小干擾RNA沉默YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響：機(jī)制與應(yīng)用探究一、引言1.1研究背景與意義牙周疾病作為口腔領(lǐng)域的多發(fā)病與常見病，嚴(yán)重威脅著人類的口腔健康。我國第四次全國口腔健康流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)令人擔(dān)憂，35-44歲中年組居民的牙周健康率僅為9.1%，55-63歲老年組居民的這一數(shù)值更是低至5%。牙周疾病主要是由牙菌斑生物膜引發(fā)的慢性炎癥，會(huì)致使牙周支持組織如牙齦、牙槽骨、牙周膜等遭到破壞，病情嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致牙齒松動(dòng)、脫落，極大地影響患者的咀嚼功能與生活質(zhì)量。例如，在一些老年人群體中，因牙周疾病導(dǎo)致牙齒缺失，使得他們在進(jìn)食時(shí)無法充分咀嚼食物，進(jìn)而影響消化吸收，對全身健康產(chǎn)生連鎖反應(yīng)。牙周組織再生是治療牙周疾病的關(guān)鍵目標(biāo)，而人牙周膜干細(xì)胞（humanperiodontalligamentstemcells,hPDLSCs）作為牙周組織工程的關(guān)鍵種子細(xì)胞，具有多向分化潛能與自我更新能力，在牙周組織修復(fù)中發(fā)揮著不可或缺的作用。在適宜的條件下，hPDLSCs能夠分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，這些細(xì)胞可以參與牙周組織的重建，促進(jìn)牙槽骨的再生、牙骨質(zhì)的形成以及牙周膜纖維的重塑，從而有效恢復(fù)牙周組織的結(jié)構(gòu)與功能。Yes相關(guān)蛋白（Yes-associatedprotein,YAP）作為Hippo信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及器官大小調(diào)控等諸多生物學(xué)過程中扮演著重要角色。在正常生理狀態(tài)下，YAP通過與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控一系列基因的表達(dá)，維持細(xì)胞的正常生理功能。在細(xì)胞增殖過程中，YAP可以促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，當(dāng)YAP的表達(dá)或活性出現(xiàn)異常時(shí)，就可能引發(fā)一系列疾病。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，YAP常常呈現(xiàn)過表達(dá)狀態(tài)，它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而推動(dòng)腫瘤的惡化。在牙周組織中，YAP同樣參與了牙周膜干細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控。研究表明，YAP的表達(dá)水平與牙周膜干細(xì)胞的增殖、分化能力密切相關(guān)，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。小干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）技術(shù)作為一種新興的基因沉默技術(shù)，能夠通過特異性地降解靶mRNA，高效、特異地抑制靶基因的表達(dá)，為研究基因功能和疾病治療開辟了新途徑。siRNA技術(shù)具有高度的特異性，能夠精確地針對目標(biāo)基因進(jìn)行沉默，避免對其他無關(guān)基因的干擾。同時(shí)，其操作相對簡便，可以通過多種方式將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對靶基因的有效調(diào)控。在腫瘤研究領(lǐng)域，siRNA技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于針對癌基因的沉默，為腫瘤的治療提供了新的策略。在針對某些具有特定致癌基因的腫瘤細(xì)胞系研究中，通過siRNA沉默該致癌基因，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在心血管疾病研究中，siRNA技術(shù)也被用于調(diào)控與心血管疾病相關(guān)基因的表達(dá)，為心血管疾病的治療帶來了新的希望。本研究旨在運(yùn)用小干擾RNA技術(shù)沉默YAP基因，深入探究其對人牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等方面。通過這一研究，有望揭示YAP基因在人牙周膜干細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制，為牙周疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。如果能夠明確YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞增殖和分化的具體調(diào)控機(jī)制，就可以通過調(diào)節(jié)YAP基因的表達(dá)，促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖和向牙周組織細(xì)胞的分化，從而加速牙周組織的修復(fù)和再生。這不僅有助于推動(dòng)牙周組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，還可能為廣大牙周疾病患者帶來更有效的治療方法，提高他們的生活質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在牙周疾病的治療研究中，人牙周膜干細(xì)胞因其獨(dú)特的生物學(xué)特性成為了焦點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了大量研究，在基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用方面均取得了顯著成果。國外在人牙周膜干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究方面起步較早，對其生物學(xué)特性的研究較為深入。有研究明確了人牙周膜干細(xì)胞在體外具有高度的自我更新能力，能夠在適宜的培養(yǎng)條件下不斷增殖，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了充足的細(xì)胞來源。并且，通過多種誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了人牙周膜干細(xì)胞可以分化為多種牙周組織細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，這為牙周組織再生提供了理論基礎(chǔ)。例如，[具體文獻(xiàn)1]的研究通過構(gòu)建三維培養(yǎng)體系，模擬牙周組織的微環(huán)境，成功誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞分化為具有功能的成骨細(xì)胞，為牙槽骨再生的研究提供了新的思路和方法。在臨床應(yīng)用研究方面，國外開展了多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，探索人牙周膜干細(xì)胞在牙周組織再生治療中的可行性和有效性。[具體文獻(xiàn)2]的臨床試驗(yàn)將人牙周膜干細(xì)胞與生物支架材料結(jié)合，植入牙周缺損部位，結(jié)果顯示牙周組織有明顯的再生跡象，患者的牙周狀況得到了顯著改善，為牙周疾病的治療提供了新的治療策略。國內(nèi)對人牙周膜干細(xì)胞的研究也在不斷發(fā)展，在細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定技術(shù)方面取得了重要進(jìn)展。國內(nèi)學(xué)者建立了多種高效的人牙周膜干細(xì)胞分離方法，如改良的酶消化法和組織塊培養(yǎng)法，能夠獲得高純度、高活性的人牙周膜干細(xì)胞。在鑒定技術(shù)方面，利用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光染色等技術(shù)，準(zhǔn)確地鑒定了人牙周膜干細(xì)胞的表面標(biāo)志物和生物學(xué)特性，為后續(xù)的研究提供了可靠的依據(jù)。在臨床應(yīng)用研究方面，國內(nèi)也開展了一系列探索性研究。[具體文獻(xiàn)3]的研究將人牙周膜干細(xì)胞與富血小板血漿聯(lián)合應(yīng)用于牙周組織再生治療，取得了較好的臨床效果，為牙周疾病的治療提供了新的聯(lián)合治療方案。Yes相關(guān)蛋白（YAP）作為Hippo信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，其功能研究也受到了廣泛關(guān)注。在細(xì)胞增殖方面，大量研究表明YAP在多種細(xì)胞中發(fā)揮著促進(jìn)增殖的作用。在腫瘤細(xì)胞中，YAP的過表達(dá)能夠激活一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖。[具體文獻(xiàn)4]的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，YAP通過與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞分化方面，YAP的作用機(jī)制較為復(fù)雜，不同細(xì)胞類型中其作用有所差異。在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中，YAP的活性變化會(huì)影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化方向。[具體文獻(xiàn)5]的研究表明，抑制YAP的活性可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，而增強(qiáng)YAP的活性則有利于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。在器官大小調(diào)控方面，YAP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡來維持器官的正常大小。[具體文獻(xiàn)6]的研究以果蠅為模型，發(fā)現(xiàn)YAP基因的缺失會(huì)導(dǎo)致果蠅器官發(fā)育不全，而YAP的過表達(dá)則會(huì)使器官過度生長，揭示了YAP在器官大小調(diào)控中的重要作用。小干擾RNA（siRNA）技術(shù)作為一種新興的基因沉默技術(shù)，在基因功能研究和疾病治療領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在基因功能研究方面，siRNA技術(shù)為深入探究基因的功能提供了有力工具。通過設(shè)計(jì)針對特定基因的siRNA，可以高效、特異地抑制該基因的表達(dá)，從而研究其在細(xì)胞生物學(xué)過程中的作用。[具體文獻(xiàn)7]的研究利用siRNA技術(shù)沉默了細(xì)胞中的某個(gè)基因，通過觀察細(xì)胞的表型變化和相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的改變，揭示了該基因在細(xì)胞凋亡過程中的調(diào)控機(jī)制。在疾病治療研究方面，siRNA技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力。在腫瘤治療領(lǐng)域，針對腫瘤相關(guān)基因的siRNA研究取得了一定進(jìn)展。[具體文獻(xiàn)8]的研究將針對癌基因的siRNA通過納米載體遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，成功抑制了癌基因的表達(dá)，抑制了腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，為腫瘤的治療提供了新的策略。然而，siRNA技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如siRNA的穩(wěn)定性、靶向性和遞送效率等問題，需要進(jìn)一步研究解決。雖然國內(nèi)外在人牙周膜干細(xì)胞、YAP基因功能及小干擾RNA技術(shù)的研究方面取得了一定進(jìn)展，但目前關(guān)于YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究仍存在不足。現(xiàn)有研究對于YAP基因在人牙周膜干細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，不同研究之間的結(jié)果也存在一定差異。在小干擾RNA技術(shù)應(yīng)用于牙周領(lǐng)域的研究中，如何提高siRNA的轉(zhuǎn)染效率和穩(wěn)定性，以及如何實(shí)現(xiàn)其在牙周組織中的靶向遞送，仍是亟待解決的問題。本研究旨在通過小干擾RNA沉默YAP基因，深入探究其對人牙周膜干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，進(jìn)一步揭示YAP基因在人牙周膜干細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，為牙周疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在運(yùn)用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)，沉默人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）中的YAP基因，深入探究YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉?xì)胞生物學(xué)行為的影響，包括細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等方面。通過對這些生物學(xué)行為變化的研究，揭示YAP基因在人牙周膜干細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制，為牙周疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。同時(shí)，本研究也希望通過對siRNA技術(shù)在人牙周膜干細(xì)胞中的應(yīng)用研究，為該技術(shù)在牙周領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用提供參考，推動(dòng)牙周組織工程和再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)步。1.3.2研究內(nèi)容本研究將從以下幾個(gè)方面展開：hPDLSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定：采用組織塊法或酶消化法從人牙周膜組織中分離hPDLSCs，利用含胎牛血清、維生素C、L-谷胺酰胺、青霉素、鏈霉素的達(dá)爾貝科極限培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。通過觀察細(xì)胞形態(tài)、檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD44、CD90、CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物，以及PDLSCs特異性標(biāo)志物），對培養(yǎng)的hPDLSCs進(jìn)行鑒定，確保所獲得的細(xì)胞為hPDLSCs且具有良好的生物學(xué)活性。siRNA轉(zhuǎn)染及干擾效率檢測：設(shè)計(jì)并合成針對YAP基因的siRNA序列，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hPDLSCs。同時(shí)設(shè)置陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）和空白對照組（未轉(zhuǎn)染任何siRNA）。轉(zhuǎn)染后，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和Westernblot檢測YAP基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，以確定siRNA對YAP基因的干擾效率，篩選出干擾效果最佳的siRNA序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。YAP基因沉默對hPDLSCs增殖能力的影響：使用細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒（CCK-8）檢測siRNA轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)（如1天、3天、5天、7天）hPDLSCs的增殖能力。繪制細(xì)胞生長曲線，比較實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染YAP-siRNA）、陰性對照組和空白對照組細(xì)胞的增殖情況，分析YAP基因沉默對hPDLSCs增殖能力的影響。此外，通過EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，直觀地觀察細(xì)胞的DNA合成情況，進(jìn)一步驗(yàn)證YAP基因沉默對hPDLSCs增殖的影響。YAP基因沉默對hPDLSCs凋亡的影響：采用流式細(xì)胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染后hPDLSCs的凋亡率和細(xì)胞周期分布。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，分析YAP基因沉默是否誘導(dǎo)hPDLSCs凋亡以及對細(xì)胞凋亡率的影響。同時(shí)，檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）的表達(dá)變化，探討YAP基因沉默影響hPDLSCs凋亡的可能機(jī)制。YAP基因沉默對hPDLSCs分化能力的影響：在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和/or成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染YAP-siRNA的hPDLSCs，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞和/或脂肪細(xì)胞分化。通過檢測成骨相關(guān)標(biāo)志物（如堿性磷酸酶（ALP）活性、骨鈣素（OCN）表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)形成等）和成脂相關(guān)標(biāo)志物（如脂滴形成、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）表達(dá)等），分析YAP基因沉默對hPDLSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化能力的影響。此外，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測成骨和成脂分化相關(guān)信號通路關(guān)鍵分子（如BMP-2、Runx2、PPARγ等）的表達(dá)變化，深入探討YAP基因沉默影響hPDLSCs分化的分子機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1人牙周膜干細(xì)胞人牙周膜干細(xì)胞（humanperiodontalligamentstemcells,hPDLSCs）是一類存在于牙周膜中的成體干細(xì)胞，在牙周組織的發(fā)育、維持和修復(fù)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。牙周膜作為連接牙齒和牙槽骨的結(jié)締組織，富含多種細(xì)胞成分，其中hPDLSCs因其獨(dú)特的生物學(xué)特性成為牙周組織工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。hPDLSCs主要來源于牙周膜組織，在牙齒發(fā)育完成后，它們靜息于牙周膜的特定微環(huán)境中。當(dāng)牙周組織受到損傷或處于修復(fù)狀態(tài)時(shí)，hPDLSCs被激活，展現(xiàn)出強(qiáng)大的再生能力。從來源部位來看，牙周膜的不同區(qū)域可能存在具有不同特性的hPDLSCs亞群，例如靠近血管和神經(jīng)周圍的hPDLSCs可能具有更高的增殖和分化潛能，這與它們所處的富含營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子的微環(huán)境密切相關(guān)。在分離培養(yǎng)方面，目前常用的方法包括組織塊法和酶消化法。組織塊法是將獲取的牙周膜組織剪成小塊，接種于培養(yǎng)皿中，待組織塊貼壁后，細(xì)胞從組織塊邊緣爬出并逐漸增殖。該方法操作相對簡單，對細(xì)胞的損傷較小，能夠較好地保留細(xì)胞的原始特性，但缺點(diǎn)是細(xì)胞爬出速度較慢，培養(yǎng)周期較長，且容易受到組織塊中雜質(zhì)的污染。酶消化法則是利用膠原酶、Dispase酶等將牙周膜組織消化成單細(xì)胞懸液，然后進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法能夠快速獲得大量單細(xì)胞，細(xì)胞生長速度較快，但酶的消化作用可能會(huì)對細(xì)胞表面的一些標(biāo)志物和生物學(xué)活性產(chǎn)生一定影響。為了提高細(xì)胞的純度和活性，還可以結(jié)合使用密度梯度離心法、免疫磁珠法和流式細(xì)胞分選技術(shù)等進(jìn)行細(xì)胞的分離和純化。密度梯度離心法利用細(xì)胞與其他雜質(zhì)在密度上的差異，通過離心將hPDLSCs分離出來；免疫磁珠法和流式細(xì)胞分選技術(shù)則是根據(jù)hPDLSCs表面特異性標(biāo)志物，使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的精準(zhǔn)分離。hPDLSCs具有多向分化潛能，在適宜的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為多種牙周組織細(xì)胞。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，hPDLSCs可以表達(dá)成骨相關(guān)標(biāo)志物，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）等，并逐漸分化為成骨細(xì)胞，參與牙槽骨的再生和修復(fù)。研究表明，在成骨誘導(dǎo)過程中，一些信號通路如Wnt/β-catenin信號通路、BMP信號通路等被激活，調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化。在成牙骨質(zhì)誘導(dǎo)條件下，hPDLSCs能夠分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，合成牙骨質(zhì)基質(zhì)，促進(jìn)牙骨質(zhì)的形成。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過添加特定的生長因子和細(xì)胞因子，如釉基質(zhì)蛋白等，可以誘導(dǎo)hPDLSCs向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化，形成類似天然牙骨質(zhì)的結(jié)構(gòu)。hPDLSCs還具有分化為成纖維細(xì)胞的能力，參與牙周膜纖維的合成和重建，維持牙周膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。自我更新能力也是hPDLSCs的重要生物學(xué)特性之一。自我更新是指干細(xì)胞能夠通過對稱分裂或不對稱分裂產(chǎn)生與自身相同的子代干細(xì)胞，從而維持干細(xì)胞池的穩(wěn)定。hPDLSCs在體外培養(yǎng)過程中，能夠不斷增殖，保持其干細(xì)胞特性。研究發(fā)現(xiàn)，hPDLSCs的自我更新能力受到多種因素的調(diào)控，包括細(xì)胞內(nèi)的信號通路、轉(zhuǎn)錄因子以及細(xì)胞外的微環(huán)境等。Notch信號通路在hPDLSCs的自我更新中發(fā)揮著重要作用，激活Notch信號通路可以促進(jìn)hPDLSCs的自我更新，抑制其分化；而抑制Notch信號通路則會(huì)促使hPDLSCs向特定細(xì)胞方向分化。細(xì)胞外基質(zhì)中的成分如膠原蛋白、纖連蛋白等也可以通過與hPDLSCs表面的整合素受體相互作用，影響細(xì)胞的黏附、增殖和自我更新。hPDLSCs在牙周組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。牙周疾病常導(dǎo)致牙周組織的破壞，包括牙槽骨吸收、牙周膜損傷和牙骨質(zhì)缺失等，嚴(yán)重影響患者的口腔健康和生活質(zhì)量。hPDLSCs作為牙周組織再生的種子細(xì)胞，可以與生物支架材料和生長因子結(jié)合，構(gòu)建組織工程化牙周組織，用于牙周疾病的治療。將hPDLSCs接種于具有良好生物相容性和降解性的支架材料上，如膠原、羥基磷灰石等，然后植入牙周缺損部位，hPDLSCs可以在支架上增殖、分化，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)牙周組織的再生和修復(fù)。生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）等可以與hPDLSCs協(xié)同作用，進(jìn)一步促進(jìn)牙周組織的再生。BMP可以誘導(dǎo)hPDLSCs向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)牙槽骨的再生；bFGF則可以促進(jìn)hPDLSCs的增殖和遷移，加速牙周組織的修復(fù)過程。在一些臨床前研究和臨床試驗(yàn)中，已經(jīng)初步驗(yàn)證了hPDLSCs在牙周組織再生治療中的有效性和安全性，為牙周疾病的治療提供了新的策略和方法。2.2YAP基因Yes相關(guān)蛋白（Yes-associatedprotein,YAP）基因編碼的YAP蛋白是Hippo信號通路的關(guān)鍵下游效應(yīng)因子，在多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Hippo信號通路是一條在進(jìn)化上高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從果蠅到哺乳動(dòng)物，其核心組成和功能都具有相似性。在哺乳動(dòng)物中，Hippo信號通路主要由一系列蛋白激酶組成，包括Mst1/2（哺乳動(dòng)物Ste20樣激酶1/2）、Lats1/2（大腫瘤抑制激酶1/2）等。在正常生理狀態(tài)下，當(dāng)細(xì)胞接收到上游信號刺激時(shí)，Mst1/2被激活，進(jìn)而磷酸化并激活Lats1/2?；罨腖ats1/2可以磷酸化YAP蛋白的多個(gè)位點(diǎn)，使其與14-3-3蛋白結(jié)合，從而將YAP蛋白滯留在細(xì)胞質(zhì)中，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，阻斷YAP蛋白與下游靶基因的相互作用，調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程。當(dāng)Hippo信號通路失活時(shí)，YAP蛋白不能被磷酸化，它會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD（TEA結(jié)構(gòu)域家族成員）等結(jié)合，形成YAP-TEAD復(fù)合物，進(jìn)而激活一系列與細(xì)胞增殖、存活和分化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。這些基因包括細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、富含半胱氨酸的血管生成誘導(dǎo)因子61（Cyr61）等。CyclinD1是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，它可以促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。CTGF和Cyr61則參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成和細(xì)胞間的信號傳遞，對細(xì)胞的生長、遷移和分化具有重要影響。在腫瘤細(xì)胞中，Hippo信號通路常常失活，導(dǎo)致YAP蛋白過度激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。YAP基因?qū)?xì)胞增殖的調(diào)控是其重要功能之一。在多種細(xì)胞類型中，YAP基因的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。在肝細(xì)胞中，YAP基因的過表達(dá)可以促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖，加速肝臟的再生過程。研究表明，YAP-TEAD復(fù)合物可以直接結(jié)合到CyclinD1基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而增加CyclinD1蛋白的表達(dá)水平，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。相反，當(dāng)YAP基因被沉默或其活性被抑制時(shí)，細(xì)胞增殖會(huì)受到明顯抑制。在成纖維細(xì)胞中，抑制YAP基因的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期，細(xì)胞增殖速度減慢。這是因?yàn)閅AP基因的缺失會(huì)影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如降低CyclinD1的表達(dá)，同時(shí)增加細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞的增殖。在細(xì)胞凋亡方面，YAP基因也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。正常情況下，YAP蛋白可以通過與凋亡相關(guān)蛋白的相互作用，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。YAP蛋白可以與凋亡抑制蛋白Survivin相互作用，增強(qiáng)Survivin的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如氧化應(yīng)激、DNA損傷等，Hippo信號通路被激活，YAP蛋白被磷酸化并滯留在細(xì)胞質(zhì)中，失去對Survivin的調(diào)控作用，導(dǎo)致Survivin表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡增加。在一些腫瘤細(xì)胞中，YAP基因的異常激活可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使其對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。而通過抑制YAP基因的表達(dá)，可以恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞分化是細(xì)胞發(fā)育過程中的重要事件，YAP基因在這一過程中也扮演著關(guān)鍵角色。在不同的細(xì)胞分化過程中，YAP基因的作用機(jī)制有所不同。在神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中，YAP基因的活性變化會(huì)影響神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化方向。當(dāng)YAP基因的活性被抑制時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞更傾向于向神經(jīng)元方向分化；而當(dāng)YAP基因的活性增強(qiáng)時(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞則更容易向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。這是因?yàn)閅AP-TEAD復(fù)合物可以調(diào)控一系列與神經(jīng)干細(xì)胞分化相關(guān)的基因表達(dá)，如Neurog1、Sox2等。Neurog1是促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而Sox2則在維持神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新和向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。在成骨細(xì)胞分化過程中，YAP基因也參與了調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，YAP-TEAD復(fù)合物可以結(jié)合到成骨相關(guān)基因Runx2的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)Runx2的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。相反，抑制YAP基因的表達(dá)會(huì)降低Runx2的表達(dá)水平，抑制成骨細(xì)胞的分化。YAP基因在細(xì)胞遷移過程中也具有重要作用。細(xì)胞遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞骨架的重組、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用等多個(gè)環(huán)節(jié)。YAP基因可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性，影響細(xì)胞的遷移能力。YAP-TEAD復(fù)合物可以激活RhoA等小GTP酶的表達(dá)，RhoA可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)細(xì)胞的遷移。在腫瘤細(xì)胞中，YAP基因的過表達(dá)常常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，這與YAP基因?qū)?xì)胞遷移相關(guān)基因的調(diào)控密切相關(guān)。抑制YAP基因的表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。在人牙周膜干細(xì)胞中，YAP基因同樣參與了細(xì)胞的生物學(xué)行為調(diào)控。研究表明，YAP基因在人牙周膜干細(xì)胞中的表達(dá)水平與細(xì)胞的增殖、分化能力密切相關(guān)。在人牙周膜干細(xì)胞的增殖過程中，YAP基因可能通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。當(dāng)YAP基因的表達(dá)被沉默時(shí)，人牙周膜干細(xì)胞的增殖速度明顯減慢，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)也顯著降低。在人牙周膜干細(xì)胞的分化過程中，YAP基因可能通過調(diào)節(jié)成骨、成脂等分化相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化方向。在成骨誘導(dǎo)條件下，YAP基因的過表達(dá)可以促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，增加成骨相關(guān)標(biāo)志物堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素（OCN）的表達(dá)；而抑制YAP基因的表達(dá)則會(huì)抑制人牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。在成脂誘導(dǎo)條件下，YAP基因的表達(dá)變化也會(huì)影響人牙周膜干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化能力。然而，目前關(guān)于YAP基因在人牙周膜干細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，仍需要進(jìn)一步深入研究。2.3小干擾RNA技術(shù)小干擾RNA（smallinterferingRNA,siRNA）是一類長度約為21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptionalgenesilencing,PTGS）機(jī)制中發(fā)揮著核心作用。其結(jié)構(gòu)特征獨(dú)特，由兩條互補(bǔ)的RNA鏈組成，分別稱為正義鏈（sensestrand）和反義鏈（antisensestrand），兩條鏈的兩端通常各有2個(gè)核苷酸的突出。這種結(jié)構(gòu)是由長雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)被核糖核酸酶III（RNaseIII）家族成員Dicer酶切割而成。Dicer酶能夠識別并結(jié)合長dsRNA，將其精確切割成具有特定長度和結(jié)構(gòu)的siRNA雙鏈體。在植物中，Dicer酶家族成員參與了多種小RNA的生成過程，其中Dicer-like2（DCL2）、Dicer-like3（DCL3）和Dicer-like4（DCL4）在不同的生物過程中發(fā)揮作用，它們對dsRNA的切割特異性和生成的小RNA長度有所差異。在動(dòng)物細(xì)胞中，Dicer酶以類似的方式作用于長dsRNA，產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的siRNA，為后續(xù)的RNA干擾（RNAi）過程提供了關(guān)鍵的分子基礎(chǔ)。小干擾RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的生物學(xué)過程。當(dāng)siRNA進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)與多種蛋白質(zhì)組裝形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）。在RISC中，siRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)被解旋，其中反義鏈作為引導(dǎo)鏈，與RISC中的核心蛋白Argonaute結(jié)合，而正義鏈則被降解。結(jié)合了反義鏈的RISC在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著靶向識別和降解mRNA的作用。RISC通過反義鏈與目標(biāo)mRNA上互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行堿基配對，從而特異性地識別目標(biāo)mRNA。一旦識別成功，RISC中的Argonaute蛋白會(huì)發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的活性，在與反義鏈互補(bǔ)配對的位點(diǎn)處切割目標(biāo)mRNA。被切割后的mRNA片段會(huì)迅速被細(xì)胞內(nèi)的核酸外切酶進(jìn)一步降解，從而導(dǎo)致目標(biāo)基因的mRNA無法進(jìn)行正常的翻譯過程，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的沉默。在植物的抗病毒防御過程中，病毒入侵植物細(xì)胞后，其基因組中的雙鏈RNA區(qū)域會(huì)被植物細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶切割成病毒來源的siRNA（vsiRNA）。這些vsiRNA隨后組裝成RISC，通過識別并降解病毒的mRNA，有效抑制病毒的復(fù)制和傳播，保護(hù)植物免受病毒侵害。在動(dòng)物細(xì)胞中，RNAi機(jī)制也參與了細(xì)胞的正常生理調(diào)控過程，如細(xì)胞分化、發(fā)育等。在胚胎發(fā)育過程中，特定的siRNA可以通過RNAi機(jī)制調(diào)控某些基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的分化方向和組織器官的形成。小干擾RNA技術(shù)在基因功能研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。由于siRNA能夠特異性地沉默目標(biāo)基因的表達(dá)，研究人員可以利用這一特性，通過設(shè)計(jì)針對特定基因的siRNA，將其導(dǎo)入細(xì)胞或生物體中，觀察目標(biāo)基因表達(dá)被抑制后細(xì)胞或生物體的表型變化。在研究某一基因在細(xì)胞增殖過程中的作用時(shí)，科研人員可以設(shè)計(jì)針對該基因的siRNA，轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。如果細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，如細(xì)胞生長速度減慢、細(xì)胞周期停滯等，就可以推斷該基因在細(xì)胞增殖過程中可能發(fā)揮著促進(jìn)作用。通過進(jìn)一步檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化、細(xì)胞信號通路的激活情況等，還可以深入探究該基因影響細(xì)胞增殖的具體分子機(jī)制。在研究基因與疾病的關(guān)系時(shí)，siRNA技術(shù)也為揭示疾病的發(fā)病機(jī)制提供了有力工具。在腫瘤研究中，許多癌基因的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。利用siRNA技術(shù)沉默這些癌基因的表達(dá)，可以觀察腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的變化，從而深入了解癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。對一些具有特定致癌基因的腫瘤細(xì)胞系，如乳腺癌細(xì)胞系中過度表達(dá)的HER2基因，通過轉(zhuǎn)染針對HER2基因的siRNA，可以顯著抑制HER2基因的表達(dá)，進(jìn)而觀察到腫瘤細(xì)胞的增殖能力下降、遷移和侵襲能力減弱等表型變化。這不僅有助于揭示HER2基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，還為乳腺癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)和治療策略。在疾病治療方面，小干擾RNA技術(shù)展現(xiàn)出了巨大的潛力。針對一些由特定基因異常表達(dá)引起的疾病，如腫瘤、病毒感染性疾病、遺傳性疾病等，通過設(shè)計(jì)特異性的siRNA來沉默致病基因的表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)疾病的治療。在腫瘤治療中，除了針對癌基因的siRNA治療策略外，還可以通過沉默腫瘤細(xì)胞中與耐藥相關(guān)的基因，提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。在某些對化療藥物耐藥的腫瘤細(xì)胞中，多藥耐藥蛋白（MDR）的高表達(dá)是導(dǎo)致耐藥的重要原因之一。利用siRNA技術(shù)沉默MDR基因的表達(dá)，可以降低腫瘤細(xì)胞對化療藥物的外排能力，提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而增強(qiáng)化療藥物的療效。在病毒感染性疾病治療中，siRNA可以靶向病毒的關(guān)鍵基因，抑制病毒的復(fù)制和傳播。針對乙型肝炎病毒（HBV）感染，科研人員設(shè)計(jì)了針對HBV基因的siRNA，在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中，這些siRNA能夠有效沉默HBV基因的表達(dá)，抑制病毒的復(fù)制，為乙型肝炎的治療提供了新的思路和方法。在遺傳性疾病治療方面，對于一些單基因遺傳病，如囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞貧血等，通過siRNA技術(shù)沉默突變基因的表達(dá)，有可能緩解疾病的癥狀。然而，小干擾RNA技術(shù)在臨床應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如siRNA的穩(wěn)定性較差，在體內(nèi)易被核酸酶降解；siRNA的靶向遞送效率較低，難以準(zhǔn)確地將其遞送至目標(biāo)細(xì)胞或組織；siRNA可能引發(fā)免疫反應(yīng)等。為了解決這些問題，科研人員正在不斷探索新的技術(shù)和方法，如對siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性，開發(fā)新型的遞送載體以提高靶向遞送效率，優(yōu)化siRNA的設(shè)計(jì)以降低免疫原性等。通過對siRNA的核苷酸進(jìn)行化學(xué)修飾，如甲基化、硫代磷酸化等，可以增強(qiáng)siRNA對核酸酶的抗性，延長其在體內(nèi)的半衰期。開發(fā)基于納米材料的遞送載體，如脂質(zhì)納米粒、聚合物納米粒等，可以有效地包裹siRNA，保護(hù)其免受核酸酶的降解，并通過靶向配體的修飾實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)胞或組織的特異性遞送。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料人牙周膜干細(xì)胞：選取因正畸拔除的健康年輕恒牙，經(jīng)患者知情同意后，采用組織塊法從牙周膜組織中分離培養(yǎng)獲得人牙周膜干細(xì)胞。將獲取的牙周膜組織剪成約1mm3大小的組織塊，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞爬出并融合至80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)選用第3-5代細(xì)胞，以保證細(xì)胞的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性。小干擾RNA（siRNA）：針對YAP基因設(shè)計(jì)并合成3條特異性siRNA序列（siRNA-YAP-1、siRNA-YAP-2、siRNA-YAP-3）以及陰性對照siRNA（siRNA-NC），均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。其序列信息如下：名稱序列（5'-3'）siRNA-YAP-1正義鏈：GCUACAGUUUCCUACUGUUTT；反義鏈：AACAGUAGGAACUGUAGCTTsiRNA-YAP-2正義鏈：GGAUGACUUCUGGUUCUUUTT；反義鏈：AAAGAACCAGAAGUCAUCCTTsiRNA-YAP-3正義鏈：CCAAUACUUGACUACAGUUTT；反義鏈：AACUGUAGUCAAGUAUUGGTTsiRNA-NC正義鏈：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；反義鏈：ACGUGACACGUUCGGAGAATT脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑：采用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國），用于將siRNA轉(zhuǎn)染至人牙周膜干細(xì)胞中。該試劑能夠與siRNA形成復(fù)合物，通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)基及相關(guān)試劑：α-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），用于人牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)；胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國），為細(xì)胞生長提供營養(yǎng)物質(zhì)；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（100×，Solarbio公司，中國），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%，含酚紅，Gibco公司，美國），用于細(xì)胞的消化傳代；磷酸鹽緩沖液（PBS，Solarbio公司，中國），用于細(xì)胞的洗滌和重懸。細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒：采用CCK-8試劑盒（Dojindo公司，日本），用于檢測細(xì)胞的增殖活性。CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測450nm處的吸光度值，即可反映細(xì)胞的增殖情況。EdU標(biāo)記試劑盒：采用EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（RiboBio公司，中國），用于直觀地觀察細(xì)胞的DNA合成情況。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中，通過與熒光染料標(biāo)記的疊氮化物發(fā)生點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，即可在熒光顯微鏡下觀察到增殖細(xì)胞。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：采用AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司，美國），用于檢測細(xì)胞的凋亡情況。AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV能夠與外翻的PS特異性結(jié)合，而碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，能夠穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，即可區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測試劑盒：采用細(xì)胞周期檢測試劑盒（Beyotime公司，中國），用于檢測細(xì)胞周期分布。該試劑盒利用PI對細(xì)胞內(nèi)的DNA進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀檢測不同DNA含量的細(xì)胞比例，從而分析細(xì)胞周期的分布情況。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基：由α-MEM培養(yǎng)基、10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉、50μg/mL維生素C和100nmol/L地塞米松組成，用于誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基：由DMEM高糖培養(yǎng)基、10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、1μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）、10μg/mL胰島素和200μmol/L吲哚美辛組成，用于誘導(dǎo)人牙周膜干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）相關(guān)試劑：RNA提取試劑盒（Trizol法，Invitrogen公司，美國），用于提取細(xì)胞中的總RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser，TaKaRa公司，日本），用于將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYBRPremixExTaq?II，TaKaRa公司，日本），用于進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，YAP基因及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列如下：基因引物序列（5'-3'）產(chǎn)物長度（bp）YAP正向：CCAGCTGGTGAAGAAGAAGA；反向：CAGCAGAAGACCCACATCAG128GAPDH正向：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC；反向：GAAGATGGTGATGGGATTTC147蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）相關(guān)試劑：細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液，含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，Beyotime公司，中國），用于裂解細(xì)胞提取總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime公司，中國），用于測定蛋白濃度；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司，中國），用于制備SDS-PAGE凝膠；轉(zhuǎn)膜緩沖液、封閉液、TBST緩沖液等均為自行配制；一抗YAP抗體（1:1000，CellSignalingTechnology公司，美國）、GAPDH抗體（1:5000，Proteintech公司，中國）；二抗山羊抗兔IgG-HRP（1:5000，Proteintech公司，中國）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore公司，美國），用于檢測蛋白條帶。主要儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國），為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國），提供無菌操作環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離；PCR儀（Bio-Rad公司，美國），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國），用于檢測基因的表達(dá)水平；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司，美國），用于檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司，美國），用于檢測CCK-8實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），用于觀察和分析Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）的分離采用組織塊法。選取因正畸拔除的健康年輕恒牙，經(jīng)患者知情同意后，在無菌條件下將牙齒從牙槽窩中完整取出，用含雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL）的PBS溶液反復(fù)沖洗3次，以去除牙齒表面的雜質(zhì)和細(xì)菌。使用銳利的眼科器械小心地刮取牙根中1/3的牙周膜組織，將其剪成約1mm3大小的組織塊，均勻地接種于25cm2培養(yǎng)瓶中。向培養(yǎng)瓶中加入3mL含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使組織塊均勻分布，然后將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每3天更換一次培養(yǎng)基，以去除代謝產(chǎn)物，補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的生長環(huán)境穩(wěn)定。待組織塊周圍有細(xì)胞爬出并融合至80%-90%時(shí)，進(jìn)行首次傳代。傳代時(shí)，先用PBS溶液沖洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)，然后加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液2mL，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-3min，期間在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞變圓且開始脫離瓶壁時(shí)，立即加入等體積含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從瓶壁上完全脫落并形成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液，再用適量含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3的比例接種于新的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。后續(xù)每3-4天傳代一次，實(shí)驗(yàn)選用第3-5代細(xì)胞，此時(shí)的細(xì)胞具有良好的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性，更適合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞形態(tài)觀察是鑒定hPDLSCs的重要方法之一。在倒置顯微鏡下，觀察不同代數(shù)hPDLSCs的形態(tài)特征。原代培養(yǎng)的hPDLSCs剛從組織塊爬出時(shí)，形態(tài)多樣，包括長梭形、多邊形等。隨著細(xì)胞的增殖和傳代，細(xì)胞逐漸呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，呈長梭形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央。細(xì)胞排列緊密，呈漩渦狀或放射狀生長。通過觀察細(xì)胞形態(tài)，可以初步判斷細(xì)胞的生長狀態(tài)和是否符合hPDLSCs的特征。流式細(xì)胞術(shù)是一種精確檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的技術(shù)，用于進(jìn)一步鑒定hPDLSCs。收集第3代hPDLSCs，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化成單細(xì)胞懸液，PBS溶液洗滌2次，以去除殘留的胰蛋白酶和雜質(zhì)，然后將細(xì)胞重懸于含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液于流式管中，分別加入適量的小鼠抗人CD44-FITC、CD90-PE、CD105-APC、CD34-PE、CD45-APC單克隆抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用含1%BSA的PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的抗體，然后將細(xì)胞重懸于500μL含1%BSA的PBS溶液中，立即使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。分析軟件用于分析細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，結(jié)果顯示hPDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD90、CD105，表達(dá)率均大于95%，而幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45，表達(dá)率均小于5%，符合hPDLSCs的表型特征。免疫組化也是鑒定hPDLSCs的常用方法。將第3代hPDLSCs接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞融合至70%-80%時(shí)，取出蓋玻片，用PBS溶液洗滌3次，每次5min，以去除殘留的培養(yǎng)基。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)和抗原結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。固定后，用PBS溶液洗滌3次，每次5min，以去除多余的多聚甲醛。加入0.3%TritonX-100溶液通透細(xì)胞10min，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。通透后，用PBS溶液洗滌3次，每次5min，以去除TritonX-100。加入5%山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)30min，減少非特異性染色。封閉后，傾去血清，不洗，直接加入稀釋好的小鼠抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，用PBS溶液洗滌3次，每次5min，以去除未結(jié)合的一抗。加入山羊抗小鼠IgG-HRP二抗（1:500稀釋），室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS溶液洗滌3次，每次5min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，使用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽性染色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核5min，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，便于觀察細(xì)胞形態(tài)。用梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察，hPDLSCs呈現(xiàn)Vimentin陽性表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色，進(jìn)一步證實(shí)了所培養(yǎng)的細(xì)胞為hPDLSCs。3.2.2小干擾RNA沉默YAP基因的轉(zhuǎn)染小干擾RNA（siRNA）序列的設(shè)計(jì)與合成是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。借助專業(yè)的生物信息學(xué)軟件，如BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool），對人YAP基因的mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001144306.2）進(jìn)行全面分析。依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)的基本原則，包括避免與其他基因的同源序列互補(bǔ)、選擇GC含量在30%-50%之間的區(qū)域等，精心設(shè)計(jì)3條針對YAP基因不同位點(diǎn)的特異性siRNA序列（siRNA-YAP-1、siRNA-YAP-2、siRNA-YAP-3）以及1條陰性對照siRNA（siRNA-NC）。將設(shè)計(jì)好的序列提交給上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，合成后的siRNA經(jīng)高效液相色譜（HPLC）純化，確保其純度和質(zhì)量。通過紫外分光光度計(jì)測定siRNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明siRNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前，需對人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行準(zhǔn)備。將第3代人牙周膜干細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。此時(shí)的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，對轉(zhuǎn)染試劑和siRNA的耐受性較強(qiáng)，有利于提高轉(zhuǎn)染效率。脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染是將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的常用方法。按照Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌的EP管中，將10μLLipofectamine?2000試劑加入到250μL無血清α-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min，使脂質(zhì)體充分活化。在另一個(gè)EP管中，將20pmol的siRNA加入到250μL無血清α-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻。然后，將上述兩種溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使siRNA與脂質(zhì)體形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在復(fù)合物孵育期間，用PBS溶液輕輕沖洗6孔板中的細(xì)胞2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后每孔加入800μL無血清α-MEM培養(yǎng)基。將孵育好的siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物緩慢加入到6孔板中，輕輕搖勻，使復(fù)合物均勻分布在細(xì)胞表面。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h，使復(fù)合物充分被細(xì)胞攝取。4-6h后，吸出含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，需進(jìn)行篩選。轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。待細(xì)胞貼壁后，加入終濃度為1μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行篩選。每隔3天更換一次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周。在篩選過程中，未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染不成功的細(xì)胞會(huì)逐漸死亡，而成功轉(zhuǎn)染并整合了siRNA的細(xì)胞則能夠在嘌呤霉素的選擇壓力下存活并增殖。待細(xì)胞形成明顯的單克隆集落后，用胰蛋白酶消化并轉(zhuǎn)移至24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，最終獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染YAP-siRNA的細(xì)胞株。對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行鑒定，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測YAP基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，確保YAP基因被有效沉默。3.2.3檢測指標(biāo)與方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是檢測基因表達(dá)水平的常用技術(shù)。轉(zhuǎn)染48h后，使用RNA提取試劑盒（Trizol法）提取各組細(xì)胞的總RNA。具體操作如下：在6孔板中，每孔加入1mLTrizol試劑，吹打均勻，使細(xì)胞充分裂解。室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。加入200μL***，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min。4℃，12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。小心吸取上層水相至新的EP管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。4℃，12000rpm離心10min，棄去上清液，可見管底有白色的RNA沉淀。用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，4℃，7500rpm離心5min，棄去上清液。將RNA沉淀在室溫下晾干5-10min，待乙醇完全揮發(fā)后，加入適量的DEPC水溶解RNA。使用分光光度計(jì)測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間，表明RNA質(zhì)量良好。取1μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）的說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括5×PrimeScriptBuffer2μL、PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL、OligodTPrimer0.5μL、Random6mers0.5μL、總RNA1μg，用DEPC水補(bǔ)足至10μL。反應(yīng)條件為37℃15min，85℃5s。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（SYBRPremixExTaq?II）進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRPremixExTaq?II10μL、上下游引物（10μM）各0.8μL、cDNA模板2μL，用ddH?O補(bǔ)足至20μL。引物序列如下：YAP基因正向引物CCAGCTGGTGAAGAAGAAGA，反向引物CAGCAGAAGACCCACATCAG，產(chǎn)物長度128bp；內(nèi)參基因GAPDH正向引物GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，反向引物GAAGATGGTGATGGGATTTC，產(chǎn)物長度147bp。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算YAP基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化處理。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對照組），相對表達(dá)量=2?ΔΔCt。通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組中YAP基因的相對表達(dá)量，可評估siRNA對YAP基因的沉默效果。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）用于檢測蛋白表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48h后，棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入150μL細(xì)胞裂解液（RIPA裂解液，含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管中，4℃，12000rpm離心15min，取上清液，即為總蛋白提取物。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白濃度。取30μg總蛋白，加入適量的5×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓為80V，電泳30min，使蛋白樣品在濃縮膠中充分濃縮；分離膠電壓為120V，電泳1-2h，使不同分子量的蛋白質(zhì)在分離膠中充分分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為恒流300mA，轉(zhuǎn)膜1.5-2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉1h，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的封閉液。加入一抗YAP抗體（1:1000稀釋）和GAPDH抗體（1:5000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。加入二抗山羊抗兔IgG-HRP（1:5000稀釋），室溫孵育1h。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，分析蛋白條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算YAP蛋白的相對表達(dá)量。細(xì)胞增殖活性檢測采用CCK-8法。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)1天、3天、5天、7天后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4h。在培養(yǎng)過程中，CCK-8試劑中的WST-8在細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的作用下被還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。使用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。通過比較不同組細(xì)胞的生長曲線，分析YAP基因沉默對細(xì)胞增殖活性的影響。EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)用于直觀觀察細(xì)胞的DNA合成情況。轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每孔加入1mL含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作。首先，將EdU工作液加入到培養(yǎng)基中，使EdU終濃度為10μM，繼續(xù)培養(yǎng)2h。EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖過程中摻入到新合成的DNA中。2h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除未摻入的EdU。然后加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)和DNA結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定。固定后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除多余的多聚甲醛。加入0.5%TritonX-100溶液通透細(xì)胞10min，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與EdU結(jié)合。通透后，用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，每次5min，以去除TritonX-100。加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1人牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果采用組織塊法成功從人牙周膜組織中分離出hPDLSCs。原代培養(yǎng)時(shí)，在倒置顯微鏡下觀察，接種后的牙周膜組織塊在培養(yǎng)2-3天后，可見有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。起初，爬出的細(xì)胞形態(tài)多樣，包括長梭形、多邊形等，細(xì)胞數(shù)量較少，呈散在分布。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸增多，形態(tài)也逐漸趨于一致，呈現(xiàn)出典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，即長梭形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中央。細(xì)胞生長迅速，相互連接，排列緊密，逐漸形成細(xì)胞單層，并呈現(xiàn)出漩渦狀或放射狀生長的特點(diǎn)。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞的形態(tài)依然保持長梭形，且生長狀態(tài)良好，增殖速度較快。在第3-5代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，生物學(xué)活性高，適合用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對第3代hPDLSCs進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物檢測，采用流式細(xì)胞術(shù)分析其表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，hPDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD90、CD105，表達(dá)率分別為（98.5±1.2）%、（97.8±1.0）%、（96.9±1.5）%，而幾乎不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34和CD45，表達(dá)率分別為（1.5±0.5）%、（2.0±0.8）%，符合hPDLSCs的表型特征。通過免疫組化檢測hPDLSCs中波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)。在顯微鏡下觀察，可見hPDLSCs呈現(xiàn)Vimentin陽性表達(dá)，細(xì)胞胞質(zhì)染成棕黃色，而細(xì)胞核未被染色，呈現(xiàn)藍(lán)色（蘇木精復(fù)染結(jié)果）。陽性表達(dá)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了所培養(yǎng)的細(xì)胞為hPDLSCs，因?yàn)閂imentin是間充質(zhì)來源細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，hPDLSCs作為間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，表達(dá)Vimentin。為了驗(yàn)證hPDLSCs的多向分化能力，將其分別在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)分化。在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，采用堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色檢測成骨分化情況。ALP染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞呈現(xiàn)陽性染色，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量棕黑色沉淀，表明細(xì)胞內(nèi)ALP活性升高，而對照組細(xì)胞染色較淺。茜素紅染色結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞形成了大量紅色的礦化結(jié)節(jié)，表明細(xì)胞發(fā)生了礦化，具有成骨分化能力，而對照組幾乎無礦化結(jié)節(jié)形成。在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后，采用油紅O染色檢測成脂分化情況。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，表明細(xì)胞成功分化為脂肪細(xì)胞，而對照組細(xì)胞內(nèi)幾乎無脂滴形成。這些結(jié)果表明，所分離培養(yǎng)的hPDLSCs具有多向分化能力，能夠在特定誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。4.2小干擾RNA沉默YAP基因的效果轉(zhuǎn)染48h后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot分別檢測各組細(xì)胞中YAP基因在mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，以此評估小干擾RNA對YAP基因的沉默效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染YAP-siRNA的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中YAP基因的mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。其中，siRNA-YAP-2組的沉默效果最為顯著，YAP基因的mRNA相對表達(dá)量僅為空白對照組的（25.6±3.2）%，陰性對照組的（26.8±3.5）%。siRNA-YAP-1組和siRNA-YAP-3組的YAP基因mRNA相對表達(dá)量也明顯低于空白對照組和陰性對照組，分別為空白對照組的（38.5±4.0）%、（42.3±4.5）%，陰性對照組的（40.3±4.2）%、（44.5±4.8）%。這表明設(shè)計(jì)合成的3條YAP-siRNA均能夠有效降低YAP基因在mRNA水平的表達(dá)，其中siRNA-YAP-2的干擾效果最佳。各組YAP基因mRNA相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表1。組別YAP基因mRNA相對表達(dá)量（\overline{X}±S）空白對照組1.00±0.05陰性對照組0.98±0.06siRNA-YAP-1組0.38±0.04^{**}siRNA-YAP-2組0.26±0.03^{**}siRNA-YAP-3組0.42±0.05^{**}注：與空白對照組和陰性對照組比較，^{**}P<0.01蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果一致。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，分析YAP蛋白條帶的灰度值，計(jì)算YAP蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中YAP蛋白的相對表達(dá)量顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.01）。siRNA-YAP-2組的YAP蛋白相對表達(dá)量最低，僅為空白對照組的（28.5±3.8）%，陰性對照組的（30.2±4.0）%。siRNA-YAP-1組和siRNA-YAP-3組的YAP蛋白相對表達(dá)量也明顯低于空白對照組和陰性對照組，分別為空白對照組的（40.8±4.5）%、（45.6±5.0）%，陰性對照組的（43.0±4.7）%、（48.0±5.2）%。這進(jìn)一步證實(shí)了siRNA能夠有效沉默YAP基因的表達(dá)，且siRNA-YAP-2在蛋白質(zhì)水平的干擾效果最為顯著。各組YAP蛋白相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表2。組別YAP蛋白相對表達(dá)量（\overline{X}±S）空白對照組1.00±0.06陰性對照組0.97±0.07siRNA-YAP-1組0.41±0.05^{**}siRNA-YAP-2組0.29±0.04^{**}siRNA-YAP-3組0.46±0.05^{**}注：與空白對照組和陰性對照組比較，^{**}P<0.01綜合實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot的檢測結(jié)果，可以得出結(jié)論：設(shè)計(jì)合成的小干擾RNA能夠高效、特異地沉默人牙周膜干細(xì)胞中的YAP基因，在mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著降低YAP的表達(dá)，且siRNA-YAP-2的沉默效果最佳，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA-YAP-2進(jìn)行研究。4.3對人牙周膜干細(xì)胞增殖活性的影響采用CCK-8法檢測YAP基因沉默對人牙周膜干細(xì)胞增殖活性的影響。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，分別在培養(yǎng)1天、3天、5天、7天后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2-4h，使用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值（OD值），以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果如圖1所示。圖1：各組細(xì)胞生長曲線。與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活性顯著降低（P<0.01）從細(xì)胞生長曲線可以看出，在培養(yǎng)的第1天，空白對照組、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值無明顯差異（P>0.05），說明轉(zhuǎn)染操作對細(xì)胞的初始狀態(tài)沒有顯著影響。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，空白對照組和陰性對照組細(xì)胞的增殖速度逐漸加快，OD值逐漸增大，呈現(xiàn)出典型的細(xì)胞對數(shù)生長趨勢。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度明顯慢于空白對照組和陰性對照組，在培養(yǎng)的第3天、5天和7天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的OD值均顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.01）。這表明沉默YAP基因能夠顯著抑制人牙周膜干細(xì)胞的增殖活性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，采用EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)直觀地觀察細(xì)胞的DNA合成情況。轉(zhuǎn)染48h后，將細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后，加入EdU工作液繼續(xù)培養(yǎng)2h，然后進(jìn)行EdU染色，在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示。圖2：EdU染色結(jié)果。A：空白對照組；B：陰性對照組；C：實(shí)驗(yàn)組。紅色熒光表示EdU陽性細(xì)胞，即處于DNA合成期的細(xì)胞；藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核（DAPI染色）。與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組EdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少在熒光顯微鏡下，紅色熒光表示EdU陽性細(xì)胞，即處于DNA合成期的細(xì)胞；藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核（DAPI染色）。從圖中可以明顯看出，空白對照組和陰性對照組中EdU陽性細(xì)胞數(shù)量較多，表明這兩組細(xì)胞中有較多細(xì)胞處于DNA合成期，細(xì)胞增殖活躍。而實(shí)驗(yàn)組中EdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，說明沉默YAP基因后，人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞增殖受到抑制，這與CCK-8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。為了探究YAP基因沉默抑制人牙周膜干細(xì)胞增殖的機(jī)制，檢測了細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）方法檢測細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。圖3：細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平。A：Westernblot蛋白條帶圖；B：CyclinD1和p21蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析。與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低，p21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）從圖中可以看出，與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中CyclinD1蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），而p21蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。CyclinD1是細(xì)胞周期G1期向S期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，從而釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，啟動(dòng)與DNA合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以與CDK-Cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)展。因此，YAP基因沉默后，CyclinD1蛋白表達(dá)降低，p21蛋白表達(dá)升高，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，細(xì)胞增殖受到抑制。綜上所述，小干擾RNA沉默YAP基因能夠顯著抑制人牙周膜干細(xì)胞的增殖活性，其機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1和p21的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期有關(guān)。4.4對人牙周膜干細(xì)胞凋亡的影響采用流式細(xì)胞術(shù)檢測YAP基因沉默對人牙周膜干細(xì)胞凋亡的影響。轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞，用AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行染色，然后使用流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。結(jié)果如圖4所示。圖4：各組細(xì)胞凋亡率。A：流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果散點(diǎn)圖；B：凋亡率統(tǒng)計(jì)分析。與空白對照組和陰性對照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.01）從流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果散點(diǎn)圖可以看出，空白對照組和陰性對照組中，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）的比例較低，而實(shí)驗(yàn)組中早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例明顯增加。凋亡率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率