(10)申請(qǐng)公布號(hào)CN114839367A(21)申請(qǐng)?zhí)?02210438001.9(71)申請(qǐng)人西南林業(yè)大學(xué)地址650000云南省昆明市白龍寺300號(hào)(72)發(fā)明人欒云鵬李襄鄭雙慶李艷梅賈璐李志朋(74)專(zhuān)利代理機(jī)構(gòu)北京國(guó)翰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11696專(zhuān)利代理師張?zhí)斐揭环N大麻素單克隆抗體的制備及其應(yīng)用本發(fā)明公開(kāi)了一種大麻素單克隆抗體的制備及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。大麻素單克隆抗體的制備具體步驟包括：(1)半抗原制備：將大麻素分子與4-氯苯甲酸甲酯反應(yīng)即得半抗原；(2)完全抗原制備：將半抗原與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)即得完全抗原。本發(fā)明通過(guò)制備出四氫大麻酚、大麻萜酚或大麻二酚的完全抗原，進(jìn)一步制備對(duì)應(yīng)的單克隆抗體，再將制得的單克隆抗體用于制備膠體金檢測(cè)試紙。制得的膠體金試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)，21.一種式I或式Ⅱ或式Ⅲ所示大麻素半抗原，2.一種式IV或式V或式VI所示大麻素完全抗原，3.一種制備權(quán)利要求2所述大麻素完全抗原的方法，其特征在于，包括如下步驟：(1)半抗原制備：將大麻素分子與4-氯苯甲酸甲酯反應(yīng)即得權(quán)利要求1所述大麻素半抗(2)完全抗原制備：將半抗原與血藍(lán)蛋白偶聯(lián)即得權(quán)利要求2所述大麻素完全抗原；所述大麻素分子選自四氫大麻酚、大麻萜酚或大麻二酚。4.一種大麻素單克隆抗體，其特征在于，使用權(quán)利要求2所述大麻素完全抗原通過(guò)動(dòng)物免疫制得。5.一種膠體金試紙，其特征在于，所述試紙含有權(quán)利要求4所述的大麻素單克隆抗體。6.權(quán)利要求5所述的膠體金試紙的制備方法，包括如下步驟：3(1)納米金標(biāo)記抗體：將納米金溶液與抗體混合振蕩，加入封閉液封閉后離心，重懸后即得抗體懸液；(2)檢測(cè)線(xiàn)制備：將抗體懸液涂布于硝酸纖維膜靠近樣品墊的一端，即得檢測(cè)線(xiàn)；(3)質(zhì)控線(xiàn)制備：將羊抗鼠抗體涂布于硝酸纖維膜靠近吸水墊的一端，即得質(zhì)控線(xiàn)；7.權(quán)利要求1所述的半抗原在制備大麻素單克隆抗體中的用途。8.權(quán)利要求2所述的完全抗原在制備大麻素單克隆抗體中的用途。9.權(quán)利要求5中所述膠體金試紙?jiān)跈z測(cè)樣品中是否含有大麻素分子中的用途。4一種大麻素單克隆抗體的制備及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大麻素單克隆抗體的制備及其應(yīng)用。背景技術(shù)[0002]大麻是一種古老的具有藥用開(kāi)發(fā)價(jià)值的栽種植物，大麻素是從大麻植物中提取的氫大麻酚酸等。[0003]CBD是從大麻中提取出的單體，是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)大麻類(lèi)藥物，CBD是大麻中的非[0004]CBG是一種不具有精神活性的大麻素，研究表明CBG在保護(hù)大腦神經(jīng)細(xì)胞方面非?；钴S。2015年西班牙馬德里康普頓斯大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系的研究人員發(fā)現(xiàn)CBG具有神經(jīng)保護(hù)特性。CBG可改善運(yùn)動(dòng)缺陷并保留神經(jīng)元，提高了抗氧化防御水平，對(duì)多發(fā)性硬化癥、亨廷頓舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病有著積極的影響。[0005]THC是大麻中的主要精神活性物質(zhì)，被列入第一類(lèi)精神藥品品種目錄管制。由于THC會(huì)威脅人類(lèi)健康。而CBG、CBD則具備有益的藥理作用，對(duì)大麻植物多種成分的快速檢測(cè)是區(qū)別優(yōu)質(zhì)工業(yè)大麻和毒品大麻的關(guān)鍵技術(shù)，對(duì)THC的快速檢測(cè)可以滿(mǎn)足毒品檢測(cè)的需要。[0006]檢測(cè)樣品中是否含有CBD、CBG或THC常用的初篩方法有放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法、膠體金免疫層析技術(shù)(GICA)等。確認(rèn)方法主要用高壓液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC/MS)等理化檢測(cè)方法。HPLC和GC/MS測(cè)試都必須在實(shí)驗(yàn)室完成，需要設(shè)備并由專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作，費(fèi)用昂貴。放射免疫分析法靈敏度和特異性高，但儀器昂貴，因而無(wú)法實(shí)現(xiàn)普及應(yīng)用。酶聯(lián)免疫分析法在靈敏度和特異性方面保留有放射免疫分析法的優(yōu)點(diǎn)，但操作復(fù)雜、耗時(shí)，必需專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作。膠體金免疫層析法由于其具有簡(jiǎn)便快捷、結(jié)果明確、無(wú)需復(fù)雜操作技巧和特殊設(shè)備、靈敏度和特異性較高等優(yōu)點(diǎn)，非常適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)篩查工作，已成為臨床診斷領(lǐng)域發(fā)展的一個(gè)新方向。[0007]本領(lǐng)域迫切需要研發(fā)一種簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確可靠、靈敏、價(jià)格便宜適用于農(nóng)業(yè)種植檢測(cè)、工業(yè)大麻產(chǎn)品檢測(cè)和大麻毒品檢測(cè)檢驗(yàn)方法。中國(guó)專(zhuān)利CN101580544A公開(kāi)了一種膠體金標(biāo)記大麻、四氫大麻酚單抗免疫檢測(cè)板，其優(yōu)點(diǎn)在于能夠快速、簡(jiǎn)易、靈敏地檢測(cè)四氫大麻酚，但該專(zhuān)利未對(duì)其他大麻素分子做進(jìn)一步研究和試驗(yàn)。發(fā)明內(nèi)容[0008]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種大麻素完全抗原及其制備方法，為達(dá)到該發(fā)明[0009]一種式I或式Ⅱ或式Ⅲ所示大麻素半抗原，5式IⅢ。一種式IV或式V或式VI所示大麻素完全抗原，式VI;[0014](1)半抗原制備：將大麻素分子與4-氯苯甲酸甲酯反應(yīng)即得半抗原；[0015](2)完全抗原制備：將半抗原與血藍(lán)蛋[0016]大麻素分子的免疫原性較弱，將大麻素分子與載體蛋白偶聯(lián)后能夠形成較免疫原性較強(qiáng)的抗原；又因THC、CBG或CBD分子表面均沒(méi)有能夠直接與蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)，因此需要在偶聯(lián)載體蛋白之前進(jìn)行衍生化處理制成半抗原，引入活性羧基。[0017]優(yōu)選地，步驟(1)半抗原制備的具體操作步驟包括：[0018]將大麻素分子、催化劑加入DMF攪拌溶解，再加入4-氯苯甲酸甲酯升溫?cái)嚢璺磻?yīng)；反應(yīng)后加LiOH溶液進(jìn)行水解反應(yīng)；之后使用乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相抽濾、干燥即得半抗6[0019]更優(yōu)選地，大麻素分子選自四氫大麻酚(THC)、大麻萜酚(CBG)或大麻二酚(CBD)。[0020]更優(yōu)選地，催化劑包括三乙胺、DMAP和NAOH。[0022]更優(yōu)選地，4-氯苯甲酸甲酯與大麻素分子的重量比為2-3:4-8。[0023]更優(yōu)選地，4-氯苯甲酸甲酯與大麻素分子的反應(yīng)溫度為65-80℃。[0024]更優(yōu)選地，4-氯苯甲酸甲酯與大麻素分子的反應(yīng)時(shí)間為2-5h。[0025]更優(yōu)選地，LiOH的濃度為20-30wt%。[0026]更優(yōu)選地，水解反應(yīng)的時(shí)間為2-5h。[0027]更優(yōu)選地，水解反應(yīng)溫度為室溫。[0028]更進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(1)半抗原的具體操作步驟包括：[0029]按重量份計(jì)，將4-8份大麻素分子、5-10份三乙胺、6-8份DMAP和1-2份NAOH加入15-20份DMF攪拌溶解，再加入2-3份4-氯苯甲酸甲酯升溫至65-80℃攪拌反應(yīng)2-5h;反應(yīng)后加15-20份水并使用乙酸乙酯進(jìn)行萃?。皇占袡C(jī)相并濃縮干燥后加15-20份20%-30%的LiOH溶液，室溫下進(jìn)行水解反應(yīng)2-5h;之后使用乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)相并調(diào)節(jié)pH至5-6,抽濾、干燥即得半抗原。[0030]優(yōu)選地，步驟(2)完全抗原制備的具體操作步驟包括：[0031]將血藍(lán)蛋白溶于緩沖液中制得血藍(lán)蛋白溶液；將半抗原溶于DMF中，并加入EDC和NHS;將半抗原溶液逐滴加入血藍(lán)蛋白溶液，滴加完畢后攪拌反應(yīng)；反應(yīng)后透析即得完全抗[0032]更優(yōu)選地，緩沖液為CBS緩沖液，pH9.5-9.8,濃度0.05-0.1M。[0033]更優(yōu)選地，血藍(lán)蛋白與緩沖液的重量比為2-8:15-30。[0034]更優(yōu)選地，血藍(lán)蛋白與半抗原的重量比為2-8:1-2。[0036]更優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為室溫。[0037]更優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間為10-15h。[0038]更優(yōu)選地，透析體系為PBS緩沖液，pH9-10,濃度0.1-0.5M。[0039]更進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟(2)完全抗原制備的具體操作步驟包括：[0040]按重量份計(jì)，將2-8份血藍(lán)蛋白溶于20-30份CBS緩沖液(pH9.5-9.8,濃度0.05-0.1M)中；將1-2份半抗原溶于80-100份DMF中，并加入2-3份EDC和1-2份NHS;將半抗原溶液逐滴加入血藍(lán)蛋白溶液，滴加完畢后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10-15h;反應(yīng)后使用PBS緩沖液(pH9-10,濃度0.1-0.5M)透析即得完全抗原。[0041]上述制備完全抗原的方法僅為優(yōu)選制備方法，本發(fā)明完全抗原的制備中，可使用任何本領(lǐng)域已知的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行連接。[0042]優(yōu)選地，一種大麻素單克隆抗體的制備方法，制備步驟還包括：[0043]血清效價(jià)檢測(cè)及篩選；雜交瘤細(xì)胞制備；雜交瘤細(xì)胞篩選；動(dòng)物體內(nèi)誘生；抗體純[0044]本發(fā)明還公開(kāi)了上述制備方法制得的大麻素單克隆抗體。[0045]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種膠體金試紙，能夠準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)樣品7本發(fā)明制備的膠體金試紙能夠同時(shí)檢測(cè)THC、CBD或CBG中的一種或幾種，檢測(cè)范圍更廣，有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。[0049](1)納米金標(biāo)記抗體：將納米金溶液與抗體混合振蕩，加入封閉液封閉后離心，重懸后即得抗體懸液；[0051](3)質(zhì)控線(xiàn)制備：將羊抗鼠抗體涂布于硝酸纖維膜靠近吸水墊的一端，即得質(zhì)控[0052](4)試紙組裝：將樣品墊、吸水墊貼、底板、將硝酸纖維膜組裝完成即得膠體金試[0053]更優(yōu)選地，(4)試紙組裝包括：將樣品墊和吸水墊貼在底板兩端，將硝酸纖維膜貼在底板中間并與樣品墊和吸水墊有重疊，組裝完成即得膠體金試紙。[0054]更優(yōu)選地，抗體溶液中抗體濃度為0.2-0.5mg/mL。時(shí)檢測(cè)2種或3種時(shí)，可以增加檢測(cè)的準(zhǔn)確性。[0057]將納米金溶液、抗體、雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽混合振蕩，加入封閉液封閉后離心，重懸后即得抗體懸液。[0058]雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽的加入不會(huì)對(duì)試紙的檢測(cè)功能造成負(fù)面影響，反之，還能夠增加膠體金和抗體的穩(wěn)定性，使其能夠耐受更高的溫度。有利于避免因高溫導(dǎo)致試紙失[0059]優(yōu)選地，雙甘肽與乙醇胺鹽酸鹽的重量比為1-3:0.3-0.8。[0060]本發(fā)明還公開(kāi)了上述完全抗原在制備大麻素單克隆抗體中的用途。[0061]本發(fā)明還公開(kāi)了上述雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽在膠體金試紙耐高溫中的用途。[0062]本發(fā)明還公開(kāi)了上述膠體金試紙?jiān)跈z測(cè)樣品中是否含有大麻素分子中的用途。[0063]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：抗體，再將制得的單克隆抗體用于制備膠體金檢測(cè)試紙，制得的膠體金試紙?zhí)禺愋詮?qiáng)，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)樣品中是否含有THC、CBD或CBG中的1種或幾種；靈敏度高，最低檢測(cè)濃度至少為10ng/mL;并且，本發(fā)明膠體金試紙能夠在90s以?xún)?nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)速度快。本發(fā)明制備膠體金試紙時(shí)，納米金標(biāo)記抗體所制得的抗體懸液中，還添加有雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽，將納米金溶液、雙甘肽和乙醇胺鹽酸鹽共同使用時(shí)，能夠增加膠體金試紙的耐高溫性，在70℃儲(chǔ)存5-10d后仍能夠準(zhǔn)確檢測(cè)。CN114839367A說(shuō)明書(shū)5/12頁(yè)8附圖說(shuō)明的條件。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。再加入300mg4-氯苯甲酸甲酯升溫至75℃攪拌反應(yīng)3h;反應(yīng)后加1500mg水并使用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，收集有機(jī)相并濃縮干燥后加2000mg25%的LiOH溶液，室溫下進(jìn)行水解反應(yīng)(400MHz,DMSO)δ:9.94(s,1H),8.19(d,2H),7.38(d,2H),6.70(s,1H),6.65(s,1H),5.40(s,1H),5.29(m,1H),3.25(d,2H),2.67(m,2H),2.06H),1.72(s,3H),1.62(m,2H),1.30-1.32(m,4H,CH?),0.95(m,3H).抗原溶液逐滴加入血藍(lán)蛋白溶液中，滴加完畢后室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10h;反應(yīng)后使用PBS緩沖液9[0080]制備方法同CBG半抗原的制備，制得式II所示CBD半抗原。采用核磁共振儀對(duì)式II所示CBD半抗原進(jìn)行核磁結(jié)構(gòu)表征，核磁鑒定結(jié)果為：HNMR(400MHz,DMSO)δ:9.89(s,1H),8.19(d,2H),7.38(d,2H),6.74(s,1H),6.69(s,1H),5.40(s,1H),5.35(m4.95(m,1H),3.25(d,1H),2.75(d,1H),2.67(m,2H),2.06(m,1H),2.00(m,1H),1.85(1.79(m,1H),1.58(m,2H),1.52(m,1H),1.30-1.32(m,4H式II。[0082](2)完全抗原制備：[0083]制備方法同CBG完全抗原的制備，最終制得式V所示CBD-KLH。式V。[0086](1)THC半抗原制備：[0087]制備方法同CBG半抗原的制備，制得式III所示THC半抗原。采用核磁共振儀對(duì)式III所示THC半抗原進(jìn)行核磁結(jié)構(gòu)表征，核磁鑒定結(jié)果為：HNMR(400MHz,DMSO)δ:9.86(s,1H),8.23(d,2H),7.44(d,2H),6.81(s,2H),5.42(d,1H),31H),1.93-1.99(t,2H),1.85(s,3H),1.79(t,1H),1.61(式IⅢ。[0089](2)完全抗原制備：[0090]制備方法同CBG完全抗原的制備，最終制得式VI所示THC-KLH。[0092]實(shí)施例2[0093]單克隆抗體的制備[0094]1、CBG單克隆抗體的制備[0095](1)動(dòng)物免疫[0096]取8只BALB/c小鼠，編號(hào)1-8,將CBG-KLH與弗氏佐劑混合免疫，CBG-KLH、弗氏佐劑的重量比為1:1;按皮下注射50μg/只的劑量進(jìn)行免疫，每3周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫時(shí)劑量減半，共進(jìn)行3次免疫，每次免疫后第7d對(duì)小鼠尾部采血，測(cè)定小鼠血清效價(jià)。[0097](2)小鼠血清效價(jià)檢測(cè)及篩選[0098]包板：用PBS包被液(pH7.4)將抗原D-BSA稀釋成1μg/mL濃度，混勻后加入96孔板[0099]封閉：包被好后，棄去包被液，洗板3次，每孔加入200μL封閉液，37℃恒溫箱1h;取[0100]一抗：抗血清按1:500開(kāi)始進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋?zhuān)靠?00μL;對(duì)照為0.01M的PBS;37℃恒溫箱1h;[0101]二抗：取出96孔板，棄去內(nèi)液，洗板3次，向每孔中加入100μL按照1:20000稀釋好的山羊抗鼠-HRP;37℃恒溫箱1h;大于設(shè)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍的孔對(duì)應(yīng)的稀釋度，定為該樣品的效價(jià)；[0104]檢測(cè)結(jié)果如表1所示；[0105]表13免后7天CBG單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)11樣品名稱(chēng)對(duì)照12345678[0107]根據(jù)表1可知，1號(hào)小鼠的血清抗體效價(jià)最優(yōu)，最優(yōu)效價(jià)為1:13500;因此選擇1號(hào)小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。[0108](3)雜交瘤細(xì)胞制備[0109]復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞；斷頸處死1號(hào)小鼠取出脾臟制成脾細(xì)胞懸液；將骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞實(shí)驗(yàn)PEG法誘導(dǎo)細(xì)胞融合；誘導(dǎo)融合后使用HAT培養(yǎng)基在96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃,5%CO?;第三天進(jìn)行半換液培養(yǎng)，第六天進(jìn)行全換液培養(yǎng)。[0110](4)雜交瘤細(xì)胞篩選[0111]培養(yǎng)第7天，按照“小鼠血清效價(jià)檢測(cè)及篩選”中的步驟進(jìn)行陽(yáng)性篩選，將篩選出的效價(jià)高的雜交瘤細(xì)胞保存?zhèn)溆?。[0112](5)動(dòng)物體內(nèi)誘生[0113]選擇BALB/c小鼠，腹腔注射1mL滅菌石蠟油，正常飼養(yǎng)7d;將篩選出的雜交瘤細(xì)胞按照10?個(gè)/只的劑量注射入小鼠腹腔；7d后小鼠明顯產(chǎn)生腹水，抽取腹水，8000r/min離心12min后取上清保存?zhèn)溆?。[0114](6)抗體純化[0115]使用飽和硫酸銨鹽析沉淀法純化抗體，純化后測(cè)定抗體濃度，保存?zhèn)溆谩0117]制備方法同CBG單克隆抗體的制備。[0119]制備方法同CBG單克隆抗體的制備。[0120]實(shí)施例3[0121]膠體金試紙的制備[0122](1)納米金標(biāo)記抗體：將100mL納米金溶液pH值調(diào)節(jié)至9后，與5mL0.3mg/mL的CBG單克隆抗體溶液、CBD單克隆抗體溶液或THC單克隆抗體溶液混合振蕩30min,加入50mL5%的BSA溶液封閉后離心，去上清，加入10mL20mMPBS溶液重懸后即得抗體懸液；[0123](2)檢測(cè)線(xiàn)制備：將抗體懸液涂布于硝酸纖維膜靠近樣品墊的一端，即得檢測(cè)線(xiàn)；[0124](3)質(zhì)控線(xiàn)制備：將0.4mg/mL的羊抗鼠抗體涂布于硝酸纖維膜靠近吸水墊的一端，即得質(zhì)控線(xiàn)。[0125](4)試紙組裝：將樣品墊和吸水墊貼在底板兩端，將硝酸纖維膜貼在底板中間并與樣品墊和吸水墊有重疊，組裝完成即得膠體金試紙；[0126]根據(jù)抗體的種類(lèi)和數(shù)量的不同，分別按照上述方法制得：[0127]單檢測(cè)線(xiàn)試紙(如圖1所示):CBG膠體金試紙、CBD膠體金試紙、THC膠體金試紙；[0129]三檢測(cè)線(xiàn)試紙：CBG-CBD-THC膠體金試紙。[0130]實(shí)施例4[0131]膠體金試紙的制備[0132](1)納米金標(biāo)記抗體：將100mL納米金溶液pH值調(diào)節(jié)至9后，加入1g雙甘肽與0.5g乙醇胺鹽酸鹽，混勻后再與5mL0.3mg/mL的CBG單克隆抗體溶液、CBD單克隆抗體溶液或THC單20mMPBS溶液重懸后即得抗體懸液；[0133](2)檢測(cè)線(xiàn)制備：同實(shí)施例3;[0134](3)質(zhì)控線(xiàn)制備：同實(shí)施例3;[0135](4)試紙組裝：同實(shí)施例3;[0136]根據(jù)抗體的種類(lèi)和數(shù)量的不同，分別按照上述方法制得：[0139]三檢測(cè)線(xiàn)試紙：CBG-CBD-THC膠體金試紙。[0140]試驗(yàn)例1[0141]單克隆抗體的檢測(cè)[0142]1、完全抗原偶聯(lián)比測(cè)定[0143]使用紫外分光光度法對(duì)偶聯(lián)后的完全抗原進(jìn)行掃描，按照吸光度的加和性原理計(jì)算KLH上偶聯(lián)半抗原的量，計(jì)算公式如下：為1722.8。說(shuō)明半抗原與KLH成功偶聯(lián)并且偶聯(lián)比適中，可以用于進(jìn)一步試驗(yàn)。[0146]2、抗體親和力測(cè)定[0147]分別取THC、CBD或CBG使用包被緩沖液配制成1μg/mL進(jìn)行包被，包被方法同實(shí)施例2中“小鼠血清效價(jià)檢測(cè)及篩選”;之后進(jìn)行封閉，封閉方法同實(shí)施例2中“小鼠血清效價(jià)檢測(cè)及篩選”;取實(shí)施例2中制得的單克隆抗體使用緩沖液稀釋至5μg/mL;將實(shí)施例1中制得的混合，37℃恒溫箱1h;之后進(jìn)行二抗、顯色、終止，方法同實(shí)施例2中“小鼠血清效價(jià)檢測(cè)及篩選”;測(cè)定OD值后計(jì)算單克隆抗體的親和常數(shù)K:[0149]經(jīng)測(cè)定，實(shí)施例2中制得的CBG單克隆抗體的親和常數(shù)為5.74×101?m?1,CBD單克隆抗體的親和常數(shù)為5.47×101?M?1,THC單克隆抗體的親和常數(shù)為5.59×101?M1;測(cè)得的親和力常數(shù)滿(mǎn)足制備膠體金試紙的需求。[0150]3、交叉反應(yīng)測(cè)定[0151]使用實(shí)施例2中“小鼠血清效價(jià)檢測(cè)及篩選”中的檢測(cè)方法測(cè)定CBG單克隆抗體、[0152]交叉反應(yīng)率(%)=(目標(biāo)物質(zhì)IC50值/其他物質(zhì)IC50值)×100%;[0153]測(cè)定結(jié)果如表3所示。[0154]表3實(shí)施例2中單克隆抗體的交叉反應(yīng)率實(shí)施例2CBD單抗THC單抗CBG單抗/CBD單抗/THC單抗/[0159]1、靈敏度檢測(cè)[0160]分別配制濃度為1.0ng/mL、2.0ng/mL、3.0ng/mL、4.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、CBD和THC溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液，使用實(shí)施例3和4中的單檢測(cè)線(xiàn)膠體金試紙進(jìn)行檢測(cè)；用膠頭滴管吸取標(biāo)準(zhǔn)液，滴3滴在樣品墊上，滴加后靜置觀察；檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)同時(shí)顯色，判定為陽(yáng)定為膠體金試紙失效；對(duì)陽(yáng)性樣品，同時(shí)記[0161]實(shí)施例3檢測(cè)結(jié)果如表4所示，實(shí)施例4檢測(cè)結(jié)果與實(shí)施例3結(jié)果類(lèi)似，為避免冗余，在此不做展示。[0162]表4實(shí)施例3膠體金試紙靈敏度檢測(cè)結(jié)果[0163]標(biāo)準(zhǔn)液濃度(ng/mL)CBG膠體金試紙CBD膠體金試紙THC膠體金試紙150陽(yáng)性，65s陽(yáng)性，62s陽(yáng)性，63s100陽(yáng)性，63s陽(yáng)性，62s陽(yáng)性，65s 70陽(yáng)性，64s陽(yáng)性，65s陽(yáng)性，64s 50陽(yáng)性，68s陽(yáng)性，67s陽(yáng)性，66s 25陽(yáng)性，69s陽(yáng)性，71s陽(yáng)性，74s 20陽(yáng)性，75s陽(yáng)性，77s陽(yáng)性，76s 15陽(yáng)性，77s陽(yáng)性，77s陽(yáng)性，80s 10陽(yáng)性，81s陽(yáng)性，80s陽(yáng)性，84s 5陰性陰性陰性4陰性陰性陰性3陰性陰性陰性2陰性陰性陰性1陰性陰性陰性[0164]由表4可知，