2025ASM臨床微生物實(shí)驗(yàn)室實(shí)用指南：二相型真菌的抗體和抗原檢測(cè)方法精準(zhǔn)檢測(cè)，守護(hù)健康防線目錄第一章第二章第三章第四章二相型真菌檢測(cè)概述血清抗體檢測(cè)技術(shù)抗原檢測(cè)方法分子診斷技術(shù)目錄第五章第六章第七章實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范驗(yàn)證與報(bào)告新技術(shù)應(yīng)用展望二相型真菌檢測(cè)概述1.常見(jiàn)病原真菌種類組織胞漿菌（Histoplasmacapsulatum）：主要流行于美洲和非洲，可引起肺部感染和播散性疾病，免疫抑制患者感染風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。球孢子菌（Coccidioidesimmitis/posadasii）：常見(jiàn)于美國(guó)西南部和拉丁美洲干旱地區(qū)，感染后可能引發(fā)慢性肺炎或全身播散。芽生菌（Blastomycesdermatitidis/gilchristii）：分布于北美五大湖及密西西比河流域，可導(dǎo)致皮膚、骨骼和肺部病變，臨床表現(xiàn)多樣?？贵w抗原檢測(cè)臨床意義抗原檢測(cè)（如尿/血清GM試驗(yàn)）可在感染初期（1-2周）檢出真菌成分，彌補(bǔ)培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)的缺陷。早期診斷價(jià)值動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)抗原水平（如組織胞漿菌尿抗原）可評(píng)估治療反應(yīng)，指導(dǎo)臨床調(diào)整抗真菌方案。療效監(jiān)測(cè)作用抗體檢測(cè)（如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)）有助于追溯流行區(qū)域暴露史，輔助鑒別活動(dòng)性感染與既往感染。流行病學(xué)篩查基于臨床場(chǎng)景的選擇急性播散性感染：優(yōu)先采用抗原檢測(cè)（如組織胞漿菌尿抗原靈敏度＞90%），聯(lián)合血清抗體檢測(cè)（如免疫擴(kuò)散試驗(yàn)）提高特異性。慢性局限性感染：推薦抗體檢測(cè)（如球孢子菌IgG抗體）為主，必要時(shí)輔以分子檢測(cè)或組織病理學(xué)檢查。技術(shù)性能考量靈敏度與特異性平衡：酶免疫法（EIA）抗原檢測(cè)靈敏度高但可能交叉反應(yīng)（如與副球孢子菌），需結(jié)合臨床和地理暴露史解讀。操作便捷性：側(cè)流免疫層析法（LFA）適用于資源有限地區(qū)，但需驗(yàn)證與本地流行菌株的兼容性。檢測(cè)方法選擇原則血清抗體檢測(cè)技術(shù)2.血清樣本需離心去除纖維蛋白原和細(xì)胞碎片，避免干擾抗原抗體反應(yīng)，必要時(shí)進(jìn)行稀釋以優(yōu)化檢測(cè)靈敏度。樣本預(yù)處理使用1.5%瓊脂糖凝膠鋪板，打孔后中央孔加入已知真菌抗原，周圍孔加入待測(cè)血清，確?？组g距標(biāo)準(zhǔn)化（通常4-6mm）。瓊脂板制備在濕潤(rùn)環(huán)境中25℃孵育48-72小時(shí)，觀察沉淀線形成，需避免溫度波動(dòng)導(dǎo)致假陰性。孵育條件沉淀線的清晰度、數(shù)量及與對(duì)照孔的位置關(guān)系可判斷抗體效價(jià)，需與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清比對(duì)確認(rèn)特異性。結(jié)果判讀免疫擴(kuò)散法操作流程補(bǔ)體系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化使用豚鼠補(bǔ)體時(shí)需預(yù)先滴定活性，避免過(guò)量補(bǔ)體導(dǎo)致假陽(yáng)性或不足導(dǎo)致假陰性，保存于-70℃防止失活?？乖贵w復(fù)合物形成將患者血清與已知真菌抗原混合后加入補(bǔ)體，37℃水浴30分鐘，需同步設(shè)立補(bǔ)體對(duì)照和溶血系統(tǒng)對(duì)照。溶血指示系統(tǒng)加入致敏羊紅細(xì)胞后，觀察未結(jié)合的補(bǔ)體介導(dǎo)的溶血程度，完全溶血提示陰性結(jié)果，需嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間（通常45分鐘）。010203補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)要點(diǎn)第二季度第一季度第四季度第三季度包被抗原選擇二抗標(biāo)記系統(tǒng)顯色與終止質(zhì)量控制使用純化的真菌細(xì)胞壁成分（如H抗原或M抗原）包被96孔板，4℃過(guò)夜后PBST洗滌3次，封閉非特異性位點(diǎn)需用5%脫脂牛奶。采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG/IgM二抗，優(yōu)化稀釋比例（通常1:5000-1:10000）以平衡信噪比。TMB底物孵育10-15分鐘后，2M硫酸終止反應(yīng)，450nm測(cè)OD值，臨界值計(jì)算需結(jié)合ROC曲線確定。每板需包含陽(yáng)性對(duì)照（國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)血清）、陰性對(duì)照（健康人血清）及空白對(duì)照，CV值應(yīng)<15%。酶聯(lián)免疫吸附標(biāo)準(zhǔn)步驟抗原檢測(cè)方法3.要點(diǎn)三高靈敏度檢測(cè)尿/血清抗原檢測(cè)是目前診斷二相型真菌感染的主要方法之一，具有較高的靈敏度，尤其適用于早期感染的篩查和診斷，能夠檢測(cè)到低濃度的真菌抗原。要點(diǎn)一要點(diǎn)二特異性差異不同二相型真菌的抗原檢測(cè)特異性存在差異，例如組織胞漿菌和球孢子菌的抗原檢測(cè)特異性較高，而芽生菌的檢測(cè)可能存在交叉反應(yīng)，需結(jié)合臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷。樣本處理要求尿/血清抗原檢測(cè)對(duì)樣本處理要求嚴(yán)格，需避免樣本污染或降解，否則可能導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果，建議在采集后盡快進(jìn)行檢測(cè)或適當(dāng)保存。要點(diǎn)三尿/血清抗原檢測(cè)01乳膠凝集試驗(yàn)是一種快速篩查方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)（通常15-30分鐘）提供初步結(jié)果，適用于臨床急需快速診斷的情況，如急診或重癥患者。快速篩查工具02該方法操作相對(duì)簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜儀器，適合資源有限的實(shí)驗(yàn)室使用，但需嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行，以避免人為誤差影響結(jié)果準(zhǔn)確性。操作簡(jiǎn)便性03乳膠凝集試驗(yàn)的靈敏度通常低于酶免疫分析法（EIA），可能漏檢低濃度抗原的樣本，因此陰性結(jié)果不能完全排除感染，需結(jié)合其他檢測(cè)方法進(jìn)一步確認(rèn)。靈敏度限制04乳膠凝集試驗(yàn)可能存在與其他真菌或細(xì)菌抗原的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，需結(jié)合患者病史和其他實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合評(píng)估。交叉反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)乳膠凝集快速檢測(cè)抗原定量分析抗原定量分析能夠提供抗原濃度的具體數(shù)值，有助于監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和治療效果，尤其在免疫抑制患者中具有重要臨床意義。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)價(jià)值不同實(shí)驗(yàn)室或檢測(cè)平臺(tái)的定量結(jié)果可能存在差異，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)化參考范圍，因此建議在同一實(shí)驗(yàn)室連續(xù)監(jiān)測(cè)以保持結(jié)果可比性。標(biāo)準(zhǔn)化挑戰(zhàn)抗原定量分析通常需要專業(yè)儀器和技術(shù)人員操作，檢測(cè)周期相對(duì)較長(zhǎng)，成本較高，適合有條件的大型臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。技術(shù)復(fù)雜性分子診斷技術(shù)4.靶標(biāo)基因選擇PCR檢測(cè)針對(duì)二相型真菌特有的保守基因序列（如ITS、18SrRNA或β-微管蛋白基因），通過(guò)特異性引物實(shí)現(xiàn)病原體核酸的定向擴(kuò)增，確保檢測(cè)的特異性。熱循環(huán)機(jī)制利用變性-退火-延伸的循環(huán)過(guò)程，在DNA聚合酶作用下指數(shù)級(jí)擴(kuò)增目標(biāo)片段，熒光標(biāo)記探針或SYBRGreen染料實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)定量分析。內(nèi)參系統(tǒng)設(shè)計(jì)引入內(nèi)源性對(duì)照（如人類β-球蛋白基因）監(jiān)測(cè)樣本質(zhì)量，同時(shí)設(shè)置外源性陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，排除假陰性和污染干擾。PCR檢測(cè)原理引物設(shè)計(jì)改良采用嵌套式PCR或多重PCR策略，通過(guò)二級(jí)擴(kuò)增提高靈敏度，或同步檢測(cè)多種二相型真菌（如組織胞漿菌、球孢子菌），減少交叉反應(yīng)。抑制劑去除技術(shù)在DNA提取階段加入玻璃珠破碎法或酶消化步驟，結(jié)合硅膠膜純化柱有效去除臨床樣本（如支氣管肺泡灌洗液）中的多糖、血紅素等PCR抑制劑。反應(yīng)體系調(diào)整優(yōu)化Mg2?濃度（1.5-3.0mM）、dNTP比例及退火溫度梯度（55-65℃），平衡擴(kuò)增效率與特異性，降低非特異性條帶產(chǎn)生風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量采用TaqMan探針與淬滅基團(tuán)的FRET效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)Ct值與真菌載量的線性關(guān)聯(lián)，動(dòng)態(tài)范圍可達(dá)1×101-1×10?拷貝/μL。核酸擴(kuò)增優(yōu)化Sanger測(cè)序應(yīng)用對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，通過(guò)BLAST比對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（覆蓋≥500bp讀長(zhǎng)），要求序列同源性>98%方可確認(rèn)菌種，尤其適用于罕見(jiàn)二相型真菌鑒定。針對(duì)混合感染或低載量樣本，采用宏基因組測(cè)序（如IlluminaMiSeq）進(jìn)行廣譜篩查，通過(guò)生物信息學(xué)過(guò)濾宿主序列，提高深部真菌病檢出率。設(shè)置測(cè)序深度閾值（如≥100×），采用Phred質(zhì)量評(píng)分（Q≥30）保障堿基識(shí)別準(zhǔn)確性，并通過(guò)重復(fù)測(cè)序驗(yàn)證單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。二代測(cè)序輔助質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)建立測(cè)序驗(yàn)證方案實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范5.輸入標(biāo)題采集時(shí)間控制樣本類型選擇優(yōu)先采集血清或腦脊液樣本用于抗體檢測(cè)，而尿液或支氣管肺泡灌洗液更適合抗原檢測(cè)，需根據(jù)臨床懷疑的真菌類型選擇最佳樣本。采集時(shí)嚴(yán)格消毒防止環(huán)境真菌污染，尤其是呼吸道樣本需避免口腔定植菌干擾。樣本需在4℃下保存并24小時(shí)內(nèi)送檢，若延遲需冷凍于-70℃；避免反復(fù)凍融導(dǎo)致抗原降解或抗體效價(jià)下降。急性期樣本（癥狀出現(xiàn)后1-2周內(nèi)）抗體檢測(cè)敏感性較低，建議在病程2-4周后復(fù)測(cè)；抗原檢測(cè)則需在抗真菌治療前完成采集以避免假陰性。無(wú)菌操作規(guī)范運(yùn)輸保存條件樣本采集處理標(biāo)準(zhǔn)保存至少2年的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，包括每日校準(zhǔn)曲線、試劑批號(hào)及操作人員信息，便于審計(jì)和偏差分析。質(zhì)控記錄追溯每批次檢測(cè)需包含陽(yáng)性和陰性質(zhì)控品，且陽(yáng)性值需落在廠商提供的臨界值±2SD范圍內(nèi)。內(nèi)控品頻率除廠商質(zhì)控外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期使用CAP或WHO標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度與特異性。第三方驗(yàn)證質(zhì)控品使用要求閾值界定結(jié)合臨床背景判斷臨界值（如光密度指數(shù)≥1.5為陽(yáng)性），對(duì)于灰區(qū)結(jié)果（0.8-1.5）建議重復(fù)檢測(cè)或補(bǔ)充分子學(xué)方法確認(rèn)。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)意義抗體滴度4倍升高或抗原水平下降50%以上具有臨床價(jià)值，單一時(shí)間點(diǎn)結(jié)果需謹(jǐn)慎解讀。假陽(yáng)性處理類風(fēng)濕因子干擾可能導(dǎo)致抗體假陽(yáng)性，需采用IgG/IgM分離檢測(cè)或預(yù)處理樣本消除干擾。交叉反應(yīng)評(píng)估注意組織胞漿菌抗原與馬爾尼菲藍(lán)狀菌的交叉反應(yīng)（約15%-20%），需結(jié)合地域流行病史輔助鑒別。結(jié)果解讀標(biāo)準(zhǔn)流程驗(yàn)證與報(bào)告6.方法學(xué)驗(yàn)證要點(diǎn)需通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床樣本驗(yàn)證檢測(cè)方法的最低檢出限（LOD）和交叉反應(yīng)率，確保對(duì)目標(biāo)二相型真菌（如組織胞漿菌、球孢子菌）的特異性識(shí)別能力，避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。靈敏度與特異性驗(yàn)證需在不同批次、不同操作人員及設(shè)備條件下進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性，確保實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果可比性。重復(fù)性與再現(xiàn)性評(píng)估需評(píng)估血清、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等不同樣本基質(zhì)對(duì)檢測(cè)性能的影響，優(yōu)化前處理步驟以降低干擾。樣本類型適應(yīng)性非目標(biāo)真菌干擾測(cè)試針對(duì)曲霉菌、念珠菌等常見(jiàn)真菌進(jìn)行交叉反應(yīng)測(cè)試，驗(yàn)證抗體或抗原檢測(cè)試劑的專一性。宿主因素干擾分析評(píng)估類風(fēng)濕因子、異嗜性抗體等內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)檢測(cè)的潛在影響，必要時(shí)采用阻斷劑或稀釋法消除干擾。地理流行株覆蓋驗(yàn)證針對(duì)不同地域流行的二相型真菌變異株（如球孢子菌的Coccidioidesposadasii和C.immitis），驗(yàn)證檢測(cè)方法的廣譜性。交叉反應(yīng)排除結(jié)果解讀框架明確標(biāo)注檢測(cè)方法（如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)）及臨界值（Cut-off值），區(qū)分陰性、灰區(qū)（equivocal）和陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)合患者臨床癥狀、影像學(xué)檢查及流行病學(xué)史，提供分層解讀建議（如“高滴度抗體提示活動(dòng)性感染”或“抗原陽(yáng)性需排除標(biāo)本污染”）。標(biāo)準(zhǔn)化格式要求包含樣本信息（采集時(shí)間、類型）、檢測(cè)項(xiàng)目、方法學(xué)、結(jié)果數(shù)值/定性描述及參考范圍，符合CLSI/ASM指南的規(guī)范化模板。附加備注欄說(shuō)明局限性（如“陰性結(jié)果不能完全排除感染”或“需結(jié)合培養(yǎng)/PCR結(jié)果綜合判斷”），避免臨床誤讀。臨床報(bào)告模板新技術(shù)應(yīng)用展望7.高通量檢測(cè)系統(tǒng)自動(dòng)化平臺(tái)通過(guò)整合樣本處理、抗原/抗體檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析模塊，顯著提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)效率，減少人工操作誤差，尤其適用于大規(guī)模篩查場(chǎng)景。人工智能輔助判讀結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行智能分析，可識(shí)別復(fù)雜抗體交叉反應(yīng)模式，提高對(duì)低濃度抗原的檢測(cè)靈敏度，減少假陰性結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)化流程控制自動(dòng)化系統(tǒng)通過(guò)內(nèi)置質(zhì)控模塊和校準(zhǔn)程序，確保不同批次檢測(cè)結(jié)果的可比性，降低實(shí)驗(yàn)室間變異系數(shù)，滿足CAP/CLIA認(rèn)證要求。自動(dòng)化平臺(tái)進(jìn)展多重免疫分析技術(shù)采用Luminex或MSD平臺(tái)同步檢測(cè)多種真菌抗原（如H/M抗原、β-葡聚糖、半乳甘露聚糖），通過(guò)信號(hào)放大系統(tǒng)提升對(duì)混合感染的鑒別能力?？贵w譜系分析聯(lián)合檢測(cè)IgG/IgM/IgE亞型及特異性抗體表位，可區(qū)分活動(dòng)性感染與既往暴露，輔助判斷疾病階段和治療響應(yīng)。交叉反應(yīng)消除方案通過(guò)預(yù)吸附柱去除類風(fēng)濕因子等干擾物質(zhì)，結(jié)合阻斷抗體技術(shù)，顯著降低組織胞漿菌與芽生菌的血清學(xué)交叉反應(yīng)率。生物標(biāo)志物組合策略將GXM抗原檢測(cè)與(1→3)-β-D-葡聚糖測(cè)定相結(jié)合，可提高隱球菌與其它二相型真菌的鑒別診斷