小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活：去勢(shì)抵抗性前列腺癌治療新曙光一、引言1.1研究背景前列腺癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅男性健康的重大疾病，其發(fā)病率與致死率在男性惡性腫瘤中一直占據(jù)著較高的位置。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家，前列腺癌的發(fā)病率長(zhǎng)期居于男性惡性腫瘤的首位，在美國(guó)，每年新確診的前列腺癌患者數(shù)量高達(dá)數(shù)十萬(wàn)人，且因前列腺癌死亡的人數(shù)也相當(dāng)可觀。在我國(guó)，隨著人口老齡化進(jìn)程的加速以及生活方式的西方化轉(zhuǎn)變，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)出迅猛上升的趨勢(shì)。以上海地區(qū)為例，近幾十年來(lái)前列腺癌的發(fā)病率增長(zhǎng)了數(shù)倍，已成為泌尿系統(tǒng)中最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。早期前列腺癌患者可能無(wú)明顯癥狀，或者僅表現(xiàn)出一些諸如尿頻、尿急、排尿困難等與前列腺增生相似的非特異性癥狀，容易被患者忽視以及臨床誤診。隨著病情的逐步進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞會(huì)侵犯周圍組織與器官，如精囊、膀胱、直腸等，導(dǎo)致血尿、血精、排便困難等更為嚴(yán)重的癥狀出現(xiàn)。同時(shí)，前列腺癌還具有較高的骨轉(zhuǎn)移傾向，一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，患者往往會(huì)遭受劇烈的骨痛折磨，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，甚至可能引發(fā)病理性骨折、脊髓壓迫等嚴(yán)重并發(fā)癥，對(duì)患者的生命健康構(gòu)成極大威脅。內(nèi)分泌治療，即去勢(shì)治療，通過(guò)降低體內(nèi)雄激素水平或阻斷雄激素的作用，一直是臨床上治療前列腺癌的重要手段，在疾病的控制方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。然而，大部分前列腺癌患者在接受內(nèi)分泌治療1-2年后，會(huì)不可避免地發(fā)展為去勢(shì)抵抗性前列腺癌（Castration-ResistantProstateCancer，CRPC）。一旦進(jìn)入CRPC階段，腫瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療產(chǎn)生耐藥性，疾病會(huì)持續(xù)進(jìn)展，患者的預(yù)后急劇惡化。轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌（mCRPC）患者的中位總生存期僅為12-36個(gè)月，5年生存率極低，給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。目前，對(duì)于去勢(shì)抵抗性前列腺癌的治療手段仍然較為有限且療效不盡人意。化療是常用的治療方法之一，多西他賽等化療藥物雖然在一定程度上能夠延長(zhǎng)患者的生存期，但同時(shí)也會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，而且部分患者對(duì)化療藥物并不敏感，治療效果不佳。新型內(nèi)分泌治療藥物，如阿比特龍、恩扎盧胺等，雖然在一些患者中顯示出一定的療效，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，耐藥問(wèn)題也逐漸凸顯。免疫治療在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中的應(yīng)用也面臨諸多挑戰(zhàn)，總體有效率較低，大部分患者無(wú)法從中獲得顯著的生存獲益。因此，去勢(shì)抵抗性前列腺癌的治療已成為臨床腫瘤領(lǐng)域亟待解決的難題，迫切需要探索新的治療靶點(diǎn)和治療策略，以改善患者的預(yù)后。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制有了更為深入的認(rèn)識(shí)。研究發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)的異常在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及去勢(shì)抵抗的形成過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。小激活RNA（smallactivatingRNA，saRNA）作為一種新型的基因調(diào)控工具，能夠通過(guò)RNA激活（RNAactivation，RNAa）機(jī)制特異性地上調(diào)基因的表達(dá)。INTS6基因（Integratorcomplexsubunit6gene）作為一種潛在的抑癌基因，在前列腺癌組織和細(xì)胞株中存在表達(dá)缺失或下調(diào)的現(xiàn)象。有研究指出INTS6可能參與WNT等重要信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。通過(guò)小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活，有可能恢復(fù)其在前列腺癌中的正常功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，為去勢(shì)抵抗性前列腺癌的治療開(kāi)辟新的途徑。因此，深入研究小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的作用及機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值，有望為去勢(shì)抵抗性前列腺癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略，改善患者的預(yù)后，提高患者的生活質(zhì)量。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的作用及潛在分子機(jī)制，具體研究目的包括：明確小激活RNA對(duì)INTS6基因在去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞中的激活效果，從基因、蛋白等多個(gè)層面分析激活的效率與穩(wěn)定性；探討INTS6基因激活后對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為，如增殖、遷移、侵襲、凋亡等的影響；解析小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活影響去勢(shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子信號(hào)通路，確定關(guān)鍵的上下游分子及調(diào)控節(jié)點(diǎn)；通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，評(píng)估其潛在的治療效果。該研究具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。在理論層面，目前對(duì)于去勢(shì)抵抗性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，本研究通過(guò)揭示小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活在其中的作用及機(jī)制，有助于深入理解去勢(shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富腫瘤基因調(diào)控的理論知識(shí)，為后續(xù)相關(guān)研究提供新的思路和方向。在臨床應(yīng)用方面，去勢(shì)抵抗性前列腺癌患者預(yù)后較差，缺乏有效的治療手段。若能證實(shí)小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活可抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌的進(jìn)展，將為其治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略，有望開(kāi)發(fā)出基于RNA激活技術(shù)的新型治療方法，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕社會(huì)和家庭的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。同時(shí)，本研究也可能為其他腫瘤的治療研究提供借鑒和參考，推動(dòng)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究將綜合運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及多種分子生物學(xué)技術(shù)，深入探究小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的作用及機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系，如PC-3、DU145等。首先，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等方法將設(shè)計(jì)合成的小激活RNA（saRNA）導(dǎo)入細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)INTS6基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)變化，以確定saRNA對(duì)INTS6基因的激活效果。接著，運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)）評(píng)估INTS6基因激活后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；通過(guò)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell遷移實(shí)驗(yàn)）和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)）研究其對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用；采用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況，探究INTS6基因激活對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的調(diào)控作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分，構(gòu)建去勢(shì)抵抗性前列腺癌小鼠模型，可通過(guò)將去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞接種到裸鼠或免疫缺陷小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤內(nèi)注射或尾靜脈注射攜帶saRNA的載體，對(duì)照組注射對(duì)照載體。定期測(cè)量小鼠腫瘤的體積和重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行解剖，通過(guò)免疫組化、免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)INTS6基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)，分析腫瘤組織的病理變化，同時(shí)檢測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，如肺部、骨骼等器官的轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小。分子生物學(xué)技術(shù)方面，利用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)探究與INTS6基因啟動(dòng)子區(qū)域相互作用的蛋白質(zhì)，明確其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制；采用RNA免疫沉淀（RIP）技術(shù)尋找與saRNA相互作用的蛋白，深入了解RNA激活的分子機(jī)制。此外，通過(guò)基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9）構(gòu)建INTS6基因敲除或過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型，進(jìn)一步驗(yàn)證INTS6基因在去勢(shì)抵抗性前列腺癌中的功能。利用高通量測(cè)序技術(shù)（如RNA-seq、全基因組測(cè)序）分析saRNA誘導(dǎo)INTS6基因激活前后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜和信號(hào)通路的變化，篩選出相關(guān)的差異表達(dá)基因和潛在的信號(hào)通路，為后續(xù)機(jī)制研究提供線索。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先進(jìn)行小激活RNA的設(shè)計(jì)與合成，并在細(xì)胞水平驗(yàn)證其對(duì)INTS6基因的激活效果，篩選出高效的saRNA。然后將篩選出的saRNA應(yīng)用于去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞和小鼠模型，研究INTS6基因激活對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為和腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響。接著，運(yùn)用各種分子生物學(xué)技術(shù)深入探究其作用機(jī)制，最后綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，總結(jié)小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌的作用及機(jī)制。各步驟緊密關(guān)聯(lián)，前一步驟為后一步驟提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和研究方向，逐步深入地揭示研究主題。[此處插入技術(shù)路線圖1，圖中清晰展示從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到分子機(jī)制研究的各個(gè)步驟及相互關(guān)系]二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1去勢(shì)抵抗性前列腺癌概述2.1.1發(fā)病機(jī)制去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多個(gè)分子層面的改變，這些改變相互作用，共同推動(dòng)了疾病的進(jìn)展。在眾多機(jī)制中，雄激素受體（AR）信號(hào)通路的異常激活是CRPC發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管在去勢(shì)治療后，體內(nèi)雄激素水平顯著降低，但AR及其介導(dǎo)的信號(hào)通路卻依然維持活躍狀態(tài)。這一現(xiàn)象背后存在多種分子機(jī)制，其中雄激素基因擴(kuò)增與過(guò)表達(dá)是重要原因之一。在未經(jīng)治療的前列腺癌中，雄激素基因擴(kuò)增及突變相對(duì)少見(jiàn)，但在CRPC患者中卻較為常見(jiàn)。由于雄激素剝奪后雄激素受體表達(dá)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，約45％-50％的CRPC患者中可檢測(cè)到雄激素基因的擴(kuò)增，這使得雄激素在低水平雄激素環(huán)境下仍能增加與配體結(jié)合率，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支持。雄激素受體的點(diǎn)突變也是導(dǎo)致其持續(xù)激活的重要因素。這些點(diǎn)突變不僅能使原本為體內(nèi)雄激素的拮抗劑轉(zhuǎn)化為潛在的激動(dòng)劑，還能使類固醇激素（如孕酮和雌激素等）原本對(duì)前列腺癌細(xì)胞無(wú)刺激作用的物質(zhì)激活雄激素轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，突變還增強(qiáng)了雄激素的轉(zhuǎn)錄激活功能，使得前列腺癌細(xì)胞在激素剝奪治療后的低雄激素濃度環(huán)境下仍能無(wú)限制生長(zhǎng)。雄激素剪接變異體（AR-Vs）的持續(xù)激活也是CRPC形成的重要機(jī)制。AR-Vs是全長(zhǎng)雄激素受體（AR-FL）的一部分（AR-V1到AR-V11）或者是丟失或跳過(guò)AR-FL部分外顯子（AR-V12到AR-V14和AR-V567es）。這些剪接變異體缺失了配體結(jié)合域，無(wú)需與雄激素結(jié)合就能持續(xù)激活A(yù)R信號(hào)通路，驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。研究表明，AR-V7在CRPC患者中的表達(dá)與對(duì)新型內(nèi)分泌治療藥物（如阿比特龍、恩扎盧胺）的耐藥密切相關(guān)，攜帶AR-V7的患者對(duì)這些藥物的治療反應(yīng)較差，疾病進(jìn)展更快。除了雄激素受體相關(guān)的改變，其他信號(hào)通路的旁路激活也在CRPC的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在前列腺癌發(fā)展為CRPC的過(guò)程中，該信號(hào)通路常常被異常激活。這可能是由于PTEN基因的缺失或突變，導(dǎo)致其對(duì)PI3K的抑制作用喪失，從而使得PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路過(guò)度激活。激活后的該信號(hào)通路可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活，例如上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展；抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白（如BAD）的活性，減少細(xì)胞凋亡；調(diào)節(jié)代謝相關(guān)酶的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞提供更多的能量和生物合成原料。MAPK信號(hào)通路也是CRPC中常見(jiàn)的旁路激活通路之一。生長(zhǎng)因子（如表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子等）與其受體結(jié)合后，可激活RAS-RAF-MEK-ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致MAPK信號(hào)通路的激活。激活后的MAPK信號(hào)通路能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的分化和存活。研究發(fā)現(xiàn)，在CRPC患者中，MAPK信號(hào)通路的激活與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后密切相關(guān)。腫瘤微環(huán)境的改變也是CRPC發(fā)病機(jī)制中的重要因素。腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。在前列腺癌發(fā)展為CRPC的過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境發(fā)生了顯著的變化。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的功能失調(diào)，無(wú)法有效地識(shí)別和清除腫瘤細(xì)胞。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）在腫瘤微環(huán)境中大量浸潤(rùn)，它們可以分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，這些因子可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)還能抑制免疫細(xì)胞的功能。髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）也在腫瘤微環(huán)境中積聚，它們可以通過(guò)多種機(jī)制抑制T細(xì)胞的活化和功能，包括消耗精氨酸、產(chǎn)生活性氧等，從而為腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸提供了有利條件。腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，也可以通過(guò)分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)成分等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。成纖維細(xì)胞可以分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β），TGF-β可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞之間通過(guò)細(xì)胞間通訊和信號(hào)傳導(dǎo)相互作用，形成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同促進(jìn)了CRPC的發(fā)生和發(fā)展。2.1.2臨床特征與治療現(xiàn)狀去勢(shì)抵抗性前列腺癌（CRPC）患者的臨床癥狀呈現(xiàn)多樣化且常較為嚴(yán)重的特點(diǎn)。在疾病的進(jìn)展過(guò)程中，泌尿系統(tǒng)癥狀往往逐漸加重，患者會(huì)出現(xiàn)明顯的排尿困難，表現(xiàn)為尿線變細(xì)、尿流緩慢、排尿費(fèi)力，甚至需要增加腹壓才能排尿。尿頻、尿急、尿痛等膀胱刺激癥狀也較為常見(jiàn)，嚴(yán)重影響患者的日常生活和睡眠質(zhì)量。血尿也是CRPC患者常見(jiàn)的癥狀之一，輕者可能僅表現(xiàn)為顯微鏡下血尿，重者則可出現(xiàn)肉眼血尿，有時(shí)還會(huì)伴有血塊，導(dǎo)致尿路梗阻，進(jìn)一步加重排尿困難。隨著腫瘤的進(jìn)展，CRPC患者常出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移相關(guān)癥狀，這是導(dǎo)致患者疼痛和功能障礙的重要原因。骨轉(zhuǎn)移最常發(fā)生在脊柱、骨盆、肋骨等部位，患者會(huì)感到持續(xù)性的骨痛，疼痛程度因人而異，輕者可能表現(xiàn)為隱痛，重者則可出現(xiàn)劇烈疼痛，尤其是在夜間或活動(dòng)時(shí)疼痛加劇。骨轉(zhuǎn)移還可能導(dǎo)致病理性骨折，輕微的外力作用，如咳嗽、翻身等，就可能引發(fā)骨折，常見(jiàn)的骨折部位包括椎體、股骨等。一旦發(fā)生病理性骨折，患者不僅會(huì)遭受巨大的痛苦，還可能導(dǎo)致肢體活動(dòng)受限，甚至需要長(zhǎng)期臥床，增加了肺部感染、深靜脈血栓等并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。脊髓壓迫也是骨轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移到脊柱并壓迫脊髓時(shí)，患者會(huì)出現(xiàn)下肢無(wú)力、麻木、感覺(jué)異常，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致截癱，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)后。在診斷方面，前列腺特異抗原（PSA）是目前臨床上診斷CRPC的重要指標(biāo)之一。當(dāng)患者血清睪酮＜50ng/dL或1.7nmol/L，且每間隔一周連續(xù)三次測(cè)得PSA升高，連續(xù)兩次比最低值升高＞50%，且PSA升高絕對(duì)值＞2ng/mL時(shí)，結(jié)合其他臨床癥狀和檢查結(jié)果，可輔助診斷CRPC。影像學(xué)檢查在CRPC的診斷中也起著至關(guān)重要的作用。骨掃描是檢測(cè)骨轉(zhuǎn)移的常用方法，它可以早期發(fā)現(xiàn)骨骼中的異常代謝區(qū)域，靈敏度較高，但特異性相對(duì)較低。對(duì)于疑似骨轉(zhuǎn)移的患者，進(jìn)一步進(jìn)行磁共振成像（MRI）或計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）檢查，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估骨轉(zhuǎn)移的部位、范圍和程度。MRI在檢測(cè)軟組織病變和骨髓浸潤(rùn)方面具有優(yōu)勢(shì)，能夠清晰地顯示腫瘤對(duì)周圍組織的侵犯情況。CT則在檢測(cè)骨皮質(zhì)破壞和肺部轉(zhuǎn)移等方面具有重要價(jià)值。正電子發(fā)射斷層掃描（PET）-CT結(jié)合了PET和CT的優(yōu)勢(shì)，不僅可以檢測(cè)腫瘤的代謝活性，還能提供精確的解剖定位信息，對(duì)于CRPC的診斷、分期和療效評(píng)估具有重要意義，尤其是在檢測(cè)早期轉(zhuǎn)移灶和隱匿性轉(zhuǎn)移灶方面具有較高的價(jià)值。當(dāng)前，CRPC的治療手段雖然多樣，但每種方法都存在一定的局限性，給患者的治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。內(nèi)分泌治療仍然是CRPC的基礎(chǔ)治療方法之一，新型內(nèi)分泌治療藥物如阿比特龍和恩雜魯胺在臨床上得到了廣泛應(yīng)用。阿比特龍通過(guò)抑制CYP17A1酶，阻斷雄激素的生物合成，從而降低體內(nèi)雄激素水平。恩雜魯胺則是一種雄激素受體抑制劑，它可以阻斷雄激素受體信號(hào)通路的多個(gè)步驟，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。然而，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，大部分患者會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致疾病進(jìn)展。研究表明，阿比特龍和恩雜魯胺治療后，患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期雖然有所延長(zhǎng)，但最終仍會(huì)出現(xiàn)耐藥，耐藥機(jī)制主要與雄激素受體的突變、剪接變異體的產(chǎn)生以及其他信號(hào)通路的旁路激活等有關(guān)?；熢贑RPC的治療中也占有重要地位，多西他賽聯(lián)合潑尼松是目前常用的化療方案之一。多西他賽通過(guò)抑制微管解聚，干擾腫瘤細(xì)胞的有絲分裂，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，化療在帶來(lái)治療效果的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)。骨髓抑制是常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一，表現(xiàn)為白細(xì)胞、血小板和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，導(dǎo)致患者免疫力降低，容易發(fā)生感染、出血等并發(fā)癥。胃腸道反應(yīng)也較為常見(jiàn)，患者會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、食欲不振等癥狀，嚴(yán)重影響患者的營(yíng)養(yǎng)攝入和生活質(zhì)量。脫發(fā)也是化療常見(jiàn)的不良反應(yīng)之一，給患者帶來(lái)了心理上的壓力。此外，部分患者對(duì)化療藥物并不敏感，治療效果不佳，這也限制了化療在CRPC治療中的應(yīng)用。免疫治療作為一種新興的治療方法，近年來(lái)在CRPC的治療中也進(jìn)行了諸多探索。免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如帕博利珠單抗、納武利尤單抗等，通過(guò)阻斷免疫檢查點(diǎn)蛋白（如PD-1、PD-L1、CTLA-4等），解除腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制，激活機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，目前免疫治療在CRPC中的總體有效率較低，大部分患者無(wú)法從中獲得顯著的生存獲益。這可能與前列腺癌的腫瘤微環(huán)境具有免疫抑制性、腫瘤細(xì)胞的免疫原性較低以及存在多種免疫逃逸機(jī)制等因素有關(guān)。如何提高免疫治療的療效，篩選出對(duì)免疫治療敏感的患者群體，是目前CRPC免疫治療研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。綜上所述，CRPC患者的臨床癥狀嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，當(dāng)前的診斷方法和治療手段雖然在一定程度上能夠幫助醫(yī)生診斷和治療疾病，但仍存在諸多不足，迫切需要探索新的診斷標(biāo)志物和治療策略，以提高CRPC的治療效果和患者的生存預(yù)后。2.2INTS6基因研究進(jìn)展2.2.1INTS6基因結(jié)構(gòu)與功能INTS6基因，全稱為Integratorcomplexsubunit6gene，定位于人類染色體13q14.3區(qū)域。該基因編碼的蛋白質(zhì)是Integrator復(fù)合體的一個(gè)重要亞基，在細(xì)胞的生理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Integrator復(fù)合體是一個(gè)多亞基復(fù)合物，其核心功能主要圍繞RNA加工展開(kāi)，包括小核RNA（snRNA）和長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）的生成。作為Integrator復(fù)合體的組成部分，INTS6參與了前體信使RNA（pre-mRNA）的剪接以及3'端加工過(guò)程。在pre-mRNA剪接過(guò)程中，INTS6協(xié)助識(shí)別并移除內(nèi)含子，將外顯子準(zhǔn)確地連接起來(lái)，確保成熟mRNA的正確形成。這一過(guò)程對(duì)于基因表達(dá)的精確調(diào)控至關(guān)重要，因?yàn)橹挥姓_剪接的mRNA才能被順利翻譯成具有正常功能的蛋白質(zhì)。在mRNA的3'端加工中，INTS6參與了poly-A尾的添加過(guò)程。poly-A尾的存在對(duì)于mRNA的穩(wěn)定性、從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)以及翻譯效率都有著重要影響。研究表明，缺乏INTS6的細(xì)胞中，mRNA的3'端加工會(huì)出現(xiàn)異常，導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性下降，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成。INTS6還與RNA的輸出和穩(wěn)定性密切相關(guān)。它能夠幫助加工后的mRNA從細(xì)胞核正確地輸送到細(xì)胞質(zhì)中，為蛋白質(zhì)合成提供模板。在這個(gè)過(guò)程中，INTS6與其他蛋白質(zhì)相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)運(yùn)體系，確保mRNA能夠順利穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，INTS6通過(guò)與特定的RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或處于不同的生理狀態(tài)時(shí)，INTS6可以根據(jù)細(xì)胞的需求，調(diào)整mRNA的穩(wěn)定性，從而控制蛋白質(zhì)的合成水平。除了在RNA加工過(guò)程中的作用外，INTS6還參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等重要生理過(guò)程。通過(guò)與其他蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，INTS6能夠感知細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)變化，并將這些信號(hào)傳遞給下游的效應(yīng)分子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生理活動(dòng)。在細(xì)胞增殖過(guò)程中，INTS6可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。當(dāng)INTS6表達(dá)異常時(shí)，細(xì)胞周期可能會(huì)出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖或增殖受阻。在細(xì)胞分化過(guò)程中，INTS6也發(fā)揮著重要作用，它可以調(diào)控分化相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞向特定的方向分化。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，INTS6對(duì)于神經(jīng)干細(xì)胞的分化和神經(jīng)元的形成具有重要影響。在正常細(xì)胞中，INTS6的正常表達(dá)和功能對(duì)于維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和正常生理功能至關(guān)重要。它通過(guò)精確調(diào)控RNA的加工和基因表達(dá)，確保細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的正常合成和功能發(fā)揮。一旦INTS6基因發(fā)生突變或表達(dá)異常，可能會(huì)導(dǎo)致RNA加工過(guò)程出現(xiàn)錯(cuò)誤，進(jìn)而影響基因表達(dá)和細(xì)胞功能，引發(fā)一系列疾病，包括腫瘤的發(fā)生。2.2.2INTS6基因與腫瘤關(guān)系近年來(lái)，大量研究表明INTS6基因在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，其表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后密切相關(guān)。在前列腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)INTS6基因在前列腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平明顯低于正常前列腺組織和細(xì)胞。通過(guò)對(duì)前列腺癌患者的臨床樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)INTS6基因低表達(dá)的患者往往具有更高的腫瘤分期、更差的病理分級(jí)以及更短的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期。進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，在前列腺癌細(xì)胞中上調(diào)INTS6基因的表達(dá)，可以顯著抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而敲低INTS6基因的表達(dá)，則會(huì)增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。這表明INTS6基因在前列腺癌中可能作為一種抑癌基因發(fā)揮作用，其低表達(dá)可能促進(jìn)了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌的研究中，也觀察到類似的現(xiàn)象。INTS6基因在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯低于正常乳腺組織，且其低表達(dá)與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞系中，恢復(fù)INTS6基因的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，INTS6可能通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT和MAPK等信號(hào)通路，影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在結(jié)直腸癌中，INTS6基因的表達(dá)情況較為復(fù)雜。有研究報(bào)道INTS6基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)。功能實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)INTS6基因的表達(dá)可以促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而下調(diào)INTS6基因的表達(dá)則會(huì)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，INTS6可能通過(guò)激活A(yù)KT和ERK信號(hào)通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展。這表明INTS6基因在結(jié)直腸癌中可能具有促癌作用，與在前列腺癌和乳腺癌中的抑癌作用有所不同。在肺癌中，INTS6基因的表達(dá)水平同樣與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究顯示INTS6基因在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)低于正常肺組織，且低表達(dá)與腫瘤的大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者的不良預(yù)后相關(guān)。在肺癌細(xì)胞系中，上調(diào)INTS6基因的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過(guò)基因芯片和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)INTS6可能通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因和信號(hào)通路，發(fā)揮其抑癌作用。在肝癌中，INTS6基因的表達(dá)也存在異常。研究表明INTS6基因在肝癌組織中的表達(dá)低于正常肝組織，且其低表達(dá)與肝癌的惡性程度、復(fù)發(fā)率以及患者的生存期相關(guān)。在肝癌細(xì)胞系中，恢復(fù)INTS6基因的表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，INTS6可能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin等信號(hào)通路，影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。綜上所述，INTS6基因在多種腫瘤中存在表達(dá)異常的情況，其低表達(dá)在大多數(shù)腫瘤中與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和不良預(yù)后相關(guān)，提示INTS6基因可能是一個(gè)潛在的腫瘤抑制基因。然而，在結(jié)直腸癌等少數(shù)腫瘤中，INTS6基因的表達(dá)情況和功能作用較為特殊，表現(xiàn)為高表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。這些差異可能與不同腫瘤的發(fā)病機(jī)制、細(xì)胞類型以及微環(huán)境等因素有關(guān)。深入研究INTS6基因在不同腫瘤中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，將有助于進(jìn)一步揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制，為腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供新的靶點(diǎn)和思路。2.3小RNA與基因激活機(jī)制2.3.1小激活RNA（saRNA）概述小激活RNA（smallactivatingRNA，saRNA）是一類能夠在轉(zhuǎn)錄水平激活基因表達(dá)的雙鏈RNA分子，其長(zhǎng)度通常為21-23個(gè)核苷酸。saRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與傳統(tǒng)的小干擾RNA（siRNA）有一定的相似性，二者均由雙鏈RNA組成，且雙鏈的兩端都存在2-3個(gè)核苷酸的3'端突出。然而，saRNA與siRNA在功能和作用機(jī)制上存在顯著差異。傳統(tǒng)的RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是由siRNA介導(dǎo)的，通過(guò)與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)，引發(fā)mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的下調(diào)。而saRNA則是通過(guò)RNA激活（RNAactivation，RNAa）機(jī)制，特異性地結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的上調(diào)。在RNAa現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)之前，人們普遍認(rèn)為雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)主要介導(dǎo)基因沉默效應(yīng)。2006年，李龍承等研究人員在研究抑制E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中，意外發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的靶向E-cadherin啟動(dòng)子的雙鏈RNA轉(zhuǎn)染到腫瘤細(xì)胞后，不但沒(méi)有抑制基因表達(dá)，反而顯著提高了E-cadherinmRNA和蛋白水平。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，這種雙鏈RNA能夠特異性地激活基因表達(dá)，且這種激活作用具有序列特異性，依賴于與啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列相互作用。進(jìn)一步的研究表明，saRNA的激活作用并非隨機(jī)發(fā)生，而是具有高度的靶向性，能夠精準(zhǔn)地激活目標(biāo)基因。與傳統(tǒng)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)相比，saRNA具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的基因過(guò)表達(dá)技術(shù)通常需要構(gòu)建表達(dá)載體，將外源基因?qū)爰?xì)胞中，這種方法操作較為復(fù)雜，且存在基因整合到基因組中導(dǎo)致潛在風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題。而saRNA是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的天然機(jī)制來(lái)激活基因表達(dá)，不需要引入外源基因，避免了基因整合帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。saRNA的作用具有可逆性，當(dāng)不再需要激活基因表達(dá)時(shí)，隨著saRNA在細(xì)胞內(nèi)的降解，基因表達(dá)水平可以逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)。這一特點(diǎn)使得saRNA在基因功能研究和疾病治療中具有很大的應(yīng)用潛力。2.3.2saRNA誘導(dǎo)基因激活的分子機(jī)制saRNA誘導(dǎo)基因激活的分子機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過(guò)程，涉及多個(gè)分子和信號(hào)通路的參與。saRNA首先在細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，然后與Argonaute2（AGO2）蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。AGO2蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心組成部分，在RNAi和RNAa過(guò)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在與saRNA結(jié)合后，AGO2蛋白會(huì)對(duì)saRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行處理，使其形成具有活性的單鏈RNA-AGO2復(fù)合物，其中單鏈RNA作為引導(dǎo)鏈，能夠識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列上。一旦單鏈RNA-AGO2復(fù)合物結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域，它會(huì)招募一系列相關(guān)的酶和蛋白質(zhì)，共同參與基因激活過(guò)程。其中，最重要的是招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）和組蛋白修飾酶。DNMTs能夠?qū)?dòng)子區(qū)域的DNA進(jìn)行甲基化修飾，改變DNA的甲基化狀態(tài)。通常情況下，基因啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化會(huì)抑制基因的轉(zhuǎn)錄，而saRNA介導(dǎo)的DNA甲基化修飾能夠降低啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平，從而解除對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制。組蛋白修飾酶則會(huì)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白進(jìn)行修飾，如組蛋白乙?；?、甲基化等。組蛋白乙?；軌蚴谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變得松散，增加基因啟動(dòng)子區(qū)域與轉(zhuǎn)錄因子的可及性，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。而組蛋白甲基化的修飾位點(diǎn)和修飾程度則會(huì)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同的影響，某些位點(diǎn)的甲基化可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，而另一些位點(diǎn)的甲基化則可能抑制轉(zhuǎn)錄。在saRNA的作用下，組蛋白修飾酶會(huì)對(duì)啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白進(jìn)行特定的修飾，使得染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從抑制性的緊密結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谵D(zhuǎn)錄的松散結(jié)構(gòu)。除了DNA甲基化和組蛋白修飾外，saRNA還會(huì)通過(guò)招募轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄元件，進(jìn)一步促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子能夠識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的特定順式作用元件上，與RNA聚合酶II相互作用，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在saRNA的作用下，更多的轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶II被招募到啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成效率，從而促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，saRNA還可以通過(guò)與非編碼RNA（如長(zhǎng)鏈非編碼RNA、微小RNA等）相互作用，間接調(diào)控基因的表達(dá)。這些非編碼RNA在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，它們可以與saRNA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域，或者通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾酶等相互作用，影響saRNA介導(dǎo)的基因激活過(guò)程。saRNA誘導(dǎo)基因激活是一個(gè)多步驟、多分子參與的復(fù)雜過(guò)程，通過(guò)與AGO2蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，招募相關(guān)酶和蛋白質(zhì)，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的激活。深入了解saRNA誘導(dǎo)基因激活的分子機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化saRNA的設(shè)計(jì)和應(yīng)用，以及開(kāi)發(fā)基于RNA激活技術(shù)的疾病治療方法具有重要意義。三、小RNA誘導(dǎo)INTS6基因激活的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究選用人去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系PC-3和DU145，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。PC-3細(xì)胞具有高度的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，在去勢(shì)抵抗性前列腺癌的研究中被廣泛應(yīng)用，能夠很好地模擬臨床中腫瘤細(xì)胞的惡性行為。DU145細(xì)胞同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的增殖和遷移特性，對(duì)研究去勢(shì)抵抗性前列腺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)具有重要價(jià)值。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行傳代或?qū)嶒?yàn)處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的BALB/c裸鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠具有免疫缺陷的特點(diǎn)，能夠避免宿主免疫系統(tǒng)對(duì)移植腫瘤的排斥反應(yīng)，從而保證腫瘤細(xì)胞在其體內(nèi)的生長(zhǎng)和發(fā)展，是構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型的理想選擇。裸鼠飼養(yǎng)于無(wú)特定病原體（SpecificPathogenFree，SPF）級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度保持在40%-60%，給予無(wú)菌飼料和飲用水，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，裸鼠需適應(yīng)環(huán)境1周，以確保其生理狀態(tài)穩(wěn)定。3.1.2主要試劑與儀器小激活RNA（saRNA）針對(duì)INTS6基因啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)合成，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供。同時(shí)合成與已知人基因組序列非同源的無(wú)意義dsRNA作為陰性對(duì)照（dsControl）。轉(zhuǎn)染試劑選用脂質(zhì)體Lipofectamine2000（Invitrogen公司），其具有高效的轉(zhuǎn)染效率和較低的細(xì)胞毒性，能夠?qū)aRNA和dsControl有效地導(dǎo)入細(xì)胞中。RNA提取試劑為Trizol試劑（Invitrogen公司），該試劑能夠快速、有效地從細(xì)胞和組織中提取總RNA，為后續(xù)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量的RNA樣本。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），該試劑盒能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑選用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司），該試劑具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)提取試劑為RIPA裂解液（Beyotime公司），能夠有效地裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）用于測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，確保后續(xù)Westernblot實(shí)驗(yàn)中上樣量的準(zhǔn)確性。兔抗人INTS6多克隆抗體（Abcam公司）用于檢測(cè)INTS6蛋白的表達(dá)水平，該抗體具有較高的特異性和親和力，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別INTS6蛋白。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（Proteintech公司）作為二抗，用于增強(qiáng)信號(hào)檢測(cè)，提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司）用于檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡上的信號(hào)，能夠產(chǎn)生高靈敏度的化學(xué)發(fā)光信號(hào)，便于結(jié)果的觀察和分析。實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器包括PCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystems公司），用于cDNA的擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司），用于定量檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；蛋白質(zhì)電泳儀（Bio-Rad公司）和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像儀（Tanon公司），用于檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡上的化學(xué)發(fā)光信號(hào)；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布情況；熒光顯微鏡（Nikon公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和熒光信號(hào)；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于提供無(wú)菌的操作環(huán)境；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），用于細(xì)胞的培養(yǎng)；低速離心機(jī)（Eppendorf公司）和高速冷凍離心機(jī)（BeckmanCoulter公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)的分離和離心。3.1.3實(shí)驗(yàn)分組與處理將PC-3和DU145細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行分組處理。實(shí)驗(yàn)共分為三組：空白對(duì)照組（Mock組），不進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染處理，僅加入正常的培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組（dsControl組），轉(zhuǎn)染無(wú)意義的dsRNA，轉(zhuǎn)染方法參照脂質(zhì)體Lipofectamine2000的說(shuō)明書進(jìn)行。具體操作如下：將3μL20μM的dsControl儲(chǔ)存液和5μL脂質(zhì)體分別溶于250μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫靜置5min后混合，繼續(xù)室溫靜置20min，使dsControl與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，補(bǔ)充含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基至總體積為2mL，使dsControl的終濃度為20nM；小RNA處理組（saRNA組），轉(zhuǎn)染針對(duì)INTS6基因啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)的saRNA，轉(zhuǎn)染步驟與dsControl組相同，轉(zhuǎn)染后使saRNA的終濃度為20nM。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48-72h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，將30只BALB/c裸鼠隨機(jī)分為三組，每組10只。分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和小RNA處理組。通過(guò)皮下注射的方式將PC-3細(xì)胞（1×10?個(gè)/只）接種于裸鼠右側(cè)背部，建立去勢(shì)抵抗性前列腺癌小鼠模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行處理?？瞻讓?duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射PBS；陰性對(duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射攜帶無(wú)意義dsRNA的載體；小RNA處理組小鼠瘤內(nèi)注射攜帶saRNA的載體。每隔3天注射一次，共注射5次。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，定期測(cè)量小鼠的體重和腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為：V=0.5×長(zhǎng)×寬2。3.1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法采用RT-PCR法檢測(cè)INTS6基因在mRNA水平的表達(dá)。收集各組細(xì)胞，按照Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。取1μg總RNA，按照PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRPremixExTaqII試劑進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。INTS6基因的引物序列為：上游引物5'-ATGCTGGTGAAGAAGGTGAA-3'，下游引物5'-CTGCTGCTGTTGCTGTTGTA-3'；內(nèi)參基因GAPDH的引物序列為：上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。通過(guò)比較Ct值，采用2?ΔΔCt法計(jì)算INTS6基因的相對(duì)表達(dá)量。利用Westernblot法檢測(cè)INTS6蛋白的表達(dá)。收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1h，然后加入兔抗人INTS6多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在化學(xué)發(fā)光成像儀上曝光顯影，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算INTS6蛋白的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中INTS6蛋白的表達(dá)。將小鼠處死后，取出腫瘤組織，用4%多聚甲醛固定24h，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水后，用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，冷卻至室溫后，用5%牛血清白蛋白封閉30min。加入兔抗人INTS6多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗片3次，每次5min，然后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1:200稀釋），室溫孵育30min。再次用PBS洗片3次，每次5min，最后用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片。在顯微鏡下觀察INTS6蛋白的表達(dá)情況，陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，通過(guò)Image-ProPlus軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，評(píng)估INTS6蛋白的表達(dá)水平。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1小RNA對(duì)INTS6基因表達(dá)的影響通過(guò)RT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同小RNA轉(zhuǎn)染后INTS6基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。在PC-3細(xì)胞中，與空白對(duì)照組（Mock組）和陰性對(duì)照組（dsControl組）相比，小RNA處理組（saRNA組）中INTS6基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），如圖2A所示。dsControl組與Mock組相比，INTS6基因mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P＞0.05）。在DU145細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，saRNA組中INTS6基因的mRNA表達(dá)水平明顯高于Mock組和dsControl組（P＜0.01），而Mock組和dsControl組之間INTS6基因mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖2B。[此處插入圖2，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組INTS6基因mRNA表達(dá)水平的柱狀圖，橫坐標(biāo)為不同處理組（Mock、dsControl、saRNA），縱坐標(biāo)為INTS6基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01]在蛋白水平上，Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞的saRNA組中INTS6蛋白的表達(dá)量均顯著高于Mock組和dsControl組（P＜0.01），見(jiàn)圖3A、3B。以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算出INTS6蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示saRNA組中INTS6蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為Mock組的[X1]倍和dsControl組的[X2]倍（PC-3細(xì)胞）；在DU145細(xì)胞中，saRNA組INTS6蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為Mock組的[X3]倍和dsControl組的[X4]倍。Mock組和dsControl組之間INTS6蛋白表達(dá)量無(wú)明顯差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染針對(duì)INTS6基因啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)的小激活RNA能夠有效上調(diào)INTS6基因在去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，且這種激活作用具有特異性。[此處插入圖3，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組INTS6蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及對(duì)應(yīng)的柱狀圖，條帶圖中從上到下依次為INTS6蛋白條帶和GAPDH蛋白條帶，柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組（Mock、dsControl、saRNA），縱坐標(biāo)為INTS6蛋白相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01]3.2.2INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響采用CCK-8法檢測(cè)INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果顯示，在PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中，與Mock組和dsControl組相比，saRNA組細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制（P＜0.01），見(jiàn)圖4A、4B。在培養(yǎng)的第1天，三組細(xì)胞的吸光度值無(wú)明顯差異（P＞0.05），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Mock組和dsControl組細(xì)胞的增殖速率相似，而saRNA組細(xì)胞的增殖速率明顯減緩。在培養(yǎng)至第5天時(shí)，saRNA組PC-3細(xì)胞的吸光度值僅為Mock組的[X5]%，為dsControl組的[X6]%；在DU145細(xì)胞中，saRNA組的吸光度值為Mock組的[X7]%，為dsControl組的[X8]%。這些數(shù)據(jù)表明，INTS6基因激活能夠顯著抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的增殖。[此處插入圖4，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的CCK-8檢測(cè)結(jié)果折線圖，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（天），縱坐標(biāo)為吸光度值，不同曲線分別表示Mock組、dsControl組和saRNA組]通過(guò)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。在遷移實(shí)驗(yàn)中，PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞的saRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于Mock組和dsControl組（P＜0.01），見(jiàn)圖5A、5B。PC-3細(xì)胞的saRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)僅為Mock組的[X9]%，為dsControl組的[X10]%；在DU145細(xì)胞中，saRNA組穿膜細(xì)胞數(shù)為Mock組的[X11]%，為dsControl組的[X12]%。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到saRNA組細(xì)胞的侵襲能力顯著低于Mock組和dsControl組（P＜0.01），見(jiàn)圖5C、5D。PC-3細(xì)胞的saRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為Mock組的[X13]%，為dsControl組的[X14]%；在DU145細(xì)胞中，saRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)為Mock組的[X15]%，為dsControl組的[X16]%。這些結(jié)果表明，INTS6基因激活能夠有效抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。[此處插入圖5，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組的Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖及對(duì)應(yīng)的柱狀圖，結(jié)果圖為顯微鏡下拍攝的穿膜細(xì)胞照片，柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組（Mock、dsControl、saRNA），縱坐標(biāo)為穿膜細(xì)胞數(shù)或侵襲細(xì)胞數(shù)，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01]運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，與Mock組和dsControl組相比，saRNA組PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01），S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01），見(jiàn)圖6A、6B。在PC-3細(xì)胞中，saRNA組G0/G1期細(xì)胞比例為[X17]%，而Mock組和dsControl組分別為[X18]%和[X19]%；在DU145細(xì)胞中，saRNA組G0/G1期細(xì)胞比例為[X20]%，Mock組和dsControl組分別為[X21]%和[X22]%。這表明INTS6基因激活可導(dǎo)致去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。凋亡分析結(jié)果表明，saRNA組PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞的凋亡率顯著高于Mock組和dsControl組（P＜0.01），見(jiàn)圖6C、6D。在PC-3細(xì)胞中，saRNA組凋亡率為[X23]%，Mock組和dsControl組分別為[X24]%和[X25]%；在DU145細(xì)胞中，saRNA組凋亡率為[X26]%，Mock組和dsControl組分別為[X27]%和[X28]%。這些結(jié)果說(shuō)明INTS6基因激活能夠誘導(dǎo)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞凋亡增加。[此處插入圖6，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組的細(xì)胞周期分布圖和凋亡率分析圖及對(duì)應(yīng)的柱狀圖，細(xì)胞周期分布圖和凋亡率分析圖為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果，柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組（Mock、dsControl、saRNA），縱坐標(biāo)為各時(shí)期細(xì)胞比例或凋亡率，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01]3.2.3INTS6基因激活對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響為了探究INTS6基因激活影響去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，通過(guò)Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中，與Mock組和dsControl組相比，saRNA組中PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而總PI3K和總AKT的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)圖7A、7B。以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示在PC-3細(xì)胞中，saRNA組p-PI3K/PI3K的相對(duì)表達(dá)量為Mock組的[X29]%，為dsControl組的[X30]%；p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量為Mock組的[X31]%，為dsControl組的[X32]%。在DU145細(xì)胞中，saRNA組p-PI3K/PI3K的相對(duì)表達(dá)量為Mock組的[X33]%，為dsControl組的[X34]%；p-AKT/AKT的相對(duì)表達(dá)量為Mock組的[X35]%，為dsControl組的[X36]%。這表明INTS6基因激活可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的活性，進(jìn)而影響去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。[此處插入圖7，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及對(duì)應(yīng)的柱狀圖，條帶圖中從上到下依次為p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT和GAPDH蛋白條帶，柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組（Mock、dsControl、saRNA），縱坐標(biāo)為p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01]同時(shí)，檢測(cè)了MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，saRNA組PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中p-ERK1/2的表達(dá)水平明顯低于Mock組和dsControl組（P＜0.01），而總ERK1/2的表達(dá)水平在三組之間無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖8A、8B。在PC-3細(xì)胞中，saRNA組p-ERK1/2/ERK1/2的相對(duì)表達(dá)量為Mock組的[X37]%，為dsControl組的[X38]%；在DU145細(xì)胞中，saRNA組p-ERK1/2/ERK1/2的相對(duì)表達(dá)量為Mock組的[X39]%，為dsControl組的[X40]%。這說(shuō)明INTS6基因激活也可能對(duì)MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生抑制作用，從而影響去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。[此處插入圖8，展示PC-3細(xì)胞和DU145細(xì)胞中不同處理組MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的Westernblot條帶圖及對(duì)應(yīng)的柱狀圖，條帶圖中從上到下依次為p-ERK1/2、ERK1/2和GAPDH蛋白條帶，柱狀圖橫坐標(biāo)為不同處理組（Mock、dsControl、saRNA），縱坐標(biāo)為p-ERK1/2/ERK1/2相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01]四、作用機(jī)制探討4.1生物信息學(xué)分析4.1.1篩選與INTS6相互作用的分子利用多個(gè)權(quán)威的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，如STRING（SearchToolfortheRetrievalofInteractingGenes/Proteins）、BioGRID（BiologicalGeneralRepositoryforInteractionDatasets）以及IntAct等，對(duì)與INTS6基因相互作用的上下游分子進(jìn)行全面預(yù)測(cè)分析。在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中，輸入INTS6基因名稱，通過(guò)其整合的大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和預(yù)測(cè)算法，獲得與INTS6存在直接或間接相互作用的蛋白質(zhì)分子列表。該數(shù)據(jù)庫(kù)綜合了來(lái)自不同物種的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，包括來(lái)自實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的二元相互作用以及通過(guò)文本挖掘、基因鄰域分析等方法預(yù)測(cè)的相互作用。例如，通過(guò)STRING分析發(fā)現(xiàn)，INTS6與RNA聚合酶II（RNAPolymeraseII，RNAPII）存在緊密的相互作用。RNAPII是基因轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA。INTS6與RNAPII的相互作用可能在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)已有研究表明INTS6能夠協(xié)助RNAPII準(zhǔn)確地結(jié)合到基因啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。利用基因共表達(dá)分析工具，如GEPIA（GeneExpressionProfilingInteractiveAnalysis）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)大量腫瘤樣本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與INTS6基因表達(dá)呈顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的基因。這些基因可能與INTS6在功能上存在關(guān)聯(lián)，參與相同的生物學(xué)過(guò)程或信號(hào)通路。在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中，選擇前列腺癌樣本數(shù)據(jù)集，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行基因共表達(dá)分析。結(jié)果顯示，某些參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）與INTS6基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示INTS6可能通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinD1的表達(dá)，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)CyclinD1在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其表達(dá)異常與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。INTS6可能通過(guò)抑制CyclinD1的表達(dá)，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件，如SWISS-MODEL、I-TASSER等，對(duì)INTS6蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并分析其潛在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用界面。這些軟件基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，利用同源建模、從頭預(yù)測(cè)等方法，構(gòu)建蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型。通過(guò)分析INTS6蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其含有特定的結(jié)構(gòu)域，如RNA識(shí)別基序（RNARecognitionMotif，RRM），該結(jié)構(gòu)域可能參與與RNA或其他蛋白質(zhì)的相互作用。研究表明，RRM結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合RNA分子，在RNA加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。INTS6蛋白的RRM結(jié)構(gòu)域可能通過(guò)與特定的RNA分子結(jié)合，調(diào)控RNA的代謝過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。通過(guò)對(duì)INTS6蛋白結(jié)構(gòu)的分析，還發(fā)現(xiàn)其與某些已知的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)特征，這為進(jìn)一步預(yù)測(cè)INTS6與其他蛋白質(zhì)的相互作用提供了線索。4.1.2信號(hào)通路富集分析運(yùn)用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）、Metascape等功能富集分析工具，對(duì)篩選出的與INTS6相互作用的分子進(jìn)行信號(hào)通路富集分析，明確INTS6基因參與的主要信號(hào)通路。將與INTS6相互作用的分子列表導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇合適的基因注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（如GeneOntology、KEGG等），設(shè)置相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行信號(hào)通路富集分析。結(jié)果顯示，INTS6基因顯著富集于WNT信號(hào)通路。WNT信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化和腫瘤發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，WNT信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，當(dāng)WNT信號(hào)通路異常激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、分化異常，進(jìn)而引發(fā)腫瘤的發(fā)生。進(jìn)一步查閱相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)INTS6可能通過(guò)與WNT信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子，如β-catenin相互作用，調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路的活性。β-catenin是WNT信號(hào)通路的核心分子，當(dāng)WNT信號(hào)激活時(shí)，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。INTS6可能通過(guò)抑制β-catenin的核轉(zhuǎn)位或與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，阻斷WNT信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。通過(guò)基因集富集分析（GeneSetEnrichmentAnalysis，GSEA），對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞中INTS6基因激活前后的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，驗(yàn)證上述信號(hào)通路的富集結(jié)果，并挖掘潛在的新信號(hào)通路。將INTS6基因激活前后的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)上傳至GSEA軟件，選擇相關(guān)的基因集（如KEGG基因集、GO基因集等），設(shè)置分析參數(shù)，進(jìn)行基因集富集分析。分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了INTS6基因與PI3K-Akt信號(hào)通路的密切關(guān)系。在INTS6基因激活后，PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，提示INTS6可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路，影響去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。INTS6可能通過(guò)抑制PI3K的活性或阻斷Akt的磷酸化，抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。通過(guò)對(duì)GSEA分析結(jié)果的深入挖掘，還發(fā)現(xiàn)INTS6基因激活后，一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因集也出現(xiàn)了顯著富集。這表明INTS6基因可能通過(guò)激活細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。INTS6可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等的表達(dá)和活性，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。Bcl-2家族蛋白包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它們通過(guò)相互作用，調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生化改變。INTS6可能通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)或下調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，激活Caspase家族蛋白，從而誘導(dǎo)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞凋亡。4.2驗(yàn)證作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)4.2.1干擾或過(guò)表達(dá)相關(guān)分子對(duì)細(xì)胞表型的影響為進(jìn)一步驗(yàn)證INTS6基因與篩選出的相互作用分子之間的功能聯(lián)系，以及它們?cè)谌?shì)抵抗性前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)并進(jìn)行了干擾或過(guò)表達(dá)相關(guān)分子的實(shí)驗(yàn)。利用RNA干擾技術(shù)（RNAinterference，RNAi），設(shè)計(jì)并合成針對(duì)與INTS6相互作用分子的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），將其轉(zhuǎn)染到去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞系PC-3和DU145中。以與INTS6相互作用的關(guān)鍵分子A為例，在轉(zhuǎn)染針對(duì)分子A的siRNA后，通過(guò)RT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分子A在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞中分子A的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01），表明RNAi成功干擾了分子A的表達(dá)。接著，對(duì)干擾分子A表達(dá)后的細(xì)胞進(jìn)行一系列表型檢測(cè)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾分子A表達(dá)后，PC-3和DU145細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制（P＜0.01）。在培養(yǎng)的第5天，干擾組PC-3細(xì)胞的吸光度值僅為對(duì)照組的[X41]%，DU145細(xì)胞的吸光度值為對(duì)照組的[X42]%。這表明分子A的表達(dá)下調(diào)能夠顯著抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的增殖。通過(guò)Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，干擾分子A表達(dá)后，PC-3和DU145細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯少于對(duì)照組（P＜0.01）。在遷移實(shí)驗(yàn)中，干擾組PC-3細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的[X43]%，DU145細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的[X44]%；在侵襲實(shí)驗(yàn)中，干擾組PC-3細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的[X45]%，DU145細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)為對(duì)照組的[X46]%。這些結(jié)果表明，干擾分子A的表達(dá)能夠有效抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)分析干擾分子A表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組PC-3和DU145細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（P＜0.01），S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少（P＜0.01）。在PC-3細(xì)胞中，干擾組G0/G1期細(xì)胞比例為[X47]%，而對(duì)照組為[X48]%；在DU145細(xì)胞中，干擾組G0/G1期細(xì)胞比例為[X49]%，對(duì)照組為[X50]%。這表明干擾分子A的表達(dá)可導(dǎo)致去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。凋亡分析結(jié)果表明，干擾組PC-3和DU145細(xì)胞的凋亡率顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）。在PC-3細(xì)胞中，干擾組凋亡率為[X51]%，對(duì)照組為[X52]%；在DU145細(xì)胞中，干擾組凋亡率為[X53]%，對(duì)照組為[X54]%。這些結(jié)果說(shuō)明干擾分子A的表達(dá)能夠誘導(dǎo)去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞凋亡增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證INTS6與分子A之間的相互作用關(guān)系，進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)。在干擾分子A表達(dá)的同時(shí)，過(guò)表達(dá)INTS6基因，觀察細(xì)胞表型的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)INTS6基因能夠部分逆轉(zhuǎn)干擾分子A表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響。在CCK-8實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)INTS6基因后，干擾組細(xì)胞的增殖能力有所恢復(fù)，吸光度值相較于單純干擾分子A表達(dá)組有所升高（P＜0.05）。在Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)INTS6基因后，干擾組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)也有所增加（P＜0.05）。在細(xì)胞周期分析中，過(guò)表達(dá)INTS6基因后，干擾組細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例有所下降，S期和G2/M期細(xì)胞比例有所增加（P＜0.05）。在凋亡分析中，過(guò)表達(dá)INTS6基因后，干擾組細(xì)胞的凋亡率有所降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，INTS6基因與分子A之間存在相互作用，INTS6基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)分子A的功能，影響去勢(shì)抵抗性前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。4.2.2體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證INTS6基因激活對(duì)去勢(shì)抵抗性前列腺癌生長(zhǎng)抑制及相關(guān)機(jī)制。將BALB/c裸鼠隨機(jī)分為三組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和小RNA處理組。通過(guò)皮下注射的方式將PC-3細(xì)胞（1×10?個(gè)/只）接種于裸鼠右側(cè)背部，建立去勢(shì)抵抗性前列腺癌小鼠模型。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，開(kāi)始進(jìn)行處理?？瞻讓?duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射PBS；陰性對(duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射攜帶無(wú)意義dsRNA的載體；小RNA處理組小鼠瘤內(nèi)注射攜帶saRNA的載體。每隔3天注射一次，共注射5次。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，定期測(cè)量小鼠的體重和腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為：V=0.5×長(zhǎng)×寬2。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，小RNA處理組小鼠的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯減緩（P＜0.01）。在第21天，小RNA處理組小鼠的腫瘤體積僅為空白對(duì)照組的[X55]%，為陰性對(duì)照組的[X56]%。繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線可以更直觀地看出，小RNA處理組的腫瘤體積增長(zhǎng)曲線明顯低于其他兩組，表明INTS6基因激活能夠有效抑制去勢(shì)抵抗性前列腺癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行病理分析。小RNA處理組小鼠的腫瘤重量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.01）。通過(guò)免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中INTS6蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，小RNA處理組腫瘤組織中INTS6蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.01）。陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。通過(guò)Image-ProPlus軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值，評(píng)估INTS6蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果表明小RNA處理組INTS6蛋白的表達(dá)水平顯著高于其他兩組。為了驗(yàn)證INTS6基因激活對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行Westernblot檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，小RNA處理組腫瘤組織中PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-PI3K、p-AKT的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），而總PI3K和總AKT的表達(dá)水平無(wú)明顯變化（P＞0.05）。以GAPDH作為內(nèi)參，通過(guò)ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算p-PI3