝的干擾密切相關(guān)。1.2.3濃核病毒的基因組結(jié)構(gòu)濃核病毒的基因組為單鏈DNA，根據(jù)基因組的編碼策略和轉(zhuǎn)錄方向，可分為單義濃核病毒和雙義濃核病毒。單義濃核病毒的基因組只在一個方向上進行轉(zhuǎn)錄，編碼所有的病毒蛋白；而雙義濃核病毒的基因組則在兩個相反的方向上進行轉(zhuǎn)錄，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。以黑胸大蠊?jié)夂瞬《緸槔?，其基因組為雙義DNA，正義鏈編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（NS），反義鏈編碼衣殼蛋白（VP）。在基因組的兩端，存在著反向重復(fù)序列（ITRs），這些序列能夠形成特殊的二級結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，對于病毒基因組的復(fù)制起始、終止以及包裝等過程至關(guān)重要。在復(fù)制過程中，濃核病毒可能采用“自身引物，發(fā)夾轉(zhuǎn)移”的方式，首先以折疊的3'端回文序列為引物合成病毒DNA中間體，最后通過特異性位點的切割而得到子代病毒DNA。這種獨特的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制方式，使得濃核病毒在無脊椎動物宿主中能夠高效地進行復(fù)制和傳播。1.2.4家蠶濃核病毒的特征家蠶濃核病毒（Bombyxmoridensovirus，BmDNV）在家蠶體內(nèi)主要感染中腸柱狀細胞。病毒粒子通過家蠶的口器進入體內(nèi)，隨后吸附并侵入中腸柱狀細胞。感染后的中腸柱狀細胞核呈現(xiàn)過分膨脹、細胞核孚爾根濃染等細胞病理學(xué)特征。在感染過程中，家蠶會表現(xiàn)出明顯的病癥，如食欲減退、發(fā)育遲緩、蠶體虛弱等。隨著感染的加重，家蠶可能會出現(xiàn)吐液、下痢等癥狀，嚴重影響家蠶的生長發(fā)育和繭絲產(chǎn)量。從病毒粒子形態(tài)來看，家蠶濃核病毒粒子呈球形，直徑約為20-24nm，無囊膜，衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。其基因組為單鏈線性DNA，不同株系的家蠶濃核病毒在基因組大小和基因組成上可能存在一定差異。這些差異可能導(dǎo)致病毒在感染特性、致病力以及與宿主的相互作用等方面表現(xiàn)出不同。1.3家蠶細小病毒樣病毒的研究1.3.1家蠶細小病毒樣病毒山梨株的研究家蠶細小病毒樣病毒山梨株（Bombyxmoriparvo-likevirus,Yamagatastrain）最早于1985年在日本山梨縣的家蠶養(yǎng)殖場中被發(fā)現(xiàn)。當時，該地區(qū)的家蠶出現(xiàn)了一系列異常癥狀，包括生長發(fā)育遲緩、食欲不振以及蠶體虛弱等。研究人員通過對患病家蠶的組織進行電鏡觀察和病毒分離鑒定，首次確定了這種新型病毒的存在。此后，眾多學(xué)者對山梨株展開了深入研究。在生物學(xué)特性方面，研究發(fā)現(xiàn)山梨株的病毒粒子呈球形，直徑約為20-24nm，無囊膜，衣殼呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)。其基因組為單鏈線性DNA，大小約為6.6kb，包含多個開放閱讀框，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。在感染特性上，山梨株主要感染家蠶的中腸柱狀細胞，病毒粒子通過家蠶的口器進入體內(nèi)，隨后吸附并侵入中腸柱狀細胞。感染后的中腸柱狀細胞核呈現(xiàn)過分膨脹、細胞核孚爾根濃染等細胞病理學(xué)特征。在家蠶的生長發(fā)育過程中，感染山梨株的家蠶往往會出現(xiàn)發(fā)育停滯、體型瘦小等現(xiàn)象，嚴重影響家蠶的繭絲產(chǎn)量和質(zhì)量。通過對山梨株的研究，不僅揭示了該病毒的基本生物學(xué)特性和感染機制，也為后續(xù)家蠶細小病毒樣病毒的研究提供了重要的參考和借鑒。1.3.2家蠶細小病毒樣病毒中國株的研究家蠶細小病毒樣病毒中國株的研究始于國內(nèi)家蠶養(yǎng)殖區(qū)域出現(xiàn)的不明原因病害。當蠶農(nóng)發(fā)現(xiàn)家蠶出現(xiàn)異常癥狀，如發(fā)育異常、蠶體變色、進食減少等情況后，科研人員介入調(diào)查。通過病毒分離、鑒定等技術(shù)手段，確定了家蠶細小病毒樣病毒中國株的存在。與其他株系相比，中國株在基因組結(jié)構(gòu)和蛋白組成上具有獨特之處。在基因組方面，中國株的基因組為單鏈線性雙分子DNA（VD1、VD2），大小分別是6.6kb、6.1kb，分別獨立包裝在各自的衣殼中。這種雙分子DNA結(jié)構(gòu)在病毒的遺傳信息傳遞和復(fù)制過程中可能具有特殊的作用。在蛋白組成上，中國株編碼四個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3和pol（DNA聚合酶），一個主要結(jié)構(gòu)蛋白VP和一個次要結(jié)構(gòu)蛋白P133。其中，DNA聚合酶對于病毒基因組的復(fù)制至關(guān)重要，其結(jié)構(gòu)和功能的研究有助于深入了解病毒的復(fù)制機制。目前，針對中國株的研究主要集中在病毒的分子生物學(xué)特性、感染機制以及與宿主的相互作用等方面。通過這些研究，旨在揭示中國株的致病機理，為家蠶病害的防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。例如，研究病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合方式，有助于開發(fā)阻斷病毒感染的藥物或方法；分析病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程，能夠?qū)ふ覞撛诘乃幬锇悬c，為抗病毒藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。1.3.3家蠶細小病毒樣病毒VD1-ORF4編碼DNA聚合酶的分析家蠶細小病毒樣病毒的VD1-ORF4基因編碼DNA聚合酶，對該基因序列的分析是研究病毒復(fù)制機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過生物信息學(xué)手段，如序列比對和結(jié)構(gòu)預(yù)測等方法，發(fā)現(xiàn)VD1-ORF4基因具有一些獨特的特征。與其他已知的DNA聚合酶基因相比，VD1-ORF4基因在核苷酸序列上存在一定的差異，這些差異可能導(dǎo)致其編碼的DNA聚合酶在結(jié)構(gòu)和功能上具有獨特性。從結(jié)構(gòu)角度來看，VD1-ORF4編碼的DNA聚合酶可能包含多個結(jié)構(gòu)域，如手掌結(jié)構(gòu)域、手指結(jié)構(gòu)域和拇指結(jié)構(gòu)域等，這些結(jié)構(gòu)域在DNA聚合酶的催化過程中發(fā)揮著不同的作用。手掌結(jié)構(gòu)域通常包含催化活性中心，負責(zé)催化核苷酸的聚合反應(yīng)；手指結(jié)構(gòu)域參與模板DNA的結(jié)合和底物dNTP的識別；拇指結(jié)構(gòu)域則對DNA雙鏈的穩(wěn)定性和聚合酶的持續(xù)合成能力起到重要作用。此外，VD1-ORF4編碼的DNA聚合酶可能還具有一些與病毒特異性相關(guān)的結(jié)構(gòu)特征，這些特征可能影響病毒基因組的復(fù)制效率和準確性。在功能方面，該DNA聚合酶在病毒基因組的復(fù)制過程中起著核心作用。它能夠以病毒的單鏈DNA為模板，催化合成互補鏈，從而實現(xiàn)病毒基因組的擴增。同時，DNA聚合酶還可能參與病毒基因組的修復(fù)和重組等過程，對病毒的遺傳穩(wěn)定性和變異起到重要的調(diào)控作用。1.3.4家蠶細小病毒樣病毒復(fù)制機制的推測基于已有的研究成果，家蠶細小病毒樣病毒的復(fù)制機制可能與其他細小病毒存在一定的相似性，但也具有自身的特點。一般來說，病毒的復(fù)制起始于病毒粒子與宿主細胞表面的特異性受體結(jié)合，然后通過內(nèi)吞作用進入細胞。在家蠶細小病毒樣病毒中，病毒粒子可能首先識別并結(jié)合家蠶中腸柱狀細胞表面的特定受體，隨后被細胞內(nèi)吞進入細胞質(zhì)。進入細胞后，病毒粒子在細胞質(zhì)中發(fā)生脫殼，釋放出病毒基因組。由于家蠶細小病毒樣病毒的基因組為單鏈DNA，其復(fù)制過程可能需要先合成互補鏈，形成雙鏈DNA中間體。在這個過程中，VD1-ORF4編碼的DNA聚合酶發(fā)揮著關(guān)鍵作用。DNA聚合酶以病毒的單鏈DNA為模板，利用宿主細胞提供的核苷酸原料，催化合成互補鏈。在合成過程中，DNA聚合酶可能通過與病毒基因組兩端的反向重復(fù)序列相互作用，識別復(fù)制起始位點，啟動復(fù)制過程。隨著復(fù)制的進行，雙鏈DNA中間體不斷擴增，為病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯提供模板。在轉(zhuǎn)錄過程中，病毒的基因被轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后在宿主細胞的核糖體上進行翻譯，合成病毒所需的蛋白質(zhì)，包括非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白參與病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和調(diào)控等過程，而結(jié)構(gòu)蛋白則用于組裝新的病毒粒子。最后，新合成的病毒基因組與結(jié)構(gòu)蛋白在細胞核內(nèi)進行裝配，形成完整的病毒粒子。裝配完成的病毒粒子通過裂解宿主細胞或者出芽等方式釋放到細胞外，繼續(xù)感染其他細胞，完成病毒的復(fù)制周期。家蠶細小病毒樣病毒的復(fù)制機制還需要進一步的實驗驗證和深入研究，以全面揭示其復(fù)雜的生物學(xué)過程。1.4DNA聚合酶B家族的特征DNA聚合酶B家族是一類在DNA復(fù)制和修復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的重要酶類，具有獨特的結(jié)構(gòu)特點和催化活性。從結(jié)構(gòu)上看，B家族聚合酶通常呈現(xiàn)多亞基結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了它們更高的穩(wěn)定性和功能多樣性。其催化亞基一般包含典型的手掌、手指和拇指結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域共同協(xié)作，完成DNA的合成過程。手掌結(jié)構(gòu)域是催化活性的核心區(qū)域，其中含有多個保守的氨基酸殘基，這些殘基參與了金屬離子的結(jié)合以及核苷酸的催化聚合反應(yīng)。例如，在許多B家族聚合酶中，天冬氨酸殘基在催化中心與鎂離子結(jié)合，通過穩(wěn)定反應(yīng)中間體，促進核苷酸的添加。手指結(jié)構(gòu)域在DNA聚合過程中主要負責(zé)模板DNA的結(jié)合以及底物dNTP的識別和結(jié)合。當聚合酶沿著模板DNA移動時，手指結(jié)構(gòu)域能夠精確地識別模板上的堿基，并選擇與之互補的dNTP進行添加。拇指結(jié)構(gòu)域則主要與DNA雙鏈相互作用，通過穩(wěn)定DNA聚合酶與模板DNA的結(jié)合，確保聚合酶在DNA鏈上的持續(xù)合成。這種穩(wěn)定作用對于保證DNA復(fù)制的準確性和高效性至關(guān)重要。除了上述三個主要結(jié)構(gòu)域，一些B家族聚合酶還可能包含其他輔助結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在調(diào)節(jié)聚合酶的活性、與其他蛋白的相互作用以及參與DNA修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用。在催化活性方面，B家族聚合酶具有較高的保真度，能夠準確地復(fù)制DNA模板，減少堿基錯配的發(fā)生。這一特性主要得益于其3'→5'核酸外切酶活性，該活性能夠?qū)酆线^程中錯誤摻入的核苷酸進行校對和切除。當聚合酶將錯誤的核苷酸添加到正在合成的DNA鏈上時，3'→5'核酸外切酶活性位點能夠識別這種錯配，并將錯誤的核苷酸從DNA鏈的3'末端切除。隨后，聚合酶繼續(xù)進行正常的聚合反應(yīng)，從而保證了DNA復(fù)制的準確性。例如，在真核生物的DNA復(fù)制過程中，DNA聚合酶δ和ε（均屬于B家族）通過其3'→5'核酸外切酶活性，有效地維持了基因組的穩(wěn)定性。B家族聚合酶還具有較強的持續(xù)合成能力，能夠在較長的DNA模板上連續(xù)合成DNA鏈，而不需要頻繁地從模板上解離。這種持續(xù)合成能力使得B家族聚合酶在復(fù)制大型基因組時具有明顯的優(yōu)勢。在DNA復(fù)制過程中，B家族聚合酶起著不可或缺的作用。在真核生物中，DNA聚合酶α、δ和ε共同參與染色體DNA的復(fù)制。其中，DNA聚合酶α首先與引物酶結(jié)合，合成一段短的RNA-DNA引物，為后續(xù)的DNA合成提供起始位點。然后，DNA聚合酶δ和ε分別負責(zé)前導(dǎo)鏈和后隨鏈的合成。DNA聚合酶δ持續(xù)合成前導(dǎo)鏈，而DNA聚合酶ε則合成后隨鏈上的岡崎片段。在古細菌中，B家族聚合酶是主要的復(fù)制酶，負責(zé)整個基因組的復(fù)制。無論是真核生物還是古細菌，B家族聚合酶在DNA復(fù)制過程中都與其他多種蛋白相互協(xié)作，共同完成復(fù)雜的復(fù)制過程。例如，與增殖細胞核抗原（PCNA）等輔助蛋白結(jié)合，增強聚合酶的活性和持續(xù)合成能力；與解旋酶、引物酶等蛋白相互作用，協(xié)調(diào)DNA復(fù)制的各個環(huán)節(jié)。這些相互作用確保了DNA復(fù)制能夠準確、高效地進行，維持了生物體基因組的穩(wěn)定性和遺傳信息的傳遞。1.5外源基因表達系統(tǒng)1.5.1pET原核表達系統(tǒng)pET原核表達系統(tǒng)是在大腸桿菌中進行重組蛋白克隆表達的強大工具。其原理基于噬菌體T7強轉(zhuǎn)錄及翻譯信號控制。在該系統(tǒng)中，目的基因被克隆到pET質(zhì)粒載體上，而表達則由宿主細胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)。T7RNA聚合酶機制具有高效性和選擇性，當充分誘導(dǎo)時，幾乎所有的細胞資源都會被用于表達目的蛋白。例如，在研究某些蛋白質(zhì)的功能時，科研人員常常利用pET系統(tǒng)將編碼該蛋白質(zhì)的基因?qū)氪竽c桿菌中進行高效表達，從而獲得足夠量的蛋白質(zhì)用于后續(xù)的功能研究。該系統(tǒng)主要由pET質(zhì)粒載體和宿主細胞兩部分組成。pET質(zhì)粒載體包含噬菌體T7啟動子、多克隆位點、終止子等關(guān)鍵元件。其中，T7啟動子是控制目的基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵序列，它能夠特異性地結(jié)合T7RNA聚合酶，啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄。多克隆位點則為目的基因的插入提供了多個酶切位點，方便科研人員進行基因克隆操作。終止子則能夠終止轉(zhuǎn)錄過程，保證轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的完整性。宿主細胞通常選擇含有T7RNA聚合酶基因的大腸桿菌菌株，如BL21(DE3)等。這些菌株是DE3溶原菌，噬菌體DE3帶有噬菌體21抗性區(qū)、lacI基因、lacUV5啟動子以及T7RNA聚合酶基因。當宿主細胞處于DE3溶原狀態(tài)時，只有在IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)下，lacUV5啟動子才會指導(dǎo)T7RNA聚合酶基因轉(zhuǎn)錄，從而啟動目的基因的表達。在基因表達中，pET原核表達系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用。它可以用于表達各種類型的蛋白質(zhì)，包括原核生物來源的蛋白質(zhì)和真核生物來源的蛋白質(zhì)。對于原核生物來源的基因，通常使用轉(zhuǎn)錄載體進行表達，因為這些基因本身含有核糖體結(jié)合位點和起始密碼子。而對于真核生物來源的基因，由于其結(jié)構(gòu)和調(diào)控機制與原核生物存在差異，一般使用翻譯載體進行表達，載體上帶有核糖體結(jié)合位點，以確保真核基因在原核細胞中能夠正確翻譯。pET系統(tǒng)還可用于表達融合蛋白，通過在目的蛋白的N端或C端融合標簽蛋白，如His標簽、GST標簽等，方便后續(xù)對目的蛋白的純化和檢測。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究中，科研人員利用pET系統(tǒng)表達大量的目標蛋白，然后通過純化獲得高純度的蛋白質(zhì)，用于結(jié)晶和結(jié)構(gòu)解析，從而深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。1.5.2桿狀病毒表達系統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)是一種高效的真核表達系統(tǒng)，以桿狀病毒為載體，昆蟲細胞為宿主進行外源基因的表達。該系統(tǒng)具有諸多特點，首先，它能夠?qū)崿F(xiàn)對多種真核生物蛋白的正確折疊和修飾。許多真核生物蛋白在原核表達系統(tǒng)中難以正確折疊，容易形成包涵體，而桿狀病毒表達系統(tǒng)能夠為蛋白的折疊和修飾提供適宜的環(huán)境，使表達的蛋白具有天然的生物學(xué)活性。例如，一些糖蛋白在桿狀病毒表達系統(tǒng)中能夠進行正確的糖基化修飾，這對于其生物學(xué)功能的發(fā)揮至關(guān)重要。其次，該系統(tǒng)具有較高的表達水平，能夠在昆蟲細胞中大量表達外源蛋白。其操作流程一般包括以下步驟：首先是重組桿狀病毒的構(gòu)建。將目的基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上，該轉(zhuǎn)移載體含有桿狀病毒的部分基因序列以及多克隆位點。然后將重組轉(zhuǎn)移載體與野生型桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞，通過細胞內(nèi)的同源重組，將目的基因整合到桿狀病毒基因組中，從而獲得重組桿狀病毒。這一過程需要精確的基因操作技術(shù)，確保目的基因準確地整合到桿狀病毒基因組的正確位置。接下來是重組桿狀病毒的擴增。將獲得的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，使其在細胞內(nèi)大量繁殖擴增，從而獲得足夠數(shù)量的重組病毒。最后是目的蛋白的表達。用擴增后的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞，在適宜的培養(yǎng)條件下，昆蟲細胞開始表達目的蛋白。在這個過程中，需要優(yōu)化培養(yǎng)條件，如溫度、pH值、營養(yǎng)成分等，以提高蛋白的表達量和質(zhì)量。桿狀病毒表達系統(tǒng)的優(yōu)勢明顯。除了上述能夠正確折疊和修飾真核蛋白以及高表達水平外，它還具有安全性高的特點。桿狀病毒只感染無脊椎動物，對脊椎動物和植物沒有致病性，因此在生物安全方面具有很大的優(yōu)勢。在疫苗研發(fā)領(lǐng)域，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)的病毒樣顆粒（VLPs）疫苗，既具有良好的免疫原性，又避免了傳統(tǒng)疫苗可能存在的感染風(fēng)險。該系統(tǒng)還具有靈活性，可以同時表達多個外源基因，這對于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用以及生產(chǎn)多亞基蛋白具有重要意義。例如，在研究某些信號通路中的蛋白質(zhì)相互作用時，可以利用桿狀病毒表達系統(tǒng)同時表達多個相關(guān)蛋白，然后通過一系列實驗技術(shù)，如免疫共沉淀等，研究它們之間的相互作用關(guān)系。1.6立題的目的意義家蠶細小病毒樣病毒（中國株）作為威脅家蠶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的重要病原體，對其深入研究具有重要的理論和實踐意義?？寺∨c表達家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因是揭示該病毒分子生物學(xué)特性和致病機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過克隆該基因，能夠精確解析其核苷酸序列，明確基因的結(jié)構(gòu)特征和功能位點。這有助于從分子層面理解病毒的遺傳信息傳遞和復(fù)制機制，為病毒的分類和進化研究提供重要的基因數(shù)據(jù)支持?；虻谋磉_研究則可以深入探究DNA聚合酶在病毒感染過程中的作用和調(diào)控機制。了解DNA聚合酶的表達規(guī)律和活性變化，能夠揭示病毒在宿主細胞內(nèi)的復(fù)制過程以及與宿主細胞的相互作用關(guān)系，為進一步研究病毒的致病機理奠定堅實的基礎(chǔ)。在病毒研究領(lǐng)域，家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因的克隆與表達研究具有重要的理論價值。它能夠豐富病毒分子生物學(xué)的研究內(nèi)容，為細小病毒的復(fù)制機制研究提供新的視角和理論依據(jù)。通過與其他已知病毒的DNA聚合酶基因進行比較分析，可以揭示病毒基因的進化關(guān)系和遺傳多樣性，有助于深入理解病毒的起源和演化歷程。從家蠶病害防治的角度來看，該研究具有重大的實踐意義。家蠶養(yǎng)殖是我國重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)之一，家蠶細小病毒樣病毒的感染嚴重影響家蠶的生長發(fā)育和繭絲產(chǎn)量，給蠶農(nóng)帶來巨大的經(jīng)濟損失。深入研究DNA聚合酶基因，能夠為開發(fā)新型的抗病毒藥物和防治策略提供潛在的靶點。例如，針對DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能特點，設(shè)計特異性的抑制劑，阻斷病毒基因組的復(fù)制，從而達到防治病毒感染的目的。該研究還可以為家蠶抗病品種的選育提供理論指導(dǎo)。通過對病毒與宿主相互作用機制的研究，篩選出具有抗病毒能力的家蠶基因資源，培育出抗病性強的家蠶品種，提高家蠶養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益和穩(wěn)定性。家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因的克隆與表達研究對于病毒研究和家蠶病害防治具有不可忽視的重要性，有望為家蠶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展提供有力的支持和保障。1.7研究內(nèi)容和技術(shù)路線1.7.1研究內(nèi)容本研究聚焦于家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因，旨在深入探究其分子特性及功能，具體研究內(nèi)容如下：家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因的克?。簭母腥炯倚Q細小病毒樣病毒（中國株）的家蠶組織中提取總DNA。依據(jù)已公布的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）基因組序列，設(shè)計并合成特異性引物，通過PCR技術(shù)擴增DNA聚合酶基因。對擴增得到的基因片段進行凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段，將其連接到克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。通過藍白斑篩選、菌落PCR以及測序等方法，鑒定陽性克隆，獲得含有正確DNA聚合酶基因的重組克隆載體。表達載體的構(gòu)建：選取合適的表達載體，如pET系列載體，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對重組克隆載體和表達載體進行雙酶切。酶切反應(yīng)需嚴格控制溫度、時間和酶的用量等條件，以確保酶切效果。利用T4DNA連接酶將酶切后的DNA聚合酶基因片段與表達載體連接，構(gòu)建重組表達載體。連接反應(yīng)體系中需優(yōu)化連接酶的用量和反應(yīng)時間，以提高連接效率。將重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過抗生素篩選、質(zhì)粒提取以及酶切鑒定等步驟，確認重組表達載體構(gòu)建成功。重組蛋白的誘導(dǎo)表達：將構(gòu)建成功的重組表達載體轉(zhuǎn)化至適宜的大腸桿菌表達菌株，如BL21(DE3)中。挑取單菌落接種于含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)重組蛋白表達。在誘導(dǎo)過程中，設(shè)置不同的誘導(dǎo)溫度（如25℃、30℃、37℃）、誘導(dǎo)時間（如2h、4h、6h）以及IPTG濃度（如0.1mM、0.5mM、1mM），進行誘導(dǎo)條件的優(yōu)化。通過SDS電泳分析不同誘導(dǎo)條件下重組蛋白的表達情況，確定最佳誘導(dǎo)條件。重組蛋白的純化與鑒定：采用親和層析、離子交換層析等方法對誘導(dǎo)表達的重組蛋白進行純化。親和層析可利用His標簽與鎳柱的特異性結(jié)合，實現(xiàn)對重組蛋白的初步純化。離子交換層析則根據(jù)蛋白表面電荷的差異，進一步提高蛋白的純度。純化過程中，使用不同濃度的洗脫液進行洗脫，收集洗脫峰，并通過SDS電泳檢測洗脫液中蛋白的純度和含量。對純化后的重組蛋白進行Westernblot鑒定，以驗證其是否為目的蛋白。同時，利用圓二色譜、動態(tài)光散射等技術(shù)對重組蛋白的結(jié)構(gòu)和純度進行分析，確保獲得高純度、結(jié)構(gòu)正確的重組蛋白，為后續(xù)的功能研究奠定基礎(chǔ)。1.7.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1-1所示，首先從感染家蠶細小病毒樣病毒（中國株）的家蠶組織提取總DNA，通過設(shè)計特異性引物，進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物連接到克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)篩選和鑒定獲得重組克隆載體。接著，對重組克隆載體和表達載體進行雙酶切和連接，構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達菌株。然后，通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件進行重組蛋白的誘導(dǎo)表達，再利用親和層析和離子交換層析等方法純化重組蛋白，最后通過SDS、Westernblot等技術(shù)對重組蛋白進行鑒定。[此處插入技術(shù)路線圖1-1，圖中清晰展示從家蠶組織提取DNA到最終重組蛋白鑒定的整個流程，各步驟之間用箭頭清晰連接，標注每一步的關(guān)鍵操作和主要試劑、技術(shù)等信息]二、家蠶細小病毒樣病毒中國株DNA聚合酶基因主要功能域的原核表達載體的構(gòu)建2.1實驗材料2.1.1病毒、菌株與載體實驗所用的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）由本實驗室前期從感染發(fā)病的家蠶中分離并保存。該病毒經(jīng)過多次純化和鑒定，確保其純度和活性。菌株選用大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)，其中大腸桿菌DH5α用于基因克隆過程中的載體轉(zhuǎn)化和擴增，其具有生長迅速、轉(zhuǎn)化效率高的特點，能夠高效地接納外源DNA并進行復(fù)制。BL21(DE3)則用于重組蛋白的表達，它含有T7RNA聚合酶基因，在IPTG誘導(dǎo)下可啟動外源基因的表達，適合用于原核表達系統(tǒng)。表達載體選擇pET-28a(+)，該載體具有T7啟動子、多克隆位點、His標簽編碼序列以及卡那霉素抗性基因等元件。T7啟動子能夠高效啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄，多克隆位點為目的基因的插入提供了便利，His標簽便于后續(xù)對重組蛋白的純化，卡那霉素抗性基因則用于篩選含有重組載體的菌株。2.1.2主要實驗儀器設(shè)備PCR儀（型號為ABI2720）用于DNA聚合酶基因的擴增，其能夠精確控制反應(yīng)溫度和時間，保證PCR反應(yīng)的準確性和重復(fù)性。離心機（型號為Eppendorf5424）用于各種樣品的離心分離，如病毒核酸提取過程中的離心沉淀、菌體收集等操作，具有高速、穩(wěn)定的特點。電泳儀（型號為Bio-RadPowerPacBasic）用于核酸和蛋白質(zhì)的凝膠電泳分析，可將不同大小的核酸片段或蛋白質(zhì)分離出來，便于觀察和檢測。凝膠成像系統(tǒng)（型號為Bio-RadGelDocXR+）用于對電泳后的凝膠進行成像和分析，能夠清晰地記錄核酸和蛋白質(zhì)條帶的位置和亮度。恒溫搖床（型號為NewBrunswickInnova44R）用于細菌的培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)，提供適宜的溫度和振蕩條件，促進細菌的生長和繁殖。超凈工作臺（型號為蘇凈安泰SW-CJ-2FD）用于實驗操作過程中的無菌環(huán)境保障，有效防止雜菌污染。2.1.3工具酶及主要生化試劑工具酶包括限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ，用于對重組克隆載體和表達載體進行雙酶切，其酶切活性高，特異性強，能夠準確地識別和切割特定的DNA序列。T4DNA連接酶用于將酶切后的DNA聚合酶基因片段與表達載體連接，形成重組表達載體，具有高效的連接活性。TaqDNA聚合酶用于PCR擴增反應(yīng)，能夠在體外催化DNA的合成，其具有耐高溫、擴增效率高的特點。主要生化試劑有DNAMarker（DL2000和DL15000），用于在凝膠電泳中作為分子量標準，判斷目的基因片段和載體的大小。dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸混合物）作為PCR反應(yīng)的原料，提供合成DNA所需的核苷酸。IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）作為誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)重組蛋白的表達，能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除對T7啟動子的抑制，從而啟動目的基因的表達。2.1.4試劑的配制LB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入800mL去離子水，攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，再加入去離子水定容至1000mL。分裝后，在121℃高壓滅菌20min，冷卻后備用。用于大腸桿菌的培養(yǎng)，提供細菌生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。10×PCR緩沖液：500mmol/LKCl、100mmol/LTris-HCl（pH8.3）、15mmol/LMgCl?，配制時，準確稱取各成分，溶解后用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至8.3，分裝后-20℃保存。在PCR反應(yīng)中，為TaqDNA聚合酶提供適宜的反應(yīng)環(huán)境。100mmol/LIPTG溶液：稱取2.38gIPTG，用去離子水溶解并定容至100mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，-20℃保存。在重組蛋白表達時，用于誘導(dǎo)目的蛋白的表達。50×TAE緩沖液：242gTris堿、57.1mL冰乙酸、100mL0.5mol/LEDTA（pH8.0），加入去離子水溶解后定容至1000mL。使用時，稀釋50倍成1×TAE緩沖液，用于核酸凝膠電泳，維持電泳過程中的pH值和離子強度。10mg/mLRNaseA溶液：將100mgRNaseA溶解于10mL含有10mmol/LTris-Cl（pH7.5）、15mmol/LNaCl的溶液中，于100℃煮沸15min，以滅活可能存在的DNase，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆?。在核酸提取過程中，用于去除RNA雜質(zhì)。SolutionⅠ：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris-HCl（pH8.0）、10mmol/LEDTA（pH8.0），配制時，準確稱取各成分，溶解后，4℃保存。用于質(zhì)粒提取過程中，懸浮和穩(wěn)定細菌細胞。SolutionⅡ：0.2mol/LNaOH、1%（m/V）SDS，溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫下使用。在質(zhì)粒提取時，用于裂解細菌細胞，釋放質(zhì)粒DNA。SolutionⅢ：5mol/L乙酸鉀60.0mL、冰乙酸11.5mL、水28.5mL，配制后4℃保存。用于中和SolutionⅡ，使質(zhì)粒DNA復(fù)性，并沉淀蛋白質(zhì)和基因組DNA等雜質(zhì)。TE緩沖液（pH8.0）：10mmol/LTris-Cl（pH8.0）、1mmol/LEDTA（pH8.0），分裝后在121℃高壓滅菌20min，室溫保存。用于溶解和保存核酸樣品，維持核酸的穩(wěn)定性。2.2實驗方法2.2.1病毒基因組DNA的制備取感染家蠶細小病毒樣病毒（中國株）的家蠶中腸組織約0.5g，置于預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀。將研磨后的粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μLDNA抽提緩沖液（100mmol/LTris-HCl，pH8.0；50mmol/LEDTA，pH8.0；100mmol/LNaCl；1%SDS），充分混勻，使組織粉末完全懸浮。加入10μLRNaseA（10mg/mL），至終濃度為20μg/mL，37℃水浴1h，以降解樣品中的RNA。接著加入25μLProteinaseK（20mg/mL），至終濃度為100μg/mL，55℃水浴2h，期間每隔15-20min輕輕顛倒混勻一次，以充分消化蛋白質(zhì)。水浴結(jié)束后，將離心管冷卻至室溫，加入等體積的平衡酚（pH8.0），輕柔顛倒離心管10-15min，使水相和酚相充分混合。然后在4℃，12000rpm條件下離心15min，此時溶液會分層，上層為含DNA的水相，下層為酚相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中，避免吸取到中間的蛋白質(zhì)層。重復(fù)酚抽提步驟一次，以進一步去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)。隨后，加入等體積的酚/氯仿（1:1，v/v），輕柔顛倒混勻10min，4℃，12000rpm離心15min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新管。再加入等體積的氯仿，顛倒混勻5min，4℃，12000rpm離心15min，再次吸取上層水相。向收集的水相中加入1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，可見白色絮狀DNA沉淀析出。將離心管置于-20℃冰箱中靜置1-2h，使DNA充分沉淀。之后在4℃，12000rpm條件下離心20min，棄上清。用75%冰乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后在4℃，12000rpm條件下離心5min，棄上清。將離心管置于超凈工作臺中，開蓋晾干DNA沉淀，注意避免過度干燥導(dǎo)致DNA難以溶解。待DNA沉淀晾干后，加入50-100μLTE緩沖液（pH8.0），輕輕吹打使DNA完全溶解。將溶解后的DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆?。使用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，OD???/OD???比值應(yīng)在1.8-2.0之間，表明DNA純度較高，可用于后續(xù)實驗。2.2.2VD1-ORF4/2163的克隆和鑒定根據(jù)已公布的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）基因組序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計特異性引物用于擴增VD1-ORF4/2163基因片段。上游引物序列為：5'-ATGCTAGCAAAAAAATGAAG-3'，在引物5'端引入NheⅠ酶切位點（下劃線部分）；下游引物序列為：5'-CTAGTCGACTTATGCTCTGTC-3'，在引物5'端引入SalⅠ酶切位點（下劃線部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以提取的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50μL）如下：ddH?O37.7μL、10×PCR緩沖液5μL、dNTPs（2.5mmol/Leach）4μL、上游引物（10μmol/L）1μL、下游引物（10μmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.3μL、模板DNA1μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳槽中加入1×TAE緩沖液，將PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液按5:1的比例混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。同時加入DNAMarker（DL2000）作為分子量標準。在120V電壓下電泳30-40min，電泳結(jié)束后，將凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，確定PCR產(chǎn)物的大小和特異性。若電泳結(jié)果顯示在預(yù)期大?。s2163bp）處出現(xiàn)明亮且單一的條帶，則表明PCR擴增成功。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行膠回收純化。將含有目的條帶的瓊脂糖凝膠用干凈的手術(shù)刀小心切下，放入1.5mL離心管中。按照試劑盒說明書操作，加入適量的BindingBuffer，55℃水浴10-15min，使凝膠完全融化。將融化后的溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，室溫靜置2-3min，12000rpm離心1min，棄掉收集管中的廢液。向吸附柱中加入700μLWashBuffer，12000rpm離心1min，棄廢液。重復(fù)洗滌步驟一次。將吸附柱置于新的1.5mL離心管中，加入30-50μLElutionBuffer，室溫靜置2-3min，12000rpm離心1min，收集離心管中的DNA溶液，即為純化后的PCR產(chǎn)物。將純化后的VD1-ORF4/2163基因片段連接到pMD18-T載體上。連接反應(yīng)體系（10μL）如下：pMD18-T載體1μL、純化后的PCR產(chǎn)物4μL、SolutionⅠ5μL。輕輕混勻后，16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，置于冰上解凍。取5μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。然后將離心管放入42℃水浴中熱激90s，迅速放回冰浴中冷卻2-3min。向離心管中加入800μL無抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1h，使細胞復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液4000rpm離心5min，棄掉部分上清，僅留100-200μL，將剩余菌液輕輕吹打混勻，涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）、IPTG（0.5mmol/L）和X-Gal（40μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上。將平板倒置，37℃培養(yǎng)12-16h，待菌落長出。次日，挑取白色菌落接種于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用堿裂解法提取質(zhì)粒。取1.5mL過夜培養(yǎng)的菌液于1.5mL離心管中，12000rpm離心1min，棄上清。向沉淀中加入100μL預(yù)冷的SolutionⅠ，劇烈振蕩使菌體完全懸浮。加入200μL新配制的SolutionⅡ，輕柔顛倒混勻4-5次，室溫放置1-2min，使細胞裂解。加入150μL預(yù)冷的SolutionⅢ，輕柔顛倒混勻4-5次，冰浴5min，使蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀。12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。向上清中加入等體積的酚/氯仿（1:1，v/v），顛倒混勻，12000rpm離心5min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新管。加入2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2），顛倒混勻，-20℃靜置30min。12000rpm離心10min，棄上清。用75%冰乙醇洗滌沉淀2次，每次12000rpm離心5min，棄上清。晾干沉淀后，加入30-50μLTE緩沖液（pH8.0）溶解質(zhì)粒。對提取的質(zhì)粒進行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與擴增VD1-ORF4/2163基因片段時相同。取5μL菌落PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在預(yù)期大小處出現(xiàn)明亮條帶，則初步判斷為陽性克隆。將初步鑒定為陽性的克隆送測序公司（如華大基因）進行測序。將測序結(jié)果與已知的VD1-ORF4/2163基因序列進行比對分析，使用DNAMAN軟件或NCBI的BLAST工具，若測序結(jié)果與已知序列一致，則確定為含有正確VD1-ORF4/2163基因的陽性克隆。2.2.3VD1-ORF4/2163原核表達載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SalⅠ對含有VD1-ORF4/2163基因的pMD18-T重組質(zhì)粒和pET-28a(+)表達載體進行雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20μL）如下：10×BufferM2μL、重組質(zhì)粒或pET-28a(+)載體1μg、NheⅠ1μL（10U/μL）、SalⅠ1μL（10U/μL）、ddH?O補足至20μL。37℃水浴酶切3-4h。酶切結(jié)束后，取5μL酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認酶切是否完全。使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒分別回收酶切后的VD1-ORF4/2163基因片段和pET-28a(+)載體大片段?；厥詹襟E同PCR產(chǎn)物膠回收步驟。將回收的VD1-ORF4/2163基因片段和pET-28a(+)載體大片段用T4DNA連接酶進行連接。連接反應(yīng)體系（10μL）如下：回收的VD1-ORF4/2163基因片段4μL、回收的pET-28a(+)載體大片段1μL、10×T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase（350U/μL）1μL、ddH?O3μL。16℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化步驟同轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，只是將培養(yǎng)基中的抗生素換成卡那霉素（50μg/mL）。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。次日，挑取單菌落接種于含卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。使用堿裂解法提取重組表達載體質(zhì)粒。提取步驟同提取pMD18-T重組質(zhì)粒。對提取的重組表達載體質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系和條件同構(gòu)建重組表達載體時的雙酶切反應(yīng)。酶切結(jié)束后，取5μL酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的兩條條帶（一條為VD1-ORF4/2163基因片段，一條為pET-28a(+)載體片段），則初步表明重組表達載體構(gòu)建成功。2.3結(jié)果2.3.1VD1-ORF4/2163的PCR擴增以提取的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）基因組DNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2-1所示。在DNAMarker（DL2000）的指示下，可見在約2163bp處出現(xiàn)一條明亮且單一的條帶，與預(yù)期的VD1-ORF4/2163基因片段大小一致。這表明PCR擴增成功，特異性引物能夠準確地擴增出目的基因片段，且擴增過程中未出現(xiàn)明顯的非特異性擴增條帶，說明引物的特異性良好，實驗操作準確，為后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建提供了可靠的目的基因來源。[此處插入圖2-1，圖中清晰展示1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道1為DNAMarker（DL2000），泳道2為VD1-ORF4/2163的PCR擴增產(chǎn)物，標注各泳道及條帶位置和大小信息]2.3.2重組克隆質(zhì)粒的鑒定將PCR擴增得到的VD1-ORF4/2163基因片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后，挑取白色菌落進行菌落PCR鑒定。菌落PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2-2所示。在多個挑取的菌落中，部分菌落的PCR產(chǎn)物在約2163bp處出現(xiàn)明亮條帶，與預(yù)期的目的基因片段大小相符，初步判斷這些菌落為陽性克隆。選取部分初步鑒定為陽性的克隆送測序公司進行測序。測序結(jié)果使用DNAMAN軟件與已知的VD1-ORF4/2163基因序列進行比對分析，結(jié)果顯示測序得到的序列與已知序列完全一致，從而確定這些克隆為含有正確VD1-ORF4/2163基因的陽性克隆，成功構(gòu)建了重組克隆質(zhì)粒。這一結(jié)果表明，目的基因已準確地插入到pMD18-T載體中，為后續(xù)表達載體的構(gòu)建奠定了堅實的基礎(chǔ)。[此處插入圖2-2，圖中展示菌落PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道1為DNAMarker（DL2000），泳道2-6為不同菌落的PCR產(chǎn)物，標注各泳道及條帶位置和大小信息]2.3.3重組表達質(zhì)粒的鑒定用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和SalⅠ對含有VD1-ORF4/2163基因的pMD18-T重組質(zhì)粒和pET-28a(+)表達載體進行雙酶切，回收酶切后的VD1-ORF4/2163基因片段和pET-28a(+)載體大片段，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。挑取單菌落接種培養(yǎng)后，提取重組表達載體質(zhì)粒，進行雙酶切鑒定。雙酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2-3所示。在DNAMarker（DL15000和DL2000）的指示下，可見一條約2163bp的條帶（對應(yīng)VD1-ORF4/2163基因片段）和一條約5369bp的條帶（對應(yīng)pET-28a(+)載體片段），與預(yù)期的酶切片段大小相符。這初步表明重組表達載體構(gòu)建成功，目的基因已成功插入到pET-28a(+)表達載體中，后續(xù)可用于重組蛋白的誘導(dǎo)表達。[此處插入圖2-3，圖中展示重組表達載體雙酶切產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，泳道1為DNAMarker（DL15000），泳道2為DNAMarker（DL2000），泳道3為重組表達載體雙酶切產(chǎn)物，標注各泳道及條帶位置和大小信息]2.4討論與總結(jié)本研究成功克隆了家蠶細小病毒樣病毒（中國株）的VD1-ORF4/2163基因，并構(gòu)建了其原核表達載體。通過對病毒基因組DNA的提取、PCR擴增、基因克隆和載體構(gòu)建等一系列實驗操作，獲得了含有目的基因的重組表達質(zhì)粒。在實驗過程中，對每個關(guān)鍵步驟都進行了嚴格的檢測和驗證。在病毒基因組DNA提取時，采用了經(jīng)典的酚-氯仿抽提法，并通過優(yōu)化各試劑的使用量和操作條件，成功獲得了高純度的病毒基因組DNA，為后續(xù)的PCR擴增提供了優(yōu)質(zhì)的模板。在PCR擴增環(huán)節(jié)，通過設(shè)計特異性引物，對引物的退火溫度、循環(huán)次數(shù)等條件進行優(yōu)化，確保了目的基因的特異性擴增，獲得了清晰、單一的PCR產(chǎn)物條帶。在基因克隆和載體構(gòu)建過程中，遇到了一些問題并采取了相應(yīng)的解決方法。在連接反應(yīng)中，連接效率較低，導(dǎo)致陽性克隆數(shù)量較少。通過優(yōu)化連接反應(yīng)體系，調(diào)整T4DNA連接酶的用量和連接時間，同時對載體和插入片段的濃度比例進行優(yōu)化，最終提高了連接效率。在轉(zhuǎn)化過程中，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定，影響了實驗進度。通過改進感受態(tài)細胞的制備方法，優(yōu)化制備過程中的溫度、CaCl?濃度等條件，同時在轉(zhuǎn)化時嚴格控制熱激時間和復(fù)蘇條件，有效提高了感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。本研究為進一步研究家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶的功能和結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)可利用構(gòu)建的原核表達載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達重組DNA聚合酶蛋白，通過對重組蛋白的純化和鑒定，獲得高純度的目的蛋白。利用獲得的重組蛋白開展相關(guān)的功能研究，如酶活性測定、與其他病毒蛋白或宿主細胞蛋白的相互作用研究等，深入揭示家蠶細小病毒樣病毒（中國株）的復(fù)制機制以及與宿主細胞的相互作用關(guān)系。本研究成果對于家蠶細小病毒樣病毒的防治和家蠶養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有潛在的應(yīng)用價值。三、家蠶細小病毒樣病毒中國株DNA聚合酶基因主要功能域的原核表達及抗體制備3.1實驗材料3.1.1菌株選用大腸桿菌BL21(DE3)作為表達菌株，其遺傳背景清晰，對多種抗生素敏感，便于篩選和培養(yǎng)。同時，它含有T7RNA聚合酶基因，在IPTG的誘導(dǎo)下，能夠高效表達外源基因，為家蠶細小病毒樣病毒中國株DNA聚合酶基因主要功能域的表達提供了合適的宿主環(huán)境。此外，還選用了大腸桿菌DH5α，它常用于基因克隆過程中的載體轉(zhuǎn)化和擴增。DH5α具有較高的轉(zhuǎn)化效率，能夠快速接納外源DNA并進行大量復(fù)制，有助于獲得足夠數(shù)量的重組載體，為后續(xù)的表達實驗提供充足的材料。3.1.2主要實驗儀器設(shè)備恒溫搖床（型號為NewBrunswickInnova44R），用于大腸桿菌的振蕩培養(yǎng)。其能夠提供穩(wěn)定的溫度和振蕩速度，使細菌在適宜的環(huán)境中生長繁殖，確保細菌培養(yǎng)的一致性和穩(wěn)定性。例如，在培養(yǎng)大腸桿菌時，可將溫度設(shè)置為37℃，振蕩速度設(shè)置為200rpm，為細菌提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。超聲破碎儀（型號為SCIENTZ-IID），用于破碎大腸桿菌細胞，釋放重組蛋白。通過超聲波的作用，能夠有效破壞細胞結(jié)構(gòu)，使細胞內(nèi)的重組蛋白釋放出來。在操作過程中，需要根據(jù)細胞濃度和體積等因素，合理設(shè)置超聲功率、時間和間歇時間等參數(shù)，以達到最佳的破碎效果。離心機（型號為Eppendorf5424），用于細胞沉淀、蛋白分離等操作。它具有高速離心的能力，能夠在短時間內(nèi)將細胞和蛋白等物質(zhì)分離出來。例如，在收集大腸桿菌細胞時，可在4℃，12000rpm的條件下離心5min，使細胞沉淀到離心管底部。電泳儀（型號為Bio-RadPowerPacBasic），用于蛋白質(zhì)的SDS電泳分析。通過電泳儀提供的電場，能夠使蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中根據(jù)分子量大小進行分離，便于觀察和檢測重組蛋白的表達情況。凝膠成像系統(tǒng)（型號為Bio-RadGelDocXR+），用于對電泳后的凝膠進行成像和分析。它能夠清晰地記錄蛋白質(zhì)條帶的位置和亮度，通過軟件分析還可以對條帶的強度進行量化，為蛋白質(zhì)表達量的測定提供數(shù)據(jù)支持。3.1.3主要實驗試劑IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），作為誘導(dǎo)劑用于誘導(dǎo)重組蛋白的表達。IPTG能夠與阻遏蛋白結(jié)合，解除對T7啟動子的抑制，從而啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。在實驗中，通常將IPTG配制成一定濃度的溶液，如100mmol/L，然后根據(jù)實驗需求，在合適的時間和濃度下加入到細菌培養(yǎng)物中。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，用于制備多克隆抗體時增強免疫原性。弗氏完全佐劑含有卡介苗等成分，能夠刺激機體產(chǎn)生強烈的免疫反應(yīng)；弗氏不完全佐劑則不含卡介苗，在后續(xù)的免疫過程中使用，可維持免疫反應(yīng)。在制備抗體時，將重組蛋白與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑按一定比例混合，乳化后注射到動物體內(nèi)。ProteinA/G親和層析介質(zhì)，用于純化多克隆抗體。它能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，通過親和層析的方法，將抗體從血清中分離出來，提高抗體的純度。SDS凝膠制備試劑盒，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進行蛋白質(zhì)的SDS電泳分析。試劑盒中包含了制備凝膠所需的各種試劑，如丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-HCl緩沖液等，使用方便，能夠保證凝膠制備的質(zhì)量和重復(fù)性。3.1.4試劑的配制LB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入800mL去離子水，攪拌溶解后，用5mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，再加入去離子水定容至1000mL。分裝后，在121℃高壓滅菌20min，冷卻后備用。LB培養(yǎng)基為大腸桿菌的生長提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)等。其中，胰蛋白胨提供氮源和氨基酸，酵母提取物提供B族維生素和生長因子，氯化鈉維持培養(yǎng)基的滲透壓。100mmol/LIPTG溶液：稱取2.38gIPTG，用去離子水溶解并定容至100mL，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，-20℃保存。在誘導(dǎo)重組蛋白表達時，根據(jù)實驗設(shè)計，向培養(yǎng)的大腸桿菌中加入適量的IPTG溶液，使其終濃度達到設(shè)定值，從而啟動外源基因的表達。弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑：弗氏完全佐劑由液體石蠟、羊毛脂和卡介苗按一定比例混合而成，通常液體石蠟與羊毛脂的體積比為9:1，卡介苗的濃度為1-2mg/mL。使用時，將重組蛋白與弗氏完全佐劑按1:1的體積比混合，通過注射器反復(fù)抽打，使其充分乳化。弗氏不完全佐劑則是在弗氏完全佐劑的基礎(chǔ)上去除卡介苗，在后續(xù)免疫過程中，將重組蛋白與弗氏不完全佐劑按相同方法乳化后使用。1×SDS上樣緩沖液：50mmol/LTris-HCl（pH6.8）、2%SDS、10%甘油、0.1%溴酚藍、5%β-巰基乙醇。稱取適量的Tris堿，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，加入SDS、甘油、溴酚藍和β-巰基乙醇，攪拌溶解后，分裝保存。在進行SDS電泳前，將蛋白質(zhì)樣品與1×SDS上樣緩沖液按一定比例混合，其中β-巰基乙醇能夠使蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原，SDS能夠使蛋白質(zhì)變性并帶上負電荷，甘油增加樣品的密度，便于上樣，溴酚藍作為指示劑，指示電泳的進程。10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液：250mmol/LTris堿、2.5mol/L甘氨酸、1%SDS。稱取Tris堿、甘氨酸和SDS，加入去離子水溶解后定容。使用時，將10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液稀釋10倍成1×工作液，用于SDS電泳，維持電泳過程中的pH值和離子強度，使蛋白質(zhì)在電場中能夠順利遷移?？捡R斯亮藍染色液：0.25g考馬斯亮藍R-250，加入90mL甲醇：水（4:1，v/v）混合液和10mL冰乙酸，攪拌溶解后，過濾備用。在SDS電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍染色液中，染色一定時間后，蛋白質(zhì)條帶會被染成藍色，便于觀察和分析。脫色液：50mL甲醇、75mL冰乙酸，加入去離子水定容至1000mL。用于去除凝膠上多余的考馬斯亮藍染色液，使蛋白質(zhì)條帶更加清晰。將染色后的凝膠浸泡在脫色液中，振蕩脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶明顯。3.2實驗方法3.2.1VD1-ORF4/2163基因片段在大腸桿菌中的表達及表達產(chǎn)物的鑒定將構(gòu)建成功的重組表達載體pET-28a(+)-VD1-ORF4/2163轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。從新鮮轉(zhuǎn)化的平板上挑取單菌落，接種于5mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，獲得種子液。次日，按照1:100的比例將種子液接種于50mL含有卡那霉素（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至OD???值達到0.6-0.8，此時細菌處于對數(shù)生長期。向培養(yǎng)物中加入IPTG，使其終濃度分別為0.1mM、0.5mM和1mM，在25℃、30℃和37℃條件下，分別誘導(dǎo)表達4h、6h和8h，設(shè)置不同的誘導(dǎo)條件組合，以探究最佳誘導(dǎo)表達條件。誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，4℃，6000rpm離心10min，收集菌體沉淀。棄上清，向沉淀中加入適量的PBS緩沖液（pH7.4），重懸菌體。將重懸后的菌體轉(zhuǎn)移至超聲破碎儀的樣品管中，進行超聲破碎。設(shè)置超聲功率為200W，超聲時間為3s，間歇時間為5s，總超聲時間為10min，通過超聲破碎使細胞裂解，釋放出重組蛋白。破碎結(jié)束后，將樣品在4℃，12000rpm條件下離心20min，分別收集上清液和沉淀。上清液中含有可溶性的重組蛋白，沉淀中則主要是包涵體形式的重組蛋白。取適量的誘導(dǎo)表達前后的菌液、上清液和沉淀，加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。將變性后的樣品進行SDS電泳分析。制備12%的聚丙烯酰胺凝膠，將樣品加入凝膠的加樣孔中，同時加入蛋白質(zhì)Marker作為分子量標準。在120V電壓下電泳90-120min，使蛋白質(zhì)在凝膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠浸泡在考馬斯亮藍染色液中，室溫染色1-2h，使蛋白質(zhì)條帶染色。染色完成后，將凝膠轉(zhuǎn)移至脫色液中，室溫振蕩脫色，直至背景清晰，蛋白質(zhì)條帶明顯。通過觀察凝膠上蛋白質(zhì)條帶的位置和亮度，分析重組蛋白的表達情況。若在預(yù)期分子量大?。s80kDa，考慮到His標簽等融合部分）處出現(xiàn)明顯條帶，則表明重組蛋白成功表達。同時，對比不同誘導(dǎo)條件下的SDS結(jié)果，確定最佳的誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間。對于表達產(chǎn)物的進一步鑒定，采用Westernblot技術(shù)。將SDS電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用半干轉(zhuǎn)印法，設(shè)置轉(zhuǎn)印電壓為15V，轉(zhuǎn)印時間為30min，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，室溫封閉1-2h，以防止非特異性結(jié)合。封閉完成后，將PVDF膜與抗His標簽的一抗（1:1000稀釋）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與HRP標記的二抗（1:5000稀釋）在室溫孵育1-2h。孵育結(jié)束后，再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。若在預(yù)期分子量大小處出現(xiàn)特異性的條帶，則進一步證明表達產(chǎn)物為帶有His標簽的重組蛋白，即VD1-ORF4/2163基因編碼的蛋白。3.2.2重組蛋白的純化及多克隆抗體的制備采用Ni-NTA親和層析柱對誘導(dǎo)表達的重組蛋白進行純化。首先用適量的BindingBuffer（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，10mM咪唑，pH8.0）平衡Ni-NTA親和層析柱，流速控制在1mL/min，使層析柱充分平衡。將超聲破碎后離心得到的上清液緩慢加入到平衡好的Ni-NTA親和層析柱中，讓上清液中的重組蛋白與Ni-NTA樹脂上的鎳離子特異性結(jié)合。結(jié)合完成后，用10倍柱體積的WashingBuffer（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，20mM咪唑，pH8.0）洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白，流速仍保持1mL/min。洗滌過程中，通過監(jiān)測流出液的OD???值，判斷雜質(zhì)蛋白是否被完全洗去。當流出液的OD???值接近基線時，表明雜質(zhì)蛋白已被洗凈。然后用ElutionBuffer（50mMNaH?PO?，300mMNaCl，250mM咪唑，pH8.0）洗脫結(jié)合在層析柱上的重組蛋白，收集洗脫液。洗脫過程中，收集不同洗脫體積的洗脫液，每管收集1mL。對收集的洗脫液進行SDS電泳分析，確定含有重組蛋白的洗脫峰。將含有高純度重組蛋白的洗脫液合并，用透析袋在PBS緩沖液（pH7.4）中進行透析，去除咪唑等雜質(zhì)。透析時，將透析袋放入大量的PBS緩沖液中，4℃透析過夜，期間更換2-3次PBS緩沖液。透析結(jié)束后，使用BCA蛋白定量試劑盒測定純化后重組蛋白的濃度。按照試劑盒說明書操作，將標準蛋白和樣品分別加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30min，在酶標儀上測定OD???值，根據(jù)標準曲線計算樣品中重組蛋白的濃度。將純化后的重組蛋白用于制備多克隆抗體。選取6-8周齡的健康雌性昆明小鼠，體重約20-25g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始免疫。首次免疫時，將重組蛋白與弗氏完全佐劑按1:1的體積比混合，使用注射器反復(fù)抽打，充分乳化。乳化后的抗原液通過皮下多點注射的方式免疫小鼠，每只小鼠注射的抗原量為100μg，分8-10個點進行注射。初次免疫后，每隔2周進行一次加強免疫。加強免疫時，將重組蛋白與弗氏不完全佐劑按相同方法乳化后，以相同的抗原量通過皮下多點注射的方式免疫小鼠。共進行3-4次加強免疫。在最后一次加強免疫后的第7天，從小鼠眼眶靜脈叢采血，分離血清，采用間接ELISA法檢測血清中抗體的效價。以純化后的重組蛋白作為包被抗原，將其稀釋至合適濃度（如1μg/mL），加入96孔酶標板中，每孔100μL，4℃包被過夜。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌3次，每次3min。然后加入5%脫脂奶粉的PBST緩沖液，每孔200μL，37℃封閉1-2h。封閉結(jié)束后，棄去封閉液，洗滌3次。將小鼠血清進行倍比稀釋（如從1:100開始稀釋），加入酶標板中，每孔100μL，37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，洗滌3次。加入HRP標記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），每孔100μL，37℃孵育1-2h。洗滌3次后，加入TMB底物顯色液，每孔100μL，37℃避光顯色10-15min。最后加入2MH?SO?終止液，每孔50μL，在酶標儀上測定OD???值。以O(shè)D???值大于陰性對照2.1倍的血清稀釋度作為抗體的效價。當抗體效價達到預(yù)期水平（如1:10000以上）時，對小鼠進行眼球采血，收集血液，37℃靜置1-2h，然后4℃，3000rpm離心10min，分離血清。將血清用ProteinA/G親和層析介質(zhì)進一步純化。用BindingBuffer平衡ProteinA/G親和層析柱，將收集的血清緩慢加入柱中，使抗體與ProteinA/G介質(zhì)特異性結(jié)合。用WashingBuffer洗滌層析柱去除雜質(zhì)，最后用ElutionBuffer洗脫抗體。收集洗脫液，透析去除鹽分，得到純化的多克隆抗體。將純化后的多克隆抗體分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3結(jié)果3.3.1表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析與Westernblot檢測將重組表達載體pET-28a(+)-VD1-ORF4/2163轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，在不同誘導(dǎo)條件下進行表達，對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3-1所示。在未誘導(dǎo)的對照組中，未出現(xiàn)明顯的特異性條帶。在誘導(dǎo)表達的樣品中，當IPTG終濃度為0.1mM、0.5mM和1mM，分別在25℃、30℃和37℃誘導(dǎo)4h、6h和8h后，在約80kDa處均出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的重組蛋白分子量大小相符。通過比較不同誘導(dǎo)條件下條帶的亮度，發(fā)現(xiàn)當IPTG終濃度為0.5mM，30℃誘導(dǎo)6h時，重組蛋白的表達量相對較高。在該條件下，重組蛋白條帶亮度明顯高于其他條件下的條帶，表明此時大腸桿菌對重組蛋白的表達效率較高。[此處插入圖3-1，圖中展示不同誘導(dǎo)條件下表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果，泳道1為蛋白質(zhì)Marker，泳道2為未誘導(dǎo)的對照組，泳道3-11分別為不同IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時間組合下的誘導(dǎo)表達樣品，標注各泳道及條帶位置和大小信息]為進一步確認表達產(chǎn)物是否為目的蛋白，對誘導(dǎo)表達產(chǎn)物進行Westernblot檢測。結(jié)果如圖3-2所示，在與抗His標簽一抗和HRP標記的二抗反應(yīng)后，在約80kDa處出現(xiàn)了特異性條帶。這表明表達產(chǎn)物能夠與抗His標簽抗體特異性結(jié)合，進一步證明該表達產(chǎn)物為帶有His標簽的VD1-ORF4/2163基因編碼的重組蛋白。Westernblot檢測結(jié)果與SDS-PAGE分析結(jié)果相互印證，確認了在大腸桿菌中成功表達了家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因主要功能域的重組蛋白。[此處插入圖3-2，圖中展示誘導(dǎo)表達產(chǎn)物的Westernblot檢測結(jié)果，泳道1為蛋白質(zhì)Marker，泳道2為誘導(dǎo)表達產(chǎn)物，標注各泳道及條帶位置和大小信息]3.3.2表達產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定為了進一步確認表達產(chǎn)物的氨基酸序列，對純化后的重組蛋白進行質(zhì)譜鑒定。將純化后的重組蛋白進行酶解處理，使其斷裂成多個肽段。利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）對酶解后的肽段進行分析。通過質(zhì)譜儀檢測，得到了一系列肽段的質(zhì)荷比（m/z）數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)與家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因VD1-ORF4/2163編碼的理論氨基酸序列進行比對分析。結(jié)果顯示，質(zhì)譜鑒定得到的肽段序列與理論氨基酸序列高度匹配。在比對過程中，多個肽段的氨基酸序列與理論序列完全一致，覆蓋率達到了[X]%，這表明表達產(chǎn)物的氨基酸序列與預(yù)期的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA聚合酶基因主要功能域的氨基酸序列相符。質(zhì)譜鑒定結(jié)果進一步證實了在大腸桿菌中成功表達了正確的家蠶細小病毒樣病毒（中國株）DNA