富氫鹽水對小型豬腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)細(xì)胞自噬的影響探究一、引言1.1腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用1.1.1腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)的發(fā)展歷程腹腔鏡技術(shù)的起源可以追溯到20世紀(jì)初，1901年，俄羅斯彼得堡的婦科醫(yī)師Ott在腹前壁作一小切口，插入窺陰器到腹腔內(nèi)，用頭鏡將光線反射進(jìn)入腹腔，對腹腔進(jìn)行檢查，同年德國的外科醫(yī)師Kelling在狗的腹腔內(nèi)插入一根膀胱鏡進(jìn)行檢查，并稱這種檢查為腹腔鏡的內(nèi)鏡檢查，這標(biāo)志著腹腔鏡技術(shù)的初步誕生。1910年瑞典斯德歌爾摩的Jacobaeus首次使用腹腔鏡檢查這一名詞，并采用套管針制造氣腹。此后，腹腔鏡技術(shù)在不斷的改進(jìn)與探索中逐漸發(fā)展。1938年匈牙利的外科醫(yī)師Veress介紹了一種注氣針，可以安全地做成氣胸，在做氣腹時(shí)，能防止針尖損傷針下的內(nèi)臟，這種安全穿刺針制作氣腹的方法被普遍接受并沿用至今。德國的胃腸病學(xué)家Kalk發(fā)明了直前斜視135°的透鏡系統(tǒng)，他也被認(rèn)為是德國診斷肝臟和膽囊疾病的腹腔鏡檢查術(shù)的奠基人，于1929年首先提倡用雙套管穿刺針技術(shù)。在后續(xù)的發(fā)展中，腹腔鏡技術(shù)不斷取得突破。20世紀(jì)80年代初，腹腔鏡手術(shù)在世界范圍內(nèi)逐漸興起。1985年，法國外科醫(yī)生Mouret首次成功地進(jìn)行了腹腔鏡膽囊切除術(shù)，標(biāo)志著腹腔鏡手術(shù)進(jìn)入了新的發(fā)展階段，使得膽囊疾病的治療從傳統(tǒng)開放手術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)槲?chuàng)手術(shù)，極大地減少了患者的痛苦和康復(fù)時(shí)間。隨后，1987年美國外科醫(yī)生Reddick首次成功地進(jìn)行了腹腔鏡胃腸切除術(shù)，進(jìn)一步擴(kuò)大了腹腔鏡手術(shù)的適應(yīng)癥范圍，此后，腹腔鏡手術(shù)在膽道、腎臟、脾臟等器官的手術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。1991年，美國婦科醫(yī)生Reich等嘗試在腹腔鏡婦科手術(shù)中對位于肝臟淺表邊緣的良性腫物實(shí)施同期切除并獲得成功，開啟了肝臟外科學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用腹腔鏡技術(shù)的新時(shí)代。1992年，美國外科醫(yī)生Schuessler首次成功地進(jìn)行了腹腔鏡心房切除術(shù)，開創(chuàng)了腹腔鏡心臟手術(shù)的先河。1991年2月，荀祖武完成中國第一例腹腔鏡膽囊切除術(shù)，這也是中國第一例腹腔鏡外科手術(shù)，此后中國的腹腔鏡技術(shù)開始快速發(fā)展。1993年，第二軍醫(yī)大學(xué)劉彥教授進(jìn)行了國內(nèi)第1例子宮切除術(shù)，并率先進(jìn)行巨大卵巢腫瘤切除、休克性宮外孕、重度子宮內(nèi)異癥等腹腔鏡下手術(shù)。經(jīng)過多年的發(fā)展，中國微創(chuàng)外科如今已達(dá)到國際領(lǐng)先水平，在胃癌、腸癌、肝癌和胰腺疾病手術(shù)等方面甚至超過歐美國家水平。從最初簡單的腹腔檢查，到如今廣泛應(yīng)用于各種復(fù)雜手術(shù)，腹腔鏡技術(shù)在不斷革新的過程中，為外科手術(shù)領(lǐng)域帶來了巨大變革，其發(fā)展歷程見證了醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步與突破。1.1.2腹腔鏡肝切除術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀目前，腹腔鏡肝切除術(shù)在臨床中的應(yīng)用愈發(fā)廣泛。隨著腹腔鏡手術(shù)技術(shù)的不斷成熟以及腹腔鏡器械的改進(jìn)創(chuàng)新，其手術(shù)安全性大大提高。在手術(shù)適應(yīng)癥方面，綜合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，比較適宜的情況為：肝功能在Child-Pugh分級B級以上，其他臟器無嚴(yán)重病變，剩余肝臟能滿足病人的生理需要，既往沒有上腹部手術(shù)史。像位于肝臟第II~第VII段表面較淺的局限小腫瘤、左肝外葉肝內(nèi)膽管結(jié)石、肝臟的良惡性腫瘤、肝囊腫等都是常見的手術(shù)對象，其中良性腫瘤大小一般應(yīng)小于8cm，惡性腫瘤直徑一般不超過5cm。在手術(shù)成功率方面，隨著技術(shù)的進(jìn)步，腹腔鏡肝切除術(shù)的成功率不斷提高。一些經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)療中心，對于符合手術(shù)指征的患者，手術(shù)成功率可達(dá)到較高水平。在術(shù)后恢復(fù)方面，腹腔鏡肝切除術(shù)展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。與傳統(tǒng)開腹手術(shù)相比，患者術(shù)后疼痛較輕，恢復(fù)速度更快，通常術(shù)后1~2天即可下床活動，2~3天可進(jìn)食。住院時(shí)間也明顯縮短，這不僅減輕了患者的痛苦，也降低了患者的醫(yī)療費(fèi)用和住院負(fù)擔(dān)。然而，腹腔鏡肝切除術(shù)也并非毫無挑戰(zhàn)。肝臟血運(yùn)豐富，重要管道較多且復(fù)雜，損傷后的后果嚴(yán)重，這使得手術(shù)操作難度較大。例如，術(shù)中出血是主要問題之一，且比開腹?fàn)顟B(tài)下更難控制，術(shù)中大出血常常是腹腔鏡肝切除失敗的主要原因。此外，對于一些位置特殊的腫瘤，如肝臟第VIII段腫瘤靠近膈頂，腹腔鏡顯露困難，切除難度極大，術(shù)中也容易引起肝靜脈損傷。而且，部分學(xué)者認(rèn)為腹腔鏡技術(shù)治療肝臟惡性腫瘤可能存在一些風(fēng)險(xiǎn)，如腹腔鏡缺乏手的觸覺，難以確定腫瘤的邊界，無法保證陰性的切緣；腹腔鏡氣腹壓力可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞從病灶釋放進(jìn)入血流引起轉(zhuǎn)移；腹腔鏡難以完成開腹手術(shù)的淋巴結(jié)清掃，增加術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率；CO2氣腹可導(dǎo)致腹膜等局部環(huán)境酸中毒，削弱其對腫瘤的免疫力從而增加腹膜和切口種植轉(zhuǎn)移的可能。但總體而言，隨著技術(shù)的發(fā)展和經(jīng)驗(yàn)的積累，腹腔鏡肝切除術(shù)在肝臟疾病治療中占據(jù)著越來越重要的地位，并且在不斷的探索與改進(jìn)中持續(xù)發(fā)展。1.1.3腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用與發(fā)展在獸醫(yī)外科手術(shù)中，腹腔鏡技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。它可用于多種疾病的診斷和治療，如在馬的疾病診治中，不僅可以用獸用腹腔鏡技術(shù)進(jìn)行腹腔探查和活組織檢查，而且還可以進(jìn)行各種腹部手術(shù)，像隱睪、卵巢的切除、疝的修補(bǔ)及結(jié)腸固定等。在腹腔探查方面，獸用腹腔鏡可直接觀察站立或仰臥馬的胃腸表面、肝膽、脾腎、胰腺、卵巢子宮和膀胱等其他腹部器官，有利于某些腹部疾病的診斷和預(yù)后；在活組織檢查中，在腹腔鏡的引導(dǎo)下進(jìn)行活檢技術(shù)可以直視被檢組織器官，準(zhǔn)確取得樣本。在疾病治療上，馬的腹腔鏡技術(shù)主要集中在生殖系統(tǒng)手術(shù)、泌尿系統(tǒng)手術(shù)、疝修補(bǔ)術(shù)、結(jié)腸固定術(shù)與腎脾間隙閉合術(shù)及粘連松解術(shù)等手術(shù)。例如，通過腹部探查鑒定隱睪的大小和位置后，利用腹腔鏡手術(shù)常規(guī)切除隱睪；腹腔鏡技術(shù)也成功用于馬的腎切除術(shù)、膀胱切開術(shù)和成形術(shù)等泌尿系統(tǒng)手術(shù)；對于馬通常發(fā)生的腹股溝疝、腹部切口疝等，利用腹腔鏡技術(shù)可以有效進(jìn)行修補(bǔ)。在小動物臨床中，腹腔鏡技術(shù)同樣得到應(yīng)用。以貓為例，有研究進(jìn)行了雙孔腹腔鏡母貓絕育術(shù)后不使用抗生素的效果觀察，為臨床實(shí)踐提供了新的思路和參考。在羊的繁殖領(lǐng)域，腹腔鏡技術(shù)也有應(yīng)用，如對哈薩克羊進(jìn)行腹腔鏡人工授精，以及對藏羊進(jìn)行腹腔鏡冷凍精液人工授精等研究，探究其對繁殖性能的影響。然而，腹腔鏡技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用也面臨一些挑戰(zhàn)。一方面，相關(guān)的專業(yè)人才相對匱乏，具備熟練操作腹腔鏡技術(shù)的獸醫(yī)數(shù)量不足，這限制了該技術(shù)的廣泛推廣；另一方面，腹腔鏡設(shè)備及相關(guān)耗材成本較高，對于一些小型獸醫(yī)診所或經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的獸醫(yī)機(jī)構(gòu)來說，購置和使用這些設(shè)備存在一定經(jīng)濟(jì)壓力。此外，不同動物種類的解剖結(jié)構(gòu)存在差異，需要針對不同動物進(jìn)行手術(shù)操作的優(yōu)化和調(diào)整，這也增加了技術(shù)應(yīng)用的難度。但隨著獸醫(yī)醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及對動物健康重視程度的提高，腹腔鏡微創(chuàng)技術(shù)在獸醫(yī)領(lǐng)域有望得到更廣泛的應(yīng)用和更深入的發(fā)展。1.2肝臟缺血再灌注損傷研究進(jìn)展1.2.1肝臟缺血再灌注損傷的機(jī)制肝臟缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，涉及多個(gè)方面的機(jī)制。炎癥反應(yīng)在其中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)肝臟經(jīng)歷缺血再灌注時(shí)，會激活免疫系統(tǒng)，引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。在缺血期，組織缺氧會導(dǎo)致細(xì)胞損傷，釋放出多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等。這些炎癥介質(zhì)會吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集到缺血區(qū)域。在再灌注期，這些免疫細(xì)胞被進(jìn)一步激活，釋放更多的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，形成炎癥級聯(lián)反應(yīng)。例如，中性粒細(xì)胞會釋放大量的活性氧（ROS）和蛋白水解酶，不僅直接損傷肝細(xì)胞，還會破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管通透性增加，加重組織水腫和炎癥反應(yīng)。而且，炎癥反應(yīng)還會導(dǎo)致微循環(huán)障礙，進(jìn)一步影響肝臟的血液灌注和氧氣供應(yīng)，加劇肝臟損傷。氧化應(yīng)激也是肝臟缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一。在缺血期，由于氧氣供應(yīng)不足，細(xì)胞內(nèi)的代謝過程發(fā)生紊亂，產(chǎn)生大量的ROS，如超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等。這些ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，會攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)變性和DNA損傷。例如，ROS會使細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)，形成脂質(zhì)過氧化物，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和細(xì)胞死亡。在再灌注期，隨著氧氣的重新供應(yīng)，會進(jìn)一步加劇ROS的產(chǎn)生，形成“再灌注損傷”。因?yàn)榇藭r(shí)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)可能已經(jīng)受到損傷，無法及時(shí)清除過多的ROS，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激進(jìn)一步加重。細(xì)胞凋亡在肝臟缺血再灌注損傷中也不容忽視。缺血再灌注過程中的多種因素，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙等，都可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。線粒體在細(xì)胞凋亡中起著核心作用，缺血再灌注會導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase家族蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。此外，死亡受體途徑也參與了肝細(xì)胞凋亡的調(diào)控。例如，TNF-α與其受體結(jié)合后，可以激活caspase-8，進(jìn)而啟動細(xì)胞凋亡過程。細(xì)胞凋亡會導(dǎo)致肝細(xì)胞數(shù)量減少，影響肝臟的正常功能。除上述機(jī)制外，還有其他因素也參與了肝臟缺血再灌注損傷。如能量代謝障礙，缺血期會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP生成減少，能量供應(yīng)不足，影響細(xì)胞的正常生理功能。再灌注期，雖然氧氣供應(yīng)恢復(fù)，但由于線粒體功能受損，ATP生成仍然受限，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷。另外，鈣離子超載也是一個(gè)重要因素，缺血再灌注會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活多種鈣依賴性酶，如磷脂酶、蛋白酶等，這些酶會破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，引發(fā)細(xì)胞損傷。肝臟缺血再灌注損傷是一個(gè)多因素、多機(jī)制共同作用的復(fù)雜病理過程，深入了解這些機(jī)制對于尋找有效的治療方法具有重要意義。1.2.2肝臟缺血再灌注損傷的治療目前，針對肝臟缺血再灌注損傷的治療方法主要包括藥物治療、預(yù)處理和后處理等。藥物治療方面，抗氧化劑是常用的一類藥物。如維生素E、維生素C等，它們可以通過提供氫原子，與ROS結(jié)合，從而清除體內(nèi)過多的ROS，減輕氧化應(yīng)激損傷。維生素E是一種脂溶性抗氧化劑，能夠嵌入細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層中，阻斷脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜免受ROS的攻擊；維生素C是一種水溶性抗氧化劑，可在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮抗氧化作用，它可以將氧化型谷胱甘肽還原為還原型谷胱甘肽，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。一些具有抗氧化作用的中藥提取物也被用于肝臟缺血再灌注損傷的治療，如丹參酮、姜黃素等。丹參酮能夠抑制ROS的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，減輕氧化應(yīng)激對肝臟的損傷；姜黃素具有抗炎、抗氧化和抗凋亡等多種生物活性，可通過抑制炎癥信號通路和減少ROS的生成，對肝臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。然而，抗氧化劑的治療效果存在一定局限性，它們往往需要在缺血再灌注前或早期使用才能發(fā)揮較好的作用，而且對于嚴(yán)重的缺血再灌注損傷，單獨(dú)使用抗氧化劑可能無法完全阻止損傷的發(fā)生。鈣通道阻滯劑也常用于治療肝臟缺血再灌注損傷。它們可以通過阻斷細(xì)胞膜上的鈣離子通道，減少鈣離子內(nèi)流，防止細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，從而減輕細(xì)胞損傷。例如，硝苯地平、維拉帕米等鈣通道阻滯劑能夠抑制鈣離子進(jìn)入肝細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，保護(hù)線粒體功能，減少細(xì)胞凋亡。但鈣通道阻滯劑也可能會帶來一些副作用，如低血壓、心動過緩等，在使用時(shí)需要密切監(jiān)測患者的生命體征。預(yù)處理是一種有效的減輕肝臟缺血再灌注損傷的方法，包括缺血預(yù)處理、藥物預(yù)處理等。缺血預(yù)處理是指在肝臟遭受長時(shí)間缺血再灌注之前，先給予短暫的缺血和再灌注循環(huán)。例如，在動物實(shí)驗(yàn)中，對肝臟進(jìn)行3-5分鐘的缺血，然后再灌注5-10分鐘，如此反復(fù)2-3次，能夠顯著減輕后續(xù)長時(shí)間缺血再灌注對肝臟的損傷。其機(jī)制可能與激活細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)信號通路、增加抗氧化酶的表達(dá)、抑制炎癥反應(yīng)等有關(guān)。藥物預(yù)處理則是在缺血再灌注前給予某些藥物，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。如腺苷、七氟醚等藥物可以通過激活細(xì)胞內(nèi)的腺苷受體、調(diào)節(jié)線粒體功能等機(jī)制，減輕肝臟缺血再灌注損傷。然而，預(yù)處理的方法也有一定的局限性，對于一些緊急手術(shù)或無法預(yù)測缺血時(shí)間的情況，可能無法實(shí)施預(yù)處理。后處理是在肝臟缺血再灌注后采取的一些干預(yù)措施，以減輕損傷。缺血后處理是指在再灌注初期給予短暫的反復(fù)缺血和再灌注。例如，在再灌注開始后的幾分鐘內(nèi)，進(jìn)行30秒-1分鐘的缺血，然后再灌注1-2分鐘，如此反復(fù)3-4次，能夠有效減輕肝臟缺血再灌注損傷。其機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等有關(guān)。藥物后處理也是一種重要的方法，如給予某些細(xì)胞保護(hù)劑或抗炎藥物等。但是，后處理的效果也受到多種因素的影響，如干預(yù)的時(shí)間點(diǎn)、干預(yù)的強(qiáng)度等，需要進(jìn)一步優(yōu)化和研究。肝臟缺血再灌注損傷的治療方法雖然眾多，但每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。在臨床實(shí)踐中，需要根據(jù)患者的具體情況，綜合運(yùn)用多種治療方法，以達(dá)到最佳的治療效果。1.3自噬的研究進(jìn)展1.3.1自噬的概念及分類自噬（Autophagy）這一概念最早由比利時(shí)科學(xué)家ChristiandeDuve在1963年提出，它是細(xì)胞內(nèi)一種高度保守的自我降解過程，對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、應(yīng)對營養(yǎng)缺乏、清除受損細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。自噬主要分為微自噬（Microautophagy）、巨自噬（Macroautophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperone-mediatedautophagy，CMA）三種類型。微自噬是指溶酶體直接內(nèi)陷包裹細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等，然后進(jìn)行降解的過程。這種方式相對較為直接，不需要形成復(fù)雜的雙層膜結(jié)構(gòu)。例如，在酵母細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞處于氮源缺乏的環(huán)境時(shí)，微自噬會被激活，溶酶體通過內(nèi)陷將細(xì)胞質(zhì)中的核糖體等物質(zhì)包裹并降解，為細(xì)胞提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)。微自噬的特點(diǎn)是其作用過程相對較為迅速，能夠快速對細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化做出響應(yīng)，但它所能降解的物質(zhì)范圍相對較窄，主要針對一些較小的分子和細(xì)胞器。巨自噬則是目前研究最為廣泛的自噬類型。在巨自噬過程中，細(xì)胞首先會形成一種雙層膜結(jié)構(gòu)，稱為自噬體（Autophagosome）。自噬體逐漸延伸并包裹需要降解的物質(zhì)，如受損的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器以及一些錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集物。當(dāng)自噬體形成后，它會與溶酶體融合，形成自噬溶酶體（Autolysosome），在溶酶體酶的作用下，自噬體內(nèi)的物質(zhì)被降解，降解產(chǎn)物則被釋放到細(xì)胞質(zhì)中供細(xì)胞重新利用。以肝細(xì)胞為例，在饑餓狀態(tài)下，肝細(xì)胞會通過巨自噬降解多余的脂肪滴，產(chǎn)生脂肪酸和甘油，為細(xì)胞提供能量。巨自噬的特點(diǎn)是能夠降解較大的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)聚集物，對維持細(xì)胞的正常功能具有重要意義，但它的形成和作用過程相對較為復(fù)雜，需要多個(gè)步驟和多種蛋白質(zhì)的參與。分子伴侶介導(dǎo)的自噬具有高度的選擇性。在這種自噬方式中，細(xì)胞內(nèi)的分子伴侶，如熱休克蛋白70（Hsp70）等，能夠識別并結(jié)合含有特定氨基酸序列（KFERQ樣基序）的蛋白質(zhì)。然后，這些分子伴侶-蛋白質(zhì)復(fù)合物會與溶酶體膜上的受體LAMP-2A結(jié)合，并通過溶酶體膜上的通道進(jìn)入溶酶體，在溶酶體中被降解。例如，在神經(jīng)細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)積累了過多的突變型α-突觸核蛋白時(shí)，分子伴侶介導(dǎo)的自噬會被激活，Hsp70會識別并結(jié)合這些異常蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體中進(jìn)行降解，從而避免異常蛋白質(zhì)的聚集對神經(jīng)細(xì)胞造成損傷。分子伴侶介導(dǎo)的自噬的特點(diǎn)是其高度的選擇性，能夠精準(zhǔn)地識別并降解特定的蛋白質(zhì)，對于維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)具有重要作用，但它只適用于含有特定基序的蛋白質(zhì)的降解。這三種自噬類型在細(xì)胞內(nèi)相互協(xié)作，共同維持著細(xì)胞的正常生理功能，它們各自的特點(diǎn)和作用機(jī)制也為進(jìn)一步研究細(xì)胞的代謝和病理過程提供了重要的方向。1.3.2自噬發(fā)生的過程及調(diào)控自噬的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜且有序的過程，主要包括自噬體的形成、自噬體與溶酶體的融合以及底物的降解等階段。在自噬體形成階段，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如營養(yǎng)缺乏、氧化應(yīng)激、生長因子缺失等信號時(shí)，自噬相關(guān)基因（Autophagy-relatedgenes，ATG）被激活。首先，ULK1（Unc-51-likekinase1）復(fù)合物被激活，它包含ULK1、ATG13、FIP200等蛋白，在自噬起始過程中起著關(guān)鍵作用。ULK1復(fù)合物通過磷酸化激活下游的VPS34（Vacuolarproteinsorting34）復(fù)合物，VPS34復(fù)合物是一種III型磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K-III），它能夠催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P）。PI3P在自噬體形成位點(diǎn)聚集，招募一系列含有PI3P結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，如WIPI1/2（WD-repeatproteininteractingwithphosphoinositides1/2）等，這些蛋白進(jìn)一步促進(jìn)自噬體膜的成核和延伸。隨后，自噬體膜的延伸需要兩個(gè)泛素樣結(jié)合系統(tǒng)的參與，即ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物和LC3（Microtubule-associatedprotein1lightchain3）-磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合系統(tǒng)。ATG12與ATG5通過共價(jià)結(jié)合形成ATG12-ATG5復(fù)合物，然后與ATG16L1結(jié)合，形成多聚體復(fù)合物，該復(fù)合物定位于自噬體膜的外側(cè)，促進(jìn)自噬體膜的延伸。同時(shí)，LC3前體（pro-LC3）被ATG4切割，暴露其C端的甘氨酸殘基，形成LC3-I。LC3-I在ATG7和ATG3的作用下，與PE結(jié)合，形成LC3-II，LC3-II定位于自噬體膜的內(nèi)側(cè)，參與自噬體的形成和底物的識別。當(dāng)自噬體形成后，它會通過細(xì)胞骨架系統(tǒng)，如微管等，運(yùn)輸?shù)饺苊阁w附近，并與溶酶體發(fā)生融合。這一過程涉及到多種蛋白質(zhì)和分子的參與，如RabGTPases家族成員Rab7、SNARE（SolubleNSFattachmentproteinreceptor）蛋白等。Rab7能夠調(diào)節(jié)自噬體與溶酶體的相互作用，促進(jìn)兩者的靠近和識別。SNARE蛋白則在自噬體與溶酶體的膜融合過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們通過形成跨膜復(fù)合物，介導(dǎo)自噬體膜與溶酶體膜的融合，形成自噬溶酶體。在自噬溶酶體中，溶酶體中的各種水解酶，如蛋白酶、核酸酶、糖苷酶等，對自噬體內(nèi)的底物進(jìn)行降解。降解產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，如氨基酸、脂肪酸、核苷酸等，通過溶酶體膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，供細(xì)胞重新利用，參與細(xì)胞的代謝和合成過程。自噬的調(diào)控機(jī)制也十分復(fù)雜，涉及多個(gè)信號通路和分子。其中，mTOR（Mammaliantargetofrapamycin）信號通路是自噬的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控通路。mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以感知細(xì)胞內(nèi)的營養(yǎng)狀態(tài)、能量水平、生長因子等信號。在營養(yǎng)充足、生長因子存在的情況下，mTOR被激活，它可以磷酸化ULK1復(fù)合物中的ULK1和ATG13，使其失去活性，從而抑制自噬的起始。相反，當(dāng)細(xì)胞處于營養(yǎng)缺乏、能量不足等應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，mTOR活性受到抑制，解除對ULK1復(fù)合物的抑制，激活自噬。此外，AMPK（AMP-activatedproteinkinase）信號通路則是自噬的正調(diào)控通路。AMPK是一種細(xì)胞內(nèi)能量感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值升高時(shí)，AMPK被激活。激活的AMPK可以磷酸化ULK1，促進(jìn)自噬的起始。同時(shí)，AMPK還可以通過抑制mTOR的活性，間接促進(jìn)自噬。除了mTOR和AMPK信號通路外，還有其他一些信號通路和分子也參與了自噬的調(diào)控，如PI3K-Akt信號通路、p53基因等。PI3K-Akt信號通路可以通過激活mTOR，抑制自噬。而p53基因在不同的細(xì)胞環(huán)境下，既可以通過激活自噬相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)自噬，也可以通過抑制mTOR等途徑，間接調(diào)控自噬。自噬的發(fā)生過程和調(diào)控機(jī)制相互關(guān)聯(lián)，共同維持著細(xì)胞的正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。1.3.3自噬在缺血再灌注中的發(fā)生機(jī)制及作用在肝臟缺血再灌注損傷中，自噬的發(fā)生機(jī)制與多種因素密切相關(guān)。缺血期，肝臟組織的血液供應(yīng)減少，導(dǎo)致氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，ATP水平下降。這種能量缺乏狀態(tài)會激活A(yù)MPK信號通路，如前文所述，AMPK被激活后可以磷酸化ULK1，從而啟動自噬過程。同時(shí)，缺血還會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，氧化應(yīng)激增強(qiáng)。ROS可以通過多種途徑誘導(dǎo)自噬，例如，ROS可以損傷細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等生物大分子，這些受損的物質(zhì)會被細(xì)胞識別為需要清除的底物，從而激活自噬。此外，ROS還可以通過調(diào)節(jié)一些自噬相關(guān)基因的表達(dá)，如ATG5、ATG7等，促進(jìn)自噬體的形成。再灌注期，隨著血液的重新流入，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)恢復(fù)，但同時(shí)也會產(chǎn)生大量的ROS，進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激。此時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)也會被激活，釋放多種炎癥介質(zhì)，如TNF-α、IL-1等。這些炎癥介質(zhì)可以通過與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號通路，影響自噬的發(fā)生。例如，TNF-α可以通過激活NF-κB（Nuclearfactor-kappaB）信號通路，調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因的表達(dá)。NF-κB被激活后，可以促進(jìn)一些自噬相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也可以抑制另一些基因的表達(dá)，從而對自噬產(chǎn)生復(fù)雜的調(diào)控作用。自噬在肝臟缺血再灌注損傷中對細(xì)胞存活和損傷修復(fù)具有重要作用。在一定程度上，自噬可以起到保護(hù)細(xì)胞的作用。它能夠清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器，如線粒體等。缺血再灌注過程中，線粒體容易受到氧化應(yīng)激的損傷，導(dǎo)致線粒體膜電位下降、呼吸鏈功能障礙等。自噬可以通過選擇性地降解受損的線粒體，維持線粒體的質(zhì)量和功能，減少ROS的產(chǎn)生，從而減輕細(xì)胞的氧化損傷。自噬還可以清除細(xì)胞內(nèi)積累的錯(cuò)誤折疊或聚集的蛋白質(zhì)，防止這些蛋白質(zhì)對細(xì)胞造成毒性作用。這些蛋白質(zhì)聚集物可能會干擾細(xì)胞的正常代謝和信號傳導(dǎo)，通過自噬的降解作用，可以恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)。然而，過度的自噬也可能對細(xì)胞造成損傷。當(dāng)自噬過度激活時(shí)，可能會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的過度降解，影響細(xì)胞的正常生理功能。例如，過度的自噬可能會降解過多的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙、蛋白質(zhì)合成受阻等。而且，在某些情況下，自噬相關(guān)的信號通路可能會被異常激活，引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死。自噬在肝臟缺血再灌注損傷中的作用具有雙重性，適度的自噬有助于細(xì)胞的存活和損傷修復(fù)，而過度的自噬則可能加重細(xì)胞損傷。深入了解自噬在肝臟缺血再灌注損傷中的發(fā)生機(jī)制和作用，對于尋找有效的治療策略，減輕肝臟缺血再灌注損傷具有重要意義。1.4HRS的研究進(jìn)展1.4.1氫分子的應(yīng)用及優(yōu)勢氫分子（H?）在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究近年來取得了顯著進(jìn)展，展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。自2007年Ohsawa等學(xué)者發(fā)現(xiàn)氫氣具有選擇性抗氧化作用，能夠特異性地清除細(xì)胞內(nèi)的羥基自由基（?OH）和過氧亞硝基陰離子（ONOO?）等毒性較強(qiáng)的活性氧，而對具有重要生理功能的超氧陰離子（O??）和過氧化氫（H?O?）等影響較小，這一發(fā)現(xiàn)為氫分子在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。此后，氫分子在多種疾病模型和臨床研究中得到廣泛探索。在抗氧化方面，氫分子能夠直接與毒性自由基反應(yīng)，通過提供電子將其還原為水，從而減輕氧化應(yīng)激對細(xì)胞和組織的損傷。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，給予氫飽和生理鹽水干預(yù)后，可顯著降低肝臟組織中的丙二醛（MDA）含量，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量的降低表明氫分子能夠有效抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少自由基對細(xì)胞膜的損傷。同時(shí)，氫分子還能提高肝臟組織中抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，增強(qiáng)機(jī)體自身的抗氧化防御系統(tǒng)。氫分子的抗炎作用也十分突出。炎癥反應(yīng)是許多疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理過程，氫分子可以通過抑制炎癥細(xì)胞的活化和炎癥介質(zhì)的釋放來減輕炎癥反應(yīng)。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中，氫氣吸入治療能夠顯著降低肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的水平，抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，從而減輕肺部的炎癥損傷。在肝臟疾病中，氫分子同樣可以抑制肝臟內(nèi)炎癥細(xì)胞的浸潤，減少炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，對肝臟起到保護(hù)作用?？沟蛲鍪菤浞肿拥牧硪恢匾獌?yōu)勢。細(xì)胞凋亡在許多疾病的病理過程中扮演著關(guān)鍵角色，氫分子可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路來抑制細(xì)胞凋亡。在心肌缺血再灌注損傷模型中，氫分子能夠抑制Bax蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，從而維持線粒體膜電位的穩(wěn)定，減少細(xì)胞色素C的釋放，抑制caspase家族蛋白酶的激活，最終抑制心肌細(xì)胞的凋亡。在肝臟缺血再灌注損傷中，氫分子也可以通過類似的機(jī)制抑制肝細(xì)胞的凋亡，保護(hù)肝臟的功能。氫分子還具有良好的生物安全性。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，氫分子具有低毒性、無殘留等優(yōu)點(diǎn)。人體對氫分子具有良好的耐受性，即使長期使用也不會產(chǎn)生明顯的毒副作用。在臨床研究中，使用氫水飲用、氫氣吸入等方式給予氫分子干預(yù)，未觀察到明顯的不良反應(yīng)。這些優(yōu)勢使得氫分子在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊，為多種疾病的治療提供了新的思路和方法。1.4.2HRS的作用機(jī)制氫分子生理鹽水（HRS）發(fā)揮作用的機(jī)制主要涉及清除自由基以及對多條信號通路的調(diào)節(jié)。在清除自由基方面，如前文所述，氫分子能夠選擇性地與細(xì)胞內(nèi)毒性較強(qiáng)的羥基自由基（?OH）和過氧亞硝基陰離子（ONOO?）發(fā)生反應(yīng)。這是因?yàn)闅浞肿泳哂休^小的分子半徑，能夠快速擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與這些高活性的自由基結(jié)合。羥基自由基是一種極具氧化活性的自由基，它能夠攻擊細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子，如細(xì)胞膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等，導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷、蛋白質(zhì)的變性以及DNA的斷裂。過氧亞硝基陰離子同樣具有很強(qiáng)的氧化能力，會引起細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。氫分子與這些自由基反應(yīng)后，將其轉(zhuǎn)化為水，從而有效減少了自由基對細(xì)胞的損傷，維持細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。在調(diào)節(jié)信號通路方面，HRS可以對多個(gè)重要的信號通路產(chǎn)生影響，進(jìn)而發(fā)揮其對細(xì)胞的保護(hù)作用。其中，對Nrf2/HO-1信號通路的調(diào)節(jié)是其重要機(jī)制之一。Nrf2（Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2）是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，Nrf2會從細(xì)胞質(zhì)中解離出來，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）結(jié)合，啟動一系列抗氧化酶和解毒酶的基因轉(zhuǎn)錄，如血紅素加氧酶-1（HO-1）等。HO-1能夠催化血紅素降解為一氧化碳（CO）、膽綠素和鐵離子，其中CO和膽綠素具有抗氧化和抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，HRS可以激活Nrf2/HO-1信號通路，增加HO-1的表達(dá)。在氧化應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型中，給予HRS處理后，Nrf2的核轉(zhuǎn)位明顯增加，HO-1的蛋白表達(dá)水平也顯著升高，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的抗氧化能力，減輕了氧化應(yīng)激對細(xì)胞的損傷。HRS還可以調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路。PI3K（Phosphatidylinositol3-kinase）是一種磷脂酰肌醇激酶，Akt是其下游的重要靶點(diǎn)，PI3K/Akt信號通路在細(xì)胞的存活、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在缺血再灌注損傷等病理情況下，PI3K/Akt信號通路的活性會受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。而HRS能夠激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)Akt的磷酸化。在肝臟缺血再灌注損傷模型中，給予HRS干預(yù)后，肝臟組織中p-Akt的表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白如cleaved-caspase3的表達(dá)降低，表明HRS通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制了細(xì)胞凋亡，對肝臟起到了保護(hù)作用。HRS還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如MAPK信號通路、NF-κB信號通路等，來發(fā)揮其抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用，這些信號通路之間相互關(guān)聯(lián)，共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，HRS通過對這些信號通路的精細(xì)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞和組織的保護(hù)。1.4.3氫分子與疾病治療的相關(guān)研究氫分子在多種疾病的治療研究中展現(xiàn)出了積極的成果，為臨床治療提供了新的潛在策略。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，對氫分子在腦缺血再灌注損傷治療中的研究較為深入。多項(xiàng)動物實(shí)驗(yàn)表明，氫氣吸入或氫水飲用能夠顯著改善腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能。在大鼠大腦中動脈阻塞再灌注模型中，吸入氫氣的實(shí)驗(yàn)組大鼠在神經(jīng)功能評分、腦梗死體積等指標(biāo)上均明顯優(yōu)于對照組。這主要是因?yàn)闅浞肿幽軌驕p輕腦內(nèi)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。氫分子還可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和信號傳導(dǎo)，對神經(jīng)系統(tǒng)起到保護(hù)作用。在帕金森病和阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的研究中，也發(fā)現(xiàn)氫分子具有一定的治療潛力。它可以減少腦內(nèi)異常蛋白的聚集，減輕神經(jīng)炎癥，改善認(rèn)知功能。在心血管系統(tǒng)疾病中，氫分子同樣表現(xiàn)出良好的治療效果。在心肌缺血再灌注損傷模型中，給予氫分子干預(yù)能夠顯著減少心肌梗死面積，改善心臟功能。氫分子可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，降低氧化應(yīng)激水平。在高血壓的治療研究中，氫水飲用能夠降低血壓，其機(jī)制可能與氫分子調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能、抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)等有關(guān)。氫分子還對動脈粥樣硬化等心血管疾病具有一定的防治作用，它可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減少脂質(zhì)沉積，穩(wěn)定斑塊。在消化系統(tǒng)疾病方面，氫分子在肝臟疾病治療中的研究備受關(guān)注。除了前文提到的肝臟缺血再灌注損傷，氫分子對非酒精性脂肪性肝病、肝炎等也有治療作用。在非酒精性脂肪性肝病模型中，氫分子能夠減少肝臟脂肪沉積，改善肝功能。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。在肝炎的治療中，氫分子可以抑制病毒復(fù)制，減輕肝臟炎癥，促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)。在胃腸道疾病中，氫分子對胃潰瘍、炎癥性腸病等也有一定的治療效果。它可以促進(jìn)胃黏膜的修復(fù)，減輕腸道炎癥，調(diào)節(jié)腸道菌群。氫分子在多種疾病的治療研究中展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景，雖然目前仍處于基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)階段，但隨著研究的不斷深入，有望為這些疾病的治療帶來新的突破，為患者提供更有效的治療手段。1.5目的與意義1.5.1研究目的本研究旨在深入探究氫分子生理鹽水（HRS）對小型豬腹腔鏡肝缺血再灌注損傷（IRI）合并肝部分切除術(shù)細(xì)胞自噬的影響。具體而言，通過建立小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝部分切除術(shù)模型，從細(xì)胞和分子水平，分析在HRS干預(yù)下，細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)的變化情況，包括自噬相關(guān)蛋白如LC3、p62等的表達(dá)水平變化，以及自噬體的形成數(shù)量和形態(tài)變化等。同時(shí)，觀察HRS對肝臟組織病理損傷程度、肝功能指標(biāo)的影響，從而明確HRS是否能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬，減輕小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝部分切除術(shù)所導(dǎo)致的肝臟損傷，為臨床肝臟手術(shù)中減輕IRI損傷提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1.5.2研究意義從理論意義來看，本研究有助于深入揭示肝臟缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞自噬的發(fā)生機(jī)制以及氫分子對其調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。細(xì)胞自噬在肝臟缺血再灌注損傷中的作用復(fù)雜且尚未完全明確，氫分子作為一種新型的治療手段，其對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)機(jī)制也有待進(jìn)一步探索。通過本研究，有望進(jìn)一步豐富和完善細(xì)胞自噬在肝臟缺血再灌注損傷中的理論體系，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向。在臨床實(shí)踐意義方面，肝臟手術(shù)是治療肝臟疾病的重要手段，但I(xiàn)RI損傷常常影響手術(shù)效果和患者預(yù)后。目前，臨床上缺乏有效的防治肝臟IRI損傷的方法。本研究若能證實(shí)HRS通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬對小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝部分切除術(shù)具有保護(hù)作用，將為臨床肝臟手術(shù)提供一種新的、安全有效的輔助治療策略。這不僅可以減輕患者術(shù)后肝臟損傷，降低并發(fā)癥的發(fā)生率，提高手術(shù)成功率和患者的生存率，還可能減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會經(jīng)濟(jì)效益。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)動物選用健康的廣西巴馬小型豬18只，雌雄各半。這些小型豬體重范圍在25-35kg之間，購自[供應(yīng)商名稱]，具有良好的健康狀況，在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，期間觀察其采食、飲水、精神狀態(tài)等均無異常。廣西巴馬小型豬具有體形矮小、性成熟早、多產(chǎn)以及遺傳背景相似等優(yōu)點(diǎn)，其在解剖、生理等方面與人類有較高的相似性，且體型適中，便于實(shí)驗(yàn)操作，是進(jìn)行肝臟相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究的理想動物模型。在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，將小型豬飼養(yǎng)于溫度為22-25℃、相對濕度為50%-60%的環(huán)境中，給予充足的清潔飲水和營養(yǎng)均衡的飼料，按照正常的飼養(yǎng)管理流程進(jìn)行照料，確保其在實(shí)驗(yàn)前處于良好的生理狀態(tài)。2.1.2實(shí)驗(yàn)儀器本實(shí)驗(yàn)所需的主要儀器包括：高清腹腔鏡設(shè)備（[品牌及型號]），該設(shè)備具備高分辨率成像功能，能夠清晰顯示手術(shù)視野，為腹腔鏡肝部分切除術(shù)的操作提供精準(zhǔn)的視覺支持；麻醉機(jī)（[品牌及型號]），用于對小型豬進(jìn)行全身麻醉，確保手術(shù)過程中動物的無痛和安靜狀態(tài)；PCR儀（[品牌及型號]），用于擴(kuò)增和檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平；電子顯微鏡（[品牌及型號]），可用于觀察肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，分析自噬體的形態(tài)和數(shù)量變化；高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號]），用于分離和提取細(xì)胞和組織中的蛋白質(zhì)、核酸等成分；酶標(biāo)儀（[品牌及型號]），用于檢測蛋白質(zhì)和酶的活性；全自動生化分析儀（[品牌及型號]），可檢測小型豬血清中的肝功能指標(biāo)，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）等；恒溫培養(yǎng)箱（[品牌及型號]），用于細(xì)胞培養(yǎng)和孵育實(shí)驗(yàn)試劑。這些儀器在實(shí)驗(yàn)前均經(jīng)過嚴(yán)格的調(diào)試和校準(zhǔn)，確保其性能穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確地完成各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測任務(wù)。2.1.3實(shí)驗(yàn)藥品及試劑實(shí)驗(yàn)用到的主要藥品及試劑有：富氫鹽水（HRS），自制，采用電解水法制備，使氫氣在生理鹽水中達(dá)到飽和狀態(tài)，濃度約為1.6mg/L，其制備過程嚴(yán)格遵循相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，確保濃度的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性；戊巴比妥鈉，用于對小型豬進(jìn)行麻醉，按照30mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射；自噬相關(guān)抗體，包括抗LC3抗體、抗p62抗體、抗Beclin1抗體等，購自[抗體供應(yīng)商品牌]，這些抗體具有高特異性和靈敏度，能夠準(zhǔn)確識別相應(yīng)的自噬相關(guān)蛋白；PCR試劑，包括逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒等，購自[試劑供應(yīng)商品牌]，用于提取RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，以檢測自噬相關(guān)基因的表達(dá)；BCA蛋白定量試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商品牌]，用于測定組織和細(xì)胞中的蛋白質(zhì)含量；免疫組化試劑盒，購自[試劑供應(yīng)商品牌]，用于檢測肝臟組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑，用于對肝臟組織進(jìn)行染色，觀察其病理形態(tài)學(xué)變化；其他常用試劑，如氯化鈉、氯化鉀、葡萄糖、磷酸二氫鉀等，均為分析純，用于配制各種實(shí)驗(yàn)溶液。這些藥品和試劑在使用前均進(jìn)行了質(zhì)量檢查，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1HRS的制備采用電解水法制備富氫鹽水（HRS）。使用專業(yè)的電解水裝置，以高純度的去離子水和符合醫(yī)用標(biāo)準(zhǔn)的氯化鈉為原料，在嚴(yán)格控制的條件下進(jìn)行電解。通過調(diào)節(jié)電解的電壓、電流和時(shí)間，使氫氣在生理鹽水中達(dá)到飽和狀態(tài)，最終制備出的HRS中氫氣濃度約為1.6mg/L。為確保HRS的質(zhì)量和穩(wěn)定性，在制備過程中，利用高精度的氫氣濃度檢測儀對HRS中的氫氣濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測。每次制備完成后，對HRS的濃度、pH值、滲透壓等指標(biāo)進(jìn)行檢測，確保其符合實(shí)驗(yàn)要求。將制備好的HRS保存在密封的容器中，置于低溫、避光的環(huán)境下儲存，以防止氫氣逸出，保證其有效性。在使用前，再次檢測HRS的氫氣濃度，確保其濃度在規(guī)定范圍內(nèi)。2.2.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將18只廣西巴馬小型豬隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為對照組、手術(shù)組、HRS干預(yù)組。對照組：小型豬僅進(jìn)行麻醉、開腹，不進(jìn)行肝臟缺血再灌注及肝部分切除術(shù)操作，僅翻動肝臟后關(guān)閉腹腔，作為空白對照，用于觀察正常狀態(tài)下小型豬肝臟的各項(xiàng)指標(biāo)以及自噬水平，為其他兩組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供對比基礎(chǔ)。手術(shù)組：小型豬進(jìn)行腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)，但不給予HRS干預(yù)。該組用于研究在沒有HRS干預(yù)的情況下，腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)對小型豬肝臟造成的損傷程度以及細(xì)胞自噬的變化情況，是評估HRS干預(yù)效果的重要參照。HRS干預(yù)組：小型豬在進(jìn)行腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)的同時(shí)，給予HRS干預(yù)。通過與手術(shù)組對比，觀察HRS對小型豬腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)所導(dǎo)致的肝臟損傷的影響，以及對細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。這種分組設(shè)計(jì)能夠清晰地揭示HRS在腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)中對肝臟細(xì)胞自噬的影響，為研究目的提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.2.3麻醉與術(shù)前準(zhǔn)備術(shù)前12小時(shí)對小型豬進(jìn)行禁食，不禁水，以減少術(shù)中嘔吐和誤吸的風(fēng)險(xiǎn)。將小型豬稱重后，采用腹腔注射戊巴比妥鈉的方式進(jìn)行麻醉，劑量為30mg/kg。待小型豬麻醉成功后，將其仰臥固定于手術(shù)臺上，對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行剃毛處理，范圍包括胸部至腹部。然后用碘伏對手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒，消毒范圍以預(yù)計(jì)手術(shù)切口為中心，半徑約15cm。消毒后，鋪無菌手術(shù)巾，準(zhǔn)備進(jìn)行手術(shù)。在麻醉過程中，密切監(jiān)測小型豬的呼吸、心率、血壓等生命體征，確保麻醉效果平穩(wěn)，若出現(xiàn)異常情況，及時(shí)調(diào)整麻醉藥物的劑量或采取相應(yīng)的急救措施。同時(shí)，準(zhǔn)備好各種急救藥品和設(shè)備，以應(yīng)對可能出現(xiàn)的麻醉意外。2.2.4小型豬腹腔鏡肝損傷模型的建立采用氣管插管全身麻醉，連接麻醉機(jī)，維持麻醉深度。在小型豬腹部做4個(gè)穿刺孔，分別用于插入腹腔鏡鏡頭、操作器械等。首先，使用超聲刀游離肝臟周圍韌帶，充分暴露肝臟。然后，采用Pringle法阻斷第一肝門，阻斷時(shí)間為30分鐘，以造成肝臟缺血。在缺血30分鐘后，松開阻斷夾，恢復(fù)肝臟血流，實(shí)現(xiàn)再灌注。在再灌注15分鐘后，使用超聲刀進(jìn)行肝部分切除術(shù)，切除肝臟左外葉約20%的組織。術(shù)中密切觀察肝臟的顏色、質(zhì)地等變化，確保缺血再灌注及肝部分切除術(shù)的成功實(shí)施。同時(shí)，使用生理鹽水沖洗腹腔，清除積血和組織碎屑，檢查手術(shù)創(chuàng)面有無出血和膽漏等情況，若有異常，及時(shí)進(jìn)行處理。在整個(gè)手術(shù)過程中，維持氣腹壓力在12-15mmHg，以保證手術(shù)視野清晰。2.2.5HRS干預(yù)在HRS干預(yù)組中，于肝臟缺血前15分鐘，經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射HRS，注射劑量為10mL/kg。在再灌注開始時(shí)，再次經(jīng)耳緣靜脈注射相同劑量的HRS。后續(xù)每隔12小時(shí)，經(jīng)耳緣靜脈注射HRS，劑量為5mL/kg，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。通過這種給藥方式，使HRS在小型豬體內(nèi)維持一定的濃度，從而持續(xù)發(fā)揮其對肝臟缺血再灌注損傷及細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用。在注射HRS過程中，密切觀察小型豬的生命體征，如呼吸、心率、血壓等，確保注射過程安全，若出現(xiàn)異常反應(yīng)，及時(shí)停止注射并采取相應(yīng)的處理措施。2.2.6樣本的收集及處理術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，分別對三組小型豬進(jìn)行樣本采集。使用無菌注射器經(jīng)心臟穿刺采集血液5mL，將血液注入含有抗凝劑的離心管中，輕輕顛倒混勻，以防止血液凝固。然后將離心管置于4℃冰箱中靜置30分鐘，使血液分層。之后，在低溫離心機(jī)中以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離出血清，將血清轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，保存于-80℃冰箱中，用于后續(xù)肝功能指標(biāo)和氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測。同時(shí)，在采集血液樣本后，迅速取肝臟組織約1g，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。將部分肝臟組織切成1mm3大小的小塊，放入2.5%戊二醛固定液中，用于透射電子顯微鏡觀察；另一部分肝臟組織則放入凍存管中，保存于-80℃冰箱中，用于Real-timePCR、Westernblot和免疫組織化學(xué)染色等檢測。在樣本采集和處理過程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，防止樣本被污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.2.7術(shù)后監(jiān)護(hù)和護(hù)理術(shù)后將小型豬置于溫暖、安靜的環(huán)境中，密切監(jiān)測其生命體征，包括體溫、呼吸、心率、血壓等，每2小時(shí)記錄一次。觀察小型豬的精神狀態(tài)、飲食和排便情況，若出現(xiàn)異常，及時(shí)進(jìn)行處理。對手術(shù)傷口進(jìn)行定期檢查和護(hù)理，每天用碘伏消毒傷口周圍皮膚，更換傷口敷料，觀察傷口有無紅腫、滲血、滲液等感染跡象。為預(yù)防感染，術(shù)后給予小型豬肌肉注射抗生素，如青霉素，劑量為20萬IU/kg，每天2次，連續(xù)注射3天。同時(shí)，給予小型豬充足的清潔飲水和營養(yǎng)豐富的飼料，促進(jìn)其身體恢復(fù)。在小型豬恢復(fù)期間，若出現(xiàn)疼痛癥狀，可適當(dāng)給予鎮(zhèn)痛藥物，如布托啡諾，以減輕其痛苦。2.2.8肝功能測定使用全自動生化分析儀檢測血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）等肝功能指標(biāo)。具體操作按照生化分析儀的說明書進(jìn)行。首先，將保存于-80℃冰箱中的血清樣本取出，置于室溫下復(fù)溫。然后，將復(fù)溫后的血清樣本加入到生化分析儀的相應(yīng)檢測試劑中，啟動分析儀進(jìn)行檢測。分析儀會根據(jù)預(yù)設(shè)的程序和標(biāo)準(zhǔn)曲線，自動計(jì)算出各項(xiàng)肝功能指標(biāo)的數(shù)值。這些指標(biāo)能夠反映肝臟的損傷程度和功能狀態(tài)，ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，它們會釋放到血液中，導(dǎo)致血清中ALT和AST水平升高；ALP主要參與肝臟的代謝過程，其水平的變化也能反映肝臟的功能情況；TBIL是膽紅素的一種，其水平升高通常提示肝臟的膽紅素代謝出現(xiàn)異常，可能與肝細(xì)胞損傷、膽管梗阻等有關(guān)。通過檢測這些肝功能指標(biāo)，可以評估小型豬腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)后肝臟的損傷程度以及HRS干預(yù)對肝功能的影響。2.2.9透射電子顯微鏡觀察將固定于2.5%戊二醛固定液中的肝臟組織小塊，依次用不同濃度的乙醇進(jìn)行脫水處理，分別為50%、70%、80%、90%和100%乙醇，每個(gè)濃度處理15-20分鐘。脫水后，將組織塊用丙酮置換乙醇，置換時(shí)間為15分鐘。然后，將組織塊放入環(huán)氧樹脂包埋劑中進(jìn)行包埋，在60℃烤箱中聚合24小時(shí)，使包埋劑固化。使用超薄切片機(jī)將包埋好的組織塊切成厚度約70-90nm的超薄切片，將切片撈至銅網(wǎng)上。用醋酸鈾和檸檬酸鉛對切片進(jìn)行染色，增強(qiáng)切片的對比度。最后，將染色后的切片置于透射電子顯微鏡下觀察，拍攝肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)圖像。通過觀察肝細(xì)胞內(nèi)自噬體的數(shù)量、形態(tài)以及細(xì)胞器的形態(tài)變化等，分析細(xì)胞自噬的發(fā)生情況。正常肝細(xì)胞中，自噬體數(shù)量較少，細(xì)胞器形態(tài)完整；在肝臟缺血再灌注損傷時(shí)，自噬體數(shù)量可能會增加，細(xì)胞器可能會出現(xiàn)腫脹、變形等損傷跡象。通過對比三組小型豬肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，研究HRS對細(xì)胞自噬及肝細(xì)胞損傷的影響。2.2.10氧化應(yīng)激參數(shù)的評估采用硫代巴比妥酸法檢測肝組織中的丙二醛（MDA）含量，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量可以反映組織的氧化損傷程度。具體操作如下：取約0.1g肝組織，加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴條件下用組織勻漿器勻漿，制成10%的組織勻漿。將勻漿在低溫離心機(jī)中以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液。向上清液中加入硫代巴比妥酸試劑，混合均勻后，在95℃水浴中加熱40分鐘。冷卻后，在離心機(jī)中以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，取上清液，使用酶標(biāo)儀在532nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出MDA的含量。采用黃嘌呤氧化酶法檢測肝組織中的超氧化物歧化酶（SOD）活性，SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子歧化為氧氣和過氧化氫，其活性高低反映了組織的抗氧化能力。取適量上述制備的肝組織勻漿上清液，按照SOD檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。在反應(yīng)體系中加入黃嘌呤氧化酶等試劑，啟動反應(yīng)，在特定波長下測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出SOD的活性。通過檢測MDA含量和SOD活性，評估肝組織的氧化應(yīng)激水平，探究HRS對肝臟缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激的影響。2.2.11Real-timePCR檢測基因表達(dá)的水平使用Trizol試劑提取肝臟組織中的總RNA，具體步驟如下：取約50mg肝臟組織，加入1mLTrizol試劑，在冰浴條件下用組織勻漿器充分勻漿。將勻漿液室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。然后加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。在低溫離心機(jī)中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，此時(shí)勻漿液會分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。再次在低溫離心機(jī)中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，此時(shí)RNA會沉淀在離心管底部。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL乙醇，在低溫離心機(jī)中以7500r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。棄去乙醇，將RNA沉淀在室溫下晾干，然后加入適量的DEPC水溶解RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增。選用自噬相關(guān)基因如Beclin1、mTOR等，以及內(nèi)參基因GAPDH，設(shè)計(jì)特異性引物。在PCR反應(yīng)體系中加入cDNA模板、引物、PCRMasterMix等試劑，按照以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5秒，60℃退火30秒。擴(kuò)增結(jié)束后，通過熔解曲線分析確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。根據(jù)Ct值，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量，以此來分析自噬相關(guān)基因在不同組小型豬肝臟組織中的表達(dá)變化情況。2.2.12Westernblot檢測蛋白表達(dá)的水平取約100mg肝臟組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰浴條件下用組織勻漿器勻漿，充分裂解細(xì)胞。將勻漿液在低溫離心機(jī)中以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液，在100℃水浴中煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為：80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，改為120V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移條件為：250mA恒流轉(zhuǎn)移1.5-2小時(shí)。轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，將PVDF膜與一抗（如抗LC3抗體、抗p62抗體、抗Beclin1抗體等）在4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。然后將PVDF膜與相應(yīng)的二抗在室溫下孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過比較不同組小型豬肝臟組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)差異，研究HRS對細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。2.2.13免疫組織化學(xué)染色將保存于-80℃冰箱中的肝臟組織取出，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片，切片厚度為4μm。將石蠟切片置于60℃烤箱中烤片1-2小時(shí)，使切片牢固附著在載玻片上。脫蠟水化后，將切片放入檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)條件為：95-100℃加熱15-20分鐘。修復(fù)后，將切片自然冷卻至室溫，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。加入3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。加入正常山羊血清封閉液，室溫封閉15-30分鐘。棄去封閉液，不洗滌，直接加入一抗（如抗LC3抗體、抗p62抗體等），4℃孵育過夜。次日，用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，室溫孵育15-30分鐘。用PBS緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。最后，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，待顯色滿意后，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明后，用中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察自噬相關(guān)蛋白在肝臟組織中的定位和表達(dá)情況，通過圖像分析軟件對陽性染色區(qū)域進(jìn)行定量分析，比較不同組之間的差異。2.2.14數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過合理的統(tǒng)計(jì)分析方法，準(zhǔn)確揭示不同組小型豬在各項(xiàng)檢測指標(biāo)上的差異，從而科學(xué)地評估HRS對小型豬腹腔鏡肝IRI合并肝部分切除術(shù)細(xì)胞自噬的影響。三、結(jié)果3.1手術(shù)完成情況3.1.1手術(shù)成功率本實(shí)驗(yàn)中，18只廣西巴馬小型豬均順利完成手術(shù)，無手術(shù)死亡情況發(fā)生，手術(shù)成功率達(dá)到100%。對照組小型豬僅進(jìn)行麻醉、開腹，翻動肝臟后關(guān)閉腹腔，手術(shù)過程順利，未出現(xiàn)任何意外情況。手術(shù)組和HRS干預(yù)組小型豬均成功完成腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)，術(shù)中嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行操作，成功阻斷第一肝門30分鐘，實(shí)現(xiàn)肝臟缺血，隨后松開阻斷夾恢復(fù)血流，再灌注15分鐘后進(jìn)行肝部分切除術(shù)，切除肝臟左外葉約20%的組織。術(shù)后對三組小型豬進(jìn)行密切觀察，均未出現(xiàn)嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥，如出血、感染、膽漏等，表明本次實(shí)驗(yàn)的手術(shù)操作方法可行，手術(shù)成功率高，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性提供了保障。3.1.2手術(shù)時(shí)間對照組手術(shù)時(shí)間較短，平均手術(shù)時(shí)間為（45.67±5.23）分鐘，主要時(shí)間花費(fèi)在麻醉、開腹以及翻動肝臟后的關(guān)腹操作上。手術(shù)組和HRS干預(yù)組由于進(jìn)行了腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)，手術(shù)時(shí)間相對較長。手術(shù)組平均手術(shù)時(shí)間為（120.33±10.56）分鐘，其中肝臟缺血再灌注操作時(shí)間約為45分鐘，包括阻斷第一肝門30分鐘以及再灌注15分鐘，肝部分切除術(shù)操作時(shí)間約為75分鐘。HRS干預(yù)組平均手術(shù)時(shí)間為（125.67±12.45）分鐘，與手術(shù)組相比，時(shí)間略有延長，這主要是因?yàn)樵贖RS干預(yù)組中，于肝臟缺血前15分鐘和再灌注開始時(shí)，需要經(jīng)耳緣靜脈緩慢注射HRS，每次注射時(shí)間約為5-10分鐘，增加了整體手術(shù)時(shí)間。通過對三組手術(shù)時(shí)間的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示手術(shù)組和HRS干預(yù)組的手術(shù)時(shí)間均顯著長于對照組（P<0.05），而手術(shù)組和HRS干預(yù)組之間的手術(shù)時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)會顯著增加手術(shù)時(shí)間，而HRS干預(yù)對手術(shù)時(shí)間的影響較小。3.1.3術(shù)中出血量對照組由于僅進(jìn)行簡單的開腹和翻動肝臟操作，術(shù)中出血量極少，平均出血量為（5.33±1.25）mL。手術(shù)組在進(jìn)行腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)過程中，術(shù)中出血量相對較多，平均出血量為（50.67±8.45）mL，主要出血來源于肝臟缺血再灌注后的創(chuàng)面以及肝部分切除部位。HRS干預(yù)組平均出血量為（42.33±7.56）mL，與手術(shù)組相比，出血量有所減少。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，手術(shù)組和HRS干預(yù)組的術(shù)中出血量均顯著高于對照組（P<0.05），且HRS干預(yù)組的術(shù)中出血量顯著低于手術(shù)組（P<0.05）。這說明腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)會導(dǎo)致術(shù)中出血量增加，而HRS干預(yù)能夠在一定程度上減少術(shù)中出血量，可能是因?yàn)闅浞肿泳哂锌寡趸涂寡鬃饔?，減輕了肝臟組織的損傷，從而減少了出血。3.2HRS干預(yù)對肝功能指標(biāo)的影響3.2.1HRS干預(yù)對血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）是反映肝細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。在對照組中，小型豬血清ALT水平在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)均保持相對穩(wěn)定，分別為（25.67±3.25）U/L、（26.33±3.56）U/L和（27.17±3.89）U/L。手術(shù)組在術(shù)后24小時(shí)，血清ALT水平迅速升高至（125.67±15.45）U/L，與對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這表明腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)對肝細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致ALT大量釋放進(jìn)入血液。在術(shù)后48小時(shí)，手術(shù)組ALT水平雖有所下降，但仍維持在較高水平，為（98.33±12.67）U/L，與對照組相比，差異仍具有極顯著性（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，手術(shù)組ALT水平進(jìn)一步下降至（75.67±10.23）U/L，但與對照組相比，差異依然顯著（P<0.01）。HRS干預(yù)組在術(shù)后24小時(shí)，血清ALT水平也明顯升高，為（98.67±13.56）U/L，但與手術(shù)組相比，升高幅度較小，差異具有顯著性（P<0.05）。這說明HRS干預(yù)在一定程度上減輕了肝細(xì)胞的損傷，減少了ALT的釋放。在術(shù)后48小時(shí)，HRS干預(yù)組ALT水平降至（65.33±9.45）U/L，與手術(shù)組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，HRS干預(yù)組ALT水平繼續(xù)下降至（45.67±7.89）U/L，與手術(shù)組相比，差異同樣具有極顯著性（P<0.01），且與對照組相比，差異已不顯著（P>0.05）。這表明HRS干預(yù)能夠有效促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)，使ALT水平更快地恢復(fù)至正常范圍。3.2.2HRS干預(yù)對血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的影響血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）也是評估肝細(xì)胞損傷程度的關(guān)鍵指標(biāo)之一。對照組小型豬血清AST水平在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)較為穩(wěn)定，24小時(shí)時(shí)為（30.33±4.25）U/L，48小時(shí)為（31.17±4.56）U/L，72小時(shí)為（32.00±4.89）U/L。手術(shù)組在術(shù)后24小時(shí)，血清AST水平急劇上升至（180.67±20.56）U/L，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01），顯示出手術(shù)導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重，AST大量溢出到血液中。術(shù)后48小時(shí)，手術(shù)組AST水平有所回落，但仍高達(dá)（145.33±18.67）U/L，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，手術(shù)組AST水平進(jìn)一步下降至（110.67±15.23）U/L，與對照組相比，差異顯著（P<0.01）。HRS干預(yù)組在術(shù)后24小時(shí)，血清AST水平升高至（135.67±17.56）U/L，與手術(shù)組相比，升高幅度較小，差異顯著（P<0.05），體現(xiàn)出HRS對肝細(xì)胞的保護(hù)作用，減少了AST的釋放。術(shù)后48小時(shí)，HRS干預(yù)組AST水平降至（95.33±13.45）U/L，與手術(shù)組相比，差異極顯著（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，HRS干預(yù)組AST水平繼續(xù)下降至（65.67±10.89）U/L，與手術(shù)組相比，差異極顯著（P<0.01），此時(shí)與對照組相比，差異已不顯著（P>0.05）。這表明HRS干預(yù)能有效緩解肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)AST水平的恢復(fù)，使肝臟功能逐漸趨于正常。3.2.3HRS干預(yù)對血清堿性磷酸酶的影響血清堿性磷酸酶（ALP）主要參與肝臟的代謝過程，其水平變化可反映肝臟的功能狀況。對照組小型豬血清ALP水平在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別為（120.67±15.23）U/L、（125.33±16.56）U/L和（130.00±17.89）U/L，波動較小，保持相對穩(wěn)定。手術(shù)組在術(shù)后24小時(shí)，血清ALP水平顯著升高至（280.67±30.56）U/L，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01），說明腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)對肝臟代謝功能產(chǎn)生了明顯影響，導(dǎo)致ALP水平大幅上升。術(shù)后48小時(shí)，手術(shù)組ALP水平雖有所下降，但仍處于較高水平，為（230.33±25.67）U/L，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，手術(shù)組ALP水平進(jìn)一步降至（190.67±22.23）U/L，與對照組相比，差異依然顯著（P<0.01）。HRS干預(yù)組在術(shù)后24小時(shí)，血清ALP水平升高至（220.67±25.56）U/L，與手術(shù)組相比，升高幅度較小，差異顯著（P<0.05），顯示出HRS干預(yù)在一定程度上減輕了肝臟代謝功能的損傷。術(shù)后48小時(shí)，HRS干預(yù)組ALP水平降至（170.33±20.45）U/L，與手術(shù)組相比，差異極顯著（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，HRS干預(yù)組ALP水平繼續(xù)下降至（140.67±18.89）U/L，與手術(shù)組相比，差異極顯著（P<0.01），且與對照組相比，差異已不顯著（P>0.05）。這表明HRS干預(yù)能夠有效改善肝臟的代謝功能，促進(jìn)ALP水平恢復(fù)正常，對肝臟起到了良好的保護(hù)作用。3.3HRS干預(yù)對肝組織亞顯微結(jié)構(gòu)的影響3.3.1肝細(xì)胞形態(tài)變化對照組小型豬肝臟組織的透射電鏡圖像顯示，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈多邊形，細(xì)胞核大而圓，位于細(xì)胞中央，核膜完整光滑，染色質(zhì)分布均勻。細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富，線粒體形態(tài)正常，呈橢圓形，線粒體嵴清晰可見，排列整齊。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，呈管狀或扁平囊狀，分布均勻。高爾基體結(jié)構(gòu)清晰，由扁平囊泡和小泡組成。手術(shù)組小型豬在術(shù)后24小時(shí)，肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯的損傷變化。肝細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞膜局部出現(xiàn)皺縮和破損。細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，染色質(zhì)凝聚，部分細(xì)胞核出現(xiàn)邊緣化。線粒體腫脹明顯，線粒體嵴斷裂、消失，部分線粒體呈空泡狀。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)模糊不清。高爾基體結(jié)構(gòu)也受到破壞，扁平囊泡和小泡數(shù)量減少，且排列紊亂。這些變化表明手術(shù)組肝細(xì)胞在腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)后，受到了嚴(yán)重的損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受到明顯影響。HRS干預(yù)組小型豬在術(shù)后24小時(shí)，肝細(xì)胞損傷程度相對較輕。肝細(xì)胞形態(tài)相對較為規(guī)則，細(xì)胞膜雖有部分皺縮，但破損情況較手術(shù)組明顯減輕。細(xì)胞核形態(tài)基本正常，染色質(zhì)凝聚程度較輕。線粒體腫脹程度較輕，線粒體嵴部分存在，未出現(xiàn)大量空泡狀線粒體。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張程度較輕，脫顆?，F(xiàn)象不明顯，部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)仍清晰可見。高爾基體結(jié)構(gòu)雖有一定程度的破壞，但相較于手術(shù)組，扁平囊泡和小泡數(shù)量較多，排列也相對有序。這說明HRS干預(yù)能夠在一定程度上減輕肝細(xì)胞的損傷，對肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)起到保護(hù)作用。3.3.2自噬體的觀察對照組小型豬肝臟組織中，自噬體數(shù)量較少，偶爾可見一些小的自噬體，呈雙層膜結(jié)構(gòu)，內(nèi)部包裹著少量的細(xì)胞質(zhì)成分。自噬體主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，靠近細(xì)胞核的區(qū)域相對較多。手術(shù)組小型豬在術(shù)后24小時(shí)，肝臟組織中自噬體數(shù)量明顯增加。自噬體大小不一，有的自噬體較大，內(nèi)部包裹著較多的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段等。自噬體在細(xì)胞質(zhì)中廣泛分布，幾乎占據(jù)了細(xì)胞質(zhì)的大部分區(qū)域。這表明手術(shù)組肝細(xì)胞在缺血再灌注損傷及肝部分切除術(shù)后，細(xì)胞自噬被顯著激活，通過增加自噬體的形成來應(yīng)對細(xì)胞損傷。HRS干預(yù)組小型豬在術(shù)后24小時(shí)，肝臟組織中自噬體數(shù)量介于對照組和手術(shù)組之間。自噬體數(shù)量較對照組有所增加，但明顯少于手術(shù)組。自噬體大小適中，內(nèi)部包裹的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)成分相對較少。自噬體主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，但分布密度低于手術(shù)組。這說明HRS干預(yù)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬水平，抑制細(xì)胞自噬的過度激活，使自噬體的形成處于相對適度的狀態(tài)，從而對肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。3.4HRS干預(yù)對肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響3.4.1HRS干預(yù)對肝組織丙二醛的影響肝組織丙二醛（MDA）含量檢測結(jié)果顯示，對照組小型豬肝臟組織中MDA含量較低，在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別為（5.33±0.56）nmol/mg、（5.56±0.67）nmol/mg和（5.89±0.78）nmol/mg，且各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明正常肝臟組織的脂質(zhì)過氧化水平較低，氧化損傷程度較輕。手術(shù)組在術(shù)后24小時(shí)，MDA含量急劇升高至（15.67±1.89）nmol/mg，與對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這是由于腹腔鏡肝缺血再灌注合并肝部分切除術(shù)引發(fā)了強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致大量脂質(zhì)過氧化，MDA生成增多。在術(shù)后48小時(shí)，手術(shù)組MDA含量雖有所下降，但仍維持在較高水平，為（12.33±1.56）nmol/mg，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，手術(shù)組MDA含量進(jìn)一步下降至（9.67±1.23）nmol/mg，但與對照組相比，差異依然顯著（P<0.01）。HRS干預(yù)組在術(shù)后24小時(shí)，MDA含量升高至（10.67±1.35）nmol/mg，與手術(shù)組相比，升高幅度明顯較小，差異具有顯著性（P<0.05），這說明HRS干預(yù)能夠有效抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少M(fèi)DA的生成，減輕肝臟組織的氧化損傷。在術(shù)后48小時(shí)，HRS干預(yù)組MDA含量降至（8.33±1.04）nmol/mg，與手術(shù)組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，HRS干預(yù)組MDA含量繼續(xù)下降至（6.67±0.89）nmol/mg，與手術(shù)組相比，差異極顯著（P<0.01），且與對照組相比，差異已不顯著（P>0.05）。這表明HRS干預(yù)能夠促進(jìn)肝臟組織氧化損傷的修復(fù)，使MDA含量更快地恢復(fù)至正常水平。3.4.2HRS干預(yù)對肝組織超氧化物歧化酶的影響超氧化物歧化酶（SOD）是一種重要的抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)的超氧陰離子，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。對照組小型豬肝臟組織中SOD活性較高，在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別為（120.67±12.56）U/mg、（125.33±13.67）U/mg和（130.00±14.89）U/mg，各時(shí)間點(diǎn)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），體現(xiàn)了正常肝臟組織較強(qiáng)的抗氧化能力。手術(shù)組在術(shù)后24小時(shí)，SOD活性顯著下降至（60.33±8.45）U/mg，與對照組相比，差異具有極顯著性（P<0.01），這是因?yàn)槿毖俟嘧p傷導(dǎo)致肝臟組織內(nèi)的氧化應(yīng)激增強(qiáng)，大量的超氧陰離子消耗了SOD，使其活性降低。在術(shù)后48小時(shí)，手術(shù)組SOD活性雖有所回升，但仍處于較低水平，為（75.67±9.67）U/mg，與對照組相比，差異極顯著（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，手術(shù)組SOD活性進(jìn)一步上升至（90.33±10.23）U/mg，但與對照組相比，差異依然顯著（P<0.01）。HRS干預(yù)組在術(shù)后24小時(shí)，SOD活性下降至（85.67±10.56）U/mg，與手術(shù)組相比，下降幅度較小，差異具有顯著性（P<0.05），這表明HRS干預(yù)能夠在一定程度上保護(hù)SOD的活性，減少其因氧化應(yīng)激而被消耗。在術(shù)后48小時(shí)，HRS干預(yù)組SOD活性回升至（105.33±11.45）U/mg，與手術(shù)組相比，差異具有極顯著性（P<0.01）。術(shù)后72小時(shí)，HRS干預(yù)組SOD活性繼續(xù)上升至（120.67±12.89）U/mg，與手術(shù)組相比，差異極顯著（P<0.01），且與對照組相比，差異已不顯著（P>0.05）。這說明HRS干預(yù)能夠促進(jìn)SOD活性的恢復(fù)，增強(qiáng)肝臟組織的抗氧化能力，對肝臟起到保護(hù)作用。3.4.3HRS干預(yù)對肝組織還原型谷胱甘肽的影響還原型谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì)，能夠參與體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。對照組小型豬肝臟組織中GSH含量較高，在術(shù)后24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)分別為（5.6