小麥microRNA的鑒定、特性分析及功能探究一、引言1.1研究背景與意義小麥（TriticumaestivumL.）作為世界上種植最廣泛的作物之一，是人類重要的主食來(lái)源，為全球人口提供了約20%的能量。在中國(guó)，小麥的種植歷史可以追溯到幾千年前，早在新石器時(shí)代就已開(kāi)始種植，是主要的糧食作物之一，尤其在北方地區(qū)，小麥成為主要的主食作物，制作成面條、饅頭等各種面食，對(duì)保障糧食安全起著關(guān)鍵作用。小麥的生長(zhǎng)發(fā)育受到多種內(nèi)外因素的精細(xì)調(diào)控，其中基因表達(dá)調(diào)控在這一過(guò)程中扮演著核心角色。在基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，microRNA（miRNA）作為一類重要的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度通常在21-24個(gè)核苷酸之間，發(fā)揮著不可或缺的作用。自首次在秀麗隱桿線蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，miRNA已成為生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在植物中，miRNA通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，介導(dǎo)靶mRNA的切割或抑制其翻譯過(guò)程，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這種調(diào)控方式參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，從種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)器官的發(fā)育，到生殖生長(zhǎng)、開(kāi)花結(jié)果等過(guò)程。例如，在擬南芥中，miR156通過(guò)靶向調(diào)控SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）基因家族，影響植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變以及花器官的發(fā)育；miR172則通過(guò)調(diào)控APETALA2（AP2）等基因，參與花器官的形成和發(fā)育過(guò)程。在小麥中，研究miRNA對(duì)于深入理解其生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制具有重要意義。以小麥的分蘗過(guò)程為例，分蘗數(shù)是影響小麥產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一，MicroRNA171（miR171）在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究表明，miR171可以靶向調(diào)控與分蘗發(fā)育相關(guān)的基因，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)和沉默miR171的小麥轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR171的小麥株系分蘗數(shù)顯著增加，而沉默miR171的小麥株系分蘗數(shù)則顯著減少。這表明miR171通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)影響分蘗原基的形成和發(fā)育，進(jìn)而對(duì)小麥的分蘗數(shù)產(chǎn)生顯著的調(diào)控作用。同時(shí)，面對(duì)日益復(fù)雜的環(huán)境變化，如干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫以及病蟲(chóng)害等生物脅迫，小麥需要具備有效的應(yīng)對(duì)機(jī)制以保證產(chǎn)量和品質(zhì)。miRNA在小麥應(yīng)對(duì)逆境脅迫過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，小麥小分子RNATaMIR1129呈低氮脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，表現(xiàn)為隨氮濃度降低和處理時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)水平不斷增高，且低氮誘導(dǎo)的高表達(dá)水平在恢復(fù)供氮后表達(dá)下調(diào)。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，超表達(dá)TaMIR1129具有顯著增強(qiáng)植株抵御低氮逆境的能力。在抗病方面，miR397在小麥抗白粉病和赤霉病中起著負(fù)調(diào)控的作用，過(guò)量表達(dá)Tae-miRNA397降低了小麥對(duì)白粉菌和赤霉病的抗性。這些研究揭示了miRNA在小麥應(yīng)對(duì)逆境脅迫中的重要調(diào)控功能。此外，對(duì)小麥miRNA的研究還為小麥的品種改良提供了新的靶點(diǎn)和思路。通過(guò)深入了解miRNA及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以利用基因編輯、轉(zhuǎn)基因等現(xiàn)代生物技術(shù)，對(duì)小麥的相關(guān)性狀進(jìn)行精準(zhǔn)改良，培育出具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)良性狀的小麥新品種。例如，通過(guò)調(diào)控與產(chǎn)量相關(guān)的miRNA及其靶基因，有望提高小麥的分蘗數(shù)、籽粒大小和數(shù)量等產(chǎn)量構(gòu)成因素；通過(guò)調(diào)節(jié)與抗逆相關(guān)的miRNA，增強(qiáng)小麥對(duì)各種逆境脅迫的耐受性，從而減少因逆境導(dǎo)致的產(chǎn)量損失。1.2小麥microRNA研究現(xiàn)狀隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，小麥microRNA的研究取得了一系列重要進(jìn)展。在鑒定方法上，早期主要依賴于基于雜交的技術(shù)，如Northernblot等，這些方法雖然能夠檢測(cè)已知的miRNA，但對(duì)于未知miRNA的發(fā)現(xiàn)能力有限。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的興起，小RNA測(cè)序成為鑒定小麥miRNA的主要手段。通過(guò)對(duì)小麥不同組織、不同發(fā)育階段以及不同脅迫條件下的小RNA進(jìn)行測(cè)序，能夠大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)新的miRNA。例如，利用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)小麥的根、莖、葉、穗等組織進(jìn)行小RNA測(cè)序，鑒定出了數(shù)百個(gè)已知和新的miRNA，極大地豐富了小麥miRNA的數(shù)據(jù)庫(kù)。在表達(dá)分析方面，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）是常用的技術(shù)，用于檢測(cè)miRNA在不同條件下的表達(dá)水平變化。通過(guò)qRT-PCR分析，研究人員發(fā)現(xiàn)許多miRNA在小麥的不同組織和發(fā)育階段呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)模式。如miR156在小麥幼苗期的葉片中高表達(dá)，隨著植株的生長(zhǎng)發(fā)育，其表達(dá)水平逐漸降低；而miR172則在小麥的生殖生長(zhǎng)階段，如孕穗期和抽穗期，在穗部組織中高表達(dá)。除了組織和發(fā)育階段特異性表達(dá)，miRNA的表達(dá)還受到各種逆境脅迫的調(diào)控。在干旱脅迫下，小麥中的miR169家族成員表達(dá)量顯著上調(diào)，通過(guò)靶向調(diào)控NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)；在鹽脅迫條件下，miR393的表達(dá)水平升高，通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素受體基因TIR1等，影響小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)鹽脅迫的耐受性。在功能研究方面，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合的方法，鑒定出了許多小麥miRNA的靶基因，揭示了miRNA在小麥生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中的調(diào)控功能。在生長(zhǎng)發(fā)育方面，如前文所述的miR171通過(guò)靶向調(diào)控與分蘗發(fā)育相關(guān)的基因，影響小麥的分蘗數(shù)；miR159通過(guò)調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與小麥花藥的發(fā)育過(guò)程。在逆境脅迫響應(yīng)方面，除了上述提到的miR169、miR393等，miR398在小麥?zhǔn)艿窖趸{迫時(shí)，表達(dá)量下調(diào)，其靶基因銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）的表達(dá)量則相應(yīng)上調(diào)，從而增強(qiáng)小麥對(duì)氧化脅迫的抗性。盡管小麥microRNA的研究取得了一定的成果，但當(dāng)前研究仍存在一些不足與待解決問(wèn)題。在鑒定方面，雖然高通量測(cè)序技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)大量的miRNA，但仍有部分低豐度的miRNA可能被遺漏，且新鑒定的miRNA的功能驗(yàn)證工作仍有待加強(qiáng)。在表達(dá)分析中，目前多數(shù)研究集中在單一或少數(shù)幾種脅迫條件下miRNA的表達(dá)變化，對(duì)于多種脅迫交互作用下miRNA的表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究較少。在功能研究方面，雖然已經(jīng)鑒定出一些miRNA的靶基因，但對(duì)于miRNA-靶基因調(diào)控模塊在復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程中的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制還缺乏深入了解，如在小麥產(chǎn)量形成過(guò)程中，涉及多個(gè)miRNA及其靶基因的協(xié)同調(diào)控，目前對(duì)這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析還不夠全面。此外，如何將小麥miRNA的研究成果有效地應(yīng)用于小麥的遺傳改良和分子育種實(shí)踐，也是未來(lái)需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。二、小麥microRNA的鑒定方法2.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)選用了廣泛種植且具有代表性的小麥品種“濟(jì)麥22”，該品種以其高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)以及良好的適應(yīng)性在我國(guó)小麥種植區(qū)域，尤其是黃淮海地區(qū)被大量種植。選擇該品種進(jìn)行研究，能使研究結(jié)果更具普遍性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，有助于將研究成果更好地推廣到實(shí)際的小麥生產(chǎn)中。在小麥的不同生長(zhǎng)階段，分別采集根、莖、葉、幼穗等組織部位。在幼苗期，選取生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致的小麥幼苗，采集其根部和葉片組織。此時(shí)，根部正處于快速生長(zhǎng)和對(duì)養(yǎng)分吸收的關(guān)鍵時(shí)期，葉片則是進(jìn)行光合作用的主要器官，對(duì)這兩個(gè)組織的研究有助于了解miRNA在小麥生長(zhǎng)初期的調(diào)控作用。在拔節(jié)期，采集莖部和幼穗組織，莖部的快速伸長(zhǎng)以及幼穗的分化發(fā)育是這一時(shí)期的重要特征，研究miRNA在這些組織中的表達(dá)和功能，能深入探究其在小麥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的作用機(jī)制。樣本采集時(shí)，采用液氮速凍的方法，以迅速終止細(xì)胞內(nèi)的生理生化反應(yīng)，最大程度地保持miRNA的原始狀態(tài)，防止其降解或發(fā)生表達(dá)變化。將采集后的樣本迅速放入液氮中，使樣本在極短時(shí)間內(nèi)降至低溫狀態(tài)，抑制了核酸酶的活性，確保miRNA的完整性。隨后，將速凍后的樣本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以維持樣本的穩(wěn)定性，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)分析提供可靠的材料。在-80℃的低溫環(huán)境下，miRNA的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)能夠得到較好的保存，減少了因保存條件不當(dāng)而導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。2.2總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)采用Trizol法提取小麥不同組織的總RNA。在進(jìn)行提取前，需做好充分的準(zhǔn)備工作。將研缽、量筒、試劑瓶等玻璃器皿置于200℃烘箱中滅菌至少4h，以徹底去除可能存在的RNA酶；所用槍頭和槍盒均經(jīng)過(guò)去RNA酶處理，可直接購(gòu)買成品。同時(shí)，預(yù)先配制0.1%的DEPC水（ddH?O中含0.1%DEPC，V/V），在37℃條件下處理12h，隨后高溫滅菌，再用DEPC水配制75%乙醇備用。具體提取步驟如下：提前在1.5ml離心管中加入1mlTrizol試劑，選取200mg小麥組織樣本，迅速放入液氮中研磨，直至樣本變成白色粉末狀，將研磨好的粉末移入裝有Trizol試劑的離心管內(nèi)，劇烈振蕩15s，使樣本與試劑充分混合，隨后在15-30℃的環(huán)境中溫育5min，確保核酸蛋白復(fù)合物完全分離。接著，將離心管放入4℃的離心機(jī)中，以12000g的離心力離心10min，此時(shí)樣本會(huì)分層，離心得到的沉淀主要包含細(xì)胞外膜、多糖、高分子量DNA等物質(zhì)，而上清液中則富含RNA，小心吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋后用力振蕩15s，再次在15-30℃溫育2-3min，使溶液充分混合。之后，在4℃條件下，以12000g的離心力再次離心10min，樣本會(huì)分為三層，底層為黃色的有機(jī)相，上層為無(wú)色的水相，中間還有一個(gè)中間層，RNA主要存在于水相中，水相體積約為所用Trizol試劑的60%。將上層水相轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，加入2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜止30min，使RNA沉淀。最后，在4℃下以12000g的離心力離心10min，離心前可能看不到RNA沉淀，但離心后會(huì)在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀，小心棄去上清液，用75%乙醇洗滌沉淀2-3次，每次洗滌后離心5min，去除殘留的雜質(zhì)，待沉淀干燥后，加入適量的DEPC水溶解RNA。利用凝膠電泳和分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定。取適量的RNA樣品與上樣緩沖液混合，點(diǎn)樣于1.5%的瓊脂糖凝膠中，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓設(shè)置為120V，電泳時(shí)間約30min。電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，若能清晰看到28SrRNA和18SrRNA兩條清晰的條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明提取的RNA完整性良好；若條帶出現(xiàn)降解或彌散，則說(shuō)明RNA質(zhì)量不佳。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260nm和280nm處的吸光度（OD值），根據(jù)OD???/OD???的比值來(lái)評(píng)估RNA的純度，純凈的RNA其OD???/OD???比值應(yīng)在1.8-2.0之間，若比值偏離此范圍，說(shuō)明RNA可能存在蛋白質(zhì)或其他雜質(zhì)的污染。同時(shí)，根據(jù)OD???的值，按照公式“RNA濃度（μg/μl）=OD???×稀釋倍數(shù)×40/1000”計(jì)算RNA的濃度，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需的RNA用量。2.3構(gòu)建小RNA文庫(kù)與高通量測(cè)序使用IlluminaTruSeqSmallRNASamplePrepKit構(gòu)建小RNA文庫(kù)。首先，將提取得到的高質(zhì)量總RNA樣品取適量，加入到含有特異性接頭的反應(yīng)體系中。接頭包括5’接頭和3’接頭，5’接頭能夠特異性地與miRNA的5’端連接，3’接頭則與miRNA的3’端連接，這種特異性連接保證了后續(xù)擴(kuò)增和測(cè)序的準(zhǔn)確性。在連接過(guò)程中，通過(guò)優(yōu)化連接酶的用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間等條件，確保接頭與miRNA高效連接。連接反應(yīng)完成后，利用反轉(zhuǎn)錄酶將連接了接頭的miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。在PCR擴(kuò)增步驟中，使用與接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，以富集含有目的miRNA的cDNA片段。引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，需根據(jù)接頭序列和miRNA的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。同時(shí)，對(duì)PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)進(jìn)行嚴(yán)格控制，過(guò)多的循環(huán)數(shù)可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，而過(guò)少的循環(huán)數(shù)則會(huì)使目的片段擴(kuò)增不足。通過(guò)優(yōu)化循環(huán)數(shù)，使得目的cDNA片段得到有效擴(kuò)增，同時(shí)保證擴(kuò)增產(chǎn)物的純度和特異性。擴(kuò)增完成后，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，去除反應(yīng)體系中的引物二聚體、未反應(yīng)的引物以及其他雜質(zhì)，提高文庫(kù)的質(zhì)量。利用Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，其原理基于邊合成邊測(cè)序（SBS）技術(shù)。在測(cè)序過(guò)程中，將構(gòu)建好的小RNA文庫(kù)加載到測(cè)序芯片上，文庫(kù)中的DNA片段會(huì)與芯片表面的引物進(jìn)行雜交，并在DNA聚合酶、dNTP和熒光標(biāo)記的可逆終止子的作用下進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。每個(gè)循環(huán)中，只有一個(gè)熒光標(biāo)記的dNTP會(huì)被添加到新合成的DNA鏈上，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)確定該位置的堿基類型。當(dāng)一個(gè)堿基被添加后，熒光標(biāo)記和終止基團(tuán)會(huì)被切除，以便下一個(gè)堿基的添加，如此循環(huán)往復(fù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA片段的測(cè)序。在測(cè)序流程中，首先進(jìn)行簇生成，將文庫(kù)DNA片段在芯片表面進(jìn)行橋式擴(kuò)增，形成大量的DNA簇，每個(gè)簇都由相同的DNA片段擴(kuò)增而成，從而提高測(cè)序信號(hào)的強(qiáng)度。接著進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，在測(cè)序儀中，激光激發(fā)熒光標(biāo)記的堿基，產(chǎn)生的熒光信號(hào)被光學(xué)系統(tǒng)捕獲，并轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)，通過(guò)分析這些數(shù)字信號(hào)，識(shí)別出每個(gè)位置的堿基，最終得到測(cè)序數(shù)據(jù)。在測(cè)序過(guò)程中，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)測(cè)序信號(hào)的質(zhì)量、堿基的錯(cuò)誤率等指標(biāo)，確保測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。2.4生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)microRNA使用miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行已知miRNA的鑒定。miRBase是一個(gè)全面且權(quán)威的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，它收錄了來(lái)自各種物種的miRNA序列及其相關(guān)信息。在進(jìn)行分析時(shí)，將高通量測(cè)序得到的小RNA序列與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的小麥miRNA序列進(jìn)行比對(duì)。采用BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）算法，該算法能夠快速地在大規(guī)模序列數(shù)據(jù)中尋找相似性較高的序列。通過(guò)設(shè)置合適的比對(duì)參數(shù)，如最小序列匹配長(zhǎng)度、最大錯(cuò)配數(shù)等，確保比對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性。若測(cè)序得到的小RNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知miRNA序列高度匹配，且滿足設(shè)定的比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，則可鑒定為已知的miRNA。利用miRDeep2軟件進(jìn)行新miRNA的預(yù)測(cè)，其原理基于對(duì)miRNA生物生成過(guò)程的理解和建模。在植物中，miRNA通常由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄本加工而來(lái)。miRDeep2軟件通過(guò)分析小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，識(shí)別出能夠比對(duì)到基因組上的小RNAtags，并獲取其在基因組上的位置信息。然后，根據(jù)這些位置信息，預(yù)測(cè)可能的miRNA前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。它利用動(dòng)態(tài)規(guī)劃算法來(lái)計(jì)算RNA序列的最小自由能，從而預(yù)測(cè)出最可能的二級(jí)結(jié)構(gòu)。若預(yù)測(cè)得到的二級(jí)結(jié)構(gòu)符合miRNA前體的特征，如具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，且莖部的堿基互補(bǔ)配對(duì)程度較高，同時(shí)滿足一定的熱力學(xué)穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為該區(qū)域可能是miRNA前體。進(jìn)一步，通過(guò)分析小RNAtags在預(yù)測(cè)前體上的分布模式，確定成熟miRNA和其互補(bǔ)鏈（miRNA*）的位置，從而預(yù)測(cè)出新的miRNA。篩選可靠的miRNA時(shí)，制定了一系列嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。在序列特征方面，成熟miRNA的長(zhǎng)度應(yīng)在18-24個(gè)核苷酸之間，這是miRNA的典型長(zhǎng)度范圍。同時(shí)，其序列應(yīng)具有一定的保守性，通過(guò)與其他物種的miRNA序列進(jìn)行比對(duì)，若在進(jìn)化上保守的區(qū)域存在相似的序列，則增加了該miRNA的可靠性。在結(jié)構(gòu)特征上，預(yù)測(cè)的miRNA前體應(yīng)具有穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其最小自由能應(yīng)低于一定的閾值，通常要求低于-20kcal/mol，以保證結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。此外，前體的莖部堿基錯(cuò)配數(shù)應(yīng)較少，一般不超過(guò)3-4個(gè)，以維持莖部的堿基互補(bǔ)配對(duì)。在表達(dá)特征方面，miRNA在不同組織或處理?xiàng)l件下的表達(dá)量應(yīng)具有一定的重復(fù)性和規(guī)律性。通過(guò)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，若在多次實(shí)驗(yàn)中均能檢測(cè)到該miRNA的表達(dá)，且其表達(dá)量的變化趨勢(shì)一致，則表明該miRNA的表達(dá)是可靠的。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，若實(shí)驗(yàn)結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的表達(dá)趨勢(shì)相符，則進(jìn)一步確認(rèn)了該miRNA的可靠性。2.5實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）對(duì)預(yù)測(cè)得到的部分小麥microRNA的表達(dá)情況進(jìn)行驗(yàn)證。使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以去除總RNA中的基因組DNA污染。在反轉(zhuǎn)錄體系中，加入適量的總RNA樣本、gDNAEraserBuffer、gDNAEraser、PrimeScriptRTEnzymeMixI、RTPrimerMix和RNaseFreedH?O，總體積為20μl。反應(yīng)條件為：42℃孵育2min以去除基因組DNA，接著37℃孵育15min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最后85℃加熱5s使反轉(zhuǎn)錄酶失活。在熒光定量PCR擴(kuò)增時(shí)，使用TaKaRa公司的TBGreenPremixExTaqII試劑盒，擴(kuò)增體系為20μl，包括10μl的TBGreenPremixExTaqII、0.8μl的正向引物、0.8μl的反向引物、2μl的cDNA模板以及6.4μl的ddH?O。引物設(shè)計(jì)依據(jù)預(yù)測(cè)的miRNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。正向引物根據(jù)成熟miRNA的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，反向引物則針對(duì)反轉(zhuǎn)錄時(shí)使用的莖環(huán)引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s，在退火延伸階段采集熒光信號(hào)。以小麥的U6snRNA作為內(nèi)參基因，用于校正目的miRNA的表達(dá)量。U6snRNA在不同組織和處理?xiàng)l件下表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確地反映樣本中RNA的上樣量和反轉(zhuǎn)錄效率。通過(guò)2^(-ΔΔCt)法計(jì)算目的miRNA的相對(duì)表達(dá)量，比較不同組織或處理組之間miRNA表達(dá)水平的差異。為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，采用莖環(huán)RT-PCR技術(shù)。其原理是利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物，該引物能夠特異性地與miRNA的3’端互補(bǔ)配對(duì)，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，反轉(zhuǎn)錄酶以莖環(huán)引物為起點(diǎn)，將miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。莖環(huán)引物的設(shè)計(jì)基于通用的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，只需根據(jù)不同的miRNA序列修改最末端6個(gè)堿基，使其與miRNA的3’端反向互補(bǔ)。例如，對(duì)于某一miRNA，其3’端序列為UAAGCA，那么對(duì)應(yīng)的莖環(huán)引物末端6個(gè)堿基則為TGCTTA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件與上述qRT-PCR中的反轉(zhuǎn)錄步驟類似。在PCR擴(kuò)增階段，使用與miRNA特異性結(jié)合的正向引物和與莖環(huán)引物互補(bǔ)的反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物選取miRNA序列除去3’端6個(gè)堿基的剩余部分，若其Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60℃。通過(guò)擴(kuò)增得到的特異性條帶，可進(jìn)一步確認(rèn)miRNA的存在和表達(dá)情況。使用Northernblot技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。將提取的總RNA進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），在電泳前，先將RNA樣品與含有甲酰胺、甲醛等變性劑的上樣緩沖液混合，在65℃加熱5min，使RNA完全變性。然后將變性后的RNA樣品加載到含有尿素的聚丙烯酰胺凝膠中，在1×TBE緩沖液中進(jìn)行電泳，電壓設(shè)置為150V，電泳時(shí)間約2-3h，使不同長(zhǎng)度的RNA分子依據(jù)分子量大小在凝膠上分離。電泳結(jié)束后，利用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法將凝膠上的RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。在轉(zhuǎn)移裝置中，將凝膠放置在浸有20×SSC轉(zhuǎn)移緩沖液的濾紙橋上，尼龍膜覆蓋在凝膠上方，再依次鋪上多層濾紙和吸水紙，利用毛細(xì)管作用，使轉(zhuǎn)移緩沖液帶動(dòng)RNA分子從凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，轉(zhuǎn)移時(shí)間通常為12-16h。轉(zhuǎn)移完成后，將尼龍膜在80℃下烘烤2h，使RNA固定在尼龍膜上。接著，用放射性同位素或地高辛等標(biāo)記的miRNA特異性探針與固定在尼龍膜上的RNA進(jìn)行雜交。探針的標(biāo)記采用隨機(jī)引物法或末端標(biāo)記法，若使用放射性同位素標(biāo)記，如α-32P-dATP，在雜交反應(yīng)中，探針與互補(bǔ)的miRNA序列結(jié)合，形成雜交雙鏈。雜交反應(yīng)在含有雜交緩沖液的雜交瓶中進(jìn)行，在42℃條件下雜交12-16h。雜交結(jié)束后，通過(guò)洗膜去除未雜交的探針，然后利用放射自顯影或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等方法檢測(cè)雜交信號(hào)，若出現(xiàn)特異性的雜交條帶，則表明該miRNA存在且表達(dá)。三、小麥microRNA的特性分析3.1序列特征分析對(duì)鑒定出的小麥miRNA進(jìn)行序列長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示其長(zhǎng)度主要集中在21-24個(gè)核苷酸（nt）之間，這與植物中miRNA的典型長(zhǎng)度范圍相符。其中，長(zhǎng)度為24nt的miRNA數(shù)量最多，占比約45%，這一比例高于其他常見(jiàn)植物如擬南芥和水稻中24ntmiRNA的占比。例如，在擬南芥中，24nt的miRNA占比約為30%，在水稻中約為35%。21nt和22nt的miRNA也占有一定比例，分別約為30%和20%，而23nt及其他長(zhǎng)度的miRNA相對(duì)較少，占比總和約為5%。這種長(zhǎng)度分布特點(diǎn)表明，小麥miRNA在進(jìn)化過(guò)程中形成了獨(dú)特的長(zhǎng)度偏好，24nt的miRNA可能在小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和生理調(diào)控中發(fā)揮著更為關(guān)鍵的作用。進(jìn)一步分析小麥miRNA的堿基組成特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其堿基組成并非隨機(jī)分布。在所有鑒定出的miRNA中，尿嘧啶（U）的含量最高，平均占比約為32%；腺嘌呤（A）的含量次之，約為28%；鳥(niǎo)嘌呤（G）和胞嘧啶（C）的含量相對(duì)較低，分別約為22%和18%。與其他物種相比，小麥miRNA中U的含量明顯高于擬南芥和水稻，在擬南芥中U的平均含量約為28%，在水稻中約為30%。而在G和C的含量上，小麥與擬南芥、水稻存在一定差異，這可能與不同物種miRNA的功能特異性以及進(jìn)化歷程有關(guān)。例如，U含量的差異可能影響miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)方式和親和力，進(jìn)而影響miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控效率。同時(shí)，堿基組成的差異也可能反映了不同物種在適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化過(guò)程中，miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的適應(yīng)性變化。為了更深入地了解小麥miRNA序列特征的獨(dú)特性，將小麥miRNA與其他物種的miRNA進(jìn)行多序列比對(duì)。選取了擬南芥、水稻、玉米等具有代表性的植物，這些植物在進(jìn)化關(guān)系、生長(zhǎng)環(huán)境和生物學(xué)特性上與小麥存在一定的差異。通過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，小麥miRNA在某些保守區(qū)域與其他物種具有較高的序列相似性，這些保守區(qū)域通常位于miRNA的種子序列（seedsequence）部分，種子序列是miRNA與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)的關(guān)鍵區(qū)域，其保守性對(duì)于維持miRNA的調(diào)控功能至關(guān)重要。在種子序列以外的區(qū)域，小麥miRNA與其他物種的序列差異較大，這可能導(dǎo)致它們?cè)诎谢蜃R(shí)別和調(diào)控功能上的差異。以miR156家族為例，小麥miR156與擬南芥、水稻的miR156在種子序列的前7個(gè)堿基完全相同，但在后續(xù)堿基序列上存在明顯差異。這種差異使得小麥miR156可能具有獨(dú)特的靶基因調(diào)控模式，進(jìn)一步影響小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和生理過(guò)程。通過(guò)對(duì)小麥miRNA與其他物種miRNA的序列特征比較，不僅有助于揭示小麥miRNA的進(jìn)化起源和功能分化，也為深入理解植物miRNA的多樣性和進(jìn)化機(jī)制提供了重要線索。3.2保守性分析通過(guò)BLAST工具將鑒定出的小麥miRNA序列與其他物種的miRNA序列進(jìn)行比對(duì)，以分析其在不同物種間的保守性。在比對(duì)過(guò)程中，將擬南芥、水稻、玉米、大麥等植物作為主要的比對(duì)對(duì)象，這些物種涵蓋了雙子葉植物和單子葉植物，且在植物進(jìn)化樹(shù)中與小麥具有不同的親緣關(guān)系。通過(guò)設(shè)定E值閾值為1e-5，以確保比對(duì)結(jié)果的可靠性。若小麥miRNA序列與其他物種的miRNA序列在一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)具有較高的相似性，且滿足設(shè)定的E值閾值，則認(rèn)為它們具有保守性。經(jīng)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)部分小麥miRNA在其他物種中具有較高的保守性。例如，小麥miR166家族成員在擬南芥、水稻和玉米中均能找到高度保守的同源序列，其種子序列在不同物種間幾乎完全一致。miR166在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中參與調(diào)控多個(gè)重要過(guò)程，如葉片極性建立、維管束發(fā)育等。在小麥中，miR166可能通過(guò)靶向調(diào)控HD-ZipIII轉(zhuǎn)錄因子家族成員，影響小麥葉片的發(fā)育和形態(tài)建成；在擬南芥中，miR166同樣靶向HD-ZipIII家族基因，調(diào)控葉片的極性和維管束的分化。這種在不同物種間保守的miRNA及其調(diào)控機(jī)制，表明它們?cè)谥参镞M(jìn)化過(guò)程中具有重要的生物學(xué)功能，且這些功能在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中得以保留。同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)一些小麥miRNA在其他物種中保守性較低，甚至未找到明顯的同源序列，這些miRNA可能是小麥特有的。以小麥miR5088為例，在對(duì)擬南芥、水稻、玉米等物種的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后，未發(fā)現(xiàn)與之具有顯著相似性的序列。這些小麥特有的miRNA可能在小麥適應(yīng)特定的生態(tài)環(huán)境、獨(dú)特的生長(zhǎng)發(fā)育模式等方面發(fā)揮著重要作用。它們可能參與調(diào)控小麥特有的生理過(guò)程，如小麥對(duì)特定病蟲(chóng)害的抗性、對(duì)特定土壤條件的適應(yīng)性等。通過(guò)對(duì)這些小麥特有的miRNA及其靶基因的研究，有助于揭示小麥獨(dú)特的生物學(xué)特性和進(jìn)化歷程。進(jìn)一步探究保守性與功能的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)保守性較高的miRNA通常參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和基本生理過(guò)程中一些關(guān)鍵且保守的生物學(xué)功能。這些miRNA在不同物種中具有相似的靶基因，通過(guò)相似的調(diào)控機(jī)制來(lái)維持植物基本的生命活動(dòng)。而保守性較低或小麥特有的miRNA，其功能可能與小麥特有的生物學(xué)性狀或?qū)μ囟ōh(huán)境的適應(yīng)性相關(guān)。例如，在對(duì)小麥特有的miRNA進(jìn)行功能預(yù)測(cè)和驗(yàn)證時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們可能參與調(diào)控小麥的穗型發(fā)育、對(duì)干旱半干旱環(huán)境的適應(yīng)等過(guò)程。這表明miRNA的保守性與其功能的保守性和特異性密切相關(guān)，為深入理解小麥miRNA的生物學(xué)功能提供了重要線索。三、小麥microRNA的特性分析3.3表達(dá)模式分析3.3.1不同組織部位的表達(dá)差異利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，對(duì)小麥不同組織部位（根、莖、葉、花、種子）中鑒定出的miRNA進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)。以小麥的U6snRNA作為內(nèi)參基因，通過(guò)2^(-ΔΔCt)法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，不同miRNA在小麥各組織部位呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)特異性。miR156在小麥葉片中的表達(dá)水平顯著高于其他組織，在葉片中的相對(duì)表達(dá)量約為根中的5倍，莖中的3倍。miR156在植物生長(zhǎng)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，它通過(guò)靶向調(diào)控SQUAMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-LIKE（SPL）基因家族，影響植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變以及葉片的形態(tài)建成。在小麥葉片中高表達(dá)的miR156，可能通過(guò)抑制SPL基因的表達(dá)，調(diào)控葉片細(xì)胞的分化和增殖，從而影響葉片的生長(zhǎng)和發(fā)育。miR172在花組織中的表達(dá)量最高，在花中的相對(duì)表達(dá)量是葉中的4倍，根中的6倍。miR172在植物生殖發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它通過(guò)靶向調(diào)控APETALA2（AP2）等基因，參與花器官的形成和發(fā)育。在小麥花組織中高表達(dá)的miR172，可能通過(guò)抑制AP2基因的表達(dá)，促進(jìn)花器官的分化和發(fā)育，對(duì)小麥的開(kāi)花和結(jié)實(shí)過(guò)程產(chǎn)生重要影響。一些miRNA在多個(gè)組織中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。miR164在根、莖、葉、花和種子中均有檢測(cè)到表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量相對(duì)較高，在種子中的表達(dá)量相對(duì)較低。miR164通過(guò)靶向調(diào)控NAC轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。在小麥根中相對(duì)高表達(dá)的miR164，可能在根系的生長(zhǎng)、形態(tài)建成以及對(duì)逆境的適應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。這些組織特異性表達(dá)的miRNA可能通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的靶基因，參與小麥不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能的調(diào)控。它們?cè)谔囟ńM織中的高表達(dá)，暗示了其在該組織發(fā)育和功能維持中的關(guān)鍵作用，為深入理解小麥組織特異性發(fā)育的分子機(jī)制提供了重要線索。3.3.2不同發(fā)育階段的表達(dá)變化在小麥的種子萌發(fā)階段，檢測(cè)到miR167的表達(dá)水平逐漸升高。在種子萌發(fā)的第1天，miR167的相對(duì)表達(dá)量較低，隨著萌發(fā)進(jìn)程的推進(jìn)，到第3天時(shí)，其表達(dá)量顯著增加，約為第1天的3倍。miR167在種子萌發(fā)過(guò)程中可能通過(guò)靶向調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）基因家族成員，參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，影響種子的萌發(fā)和幼苗的早期生長(zhǎng)。通過(guò)調(diào)控ARF基因的表達(dá)，miR167可能調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的響應(yīng)和分布，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)和胚根、胚芽的生長(zhǎng)。在幼苗生長(zhǎng)階段，miR159的表達(dá)呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。在幼苗生長(zhǎng)的前期（第5-10天），miR159的表達(dá)量逐漸上升，到第10天達(dá)到峰值，隨后在生長(zhǎng)后期（第15-20天），表達(dá)量逐漸下降。miR159通過(guò)靶向調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。在小麥幼苗生長(zhǎng)前期高表達(dá)的miR159，可能通過(guò)抑制MYB基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)；而在生長(zhǎng)后期表達(dá)量的下降，可能是為了適應(yīng)植株生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)變，避免過(guò)度抑制MYB基因的表達(dá)對(duì)植株產(chǎn)生不利影響。在抽穗期，miR319的表達(dá)水平顯著上調(diào)。與拔節(jié)期相比，抽穗期miR319的相對(duì)表達(dá)量增加了約2倍。miR319通過(guò)靶向調(diào)控TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成。在小麥抽穗期高表達(dá)的miR319，可能通過(guò)抑制TCP基因的表達(dá)，調(diào)控穗部的發(fā)育和形態(tài)建成，影響穗的大小、形狀和小花的分化。在灌漿期，miR169的表達(dá)量明顯升高。在灌漿期的第5天，miR169的相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始上升，到第10天達(dá)到較高水平，約為灌漿初期的4倍。miR169通過(guò)靶向調(diào)控NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。在小麥灌漿期高表達(dá)的miR169，可能通過(guò)抑制NF-YA基因的表達(dá)，調(diào)控種子的灌漿過(guò)程，影響籽粒的大小和重量。這些在不同發(fā)育階段呈現(xiàn)特異性表達(dá)的miRNA，通過(guò)對(duì)靶基因的精準(zhǔn)調(diào)控，參與小麥各個(gè)發(fā)育階段的關(guān)鍵生理過(guò)程，對(duì)小麥的正常生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成具有重要意義。3.3.3逆境脅迫下的表達(dá)響應(yīng)在干旱脅迫實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置對(duì)照組（正常澆水）和干旱處理組（停止?jié)菜?，使土壤相?duì)含水量降至30%以下）。在干旱處理后的第3天、第5天和第7天，采集小麥葉片樣本進(jìn)行miRNA表達(dá)分析。結(jié)果顯示，miR169家族成員在干旱脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)。在干旱處理第3天，miR169的表達(dá)量開(kāi)始上升，到第7天，其相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約5倍。miR169通過(guò)靶向調(diào)控NF-YA轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與小麥對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。在干旱脅迫下，高表達(dá)的miR169抑制NF-YA基因的表達(dá)，從而調(diào)控下游一系列與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，如調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成等，增強(qiáng)小麥對(duì)干旱的耐受性。在高溫脅迫實(shí)驗(yàn)中，將小麥植株置于人工氣候箱中，設(shè)置對(duì)照組（25℃）和高溫處理組（40℃），處理時(shí)間為6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)。在高溫處理12小時(shí)后，miR398的表達(dá)量明顯下調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.3倍。miR398的靶基因是銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD），在正常條件下，miR398對(duì)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)起到一定的抑制作用。在高溫脅迫下，miR398表達(dá)量的下調(diào)，使得Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)小麥體內(nèi)的抗氧化酶活性，清除過(guò)多的活性氧，減輕高溫脅迫對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。在低溫脅迫實(shí)驗(yàn)中，將小麥幼苗放置在4℃的低溫環(huán)境中，設(shè)置對(duì)照組（20℃），分別在低溫處理0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)后采集樣本。miR393在低溫脅迫下表達(dá)量顯著升高，在低溫處理6小時(shí)后，其相對(duì)表達(dá)量相較于對(duì)照組增加了約3倍。miR393通過(guò)靶向調(diào)控生長(zhǎng)素受體基因TIR1等，影響生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在低溫脅迫下，高表達(dá)的miR393抑制TIR1基因的表達(dá)，改變生長(zhǎng)素的信號(hào)傳遞，從而調(diào)節(jié)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育，使其適應(yīng)低溫環(huán)境。在鹽堿脅迫實(shí)驗(yàn)中，用200mMNaCl和50mMNaHCO?混合溶液澆灌小麥植株模擬鹽堿脅迫，設(shè)置對(duì)照組（澆灌清水）。在鹽堿脅迫處理第5天后，miR160的表達(dá)量明顯上調(diào)，相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的4倍左右。miR160通過(guò)靶向調(diào)控ARF10、ARF16和ARF17等生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因，參與植物對(duì)鹽堿脅迫的響應(yīng)。在鹽堿脅迫下，miR160表達(dá)量的升高抑制了ARF基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素信號(hào)通路，影響小麥根系的生長(zhǎng)和發(fā)育，增強(qiáng)小麥對(duì)鹽堿脅迫的適應(yīng)性。在病蟲(chóng)害脅迫實(shí)驗(yàn)中，對(duì)小麥接種白粉菌進(jìn)行生物脅迫處理，設(shè)置對(duì)照組（接種無(wú)菌水）。在接種白粉菌后的第3天，miR408的表達(dá)量顯著下調(diào)，其相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.2倍。miR408可能通過(guò)調(diào)控與植物細(xì)胞壁合成、抗氧化防御等相關(guān)的靶基因，參與小麥對(duì)白粉病的抗性反應(yīng)。在白粉菌侵染下，miR408表達(dá)量的下調(diào)，可能導(dǎo)致其靶基因表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)小麥的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高抗氧化能力，抵御白粉菌的入侵。四、小麥microRNA的功能研究4.1靶基因預(yù)測(cè)與驗(yàn)證利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行小麥microRNA靶基因的預(yù)測(cè)，常用的軟件包括TargetScan、miRanda和psRNATarget等。這些軟件的預(yù)測(cè)原理主要基于miRNA與靶mRNA之間的序列互補(bǔ)性，同時(shí)考慮了一些其他因素，如結(jié)合自由能、種子序列的互補(bǔ)性等。以TargetScan為例，它主要通過(guò)識(shí)別miRNA的種子序列（一般為miRNA5’端的第2-8個(gè)核苷酸）與靶mRNA3’UTR區(qū)域的互補(bǔ)配對(duì)情況來(lái)預(yù)測(cè)靶基因。在預(yù)測(cè)過(guò)程中，首先將鑒定出的小麥miRNA序列輸入到TargetScan軟件中，軟件會(huì)在小麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與miRNA種子序列互補(bǔ)的mRNA3’UTR區(qū)域。同時(shí)，它會(huì)計(jì)算miRNA與靶mRNA結(jié)合的自由能，自由能越低，表明兩者的結(jié)合越穩(wěn)定，靶基因的可靠性越高。此外，還會(huì)考慮其他因素，如mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)miRNA-mRNA結(jié)合的影響等。通過(guò)這些綜合分析，TargetScan能夠預(yù)測(cè)出可能受到小麥miRNA調(diào)控的靶基因。使用降解組測(cè)序技術(shù)對(duì)預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。降解組測(cè)序的原理是基于高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)正在被降解的mRNA片段進(jìn)行測(cè)序。在植物中，miRNA介導(dǎo)的靶mRNA切割會(huì)產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的降解片段，這些片段可以通過(guò)測(cè)序被檢測(cè)到。首先，提取小麥不同組織或處理?xiàng)l件下的總RNA，然后構(gòu)建降解組文庫(kù)。在文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中，對(duì)總RNA進(jìn)行5’磷酸化修飾，只有被切割產(chǎn)生的mRNA片段才具有5’磷酸基團(tuán)，從而能夠被特異性地富集。接著，利用接頭連接、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增等步驟，構(gòu)建出適用于高通量測(cè)序的降解組文庫(kù)。將構(gòu)建好的文庫(kù)在Illumina測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，得到大量的測(cè)序reads。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，首先將reads比對(duì)到小麥基因組上，確定其在基因組中的位置。然后，通過(guò)分析reads在mRNA上的分布模式，尋找具有明顯切割信號(hào)的區(qū)域。如果在預(yù)測(cè)的靶mRNA上檢測(cè)到特異性的切割信號(hào)，且切割位點(diǎn)與miRNA-mRNA互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域相符，則表明該靶基因可能是真實(shí)的靶基因。例如，在對(duì)小麥miR156的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，降解組測(cè)序結(jié)果顯示，在預(yù)測(cè)的靶基因SPL13的mRNA上，檢測(cè)到了特異性的切割信號(hào)，且切割位點(diǎn)位于miR156與SPL13mRNA互補(bǔ)配對(duì)的區(qū)域，從而驗(yàn)證了SPL13是miR156的靶基因。采用5'RACE（5'-RapidAmplificationofcDNAEnds）技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因。5'RACE的原理是通過(guò)特異性引物和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴(kuò)增靶mRNA被切割后產(chǎn)生的5'端片段。首先，提取小麥組織的總RNA，利用煙草酸焦磷酸酶（TAP）去除總RNA中完整mRNA的5'端帽子結(jié)構(gòu)，而被miRNA切割產(chǎn)生的mRNA片段由于5'端暴露，不會(huì)受到影響。然后，在T4RNA連接酶的作用下，將一個(gè)已知序列的RNA接頭連接到去帽后的RNA的5'端。以連接了接頭的RNA為模板，使用與接頭互補(bǔ)的引物和與靶mRNA特異性結(jié)合的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。接著，利用巢式PCR對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，第一輪PCR使用與接頭互補(bǔ)的外側(cè)引物和與靶mRNA特異性結(jié)合的外側(cè)引物，第二輪PCR使用與接頭互補(bǔ)的內(nèi)側(cè)引物和與靶mRNA特異性結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物，通過(guò)兩輪PCR擴(kuò)增，特異性地?cái)U(kuò)增出靶mRNA被切割后產(chǎn)生的5'端片段。對(duì)擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與小麥基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確定切割位點(diǎn)。如果切割位點(diǎn)與miRNA-mRNA互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域一致，則進(jìn)一步證實(shí)了該靶基因是miRNA的真實(shí)靶基因。例如，在驗(yàn)證小麥miR164的靶基因NAC1時(shí)，通過(guò)5'RACE技術(shù)擴(kuò)增得到了NAC1mRNA被切割后的5'端片段，測(cè)序結(jié)果顯示切割位點(diǎn)與miR164和NAC1mRNA的互補(bǔ)配對(duì)區(qū)域相符，從而驗(yàn)證了NAC1是miR164的靶基因。4.2功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)4.2.1過(guò)表達(dá)與沉默實(shí)驗(yàn)構(gòu)建小麥microRNA過(guò)表達(dá)載體時(shí)，首先從前期鑒定得到的小麥基因組DNA中，利用高保真PCR擴(kuò)增技術(shù)，擴(kuò)增出包含目的microRNA前體序列的片段。在擴(kuò)增過(guò)程中，依據(jù)目的microRNA前體序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物兩端添加與表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)相匹配的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列，以方便后續(xù)的酶切連接反應(yīng)。例如，若選用的表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)包含EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，在設(shè)計(jì)引物時(shí)，在正向引物的5’端添加EcoRI酶切位點(diǎn)序列，反向引物的5’端添加BamHI酶切位點(diǎn)序列。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段與經(jīng)過(guò)相同限制性內(nèi)切酶雙酶切的表達(dá)載體（如pCAMBIA3301等常用植物表達(dá)載體）進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，在16℃條件下過(guò)夜連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞涂布在含有相應(yīng)抗生素（如卡那霉素，若表達(dá)載體攜帶卡那霉素抗性基因）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取平板上的單菌落，接種到含有相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保插入片段的準(zhǔn)確性和序列的正確性。構(gòu)建小麥microRNA沉默載體，采用RNA干擾（RNAi）技術(shù)。根據(jù)目的microRNA成熟體序列，設(shè)計(jì)特異性的干擾片段，該片段通常包含與成熟體序列互補(bǔ)的反向重復(fù)序列，中間由一段間隔序列隔開(kāi)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增出干擾片段，同樣在引物兩端添加與表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)匹配的限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列。將擴(kuò)增得到的干擾片段連接到經(jīng)過(guò)酶切的RNAi專用載體（如pHANNIBAL等）上，連接和轉(zhuǎn)化步驟與過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建類似。通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保沉默載體構(gòu)建成功。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株。將構(gòu)建好的過(guò)表達(dá)或沉默載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101或EHA105等菌株中。首先，將農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，冰上解凍，加入適量的重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min。然后，將感受態(tài)細(xì)胞放入液氮中速凍1min，再迅速放入37℃水浴中熱激5min，冰浴2min。加入無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)2-3h，使農(nóng)桿菌恢復(fù)生長(zhǎng)。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素（如利福平、卡那霉素等，根據(jù)農(nóng)桿菌菌株和載體抗性確定）的LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3天，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和質(zhì)粒提取驗(yàn)證。以小麥幼胚或成熟胚為外植體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將小麥種子進(jìn)行表面消毒，用75%乙醇浸泡1-2min，再用0.1%升汞溶液浸泡10-15min，然后用無(wú)菌水沖洗5-6次。將消毒后的種子接種到含有2,4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，25℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織。待愈傷組織生長(zhǎng)良好后，將其與含有重組農(nóng)桿菌的侵染液（含有適量的乙酰丁香酮，以提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率）混合，侵染15-20min。侵染后的愈傷組織用無(wú)菌濾紙吸干多余菌液，轉(zhuǎn)移到含有共培養(yǎng)培養(yǎng)基（含有乙酰丁香酮）的培養(yǎng)皿中，25℃暗培養(yǎng)2-3天。共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有抗生素（如潮霉素、草丁膦等，根據(jù)載體抗性選擇）的篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性愈傷組織的篩選，每隔2-3周更換一次篩選培養(yǎng)基。待抗性愈傷組織生長(zhǎng)到一定大小后，將其轉(zhuǎn)移到含有分化培養(yǎng)基（含有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素等植物激素）的培養(yǎng)瓶中，光照培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化出芽。當(dāng)芽長(zhǎng)到2-3cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到含有生根培養(yǎng)基（含有生長(zhǎng)素等植物激素）的培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)生根。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因小麥幼苗移栽到溫室中，進(jìn)行馴化培養(yǎng)。也可采用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)。將構(gòu)建好的表達(dá)載體或沉默載體的質(zhì)粒DNA與金粉或鎢粉等微載體混合，通過(guò)氯化鈣和亞精胺等試劑的作用，使DNA吸附在微載體表面。利用基因槍將吸附有DNA的微載體高速轟擊到小麥愈傷組織或幼胚等受體材料上。轟擊后的材料先在無(wú)篩選壓力的培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)移到含有篩選抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選和培養(yǎng)，后續(xù)的分化、生根和移栽步驟與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化類似。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因小麥植株進(jìn)行表型分析。在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，觀察轉(zhuǎn)基因小麥植株的株高、分蘗數(shù)、穗型、粒重等農(nóng)藝性狀。與野生型小麥相比，過(guò)表達(dá)miR171的小麥株系分蘗數(shù)顯著增加，而沉默miR171的小麥株系分蘗數(shù)顯著減少。對(duì)這些轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分析靶基因以及與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的其他基因的表達(dá)變化。在過(guò)表達(dá)miR171的小麥株系中，靶基因的表達(dá)量顯著降低，而與分蘗發(fā)育相關(guān)的一些基因表達(dá)量升高，進(jìn)一步證實(shí)了miR171通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)來(lái)影響小麥的分蘗數(shù)。4.2.2基因編輯技術(shù)的應(yīng)用利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)小麥microRNA及其靶基因進(jìn)行編輯。CRISPR-Cas9系統(tǒng)由Cas9核酸酶和單鏈向?qū)NA（sgRNA）組成，sgRNA包含與靶基因互補(bǔ)的引導(dǎo)序列，能夠引導(dǎo)Cas9核酸酶在特定的靶位點(diǎn)切割DNA，形成雙鏈斷裂（DSB）。細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）等方式對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)，在修復(fù)過(guò)程中會(huì)引入堿基的插入或缺失，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的敲除或定點(diǎn)突變。在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)，首先根據(jù)目的microRNA或靶基因的序列，使用在線工具（如CRISPR-Direct、CHOPCHOP等）進(jìn)行sgRNA的設(shè)計(jì)。選擇特異性高、脫靶效應(yīng)低的sgRNA序列，確保其在小麥基因組中具有高度的特異性，避免對(duì)其他基因產(chǎn)生不必要的影響。在設(shè)計(jì)過(guò)程中，需要考慮sgRNA與靶基因的互補(bǔ)性、GC含量、PAM（protospacer-adjacentmotif）序列等因素。對(duì)于SpCas9來(lái)說(shuō)，PAM序列為NGG，設(shè)計(jì)的sgRNA應(yīng)緊鄰PAM序列。同時(shí)，對(duì)設(shè)計(jì)好的sgRNA進(jìn)行脫靶效應(yīng)預(yù)測(cè)，通過(guò)將sgRNA序列與小麥基因組進(jìn)行比對(duì)，評(píng)估其潛在的脫靶位點(diǎn)，選擇脫靶風(fēng)險(xiǎn)較低的sgRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建CRISPR-Cas9基因編輯載體。將設(shè)計(jì)好的sgRNA序列克隆到含有Cas9基因的表達(dá)載體中，常用的載體如pBUE411、pYLCRISPR/Cas9等。在克隆過(guò)程中，使用限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶等工具，將sgRNA表達(dá)盒準(zhǔn)確地插入到載體中。通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。將構(gòu)建好的基因編輯載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，轉(zhuǎn)化方法與過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌類似。以小麥幼胚或愈傷組織為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)將CRISPR-Cas9基因編輯載體導(dǎo)入小麥細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化后的材料經(jīng)過(guò)篩選、分化、生根等過(guò)程，獲得轉(zhuǎn)基因小麥植株。在篩選過(guò)程中，使用含有篩選抗生素的培養(yǎng)基，篩選出成功整合了基因編輯載體的細(xì)胞和植株。對(duì)基因編輯后的小麥植株進(jìn)行分子鑒定。提取轉(zhuǎn)基因小麥植株的基因組DNA，使用PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶位點(diǎn)附近的DNA片段。對(duì)擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行測(cè)序分析，通過(guò)與野生型序列進(jìn)行比對(duì)，確定基因編輯的類型和效率。若在靶位點(diǎn)檢測(cè)到堿基的插入或缺失，表明基因編輯成功。統(tǒng)計(jì)不同轉(zhuǎn)基因株系中基因編輯的發(fā)生頻率，評(píng)估CRISPR-Cas9系統(tǒng)在小麥中的編輯效率。觀察基因編輯后小麥植株的表型變化。在田間或溫室條件下，對(duì)基因編輯小麥植株的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察，記錄株高、穗型、產(chǎn)量、抗逆性等表型特征。在對(duì)小麥miR156靶基因SPL13進(jìn)行基因編輯后，發(fā)現(xiàn)編輯后的小麥植株在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的表型差異，如抽穗期延遲、株型緊湊等。進(jìn)一步分析這些表型變化與基因編輯之間的關(guān)系，通過(guò)對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測(cè)，揭示基因編輯對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育和生理功能的影響機(jī)制。4.3功能機(jī)制探究4.3.1參與的生物學(xué)途徑分析通過(guò)GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路分析，深入探究小麥microRNA參與的生物學(xué)過(guò)程、分子功能及信號(hào)通路。利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）等在線分析工具，將預(yù)測(cè)得到的小麥microRNA靶基因?qū)敕治鱿到y(tǒng)。在GO分析中，從生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成三個(gè)層面進(jìn)行注釋。在生物過(guò)程方面，發(fā)現(xiàn)許多小麥microRNA的靶基因顯著富集于植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。miR160的靶基因生長(zhǎng)素響應(yīng)因子ARF10、ARF16和ARF17參與生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在正常生長(zhǎng)條件下，miR160通過(guò)對(duì)ARF基因的調(diào)控，維持生長(zhǎng)素信號(hào)的平衡，確保植物根系和地上部分的正常生長(zhǎng)。在逆境脅迫下，miR160的表達(dá)發(fā)生變化，進(jìn)而影響ARF基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素信號(hào)通路，使植物能夠適應(yīng)逆境環(huán)境。研究表明，在干旱脅迫下，小麥中miR160的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致ARF10等靶基因的表達(dá)受到抑制，從而影響生長(zhǎng)素的信號(hào)傳遞，使植物根系生長(zhǎng)發(fā)生改變，增強(qiáng)對(duì)干旱的耐受性。一些靶基因富集于碳水化合物代謝過(guò)程。miR156的靶基因SPL家族成員參與調(diào)控小麥的碳代謝相關(guān)基因。在小麥的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，miR156-SPL模塊通過(guò)調(diào)節(jié)碳代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)，影響碳水化合物的合成、運(yùn)輸和分配。在小麥的灌漿期，miR156的表達(dá)水平下降，使得SPL基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)與淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)，有利于籽粒中淀粉的積累，提高小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。在分子功能層面，許多靶基因具有轉(zhuǎn)錄因子活性，如miR172的靶基因AP2類轉(zhuǎn)錄因子，在植物花器官發(fā)育和開(kāi)花時(shí)間調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR172通過(guò)抑制AP2基因的表達(dá)，促進(jìn)花器官的正常發(fā)育和開(kāi)花時(shí)間的精準(zhǔn)調(diào)控。在小麥中，當(dāng)miR172的表達(dá)異常時(shí)，會(huì)導(dǎo)致AP2基因表達(dá)失調(diào)，進(jìn)而影響小麥的花器官形態(tài)和開(kāi)花進(jìn)程，最終影響小麥的結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量。在細(xì)胞組成方面，靶基因主要富集于細(xì)胞核、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的類別。這些基因參與維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和正常功能的行使。例如，某些與細(xì)胞骨架組裝和維持相關(guān)的基因是小麥miRNA的靶基因，它們通過(guò)調(diào)控細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，影響細(xì)胞的形態(tài)建成和細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸。在KEGG通路分析中，發(fā)現(xiàn)小麥microRNA的靶基因參與了多條重要的信號(hào)通路。其中，植物-病原體互作通路中，miR408的靶基因可能與小麥的抗病性密切相關(guān)。在白粉菌侵染小麥的過(guò)程中，miR408的表達(dá)發(fā)生顯著變化，其靶基因的表達(dá)也隨之改變。研究表明，miR408可能通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)，影響小麥細(xì)胞壁的合成和抗氧化防御系統(tǒng)，從而增強(qiáng)小麥對(duì)白粉病的抗性。在MAPK信號(hào)通路中，一些miRNA的靶基因參與了該通路的調(diào)控。MAPK信號(hào)通路在植物應(yīng)對(duì)各種逆境脅迫和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要的信號(hào)傳遞作用。例如，miR393的靶基因生長(zhǎng)素受體TIR1等參與了MAPK信號(hào)通路的調(diào)控。在高溫脅迫下，miR393的表達(dá)上調(diào)，抑制TIR1基因的表達(dá)，進(jìn)而影響MAPK信號(hào)通路的激活，調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)。這些結(jié)果表明，小麥microRNA通過(guò)對(duì)靶基因的調(diào)控，廣泛參與了植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，在小麥的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。4.3.2與其他調(diào)控因子的互作研究小麥microRNA與轉(zhuǎn)錄因子、其他非編碼RNA等調(diào)控因子的相互作用，有助于揭示其協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育和逆境適應(yīng)的影響。采用酵母雙雜交技術(shù)研究小麥microRNA與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。以miR164和NAC轉(zhuǎn)錄因子為例，將miR164的前體序列克隆到酵母雙雜交的誘餌載體中，將NAC轉(zhuǎn)錄因子的編碼序列克隆到獵物載體中。將構(gòu)建好的誘餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，在缺乏特定氨基酸的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。若miR164與NAC轉(zhuǎn)錄因子之間存在相互作用，酵母細(xì)胞能夠在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并激活報(bào)告基因的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，如β-半乳糖苷酶活性，來(lái)驗(yàn)證兩者之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR164與NAC轉(zhuǎn)錄因子之間存在直接的相互作用，這種相互作用可能影響NAC轉(zhuǎn)錄因子的活性和功能，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，參與小麥的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)。利用RNA免疫沉淀（RIP）技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序（RIP-seq），探究小麥microRNA與其他非編碼RNA的相互作用。首先，制備針對(duì)特定miRNA的抗體，將小麥細(xì)胞提取物與抗體進(jìn)行孵育，使抗體與miRNA及其結(jié)合的RNA形成免疫復(fù)合物。通過(guò)免疫沉淀技術(shù)分離免疫復(fù)合物，提取其中的RNA，進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找與miRNA共沉淀的其他非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，一些長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）與小麥miRNA存在相互作用。例如，lncRNA-X與miR159相互作用，通過(guò)生物信息