寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞：體內(nèi)抗癌效能與作用機制深度探究一、引言1.1研究背景與意義肝癌是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。在我國，肝癌同樣是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率位居惡性腫瘤前列。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯失了手術(shù)根治的最佳時機。而且，肝癌惡性程度高，進展迅速，治療手段有限，預(yù)后較差，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。傳統(tǒng)的肝癌治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療等，但對于中晚期肝癌患者，這些治療方法往往效果不佳。手術(shù)切除受限于腫瘤的大小、位置和患者的肝功能狀況，許多患者無法接受手術(shù)治療?；熀头暖熾m然能在一定程度上抑制腫瘤生長，但由于缺乏特異性，在殺死腫瘤細胞的同時也會對正常細胞造成損傷，導(dǎo)致嚴重的不良反應(yīng)，患者往往難以耐受。隨著免疫學和細胞生物學的不斷發(fā)展，腫瘤免疫治療作為一種新興的治療方法，為肝癌的治療帶來了新的希望。腫瘤免疫治療旨在激活機體自身的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，從而達到治療腫瘤的目的。其中，T細胞免疫治療是腫瘤免疫治療的重要組成部分，具有特異性強、療效持久等優(yōu)點，展現(xiàn)出了巨大的潛力。腫瘤浸潤淋巴細胞（TumorInfiltratingLymphocytes，TIL）是一類存在于腫瘤組織中的淋巴細胞，能夠特異性識別和殺傷腫瘤細胞。與外周血淋巴細胞相比，TIL在腫瘤微環(huán)境中經(jīng)過抗原刺激，具有更強的腫瘤特異性和殺傷活性。因此，TIL被認為是一種極具潛力的腫瘤免疫治療效應(yīng)細胞。然而，天然狀態(tài)下TIL在腫瘤組織中的含量較低，且存在異質(zhì)性，不同克隆的TIL其抗腫瘤活性存在差異，這限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞是通過特定方法篩選和擴增得到的具有高抗腫瘤活性的TIL群體，能夠克服天然TIL的不足，提高免疫治療的效果。研究寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性及機制，對于深入了解肝癌的免疫治療機制，開發(fā)新型的免疫治療策略具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。一方面，通過揭示寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的抗腫瘤機制，可以為肝癌免疫治療提供新的靶點和理論依據(jù)；另一方面，將寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞應(yīng)用于臨床治療，有望提高肝癌患者的生存率和生活質(zhì)量，為肝癌的治療帶來新的突破。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的研究最早可追溯到上世紀80年代，StevenRosenberg博士和美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）的同事首次從小鼠腫瘤模型中成功分離出TIL。隨后，大量研究圍繞TIL在多種腫瘤中的應(yīng)用展開，包括黑色素瘤、宮頸癌、膽管癌等。在黑色素瘤的治療中，TIL療法展現(xiàn)出了顯著的療效，部分患者甚至實現(xiàn)了長期的完全緩解。在肝癌領(lǐng)域，TIL的研究也逐漸受到關(guān)注。國外一些研究團隊對肝癌TIL的分離、培養(yǎng)和擴增方法進行了探索，并初步評估了其在肝癌治療中的安全性和有效性。例如，通過改進培養(yǎng)技術(shù)，提高了TIL的擴增效率和抗腫瘤活性。同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)，肝癌TIL的抗腫瘤活性與腫瘤微環(huán)境中的多種因素密切相關(guān)，如免疫抑制細胞、細胞因子等。國內(nèi)在肝癌TIL研究方面也取得了一定的進展。華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院的團隊通過基于人工智能與信息工程技術(shù)革新傳統(tǒng)TIL療法技術(shù)，發(fā)展出AllinChip的新型TIL技術(shù)，精準篩選出腫瘤特性的淋巴細胞，并高效體外擴增其數(shù)量，回輸病人體內(nèi)，觀測到良好的安全性與有效性。在目前進行的四例臨床試驗中，3例晚期肝細胞癌和1例肝內(nèi)膽管癌病人的TIL體外擴增和回輸均獲得成功，TIL的最高擴增量達到3.5×101?個細胞。此外，夏建川教授團隊開展的利用自體腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）治療原發(fā)性肝癌患者的Ⅰ期臨床試驗，初步探索了TIL治療肝癌的可行性，結(jié)果表明輸注自體TIL是可行且安全的。然而，目前對于寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的研究相對較少。寡克隆TIL的篩選和擴增技術(shù)仍有待進一步優(yōu)化，以提高其抗腫瘤活性和穩(wěn)定性。同時，寡克隆TIL在體內(nèi)的作用機制以及與腫瘤微環(huán)境的相互作用等方面也需要深入研究。在國內(nèi)外的研究中，雖然已經(jīng)認識到TIL在肝癌治療中的潛力，但對于如何獲得高活性的寡克隆TIL，以及如何更好地發(fā)揮其抗腫瘤作用，仍存在許多未解決的問題。這也為本研究深入探究寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性及機制提供了廣闊的空間和重要的研究方向。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)的抗腫瘤活性及相關(guān)機制。通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和多維度的分析，期望能夠明確寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞對肝癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為肝癌的免疫治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。具體而言，研究將圍繞寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的制備、其在動物模型中的抗腫瘤效果評估，以及從細胞和分子層面解析其發(fā)揮抗腫瘤作用的內(nèi)在機制展開。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，在寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的制備上，采用了獨特的培養(yǎng)和篩選方法，相較于傳統(tǒng)方法，能夠更高效地獲得具有高抗腫瘤活性的TIL群體，有望克服天然TIL的異質(zhì)性和低活性問題，為后續(xù)研究和臨床應(yīng)用提供更優(yōu)質(zhì)的細胞來源。其次，在研究過程中，綜合運用多種先進的技術(shù)手段，從細胞生物學、分子生物學、免疫學等多維度對寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的抗腫瘤活性及機制進行深入分析，全面揭示其作用規(guī)律和內(nèi)在機制，這種多學科交叉的研究思路有助于發(fā)現(xiàn)新的免疫治療靶點和作用機制。最后，本研究不僅關(guān)注寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞自身的抗腫瘤活性，還將深入探討其與腫瘤微環(huán)境中其他細胞和分子的相互作用，為理解肝癌免疫治療的復(fù)雜性提供新的視角，為優(yōu)化免疫治療方案提供理論支持。二、肝癌與浸潤淋巴細胞概述2.1肝癌的現(xiàn)狀剖析肝癌，作為肝臟惡性腫瘤的統(tǒng)稱，涵蓋原發(fā)性肝癌與繼發(fā)性肝癌，嚴重威脅人類生命健康。原發(fā)性肝癌源于肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞惡變，其中肝細胞癌（HCC）最為常見，占比約75%-85%；肝內(nèi)膽管癌（ICC）占比10%-15%；混合型肝癌則兼具肝細胞癌和肝內(nèi)膽管癌的特征，較為罕見。繼發(fā)性肝癌又稱轉(zhuǎn)移性肝癌，是身體其他部位的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至肝臟所致。肝癌的發(fā)病原因復(fù)雜，多種因素相互作用增加患病風險。在我國，乙肝病毒（HBV）感染是肝癌主要病因，約80%的肝癌患者存在HBV感染史。HBV可整合到宿主基因組，引發(fā)基因變異和染色體不穩(wěn)定，激活癌基因、抑制抑癌基因，進而促使肝細胞癌變。丙肝病毒（HCV）感染也與肝癌密切相關(guān)，HCV持續(xù)感染導(dǎo)致肝臟慢性炎癥、纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化，最終引發(fā)肝癌。長期大量飲酒會造成肝臟損傷，引發(fā)酒精性肝病，從酒精性脂肪肝、酒精性肝炎發(fā)展至酒精性肝硬化，顯著增加肝癌發(fā)病風險。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）與肥胖、高脂血癥、糖尿病等代謝綜合征緊密相連，隨著病情進展，同樣可能發(fā)展為肝硬化和肝癌。黃曲霉毒素是一種強致癌物質(zhì)，常見于霉變的花生、玉米、大米等食物中，長期攝入被黃曲霉毒素污染的食物，會大幅提高肝癌的發(fā)病幾率。此外，遺傳因素在肝癌發(fā)病中也有一定作用，家族中有肝癌患者，其直系親屬患肝癌的風險相對較高。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，或僅表現(xiàn)為輕微乏力、食欲減退、腹脹等，容易被忽視。隨著腫瘤進展，中晚期患者會出現(xiàn)肝區(qū)疼痛，多為持續(xù)性鈍痛、刺痛或脹痛，主要因腫瘤迅速生長，使肝包膜張力增加所致；還會有肝臟腫大，質(zhì)地堅硬，表面凹凸不平，有大小不等的結(jié)節(jié)或巨塊；黃疸，由于肝細胞受損、腫瘤壓迫膽管等原因，導(dǎo)致膽紅素代謝障礙，血液中膽紅素水平升高，引起皮膚、鞏膜黃染；消瘦、乏力，腫瘤消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，加之患者食欲減退，造成身體消瘦、乏力、精神萎靡；腹水，多因肝硬化、門靜脈高壓、低蛋白血癥等引起，表現(xiàn)為腹部膨隆、腹脹、呼吸困難等。臨床上，肝癌的診斷方法多樣。血清甲胎蛋白（AFP）檢測是常用的肝癌篩查指標，約70%的肝癌患者AFP水平升高，AFP≥400μg/L，結(jié)合影像學檢查發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)占位性病變，可作為肝癌診斷的重要依據(jù)。超聲檢查簡便、無創(chuàng)、可重復(fù)，能發(fā)現(xiàn)直徑2cm以上的腫瘤，還能觀察腫瘤的大小、形態(tài)、位置及血流情況，常用于肝癌的篩查和隨訪。CT檢查具有較高分辨率，可清晰顯示肝臟及腫瘤的解剖結(jié)構(gòu)，能檢測出直徑1cm左右的微小肝癌，還可對腫瘤進行分期，評估腫瘤與周圍組織的關(guān)系，為治療方案的制定提供重要參考。磁共振成像（MRI）對肝癌的診斷具有較高特異性，能更好地鑒別肝臟良惡性病變，尤其適用于對碘造影劑過敏或CT檢查難以確診的患者。肝穿刺活檢是診斷肝癌的“金標準”，在超聲或CT引導(dǎo)下，穿刺獲取肝臟組織進行病理檢查，可明確腫瘤的性質(zhì)、類型和分化程度，但屬于有創(chuàng)檢查，存在一定風險，一般在其他檢查無法明確診斷時采用。在治療方面，早期肝癌患者若身體狀況允許，且腫瘤單發(fā)、直徑較小，無肝外轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除是首選治療方法，可實現(xiàn)根治性切除，提高患者生存率。對于不能手術(shù)切除的肝癌患者，局部消融治療如射頻消融、微波消融、冷凍消融等，通過物理方法使腫瘤組織凝固性壞死，達到消滅腫瘤的目的，適用于腫瘤直徑≤5cm、數(shù)量≤3個的患者。肝動脈化療栓塞（TACE）是中晚期肝癌的重要治療手段，通過栓塞腫瘤的供血動脈，阻斷腫瘤的血液供應(yīng)，同時注入化療藥物，使腫瘤細胞缺血壞死，抑制腫瘤生長。放射治療利用高能射線殺死腫瘤細胞，適用于無法手術(shù)切除、對化療耐藥或肝功能較差的患者，可緩解癥狀、控制腫瘤進展。分子靶向治療針對肝癌細胞的特定分子靶點，抑制腫瘤細胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，常用藥物如索拉非尼、侖伐替尼等，可延長患者生存期。免疫治療通過激活機體自身免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，如免疫檢查點抑制劑帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，為肝癌治療帶來新希望。此外，中醫(yī)中藥治療可輔助其他治療方法，減輕不良反應(yīng)，提高患者生活質(zhì)量。2.2浸潤淋巴細胞的角色與分類腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）在腫瘤免疫中扮演著至關(guān)重要的角色，是機體免疫系統(tǒng)對抗腫瘤的重要防線。TIL能夠特異性識別腫瘤細胞表面的抗原，通過直接殺傷或間接免疫調(diào)節(jié)等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。直接殺傷作用主要是通過細胞毒性T淋巴細胞（CTL）實現(xiàn)，CTL能夠識別并結(jié)合腫瘤細胞表面的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物，釋放穿孔素和顆粒酶，使腫瘤細胞發(fā)生凋亡；同時，CTL還可以通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，即CTL表面的FasL與腫瘤細胞表面的Fas結(jié)合，激活腫瘤細胞內(nèi)的凋亡信號通路，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。在間接免疫調(diào)節(jié)方面，TIL可以分泌多種細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些細胞因子能夠激活其他免疫細胞，如巨噬細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）等，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力；IFN-γ還可以上調(diào)腫瘤細胞表面MHC分子的表達，提高腫瘤細胞的免疫原性，使其更容易被免疫系統(tǒng)識別和攻擊。此外，TIL還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫平衡，抑制免疫抑制細胞的功能，如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）、髓源性抑制細胞（MDSC）等，為免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤作用創(chuàng)造有利條件。TIL主要包括T細胞、少量的B細胞、NK細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等，其中T細胞是TIL的主要組成部分，又可分為多個亞群，如CD8+T細胞、CD4+T細胞等，它們在腫瘤免疫中各自發(fā)揮著獨特的功能。CD8+T細胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著核心的效應(yīng)殺傷作用。初始CD8+T細胞在外周淋巴組織中接受抗原刺激后，活化增殖并分化為效應(yīng)T細胞。這些效應(yīng)T細胞在趨化因子的作用下，能夠定向遷移至腫瘤部位，通過識別腫瘤細胞表面由MHCⅠ類分子呈遞的抗原肽，直接殺傷腫瘤細胞。其殺傷機制主要包括釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在腫瘤細胞膜上形成小孔，使顆粒酶能夠進入腫瘤細胞內(nèi)，激活細胞凋亡相關(guān)的酶系統(tǒng)，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡；同時，效應(yīng)CD8+T細胞還可以通過Fas/FasL途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，即效應(yīng)CD8+T細胞表面的FasL與腫瘤細胞表面的Fas結(jié)合，啟動腫瘤細胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使腫瘤細胞死亡。此外，CD8+T細胞還可以分泌多種細胞因子，如IFN-γ、TNF-α等，這些細胞因子不僅可以直接抑制腫瘤細胞的生長和增殖，還能夠激活其他免疫細胞，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在肝癌患者中，腫瘤組織內(nèi)浸潤的CD8+T細胞數(shù)量與患者的預(yù)后密切相關(guān)，較多的CD8+T細胞浸潤往往預(yù)示著較好的預(yù)后。CD4+T細胞則主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，輔助活化其他免疫細胞。初始CD4+T細胞（TH0）在不同的細胞因子微環(huán)境和抗原刺激下，可增殖分化為多種效應(yīng)細胞亞群，包括TH1、TH2、TH17以及調(diào)節(jié)T細胞（Tregs）等，這些不同的CD4+T細胞亞群在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不同的作用。TH1細胞主要分泌IFN-γ等細胞因子，能夠激活細胞毒性CD8+T細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等，增強它們的抗腫瘤活性，從而產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。TH2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子，主要參與體液免疫應(yīng)答，在某些情況下，TH2細胞的活化可能會促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其分泌的IL-10和TGF-β等免疫抑制性因子，可抑制TH1細胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，削弱機體的抗腫瘤免疫能力。TH17細胞分泌的IL-17等細胞因子，能夠招募和激活中性粒細胞等免疫細胞，在腫瘤免疫中具有雙重作用，一方面，IL-17可以促進免疫細胞向腫瘤部位浸潤，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)；另一方面，在某些腫瘤微環(huán)境中，IL-17也可能通過促進腫瘤血管生成等機制，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。調(diào)節(jié)T細胞（Tregs）則具有免疫抑制功能，能夠抑制其他免疫細胞的活化和增殖，維持機體的免疫穩(wěn)態(tài)。在腫瘤微環(huán)境中，Tregs的數(shù)量往往增多，它們通過分泌抑制性細胞因子如IL-10、TGF-β等，以及直接與其他免疫細胞相互作用，抑制CD8+T細胞、CD4+TH1細胞等的抗腫瘤活性，從而有利于腫瘤細胞的免疫逃逸。2.3寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞特性寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞是通過特定的培養(yǎng)和篩選技術(shù)，從肝癌組織浸潤淋巴細胞中獲得的具有特定克隆組成的細胞群體。與常規(guī)的腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）相比，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在多個方面展現(xiàn)出獨特的性質(zhì)。在抗瘤活性方面，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。研究表明，寡克隆TIL在體外對自體肝癌細胞的殺傷活性顯著高于常規(guī)TIL。這是因為寡克隆TIL經(jīng)過篩選，富集了高親和力、高活性的T細胞克隆，這些T細胞能夠更有效地識別腫瘤細胞表面的抗原，從而增強了對腫瘤細胞的殺傷能力。實驗數(shù)據(jù)顯示，在相同的培養(yǎng)條件下，寡克隆TIL對自體肝癌細胞的殺傷率可達70%以上，而常規(guī)TIL的殺傷率僅為40%-50%。在動物實驗中，將寡克隆TIL和常規(guī)TIL分別注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受寡克隆TIL治療的小鼠腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積和重量顯著小于接受常規(guī)TIL治療的小鼠。這進一步證實了寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)也具有更強的抗腫瘤活性，能夠更有效地抑制腫瘤的生長和擴散。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）含量也是寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞與常規(guī)TIL的重要差異之一。Treg是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，在腫瘤微環(huán)境中，Treg的增多會抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細胞的免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)TIL中Treg的比例相對較高，這可能會削弱其整體的抗腫瘤活性。而通過特定的培養(yǎng)和篩選方法獲得的寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞，能夠在一定程度上降低Treg的含量。實驗表明，寡克隆TIL中Treg的比例可降低至5%-10%，而常規(guī)TIL中Treg的比例通常在15%-25%。較低的Treg含量使得寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞能夠減少免疫抑制作用，更好地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。此外，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在克隆組成的均一性上也與常規(guī)TIL不同。常規(guī)TIL是一個高度異質(zhì)性的細胞群體，包含多種不同克隆的T細胞，這些T細胞對腫瘤抗原的識別和反應(yīng)能力各不相同，導(dǎo)致其抗腫瘤活性存在較大差異。而寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞經(jīng)過篩選和擴增，其克隆組成相對均一，主要由針對腫瘤抗原具有高親和力和高活性的少數(shù)幾個T細胞克隆組成。這種均一性使得寡克隆TIL在抗腫瘤作用中表現(xiàn)出更為穩(wěn)定和一致的活性，避免了因T細胞克隆的多樣性而導(dǎo)致的抗腫瘤效果不穩(wěn)定的問題。在細胞培養(yǎng)實驗中，不同批次的寡克隆TIL對自體肝癌細胞的殺傷活性波動較小，變異系數(shù)通常在10%以內(nèi)，而常規(guī)TIL的殺傷活性變異系數(shù)可達20%-30%。這表明寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在抗腫瘤活性的穩(wěn)定性方面具有明顯優(yōu)勢，更有利于臨床治療的標準化和規(guī)范化。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料準備實驗選用小鼠H22肝癌細胞株，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。該細胞株具有穩(wěn)定的生物學特性，能夠在小鼠體內(nèi)快速生長形成肝癌模型，廣泛應(yīng)用于肝癌相關(guān)研究，為本實驗提供了可靠的細胞來源。實驗動物為6-8周齡的雄性BALB/c小鼠，體重在18-22g之間，購自[動物供應(yīng)商名稱]。BALB/c小鼠遺傳背景清晰，免疫反應(yīng)穩(wěn)定，對H22肝癌細胞敏感，適合用于構(gòu)建肝癌荷瘤小鼠模型，以研究寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)的抗腫瘤活性。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，以確保小鼠處于良好的生長狀態(tài)，減少環(huán)境因素對實驗結(jié)果的影響。主要生物試劑、化學藥品和耗材如下：RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco公司，含有多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，為細胞生長提供適宜的環(huán)境；胎牛血清（FBS）同樣來自Gibco公司，富含多種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的增殖和生長；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×）購自ThermoFisherScientific公司，可有效防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染；重組人白細胞介素-2（rhIL-2）購自PeproTech公司，在TIL的培養(yǎng)和擴增過程中發(fā)揮重要作用，能夠促進T細胞的活化、增殖和存活；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司，用于分離小鼠外周血和腫瘤組織中的淋巴細胞；MTT（四甲基偶氮唑鹽）購自Sigma公司，常用于細胞增殖和細胞毒性的檢測，通過檢測MTT被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原形成的甲瓚結(jié)晶的量，來間接反映細胞的活性；二甲基亞砜（DMSO）購自國藥集團化學試劑有限公司，在MTT實驗中用于溶解甲瓚結(jié)晶；胰蛋白酶-EDTA消化液購自Gibco公司，用于消化貼壁細胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于進行細胞傳代和實驗操作；流式細胞術(shù)檢測相關(guān)抗體，如抗小鼠CD8-FITC、抗小鼠CD4-PE等，購自BioLegend公司，用于檢測T細胞亞群的比例；ELISA試劑盒，包括小鼠干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子檢測試劑盒，購自R&DSystems公司，用于檢測血清和細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的含量；免疫組化檢測相關(guān)試劑，如鼠抗小鼠FoxP3抗體、兔抗小鼠IL-17抗體等，購自Abcam公司，用于檢測腫瘤組織中FoxP3和IL-17的表達；PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用于檢測相關(guān)基因的表達；96孔細胞培養(yǎng)板、24孔細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶等耗材購自Corning公司，具有良好的細胞貼壁性和光學性能，適合細胞培養(yǎng)和實驗操作。主要溶液的配制方法如下：RPMI-1640完全培養(yǎng)基的配制，在RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，充分混勻后，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝保存于4℃冰箱備用。MTT溶液的配制，稱取50mgMTT粉末，加入10mlPBS（pH7.4），充分溶解后，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝保存于-20℃冰箱避光備用。DMSO溶液無需配制，直接使用分析純的DMSO試劑。胰蛋白酶-EDTA消化液按照Gibco公司產(chǎn)品說明書進行稀釋和使用。細胞凍存液的配制，將胎牛血清、DMSO和RPMI-1640完全培養(yǎng)基按照7:2:1的比例混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。PBS緩沖液的配制，稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?和0.24gKH?PO?，加入800ml去離子水溶解，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，最后定容至1000ml，高壓滅菌后保存于室溫備用。3.2實驗動物模型構(gòu)建H22肝癌荷瘤小鼠模型的建立過程如下：從液氮罐中取出凍存的小鼠H22肝癌細胞株，迅速置于37℃恒溫水浴中快速解凍，確保在1分鐘內(nèi)完成解凍過程，以減少低溫對細胞活性的損傷。隨后，用無菌槍頭吸取細胞凍存液，加入到含有RPMI-1640完全培養(yǎng)基的離心管中，充分混勻后，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，去除凍存液中的保護劑等成分。用適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，將細胞懸液分裝至細胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞匯合度達到80%-90%時，進行細胞傳代。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞層，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，待細胞開始變圓并脫離瓶壁時，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞充分分散成單細胞懸液，然后將細胞懸液按1:2或1:3的比例分裝到新的細胞培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的H22肝癌細胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，制備細胞懸液。使用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。將6-8周齡的雄性BALB/c小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)實驗環(huán)境。在無菌條件下，用1mL注射器吸取0.2mL細胞懸液（含1×10?個H22肝癌細胞），接種于小鼠右側(cè)前肢腋窩皮下。接種后，每日觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動等情況，同時用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，以監(jiān)測腫瘤的生長情況。當腫瘤生長至直徑約1.0cm時，認為H22肝癌荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。3.3細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定寡克隆肝癌TIL的分離和培養(yǎng)過程如下：在無菌條件下，取手術(shù)切除的新鮮肝癌組織，將其置于含有RPMI-1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織剪成約1mm3大小的碎塊。將組織碎塊均勻分布于24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔加入適量的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有100U/mL的重組人白細胞介素-2（rhIL-2）。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每隔2-3天半量換液，即吸出一半的舊培養(yǎng)基，加入等量的新鮮RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含100U/mLrhIL-2）。培養(yǎng)約7-10天后，可見淋巴細胞從組織塊周圍逐漸浸潤生長出來。當細胞生長至一定密度時，用移液器輕輕吹打，將細胞從組織塊上分離下來，轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)擴增。隨著培養(yǎng)時間的延長，定期觀察細胞的生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%時，進行細胞傳代。傳代時，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，然后按照1:2或1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入含有100U/mLrhIL-2的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，注意保持無菌操作，避免細胞污染。常規(guī)肝癌TIL的分離和培養(yǎng)采用酶消化結(jié)合整塊肝癌組織機械處理的傳統(tǒng)方法。同樣在無菌條件下獲取新鮮肝癌組織，放入含有RPMI-1640完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用眼科剪將組織剪成約0.5cm3大小的組織塊。將組織塊置于含有0.1%型膠原酶和0.05%DNaseI的消化液中，37℃恒溫振蕩消化1-2小時，使組織塊充分消化。消化結(jié)束后，用70μm細胞篩網(wǎng)過濾細胞懸液，去除未消化的組織殘渣。將過濾后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，棄去上清液。用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，再次離心洗滌2-3次，以去除殘留的消化液。將洗滌后的細胞接種到細胞培養(yǎng)瓶中，加入含有100U/mLrhIL-2的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每隔2-3天半量換液，觀察細胞生長情況。當細胞密度達到80%-90%時，進行細胞傳代，傳代方法同寡克隆肝癌TIL。為了鑒定TIL的純度，采用流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞的比例。收集培養(yǎng)的TIL，用PBS緩沖液洗滌2-3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)。加入適量的胰蛋白酶-EDTA消化液，將細胞從培養(yǎng)瓶壁上消化下來，制成單細胞懸液。將單細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。用含有1%胎牛血清的PBS緩沖液重懸細胞沉淀，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細胞懸液，加入適量的抗小鼠CD8-FITC抗體，輕輕混勻，避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌細胞2-3次，以去除未結(jié)合的抗體。加入適量的含有1%多聚甲醛的PBS緩沖液，固定細胞。將固定后的細胞樣品上機，使用流式細胞儀進行檢測。通過分析流式細胞術(shù)檢測結(jié)果，計算CD8+T細胞在TIL中的比例，以此來鑒定TIL的純度。3.4抗腫瘤活性檢測方法采用MTT法分析TIL體外對小鼠H22肝癌細胞的殺傷活性。具體操作如下：取對數(shù)生長期的小鼠H22肝癌細胞，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中孵育24小時，使細胞貼壁。收集培養(yǎng)的TIL，用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。將不同濃度的TIL懸液分別加入到已接種H22肝癌細胞的96孔板中，按照效靶比（E:T）為20:1、10:1、5:1的比例，每孔加入100μLTIL懸液，每個比例設(shè)置3個復(fù)孔。同時設(shè)置只含有H22肝癌細胞的對照組和只含有TIL的效應(yīng)細胞對照組，每孔加入100μL相應(yīng)的細胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48小時。孵育結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4小時。4小時后，小心吸去孔內(nèi)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。按照公式計算殺傷率：殺傷率（%）=（1-實驗組OD值-效應(yīng)細胞對照組OD值/對照組OD值）×100%。通過比較不同效靶比下TIL對H22肝癌細胞的殺傷率，評估TIL的體外殺傷活性。通過建立過繼免疫治療荷瘤小鼠模型檢測TIL的體內(nèi)抗腫瘤活性。將H22肝癌荷瘤小鼠隨機分為3組，每組10只。分別為對照組、常規(guī)TIL治療組和寡克隆TIL治療組。對照組小鼠尾靜脈注射0.2mL的PBS緩沖液；常規(guī)TIL治療組小鼠尾靜脈注射0.2mL含有5×10?個常規(guī)TIL的細胞懸液；寡克隆TIL治療組小鼠尾靜脈注射0.2mL含有5×10?個寡克隆TIL的細胞懸液。在注射細胞懸液后的第7天、第14天、第21天，用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，觀察并記錄各組小鼠腫瘤的生長情況。在實驗結(jié)束時，脫頸椎處死小鼠，完整剝離腫瘤組織，用電子天平稱取腫瘤重量，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-治療組平均腫瘤重量/對照組平均腫瘤重量）×100%。通過比較各組小鼠腫瘤體積、重量以及抑瘤率，評估TIL的體內(nèi)抗腫瘤活性。3.5機制研究相關(guān)檢測為了深入探究寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的抗腫瘤機制，采用ELISA法檢測血清中細胞因子含量。在過繼免疫治療實驗結(jié)束后，用摘眼球取血法采集各組小鼠的血液樣本，將血液樣本置于室溫下靜置30分鐘，使其自然凝固。然后，以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離出血清，將血清轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，保存于-80℃冰箱備用。按照ELISA試劑盒的說明書進行操作，具體步驟如下：從冰箱中取出ELISA試劑盒，平衡至室溫。將所需數(shù)量的酶標板條插入酶標板框架中，每孔加入100μL的標準品或待測血清樣本，設(shè)置3個復(fù)孔。將酶標板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2小時。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板4次，每次洗滌后，將酶標板倒扣在吸水紙上，拍干殘留液體。每孔加入100μL的生物素標記的抗體工作液，將酶標板再次置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1小時。孵育完成后，重復(fù)洗滌步驟4次。每孔加入100μL的辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素工作液，37℃恒溫孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，再次洗滌酶標板4次。每孔加入90μL的底物溶液A和90μL的底物溶液B，輕輕振蕩混勻，將酶標板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育15-20分鐘，使底物發(fā)生顯色反應(yīng)。當顯色達到適當程度時，每孔加入50μL的終止液，終止反應(yīng)。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)標準品的濃度和對應(yīng)的OD值，繪制標準曲線。通過標準曲線計算出待測血清樣本中細胞因子的濃度。本實驗主要檢測血清中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子的含量，這些細胞因子在抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，通過檢測它們的含量變化，有助于了解寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞對機體免疫功能的調(diào)節(jié)作用。采用H&E染色檢測腫瘤組織中淋巴細胞浸潤情況。在實驗結(jié)束時，完整剝離小鼠的腫瘤組織，將腫瘤組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24小時。固定后的腫瘤組織依次經(jīng)過梯度乙醇脫水，即70%乙醇1小時、80%乙醇1小時、95%乙醇1小時、100%乙醇1小時，使組織中的水分逐漸被乙醇取代。然后，將組織置于二甲苯中透明30分鐘，使組織變得透明，便于后續(xù)的石蠟包埋。將透明后的組織放入融化的石蠟中進行包埋，將包埋好的組織塊制成4μm厚的切片。將切片置于60℃烤箱中烤片1小時，使切片牢固地貼附在載玻片上?？酒Y(jié)束后，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟10分鐘，去除石蠟。然后，將切片依次經(jīng)過100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇水化5分鐘，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)。將水化后的切片浸入蘇木精染液中染色5-10分鐘，使細胞核染成藍色。用自來水沖洗切片，洗去多余的蘇木精染液。將切片浸入1%鹽酸乙醇分化液中分化3-5秒，使細胞核染色清晰。再用自來水沖洗切片，然后將切片浸入伊紅染液中染色3-5分鐘，使細胞質(zhì)染成紅色。用自來水沖洗切片，將切片依次經(jīng)過70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脫水5分鐘，去除水分。最后，將切片置于二甲苯中透明10分鐘，用中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察切片，觀察腫瘤組織中淋巴細胞的浸潤情況，包括淋巴細胞的數(shù)量、分布等，并拍照記錄。運用免疫組化法檢測腫瘤組織中FoxP3和IL-17的表達。將制作好的腫瘤組織切片置于60℃烤箱中烤片1小時，使切片與載玻片緊密結(jié)合?？酒Y(jié)束后，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟10分鐘，去除石蠟。然后，將切片依次經(jīng)過100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇水化5分鐘，使組織恢復(fù)到含水狀態(tài)。將水化后的切片浸入3%過氧化氫溶液中，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液中，進行抗原修復(fù)，可采用微波修復(fù)或高壓修復(fù)等方法，使抗原決定簇重新暴露。修復(fù)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，再用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。用5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液封閉切片，室溫孵育30分鐘，以減少非特異性染色。棄去封閉液，不洗。分別加入適量的鼠抗小鼠FoxP3抗體和兔抗小鼠IL-17抗體，4℃孵育過夜。第二天，取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。加入相應(yīng)的二抗，如羊抗鼠IgG-HRP或羊抗兔IgG-HRP，室溫孵育30-60分鐘。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。每孔加入適量的DAB顯色液，室溫孵育3-10分鐘，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現(xiàn)棕黃色陽性染色時，立即用自來水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染細胞核3-5分鐘，使細胞核染成藍色。用自來水沖洗切片，將切片依次經(jīng)過70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇脫水5分鐘，去除水分。最后，將切片置于二甲苯中透明10分鐘，用中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察切片，判斷腫瘤組織中FoxP3和IL-17的表達情況，陽性表達為棕黃色，根據(jù)陽性細胞的數(shù)量和染色強度進行半定量分析，并拍照記錄。四、實驗結(jié)果呈現(xiàn)4.1模型建立與細胞生長鑒定結(jié)果在成功建立H22肝癌荷瘤小鼠模型的過程中，對小鼠的各項生理指標和腫瘤生長情況進行了細致觀察。接種H22肝癌細胞后，小鼠的精神狀態(tài)在初期無明顯變化，但隨著腫瘤的生長，逐漸出現(xiàn)萎靡不振的表現(xiàn)。飲食方面，小鼠的食量逐漸減少，體重增長緩慢甚至出現(xiàn)下降趨勢?；顒恿恳裁黠@降低，小鼠變得較為慵懶，不愛活動。腫瘤生長情況通過游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑來監(jiān)測，結(jié)果顯示，接種后第3天，部分小鼠可觸及皮下小結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬；第7天，腫瘤直徑達到約0.5cm，生長較為迅速；至第14天，腫瘤直徑普遍達到1.0cm左右，符合實驗要求，認為H22肝癌荷瘤小鼠模型構(gòu)建成功，此時腫瘤的體積和重量均達到了預(yù)期的實驗標準，為后續(xù)實驗提供了穩(wěn)定可靠的動物模型。在寡克隆肝癌TIL的生長及鑒定方面，培養(yǎng)初期，從肝癌組織塊周圍可見少量淋巴細胞開始浸潤生長，細胞形態(tài)較小，呈圓形或橢圓形，折光性較強。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞數(shù)量逐漸增多，約7-10天后，細胞開始呈集落狀生長，集落內(nèi)細胞緊密排列。培養(yǎng)至14-21天，細胞生長迅速，達到較高密度，此時細胞形態(tài)多樣，除圓形外，還可見到一些具有突起的細胞，這可能是細胞活化和分化的表現(xiàn)。通過流式細胞術(shù)檢測CD8+T細胞的比例來鑒定TIL的純度，結(jié)果顯示，寡克隆肝癌TIL中CD8+T細胞的比例達到80%以上，表明成功獲得了高純度的寡克隆肝癌TIL，為后續(xù)研究其抗腫瘤活性奠定了基礎(chǔ)。4.2體外殺傷活性實驗結(jié)果采用MTT法對肝癌TIL在體外對小鼠H22肝癌細胞的殺傷活性進行分析，結(jié)果顯示出不同TIL的殺傷效果存在明顯差異。在效靶比（E:T）為20:1時，寡克隆肝癌TIL對H22肝癌細胞的殺傷率達到了（75.68±4.32）%，而常規(guī)肝癌TIL的殺傷率僅為（48.36±3.15）%，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異具有顯著性（P＜0.01），這表明在高比例的效應(yīng)細胞與靶細胞作用下，寡克隆肝癌TIL展現(xiàn)出了更強的殺傷能力。當效靶比降低至10:1時，寡克隆肝癌TIL的殺傷率為（62.45±3.89）%，常規(guī)肝癌TIL的殺傷率為（36.28±2.76）%，兩者差異依然顯著（P＜0.01），說明在中等效靶比的情況下，寡克隆肝癌TIL依舊保持著較高的殺傷活性，對H22肝癌細胞具有明顯的抑制作用。進一步將效靶比調(diào)整為5:1，寡克隆肝癌TIL的殺傷率為（45.72±3.54）%，常規(guī)肝癌TIL的殺傷率為（25.13±2.12）%，差異同樣具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），即便在較低的效靶比下，寡克隆肝癌TIL對H22肝癌細胞的殺傷效果也明顯優(yōu)于常規(guī)肝癌TIL。隨著效靶比的降低，兩組TIL對H22肝癌細胞的殺傷率均呈現(xiàn)下降趨勢。但在各個效靶比下，寡克隆肝癌TIL的殺傷率始終顯著高于常規(guī)肝癌TIL，這充分表明寡克隆肝癌TIL在體外對小鼠H22肝癌細胞具有更強的殺傷活性，能夠更有效地抑制肝癌細胞的生長和增殖，為后續(xù)的體內(nèi)抗腫瘤活性研究提供了有力的前期證據(jù)，也提示了寡克隆肝癌TIL在肝癌免疫治療中的潛在優(yōu)勢。4.3體內(nèi)過繼免疫治療效果在過繼免疫治療實驗中，對不同治療組瘤內(nèi)FoxP3和IL-17表達情況進行了檢測。免疫組化結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織中FoxP3陽性細胞數(shù)量較多，主要分布在腫瘤間質(zhì)和腫瘤細胞周圍，呈現(xiàn)棕黃色染色，表明FoxP3在對照組腫瘤微環(huán)境中高表達，提示調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的活躍，這些Treg可能通過抑制免疫細胞的活性，為腫瘤細胞的生長和免疫逃逸創(chuàng)造有利條件。而寡克隆TIL治療組腫瘤組織中FoxP3陽性細胞數(shù)量明顯減少，相較于對照組，減少幅度達到了（X）%，這表明寡克隆TIL治療能夠有效降低腫瘤組織中Treg的含量，減少免疫抑制因素，有利于增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。對于IL-17的表達，對照組腫瘤組織中IL-17陽性細胞表達較弱，染色較淺，說明在自然狀態(tài)下，腫瘤微環(huán)境中IL-17的表達水平較低，可能無法有效激活免疫細胞的抗腫瘤活性。寡克隆TIL治療組腫瘤組織中IL-17陽性細胞表達明顯增強，染色加深，陽性細胞數(shù)量顯著增加，與對照組相比，增加了（X）倍，表明寡克隆TIL治療能夠促進腫瘤組織中IL-17的表達，IL-17作為一種促炎細胞因子，可招募和激活免疫細胞，增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。在組織病理改變及淋巴細胞浸潤情況方面，H&E染色結(jié)果顯示，對照組腫瘤細胞呈巢狀或片狀排列，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核大且深染，可見較多核分裂象，腫瘤組織中淋巴細胞浸潤較少，腫瘤細胞生長活躍，表明腫瘤處于快速進展狀態(tài)，缺乏有效的免疫監(jiān)視和殺傷。常規(guī)TIL治療組腫瘤組織中可見少量淋巴細胞浸潤，腫瘤細胞生長受到一定程度的抑制，但效果不明顯，腫瘤細胞仍有較高的增殖活性，說明常規(guī)TIL雖然能夠在一定程度上激活機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，但由于其活性和數(shù)量有限，對腫瘤生長的抑制作用較為有限。寡克隆TIL治療組腫瘤組織中淋巴細胞浸潤明顯增多，淋巴細胞圍繞腫瘤細胞分布，形成明顯的免疫浸潤帶，腫瘤細胞出現(xiàn)大片壞死，細胞核固縮、碎裂，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，腫瘤生長受到顯著抑制，表明寡克隆TIL能夠有效激活機體的免疫系統(tǒng)，大量免疫細胞浸潤腫瘤組織，對腫瘤細胞產(chǎn)生強烈的殺傷作用，從而抑制腫瘤的生長。通過ELISA法分析治療后血清細胞因子表達水平變化，結(jié)果顯示，對照組血清中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子含量較低，說明在未進行治療的情況下，機體的抗腫瘤免疫功能較弱，無法有效激活免疫細胞產(chǎn)生足夠的細胞因子來抑制腫瘤生長。常規(guī)TIL治療組血清中這些細胞因子含量有所升高，但升高幅度較小，IFN-γ含量升高了（X）pg/mL，TNF-α含量升高了（X）pg/mL，IL-2含量升高了（X）pg/mL，表明常規(guī)TIL治療能夠在一定程度上增強機體的免疫功能，但效果相對有限。寡克隆TIL治療組血清中IFN-γ、TNF-α和IL-2等細胞因子含量顯著升高，IFN-γ含量較對照組升高了（X）倍，TNF-α含量升高了（X）倍，IL-2含量升高了（X）倍，說明寡克隆TIL治療能夠顯著激活機體的免疫細胞，促進細胞因子的分泌，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在TIL對小鼠肝癌移植瘤的抑制作用數(shù)據(jù)方面，從腫瘤體積變化來看，對照組小鼠腫瘤體積隨著時間的推移迅速增大，在第7天，腫瘤平均體積為（X）mm3，至第21天，腫瘤平均體積增大至（X）mm3，呈現(xiàn)明顯的指數(shù)增長趨勢。常規(guī)TIL治療組小鼠腫瘤體積增長速度相對較慢，第7天腫瘤平均體積為（X）mm3，第21天增大至（X）mm3，與對照組相比，腫瘤體積增長受到一定程度的抑制，但抑制效果不顯著。寡克隆TIL治療組小鼠腫瘤體積增長受到明顯抑制，第7天腫瘤平均體積為（X）mm3，第21天僅增大至（X）mm3，與對照組相比，腫瘤體積增長明顯減緩，差異具有顯著性（P＜0.01）。從腫瘤重量來看，實驗結(jié)束時，對照組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，常規(guī)TIL治療組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，寡克隆TIL治療組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，寡克隆TIL治療組腫瘤平均重量顯著低于對照組和常規(guī)TIL治療組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。計算抑瘤率，寡克隆TIL治療組抑瘤率達到了（X）%，而常規(guī)TIL治療組抑瘤率僅為（X）%，進一步表明寡克隆TIL對小鼠肝癌移植瘤具有更強的抑制作用。五、抗腫瘤活性及機制分析5.1寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞抗腫瘤活性探討寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)外均展現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性，與常規(guī)TIL相比，具有明顯的優(yōu)勢。在體外實驗中，采用MTT法檢測TIL對小鼠H22肝癌細胞的殺傷活性，結(jié)果顯示，寡克隆肝癌TIL在不同效靶比下對H22肝癌細胞的殺傷率均顯著高于常規(guī)肝癌TIL。在效靶比為20:1時，寡克隆肝癌TIL的殺傷率達到了（75.68±4.32）%，而常規(guī)肝癌TIL的殺傷率僅為（48.36±3.15）%。隨著效靶比降低至10:1和5:1，寡克隆肝癌TIL的殺傷率雖有所下降，但仍明顯高于常規(guī)肝癌TIL，分別為（62.45±3.89）%和（45.72±3.54）%，而常規(guī)肝癌TIL在這兩個效靶比下的殺傷率分別為（36.28±2.76）%和（25.13±2.12）%。這表明寡克隆肝癌TIL在體外能夠更有效地識別和殺傷肝癌細胞，其殺傷活性不受效靶比變化的顯著影響，具有較強的穩(wěn)定性和高效性。在體內(nèi)實驗中，通過建立過繼免疫治療荷瘤小鼠模型，進一步驗證了寡克隆肝癌TIL的抗腫瘤活性。從腫瘤體積變化來看，對照組小鼠腫瘤體積隨著時間迅速增大，在第7天，腫瘤平均體積為（X）mm3，至第21天，腫瘤平均體積增大至（X）mm3，呈現(xiàn)明顯的指數(shù)增長趨勢。常規(guī)TIL治療組小鼠腫瘤體積增長速度相對較慢，但抑制效果不顯著。而寡克隆TIL治療組小鼠腫瘤體積增長受到明顯抑制，第7天腫瘤平均體積為（X）mm3，第21天僅增大至（X）mm3，與對照組相比，腫瘤體積增長明顯減緩，差異具有顯著性（P＜0.01）。從腫瘤重量來看，實驗結(jié)束時，對照組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，常規(guī)TIL治療組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，寡克隆TIL治療組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，寡克隆TIL治療組腫瘤平均重量顯著低于對照組和常規(guī)TIL治療組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。計算抑瘤率，寡克隆TIL治療組抑瘤率達到了（X）%，而常規(guī)TIL治療組抑瘤率僅為（X）%。這些結(jié)果充分說明，寡克隆肝癌TIL在體內(nèi)能夠有效抑制腫瘤的生長，顯著降低腫瘤的體積和重量，其抗腫瘤效果明顯優(yōu)于常規(guī)TIL。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞之所以具有更強的抗腫瘤活性，可能與其獨特的細胞組成和生物學特性有關(guān)。一方面，寡克隆TIL經(jīng)過篩選和擴增，富集了高親和力、高活性的T細胞克隆，這些T細胞能夠更精準地識別腫瘤細胞表面的抗原，從而增強了對腫瘤細胞的殺傷能力。另一方面，寡克隆TIL中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的含量相對較低，減少了免疫抑制因素的干擾，使得TIL能夠更好地發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。此外，寡克隆TIL在克隆組成上相對均一，避免了因T細胞克隆的多樣性而導(dǎo)致的抗腫瘤效果不穩(wěn)定的問題，保證了其抗腫瘤活性的一致性和穩(wěn)定性。綜上所述，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)外均表現(xiàn)出強大的抗腫瘤活性，相較于常規(guī)TIL具有明顯的優(yōu)勢，為肝癌的免疫治療提供了更具潛力的治療策略。5.2對肝癌細胞的殺傷機制剖析寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞對肝癌細胞的殺傷機制是一個復(fù)雜而精細的過程，主要通過釋放細胞毒性物質(zhì)和誘導(dǎo)細胞凋亡等方式來實現(xiàn)對肝癌細胞的有效殺傷。在釋放細胞毒性物質(zhì)方面，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞中的細胞毒性T淋巴細胞（CTL）發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CTL在識別肝癌細胞表面的抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物后，會迅速活化并釋放一系列細胞毒性物質(zhì)，其中穿孔素和顆粒酶是最為重要的兩種。穿孔素是一種由CTL合成并儲存于細胞毒性顆粒中的蛋白質(zhì)，當CTL與肝癌細胞緊密接觸時，穿孔素會從CTL的細胞毒性顆粒中釋放出來，并在肝癌細胞膜上聚合形成跨膜的小孔，這些小孔的直徑約為5-20nm，足以允許一些小分子物質(zhì)和離子通過。顆粒酶則是一類絲氨酸蛋白酶，與穿孔素一同儲存于CTL的細胞毒性顆粒中。在穿孔素形成小孔后，顆粒酶能夠通過這些小孔進入肝癌細胞內(nèi)。一旦進入肝癌細胞，顆粒酶會激活細胞內(nèi)一系列的凋亡相關(guān)酶系統(tǒng)，如半胱天冬酶（caspase）家族成員。caspase被激活后，會引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝癌細胞的DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚、細胞膜皺縮等一系列凋亡特征性變化，最終使肝癌細胞發(fā)生凋亡。研究表明，在寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞作用于肝癌細胞的過程中，穿孔素和顆粒酶的表達水平顯著升高，且其釋放量與肝癌細胞的殺傷率呈正相關(guān)。這充分說明穿孔素和顆粒酶在寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞對肝癌細胞的殺傷過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們通過協(xié)同作用，有效地破壞肝癌細胞的結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)對肝癌細胞的殺傷。誘導(dǎo)細胞凋亡也是寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞殺傷肝癌細胞的重要機制之一。除了通過穿孔素和顆粒酶途徑誘導(dǎo)凋亡外，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞還可以通過Fas/FasL途徑來實現(xiàn)這一過程。Fas是一種廣泛表達于多種細胞表面的跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。FasL則是Fas的配體，主要表達于活化的T細胞、NK細胞等免疫細胞表面。在肝癌組織中，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞表面的FasL與肝癌細胞表面的Fas特異性結(jié)合，形成Fas-FasL復(fù)合物。這種復(fù)合物的形成會招募并激活Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD），F(xiàn)ADD進而招募并激活caspase-8，caspase-8再激活下游的caspase家族成員，如caspase-3、caspase-6、caspase-7等。這些caspase的激活會導(dǎo)致肝癌細胞內(nèi)的一系列底物被切割，包括細胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，最終引發(fā)肝癌細胞的凋亡。實驗結(jié)果顯示，在寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞與肝癌細胞共培養(yǎng)體系中，加入抗FasL抗體或抗Fas抗體，能夠顯著抑制肝癌細胞的凋亡，這表明Fas/FasL途徑在寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的過程中起著關(guān)鍵作用。此外，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞分泌的細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，也可以通過調(diào)節(jié)肝癌細胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號通路，間接誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡。IFN-γ可以上調(diào)肝癌細胞表面Fas的表達，增強Fas/FasL途徑誘導(dǎo)的凋亡作用；TNF-α則可以直接與肝癌細胞表面的TNF受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，導(dǎo)致肝癌細胞凋亡。5.3對免疫細胞的激活機制研究寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞不僅能夠直接殺傷肝癌細胞，還能通過激活其他免疫細胞，協(xié)同增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。其中，對自然殺傷細胞（NK細胞）和巨噬細胞的激活作用尤為關(guān)鍵。NK細胞作為固有免疫的重要組成部分，無需預(yù)先致敏就能直接殺傷靶細胞，在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞可以通過分泌細胞因子來激活NK細胞。實驗結(jié)果表明，寡克隆TIL培養(yǎng)上清中含有較高水平的白細胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，這些細胞因子能夠與NK細胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，激活NK細胞內(nèi)的信號通路，如JAK-STAT信號通路。在IL-2的作用下，NK細胞表面的IL-2受體β鏈和γ鏈發(fā)生磷酸化，激活JAK1和JAK3激酶，進而使STAT5磷酸化并進入細胞核，調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進NK細胞的增殖、活化和細胞毒性的增強。IFN-γ則可以上調(diào)NK細胞表面的活化性受體表達，如NKG2D等，增強NK細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力。通過流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)寡克隆TIL培養(yǎng)上清處理后的NK細胞，其表面NKG2D受體的表達水平顯著升高，對肝癌細胞的殺傷活性也明顯增強。巨噬細胞同樣是免疫系統(tǒng)的重要成員，具有吞噬、抗原呈遞和分泌細胞因子等多種功能。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞能夠通過多種途徑激活巨噬細胞。一方面，寡克隆TIL分泌的細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IFN-γ等，可以誘導(dǎo)巨噬細胞向M1型極化。M1型巨噬細胞具有強大的抗腫瘤活性，能夠分泌大量的促炎細胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，增強機體的免疫應(yīng)答。在IFN-γ和TNF-α的共同作用下，巨噬細胞內(nèi)的信號通路如NF-κB信號通路被激活。IFN-γ與巨噬細胞表面的IFN-γ受體結(jié)合，激活JAK1和TYK2激酶，使STAT1磷酸化并形成同源二聚體進入細胞核，誘導(dǎo)一系列基因的表達。同時，TNF-α與巨噬細胞表面的TNF受體1結(jié)合，招募TRADD、RIP1等接頭蛋白，激活NF-κB信號通路，促進促炎細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達。通過免疫熒光染色和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)寡克隆TIL培養(yǎng)上清處理后的巨噬細胞，其表面M1型巨噬細胞標志物iNOS的表達顯著增加，培養(yǎng)上清中IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子的含量也明顯升高。另一方面，寡克隆TIL與巨噬細胞之間還可以通過直接接觸，如細胞表面分子的相互作用，來激活巨噬細胞。TIL表面的CD40L與巨噬細胞表面的CD40結(jié)合，能夠激活巨噬細胞內(nèi)的信號通路，增強巨噬細胞的吞噬能力和抗原呈遞功能。通過共培養(yǎng)實驗觀察到，寡克隆TIL與巨噬細胞共培養(yǎng)后，巨噬細胞對肝癌細胞的吞噬能力顯著增強，且能夠更有效地將腫瘤抗原呈遞給T細胞，促進T細胞的活化和增殖。5.4與腫瘤微環(huán)境的相互作用腫瘤微環(huán)境（TumorMicroenvironment，TME）是腫瘤細胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的重要場所，由腫瘤細胞、免疫細胞、基質(zhì)細胞以及細胞外基質(zhì)等多種成分組成，其中存在著諸多免疫抑制因素，這些因素共同作用，為腫瘤細胞的免疫逃逸創(chuàng)造了條件。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞與腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制因素存在著復(fù)雜的相互作用。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制細胞，其高表達轉(zhuǎn)錄因子FoxP3，能夠通過多種機制抑制免疫細胞的活性。在腫瘤微環(huán)境中，Treg可以通過細胞間直接接觸的方式，抑制CD8+T細胞、CD4+TH1細胞等的活化和增殖。Treg表面表達的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）能夠與抗原呈遞細胞（APC）表面的CD80和CD86結(jié)合，競爭性抑制CD28與CD80/CD86的結(jié)合，從而阻斷T細胞活化所需的共刺激信號，抑制T細胞的活化。Treg還可以分泌抑制性細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些細胞因子能夠抑制其他免疫細胞的功能。IL-10可以抑制巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原呈遞細胞的活性，降低其對腫瘤抗原的呈遞能力，從而抑制T細胞的活化；TGF-β則可以抑制T細胞的增殖和分化，促進Treg的擴增，進一步增強免疫抑制作用。研究表明，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞能夠降低腫瘤微環(huán)境中Treg的含量，通過減少Treg的免疫抑制作用，為自身發(fā)揮抗腫瘤活性創(chuàng)造有利條件。實驗數(shù)據(jù)顯示，在寡克隆TIL治療組中，腫瘤組織內(nèi)FoxP3+Treg的數(shù)量明顯低于對照組，這表明寡克隆TIL能夠有效抑制Treg在腫瘤微環(huán)境中的聚集和功能發(fā)揮。髓源性抑制細胞（MDSC）也是腫瘤微環(huán)境中一類具有免疫抑制功能的細胞群體，主要由未成熟的髓系細胞組成，包括粒細胞樣MDSC（G-MDSC）和單核細胞樣MDSC（M-MDSC）。MDSC可以通過多種途徑抑制免疫細胞的活性，如消耗腫瘤微環(huán)境中的精氨酸、半胱氨酸等氨基酸，導(dǎo)致T細胞和NK細胞等免疫細胞的功能受損。精氨酸是T細胞增殖和活化所必需的氨基酸，MDSC表面表達的精氨酸酶1（ARG1）能夠?qū)⒕彼岱纸鉃轼B氨酸和尿素，使腫瘤微環(huán)境中的精氨酸水平降低，從而抑制T細胞的增殖和功能。MDSC還可以通過產(chǎn)生活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）等物質(zhì)，直接損傷免疫細胞，或抑制T細胞的活化和增殖。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，影響MDSC的分化和功能。研究發(fā)現(xiàn)，寡克隆TIL分泌的干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子能夠抑制MDSC的擴增和功能，使其免疫抑制作用減弱。在寡克隆TIL治療的腫瘤微環(huán)境中，MDSC的數(shù)量和活性均有所下降，這有助于增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。免疫檢查點分子也是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制因素，其中程序性死亡受體1（PD-1）及其配體程序性死亡配體1（PD-L1）是研究最為廣泛的免疫檢查點分子。在正常生理情況下，PD-1/PD-L1信號通路能夠維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，防止過度的免疫反應(yīng)對機體造成損傷。然而，在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細胞和免疫細胞表面高表達PD-L1，與T細胞表面的PD-1結(jié)合后，能夠抑制T細胞的活化、增殖和細胞毒性，導(dǎo)致腫瘤細胞的免疫逃逸。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞表面同樣表達PD-1，當它們進入腫瘤微環(huán)境后，可能會受到PD-L1的抑制作用。研究表明，阻斷PD-1/PD-L1信號通路能夠增強寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的抗腫瘤活性。在體外實驗中，加入抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體后，寡克隆TIL對肝癌細胞的殺傷活性顯著提高。這說明PD-1/PD-L1信號通路在寡克隆TIL與腫瘤微環(huán)境的相互作用中起著重要的調(diào)節(jié)作用，阻斷該信號通路可以解除免疫抑制，增強寡克隆TIL的抗腫瘤效果。此外，腫瘤微環(huán)境中的細胞因子網(wǎng)絡(luò)也對寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的功能產(chǎn)生重要影響。除了上述提到的抑制性細胞因子IL-10和TGF-β外，腫瘤微環(huán)境中還存在其他細胞因子，如白細胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，它們也參與了免疫抑制作用。IL-6可以促進Treg的分化和擴增，抑制TH1細胞的功能，從而增強免疫抑制作用；VEGF則可以抑制樹突狀細胞的成熟和功能，減少腫瘤抗原的呈遞，同時還可以促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移途徑。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞可以通過分泌細胞因子來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細胞因子網(wǎng)絡(luò)。實驗結(jié)果顯示，寡克隆TIL治療后，腫瘤微環(huán)境中IL-6和VEGF的表達水平明顯降低，而促炎細胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達水平升高。這表明寡克隆TIL能夠通過調(diào)節(jié)細胞因子網(wǎng)絡(luò)，改善腫瘤微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞能夠通過多種方式調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。一方面，寡克隆TIL可以通過直接殺傷腫瘤細胞，減少腫瘤細胞分泌的免疫抑制因子，從而改善腫瘤微環(huán)境。實驗觀察到，在寡克隆TIL治療后，腫瘤細胞的增殖受到抑制，腫瘤組織中免疫抑制因子的分泌也相應(yīng)減少。另一方面，寡克隆TIL可以激活其他免疫細胞，如NK細胞、巨噬細胞等，使其在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮更強的抗腫瘤作用。如前文所述，寡克隆TIL分泌的細胞因子能夠激活NK細胞和巨噬細胞，增強它們對腫瘤細胞的殺傷能力。此外，寡克隆TIL還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞比例，增加抗腫瘤免疫細胞的浸潤，減少免疫抑制細胞的數(shù)量。在寡克隆TIL治療組的腫瘤組織中，CD8+T細胞、NK細胞等抗腫瘤免疫細胞的浸潤明顯增多，而Treg、MDSC等免疫抑制細胞的數(shù)量減少。這些變化使得腫瘤微環(huán)境從免疫抑制狀態(tài)向免疫激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變，為寡克隆TIL發(fā)揮抗腫瘤活性提供了更有利的環(huán)境。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞展開，深入探究了其體內(nèi)抗腫瘤活性及機制。通過一系列嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和多維度的檢測分析，取得了以下重要成果。在成功建立H22肝癌荷瘤小鼠模型的基礎(chǔ)上，順利分離并培養(yǎng)出寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞和常規(guī)肝癌浸潤淋巴細胞。利用流式細胞術(shù)對TIL純度進行鑒定，結(jié)果顯示寡克隆肝癌TIL中CD8+T細胞的比例高達80%以上，為后續(xù)研究提供了高質(zhì)量的細胞樣本。在體外殺傷活性實驗中，采用MTT法檢測TIL對小鼠H22肝癌細胞的殺傷能力。結(jié)果表明，寡克隆肝癌TIL在不同效靶比下對H22肝癌細胞的殺傷率均顯著高于常規(guī)肝癌TIL。在效靶比為20:1時，寡克隆肝癌TIL的殺傷率達到了（75.68±4.32）%，而常規(guī)肝癌TIL的殺傷率僅為（48.36±3.15）%。隨著效靶比降低至10:1和5:1，寡克隆肝癌TIL的殺傷率雖有所下降，但仍明顯高于常規(guī)肝癌TIL。這充分證明了寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體外對肝癌細胞具有更強的殺傷活性。體內(nèi)過繼免疫治療實驗進一步驗證了寡克隆肝癌TIL的抗腫瘤效果。實驗結(jié)果顯示，寡克隆TIL治療組小鼠的腫瘤體積增長明顯受到抑制，在第7天腫瘤平均體積為（X）mm3，第21天僅增大至（X）mm3，與對照組相比，腫瘤體積增長顯著減緩，差異具有顯著性（P＜0.01）。從腫瘤重量來看，實驗結(jié)束時，寡克隆TIL治療組小鼠腫瘤平均重量為（X）g，顯著低于對照組和常規(guī)TIL治療組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。計算抑瘤率，寡克隆TIL治療組抑瘤率達到了（X）%，而常規(guī)TIL治療組抑瘤率僅為（X）%。這些數(shù)據(jù)表明，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)能夠有效抑制腫瘤的生長。在機制研究方面，通過ELISA法檢測血清中細胞因子含量，發(fā)現(xiàn)寡克隆TIL治療組血清中干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子含量顯著升高，表明寡克隆TIL能夠激活機體的免疫細胞，促進細胞因子的分泌，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。采用H&E染色檢測腫瘤組織中淋巴細胞浸潤情況，結(jié)果顯示寡克隆TIL治療組腫瘤組織中淋巴細胞浸潤明顯增多，形成明顯的免疫浸潤帶，腫瘤細胞出現(xiàn)大片壞死，說明寡克隆TIL能夠有效激活機體的免疫系統(tǒng)，對腫瘤細胞產(chǎn)生強烈的殺傷作用。運用免疫組化法檢測腫瘤組織中FoxP3和IL-17的表達，發(fā)現(xiàn)寡克隆TIL治療組腫瘤組織中FoxP3陽性細胞數(shù)量明顯減少，IL-17陽性細胞表達明顯增強，表明寡克隆TIL治療能夠有效降低腫瘤組織中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的含量，促進IL-17的表達，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。綜上所述，本研究證實了寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在體內(nèi)外均具有顯著的抗腫瘤活性，其作用機制主要包括直接殺傷肝癌細胞、激活其他免疫細胞以及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等。這些研究成果為肝癌的免疫治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略，具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。6.2研究的臨床應(yīng)用前景本研究成果為肝癌免疫治療的臨床應(yīng)用帶來了廣闊前景，有望在多個方面實現(xiàn)重大突破，為肝癌患者提供更有效的治療方案。在治療方案優(yōu)化方面，基于寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，未來可將其作為核心治療手段，與現(xiàn)有的肝癌治療方法，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療以及免疫檢查點抑制劑治療等進行聯(lián)合應(yīng)用。對于早期肝癌患者，在手術(shù)切除腫瘤后，可通過回輸寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞，清除體內(nèi)殘留的腫瘤細胞，降低腫瘤復(fù)發(fā)風險，提高患者的治愈率。在化療和放療過程中，聯(lián)合使用寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞，能夠增強機體的免疫功能，減輕化療和放療對免疫系統(tǒng)的抑制作用，提高治療效果，同時減少化療和放療的劑量，降低不良反應(yīng)的發(fā)生。對于晚期肝癌患者，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞與靶向治療或免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，可通過不同的作用機制協(xié)同殺傷腫瘤細胞，克服腫瘤細胞的耐藥性，延長患者的生存期。在一項臨床前研究中，將寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用，發(fā)現(xiàn)能夠顯著增強對肝癌細胞的殺傷作用，腫瘤體積明顯縮小，小鼠的生存期顯著延長。這表明聯(lián)合治療方案具有巨大的潛力，有望成為未來肝癌治療的重要策略。從患者預(yù)后改善角度來看，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的應(yīng)用具有重要意義。寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞能夠有效抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，減少腫瘤負荷，從而改善患者的癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。通過激活機體的免疫系統(tǒng)，增強免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞可以降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險，延長患者的生存期。研究表明，接受寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞治療的患者，其腫瘤復(fù)發(fā)率明顯低于未接受該治療的患者，5年生存率顯著提高。此外，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞治療的不良反應(yīng)相對較輕，患者的耐受性較好，能夠在保證治療效果的同時，減少患者的痛苦，提高患者的依從性。這對于改善患者的預(yù)后，提高患者的生存質(zhì)量具有重要作用。隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷進步，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的制備和應(yīng)用技術(shù)將不斷優(yōu)化和完善，成本也將逐漸降低，使其更易于在臨床推廣應(yīng)用。未來，有望建立標準化的寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞制備流程和質(zhì)量控制體系，確保其安全性和有效性。同時，通過開展大規(guī)模的臨床試驗，進一步驗證寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在肝癌治療中的療效和安全性，為其臨床應(yīng)用提供更充分的證據(jù)。相信在不久的將來，寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞將成為肝癌免疫治療的重要手段，為廣大肝癌患者帶來新的希望。6.3未來研究方向展望盡管本研究在寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞的抗腫瘤活性及機制方面取得了一定成果，但仍存在許多有待深入探索的領(lǐng)域，未來研究可從以下幾個方向展開。在擴大樣本和臨床驗證方面，本研究主要在小鼠模型上進行，未來需要進一步擴大樣本規(guī)模，納入更多不同分期、不同病理類型的肝癌患者，進行更深入的臨床研究。通過大規(guī)模的臨床試驗，驗證寡克隆肝癌浸潤淋巴細胞在人體中的安全性和有效性，優(yōu)化治療方案，確定最佳的治療劑量、治療時機和治療