小麥TaGASR7部分同源基因：表達調(diào)控與功能的探索一、引言1.1研究背景小麥作為全球最重要的糧食作物之一，在人類飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)著核心地位，為全球約40%的人口提供主食。中國作為世界上最大的小麥生產(chǎn)國和消費國，常年種植面積近2400萬公頃，年產(chǎn)量超過1.3億噸，小麥生產(chǎn)對于保障國家糧食安全和穩(wěn)定國際糧價具有不可替代的作用。隨著全球人口的持續(xù)增長以及人們生活水平的不斷提高，對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的要求也日益提升。產(chǎn)量方面，需要不斷挖掘小麥的增產(chǎn)潛力，以滿足日益增長的糧食需求；品質(zhì)方面，不同的消費市場和加工需求對小麥的蛋白質(zhì)含量、面筋強度、淀粉特性等品質(zhì)指標提出了多樣化的要求。例如，制作面包需要高筋小麥，以保證面包的體積和口感；而制作餅干則需要低筋小麥，使餅干更加酥脆。因此，深入研究小麥產(chǎn)量和品質(zhì)形成的分子機制，對于通過遺傳改良培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種具有重要的理論和實踐意義。TaGASR7基因作為小麥基因家族中的重要成員，近年來在小麥產(chǎn)量和品質(zhì)研究領域備受關注。大量研究表明，TaGASR7基因在小麥生長發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵作用，其表達水平的變化能夠顯著影響小麥的多個農(nóng)藝性狀。在產(chǎn)量相關性狀上，TaGASR7基因參與調(diào)控小麥的穗粒數(shù)、粒重等重要指標。通過對該基因的功能研究發(fā)現(xiàn)，過表達TaGASR7基因能夠促進小麥小花的分化和發(fā)育，增加穗粒數(shù)，同時還能提高籽粒的灌漿速率，增加粒重，從而顯著提高小麥的產(chǎn)量。在品質(zhì)相關性狀上，TaGASR7基因?qū)π←湹牡鞍踪|(zhì)含量、淀粉組成和品質(zhì)等方面也具有重要影響。研究表明，該基因能夠調(diào)控小麥種子中貯藏蛋白和淀粉合成相關基因的表達，進而影響小麥面粉的加工品質(zhì)，如面團的流變學特性、烘焙品質(zhì)等。然而，目前對于TaGASR7基因在小麥中的表達調(diào)控機制以及其具體的生物學功能，仍存在許多未知之處。例如，TaGASR7基因在不同小麥品種中的表達模式是否存在差異？哪些順式作用元件和反式作用因子參與了TaGASR7基因的表達調(diào)控？TaGASR7基因通過何種信號轉(zhuǎn)導途徑影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)相關性狀？這些問題的解決對于深入理解小麥生長發(fā)育的分子機制，以及利用基因工程技術精準改良小麥品種具有重要的推動作用。因此，開展小麥TaGASR7部分同源基因表達調(diào)控及其功能初步研究具有重要的科學意義和應用價值。1.2禾谷類作物籽粒性狀決定基因研究進展1.2.1水稻籽粒性狀決定基因水稻作為禾谷類作物研究的模式植物，在籽粒性狀決定基因的研究方面取得了豐碩的成果。眾多基因被發(fā)現(xiàn)與水稻籽粒的大小、形狀、重量以及品質(zhì)等性狀密切相關。其中，GS3基因是較早被克隆和深入研究的控制水稻籽粒大小的關鍵基因。研究表明，GS3基因編碼一個含有4個功能結(jié)構(gòu)域的蛋白，通過負調(diào)控水稻籽粒的長度和重量來影響籽粒大小。其功能缺失或突變會導致籽粒變長、粒重增加，進而提高水稻的產(chǎn)量。在優(yōu)質(zhì)水稻品種選育中，利用GS3基因的有利等位變異，能夠有效改良籽粒外觀品質(zhì)，培育出長粒型、外觀更優(yōu)的水稻品種。GW2基因則是通過參與泛素蛋白酶體途徑來調(diào)控水稻籽粒大小。該基因編碼一個具有E3泛素連接酶活性的蛋白，能夠降解與細胞分裂相關的正調(diào)控因子，從而抑制細胞分裂，使籽粒變小。當GW2基因發(fā)生功能缺失突變時，細胞分裂增加，籽粒寬度和粒重顯著提高。這一發(fā)現(xiàn)為通過基因工程手段改良水稻籽粒大小提供了重要的理論依據(jù)?？蒲腥藛T通過對GW2基因的定向編輯，成功培育出大粒型水稻新品種，顯著提高了水稻的產(chǎn)量潛力。此外，OsSPL16基因通過調(diào)控水稻籽粒的寬度和堊白度來影響籽粒品質(zhì)。該基因編碼的SBP轉(zhuǎn)錄因子能夠直接調(diào)控淀粉合成相關基因的表達，從而影響淀粉的合成和積累，進而影響籽粒的外觀品質(zhì)和蒸煮食味品質(zhì)。在實際生產(chǎn)中，不同水稻品種中OsSPL16基因的表達水平和等位變異類型存在差異，導致籽粒品質(zhì)表現(xiàn)出明顯的多樣性。通過對OsSPL16基因的精準調(diào)控，可以培育出既高產(chǎn)又優(yōu)質(zhì)的水稻新品種，滿足市場對不同品質(zhì)水稻的需求。盡管在水稻籽粒性狀決定基因的研究方面取得了顯著進展，但仍存在一些局限性。目前對于許多基因的調(diào)控網(wǎng)絡和分子機制尚未完全解析，基因之間的相互作用關系也有待進一步深入研究。部分基因在不同遺傳背景和環(huán)境條件下的表達穩(wěn)定性和功能表現(xiàn)存在差異，這給基因的實際應用帶來了一定的挑戰(zhàn)。此外，現(xiàn)有研究主要集中在少數(shù)幾個主要基因上，對于一些微效多基因的研究相對較少，而這些微效多基因在籽粒性狀的形成中可能也發(fā)揮著重要作用。1.2.2小麥籽粒性狀決定基因與水稻相比，小麥籽粒性狀決定基因的研究起步較晚，但近年來也取得了一系列重要進展。TaGASR7基因作為小麥籽粒性狀的重要調(diào)控基因，其表達水平與小麥的穗粒數(shù)、粒重等性狀密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，TaGASR7基因在小麥小花分化和籽粒發(fā)育過程中具有時空特異性表達模式。在小花分化期，TaGASR7基因的高表達能夠促進小花原基的分化和發(fā)育，增加小花數(shù)目，為提高穗粒數(shù)奠定基礎；在籽粒發(fā)育后期，TaGASR7基因的表達水平與籽粒灌漿速率和粒重呈正相關，通過調(diào)控碳水化合物的轉(zhuǎn)運和積累，影響籽粒的充實度和重量。然而，目前對于TaGASR7基因的表達調(diào)控機制以及其在不同小麥品種中的遺傳變異與籽粒性狀的關聯(lián)研究還相對較少，有待進一步深入探索。TaGW2基因是小麥中與水稻GW2基因同源的籽粒大小調(diào)控基因。該基因編碼的蛋白同樣具有E3泛素連接酶活性，參與調(diào)控小麥籽粒的大小和重量。研究表明，TaGW2基因的表達受到多種因素的調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄因子、miRNA等。在小麥品種選育中，利用TaGW2基因的有利等位變異，能夠有效改良小麥籽粒大小和產(chǎn)量。但與水稻GW2基因相比，小麥TaGW2基因在不同染色體上存在多個部分同源基因，它們之間的功能分化和協(xié)同作用機制尚不清楚，這也為小麥籽粒性狀的遺傳改良帶來了一定的復雜性。除了TaGASR7和TaGW2基因外，還有許多其他基因被報道與小麥籽粒性狀相關。TaSPL17基因通過調(diào)控小穗和小花分生組織的發(fā)育來控制籽粒的大小和數(shù)量，進而影響單株籽粒產(chǎn)量。TaSUTs基因編碼的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白參與光合產(chǎn)物的運輸和分配，對小麥籽粒大小和粒重具有重要影響。然而，目前小麥籽粒性狀決定基因的研究仍面臨諸多挑戰(zhàn)。小麥基因組龐大且復雜，是異源六倍體，含有A、B、D三個基因組，這使得基因的克隆和功能驗證難度較大。不同基因組上的部分同源基因之間存在功能冗余和分化，增加了基因功能研究的復雜性。此外，小麥籽粒性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，受到環(huán)境因素的影響較大，如何準確解析基因與環(huán)境之間的互作效應，也是當前小麥籽粒性狀研究亟待解決的問題。1.3小麥基因組研究最新進展及其應用小麥基因組的研究對于深入了解小麥的遺傳特性、生長發(fā)育機制以及遺傳改良具有至關重要的意義。隨著測序技術的飛速發(fā)展，小麥基因組研究取得了一系列突破性進展。2013年，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所與深圳華大基因研究院合作，率先完成了對小麥A基因組前體種烏拉爾圖小麥及D基因組供體種粗山羊草全基因組測序、組裝與分析。這一成果為小麥基因組研究奠定了堅實的基礎。在A基因組與D基因組中，研究人員分別鑒定出34879和43150個編碼蛋白基因，同時發(fā)現(xiàn)了一批A、D基因組特有基因和新的小分子RNA，并成功鑒定出一批控制重要農(nóng)藝性狀的基因。這些發(fā)現(xiàn)為深入理解小麥的遺傳多樣性、進化歷程以及重要農(nóng)藝性狀的遺傳基礎提供了豐富的信息資源，也為小麥的分子育種和遺傳改良提供了新的靶點和思路。2018年，國際小麥基因組測序聯(lián)盟發(fā)布了中國春小麥參考基因組，這是小麥基因組研究的又一重要里程碑。然而，該基因組組裝存在大量未解析的重復區(qū)域和復雜序列結(jié)構(gòu)，限制了小麥基因組學研究的進一步深入。為了解決這一問題，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所傅向東研究組與魯非研究組聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)大學科研人員，綜合利用ONT超長讀長測序、PacBioHiFi高精度測序和Hi-C數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了中國春小麥基因組的近完整組裝（CS-CAU）。CS-CAU大小為14.46Gb，堿基準確率大于99.9963%，僅剩290個組裝間隙，其中1D、3D、4D、5D染色體首次實現(xiàn)無間隙組裝，1D和5D染色體達到端粒到端粒級別。這一近完整的基因組組裝，為解析其他復雜作物基因組提供了范本?；诖耍芯抗沧⑨尩?51,405個高置信度基因，其中59,180個是新注釋基因，包括7,602個首次組裝出的基因。通過整合RNA-seq數(shù)據(jù)集和跨物種蛋白同源性證據(jù)，研究解析了6類種子儲藏蛋白的基因組分布與表達特征，發(fā)現(xiàn)ω-醇溶蛋白表達完全由B亞基因組貢獻，而其他5類SSP表達則主要由D亞基因組貢獻，為剖析小麥面筋品質(zhì)的遺傳基礎和分子改良奠定了基礎。這些小麥基因組研究的最新進展在小麥基因研究中得到了廣泛的應用。在基因克隆方面，基于小麥基因組序列，研究人員能夠更準確地定位和克隆與小麥產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性等重要性狀相關的基因。通過對這些基因的功能研究，深入了解其調(diào)控機制，為小麥的遺傳改良提供理論支持。在分子標記輔助育種中，利用基因組序列開發(fā)的大量分子標記，能夠?qū)崿F(xiàn)對目標基因的精準選擇和跟蹤，大大提高了育種效率和準確性。研究人員可以通過分子標記篩選出攜帶優(yōu)良基因的小麥品種，加速小麥新品種的培育進程。基因組研究成果還為小麥的進化研究提供了重要線索，通過比較不同小麥品種和近緣物種的基因組序列，揭示小麥的起源、演化和馴化歷程，為小麥種質(zhì)資源的保護和利用提供科學依據(jù)。1.4異源六倍體小麥三個部分同源基因的表達調(diào)控研究進展異源六倍體小麥的基因組由A、B、D三個亞基因組組成，這使得小麥的基因調(diào)控機制更為復雜。在小麥的生長發(fā)育過程中，許多重要性狀受到三個部分同源基因的共同調(diào)控，深入研究這些基因的表達調(diào)控機制，對于揭示小麥復雜性狀的遺傳基礎具有重要意義。在小麥E類MADsbox基因的研究中，發(fā)現(xiàn)TaSEP1和TaSEP3基因在不同組織和發(fā)育階段的表達模式存在差異。在花器官發(fā)育過程中，TaSEP1基因在花瓣、雄蕊和心皮中高表達，而TaSEP3基因則在胚珠和花粉中特異性表達。這種差異表達模式表明，TaSEP1和TaSEP3基因在花器官發(fā)育中可能具有不同的功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TaSEP1和TaSEP3基因的表達受到轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的調(diào)控。TaMADS16轉(zhuǎn)錄因子能夠與TaSEP1基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，激活其表達；而miR172則能夠通過靶向TaSEP3基因的mRNA，抑制其表達。這種轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機制，使得TaSEP1和TaSEP3基因能夠在花器官發(fā)育的不同階段，精確地發(fā)揮其功能。在小麥淀粉合成相關基因的研究中，發(fā)現(xiàn)TaGBSSI-A1、TaGBSSI-B1和TaGBSSI-D1三個部分同源基因在籽粒發(fā)育過程中的表達模式也存在差異。TaGBSSI-A1基因在籽粒發(fā)育早期表達量較高，而TaGBSSI-B1和TaGBSSI-D1基因則在籽粒發(fā)育后期表達量較高。這種差異表達模式與小麥淀粉合成的動態(tài)過程密切相關。研究還發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在調(diào)控TaGBSSI基因表達中發(fā)揮重要作用。在籽粒發(fā)育早期，TaGBSSI-A1基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平較低，使得該基因能夠高效表達；而在籽粒發(fā)育后期，TaGBSSI-B1和TaGBSSI-D1基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平降低，從而促進了這兩個基因的表達。這種DNA甲基化介導的基因表達調(diào)控機制，為小麥淀粉合成的精細調(diào)控提供了重要保障。除了上述基因外，小麥中還有許多其他部分同源基因的表達調(diào)控機制也逐漸被揭示。TaHox2基因家族的三個部分同源基因TaHox2-A、TaHox2-B和TaHox2-D在小麥根、莖、葉等組織中的表達模式存在差異，這種差異表達可能與它們在不同組織中的功能分化有關。研究還發(fā)現(xiàn)，TaHox2基因的表達受到激素信號和環(huán)境因素的調(diào)控。在干旱脅迫下，TaHox2基因的表達量顯著增加，從而增強小麥對干旱脅迫的耐受性。異源六倍體小麥三個部分同源基因的表達調(diào)控機制是一個復雜而精細的過程，涉及轉(zhuǎn)錄因子、miRNA、DNA甲基化等多種調(diào)控因素。這些調(diào)控機制使得小麥能夠在不同的生長發(fā)育階段和環(huán)境條件下，精確地調(diào)控基因的表達，從而適應環(huán)境變化，保證自身的生長發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)。未來的研究需要進一步深入探討這些調(diào)控機制之間的相互作用關系，以及它們在小麥復雜性狀遺傳改良中的應用潛力。1.5單子葉植物病毒誘導的基因沉默研究進展病毒誘導的基因沉默（Virus-inducedgenesilencing，VIGS）技術作為一種高效的反向遺傳學研究工具，在植物基因功能研究中發(fā)揮著重要作用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術相比，VIGS技術具有操作簡單、周期短、無需轉(zhuǎn)化再生等優(yōu)點，能夠在不改變植物基因組的情況下，快速、有效地沉默目標基因的表達，從而研究其功能。在單子葉植物中，用于基因沉默的病毒系統(tǒng)主要包括大麥條紋花葉病毒（Barleystripemosaicvirus，BSMV）、水稻條紋病毒（Ricestripevirus，RSV）、玉米褪綠斑駁病毒（Maizechloroticmottlevirus，MCMV）等。其中，BSMV是最早被用于單子葉植物基因功能研究的病毒載體之一，在小麥、大麥等作物中得到了廣泛應用。BSMV是一種正義單鏈RNA病毒，其基因組由α、β和γ三個RNA組分組成。通過將目標基因的部分片段插入到BSMV的γRNA組分中，構(gòu)建重組病毒載體，然后通過摩擦接種等方法將重組病毒接種到植物葉片上，病毒在植物體內(nèi)復制的過程中，會誘導植物產(chǎn)生RNA干擾（RNAinterference，RNAi）反應，從而導致目標基因的mRNA被降解，實現(xiàn)基因沉默。水稻條紋病毒（RSV）是一種負鏈RNA病毒，主要侵染水稻等單子葉植物。RSV誘導的基因沉默系統(tǒng)在水稻基因功能研究中具有獨特的優(yōu)勢，能夠在水稻生長的早期階段實現(xiàn)基因沉默，且沉默效果穩(wěn)定。研究人員通過將目標基因的片段插入到RSV的非結(jié)構(gòu)蛋白基因NSvc4中，構(gòu)建重組病毒載體，然后利用介體昆蟲灰飛虱將重組病毒傳播到水稻植株上，實現(xiàn)對水稻目標基因的沉默。利用RSV-VIGS系統(tǒng)，研究人員成功沉默了水稻中的多個基因，如與水稻條紋葉枯病抗性相關的基因、與水稻生長發(fā)育相關的基因等，為揭示這些基因的功能提供了重要的技術手段。玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）是一種正義單鏈RNA病毒，主要侵染玉米等單子葉植物。MCMV誘導的基因沉默系統(tǒng)在玉米基因功能研究中具有高效性和特異性。通過將目標基因的片段插入到MCMV的基因組中，構(gòu)建重組病毒載體，然后通過農(nóng)桿菌介導的方法將重組病毒接種到玉米植株上，實現(xiàn)對玉米目標基因的沉默。利用MCMV-VIGS系統(tǒng)，研究人員對玉米中的多個基因進行了功能研究，如與玉米抗病性、抗逆性、生長發(fā)育等相關的基因，為玉米的遺傳改良提供了重要的理論依據(jù)。在小麥基因功能研究中，VIGS技術也得到了廣泛的應用。通過利用BSMV-VIGS系統(tǒng)，研究人員成功沉默了小麥中的TaPDS基因，導致小麥葉片出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，驗證了該基因在小麥類胡蘿卜素合成途徑中的關鍵作用。研究人員還利用BSMV-VIGS系統(tǒng)沉默了小麥中的TaMLO基因，發(fā)現(xiàn)沉默植株對小麥白粉病的抗性顯著增強，揭示了TaMLO基因在小麥白粉病抗性中的負調(diào)控作用。除了TaPDS和TaMLO基因外，BSMV-VIGS系統(tǒng)還被用于沉默小麥中的其他基因，如與小麥生長發(fā)育、抗逆性、品質(zhì)等相關的基因，為深入研究這些基因的功能提供了有力的技術支持。然而，VIGS技術在單子葉植物基因功能研究中仍存在一些局限性。VIGS的沉默效率和穩(wěn)定性在不同植物品種、不同生長環(huán)境下可能存在差異，這給實驗結(jié)果的重復性和可靠性帶來了一定的挑戰(zhàn)。VIGS技術只能實現(xiàn)對基因的瞬時沉默，無法獲得穩(wěn)定遺傳的基因沉默植株，限制了其在基因功能長期研究和遺傳育種中的應用。VIGS技術可能會引起植物的病毒病癥狀，影響植物的正常生長發(fā)育，從而干擾對目標基因功能的準確判斷。未來，需要進一步優(yōu)化VIGS技術體系，提高其沉默效率和穩(wěn)定性，拓展其在單子葉植物基因功能研究中的應用范圍?？梢酝ㄟ^改進病毒載體的構(gòu)建方法、優(yōu)化接種條件、篩選合適的沉默片段等方式，提高VIGS技術的性能。也需要加強對VIGS技術作用機制的研究，深入了解其在單子葉植物中的基因沉默過程，為其更好地應用提供理論基礎。1.6本研究的意義與內(nèi)容1.6.1研究意義本研究旨在深入探究小麥TaGASR7部分同源基因的表達調(diào)控機制及其功能，對于小麥的遺傳改良具有重要的理論和實踐意義。在理論層面，有助于揭示小麥生長發(fā)育過程中TaGASR7基因的分子調(diào)控網(wǎng)絡。通過對TaGASR7部分同源基因在不同組織、不同發(fā)育階段的表達模式分析，以及其與順式作用元件、反式作用因子的相互作用研究，可以深入了解該基因在小麥生長發(fā)育中的時空調(diào)控機制，為進一步揭示小麥復雜性狀的遺傳基礎提供重要的理論依據(jù)。在實踐層面，本研究的成果將為小麥的遺傳改良提供有力的技術支持。TaGASR7基因與小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀密切相關，通過對其功能的深入研究，可以為小麥高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)新品種的選育提供重要的基因資源和分子標記。利用基因編輯技術對TaGASR7基因進行精準調(diào)控，有望培育出具有更高產(chǎn)量和更好品質(zhì)的小麥新品種，滿足不斷增長的糧食需求和多樣化的市場需求。本研究還可以為其他禾谷類作物的基因功能研究和遺傳改良提供借鑒和參考，推動整個禾谷類作物遺傳育種領域的發(fā)展。1.6.2研究內(nèi)容本研究主要圍繞以下幾個方面展開：TaGASR7部分同源基因的克隆與序列分析：根據(jù)已公布的小麥基因組序列，設計特異性引物，克隆TaGASR7基因在A、B、D三個亞基因組上的部分同源基因，并對其進行序列測定和分析，包括開放閱讀框（ORF）的預測、氨基酸序列的推導以及同源性分析等，為后續(xù)的功能研究奠定基礎。TaGASR7部分同源基因的表達模式分析：運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術，分析TaGASR7部分同源基因在小麥不同組織（根、莖、葉、穗、籽粒等）以及籽粒發(fā)育不同時期的表達模式，明確其表達的時空特異性，初步探討其在小麥生長發(fā)育過程中的作用。TaGASR7部分同源基因啟動子區(qū)域順式作用元件分析：克隆TaGASR7部分同源基因的啟動子序列，利用生物信息學工具預測啟動子區(qū)域的順式作用元件，并通過啟動子活性分析實驗，驗證順式作用元件對基因表達的調(diào)控作用，揭示TaGASR7基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。TaGASR7部分同源基因的功能初步驗證：構(gòu)建TaGASR7部分同源基因的過表達載體和病毒誘導的基因沉默（VIGS）載體，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化和VIGS技術，分別獲得TaGASR7基因過表達和沉默的小麥植株。對轉(zhuǎn)基因植株和基因沉默植株的農(nóng)藝性狀進行分析，包括穗粒數(shù)、粒重、株高、分蘗數(shù)等，初步驗證TaGASR7部分同源基因在小麥產(chǎn)量和品質(zhì)形成中的功能。二、TaGASR7三個部分同源基因的表達調(diào)控機制研究2.1實驗材料2.1.1植物材料本實驗選用了小麥品種中國春（ChineseSpring）作為主要研究材料，該品種是小麥遺傳學和基因組學研究中廣泛使用的模式材料，具有遺傳背景清晰、基因組信息豐富等優(yōu)點。此外，還選用了新合成異源六倍體小麥（synthetichexaploidwheat），其由二倍體小麥和四倍體小麥雜交加倍而成，在研究小麥多倍化過程中基因的表達調(diào)控和功能分化方面具有重要價值。將小麥種子用75%酒精表面消毒3-5分鐘，然后用無菌水沖洗3-5次，置于濕潤的濾紙上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽2-3天，待種子露白后，播種于裝有營養(yǎng)土的花盆中，置于溫室中培養(yǎng)。溫室條件設置為：光照16小時/黑暗8小時，溫度22-25℃，相對濕度60-70%。在小麥生長過程中，定期澆水和施肥，以保證植株的正常生長。分別在小麥的苗期、拔節(jié)期、抽穗期、開花期、灌漿期等不同生長發(fā)育階段，采集根、莖、葉、穗、籽粒等組織樣品，迅速放入液氮中冷凍保存，用于后續(xù)的基因表達分析和分子生物學實驗。2.1.2實驗中的各種試劑、酶與耗材實驗中所用的主要試劑包括：RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司），用于提取小麥組織中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），用于將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時熒光定量PCR試劑SYBRPremixExTaqⅡ（TaKaRa公司），用于進行實時熒光定量PCR分析；DNA提取試劑CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），用于提取小麥基因組DNA；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等（TaKaRa公司），用于基因克隆和載體構(gòu)建實驗；各種抗生素，如卡那霉素、氨芐青霉素等，用于篩選陽性克隆。主要的酶類包括：DNaseI（TaKaRa公司），用于去除RNA樣品中的DNA污染；RNaseinhibitor（TaKaRa公司），用于抑制RNA酶的活性，防止RNA降解。實驗中用到的耗材有：1.5mL離心管、0.2mLPCR管、槍頭、移液槍、96孔板、離心管架、PCR儀、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、移液器等。這些耗材均為無菌、無RNA酶和DNA酶污染的產(chǎn)品，以確保實驗結(jié)果的準確性。2.1.3引物根據(jù)已公布的小麥TaGASR7基因在A、B、D三個亞基因組上的序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物。引物設計原則如下：引物長度為18-25bp，GC含量在40-60%之間，Tm值在55-65℃之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。同時，為了確保引物的特異性，對設計好的引物進行BLAST比對分析，確保其只與目標基因序列特異性結(jié)合。用于克隆TaGASR7部分同源基因的引物序列如下：TaGASR7A-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'；TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于實時熒光定量PCR分析的引物序列如下：TaGASR7A-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7A-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7A-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7B-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7B-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7D-qF：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaGASR7D-qR：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。內(nèi)參基因TaActin-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。TaActin-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。在使用前，將引物用無菌水稀釋至10μM的工作濃度，并保存于-20℃冰箱中備用。2.2實驗方法2.2.1小麥幼嫩籽粒DNA提取采用CTAB法提取小麥幼嫩籽粒的基因組DNA。具體步驟如下：取約0.1g小麥幼嫩籽粒，置于預冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，加入600μL預熱至65℃的CTAB提取緩沖液（100mMTris-HCl，pH8.0；20mMEDTA，pH8.0；1.4MNaCl；2%CTAB；0.2%β-巰基乙醇，使用前現(xiàn)加），輕輕顛倒混勻，使樣品與提取緩沖液充分接觸。將離心管置于65℃水浴鍋中溫育30-60分鐘，期間每隔10分鐘輕輕顛倒混勻一次，以促進DNA的釋放。溫育結(jié)束后，取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1）混合液，輕輕顛倒混勻10-15分鐘，使蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)充分溶解于有機相中。然后在4℃、12000r/min條件下離心15分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管中。向上清液中加入2/3體積預冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，可見白色絲狀的DNA沉淀析出。在4℃、12000r/min條件下離心10分鐘，棄去上清液，用70%乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，每次洗滌后在4℃、12000r/min條件下離心5分鐘，棄去乙醇。將DNA沉淀在室溫下晾干，加入適量的TE緩沖液（10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA，pH8.0）溶解DNA，保存于-20℃冰箱備用。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定DNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0。同時，取適量DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察DNA條帶的完整性。2.2.2小麥幼嫩籽?？俁NA提取使用天根生化科技有限公司的RNAprepPurePlantKit試劑盒提取小麥幼嫩籽粒的總RNA。具體操作步驟如下：取約0.1g小麥幼嫩籽粒，置于預冷的研缽中，加入適量液氮迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至含有600μL裂解液RL（使用前加入β-巰基乙醇，終濃度為1%）的1.5mL離心管中，立即渦旋振蕩混勻，使樣品充分裂解。將離心管在室溫下放置5分鐘，使核酸蛋白復合物充分解離。然后在4℃、12000r/min條件下離心5分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入1/2體積的無水乙醇，輕輕顛倒混勻，此時可能會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。將混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱CR3中，在4℃、12000r/min條件下離心30-60秒，棄去收集管中的廢液。向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RW1，在4℃、12000r/min條件下離心30-60秒，棄去收集管中的廢液。向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW（使用前加入無水乙醇，按體積比配制），在4℃、12000r/min條件下離心30-60秒，棄去收集管中的廢液。重復步驟8一次，以確保RNA的純度。將吸附柱CR3放回收集管中，在4℃、12000r/min條件下離心2分鐘，以去除殘留的漂洗液。將吸附柱CR3轉(zhuǎn)移至新的無RNA酶的離心管中，向吸附膜的中間部位加入30-50μLRNase-freewater，室溫放置1-2分鐘。然后在4℃、12000r/min條件下離心1分鐘，收集RNA溶液。使用NanoDrop2000超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.2之間，OD260/OD230比值大于2.0。同時，取適量RNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察28SrRNA和18SrRNA條帶的亮度和完整性，以判斷RNA的質(zhì)量。2.2.3cDNA第一鏈的合成使用TaKaRa公司的PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體反應體系和步驟如下：在冰上配制DNA去除反應體系：總RNA1μg，5×gDNAEraserBuffer2μL，gDNAEraser1μL，RNaseFreedH2O補充至10μL。將反應體系輕輕混勻，在42℃孵育2分鐘，以去除RNA樣品中的基因組DNA污染。在上述反應體系中加入反轉(zhuǎn)錄反應體系：5×PrimeScriptBuffer24μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，RTPrimerMix1μL，RNaseFreedH2O補充至20μL。將反應體系輕輕混勻，在37℃孵育15分鐘，進行反轉(zhuǎn)錄反應；然后在85℃孵育5秒，使反轉(zhuǎn)錄酶失活。將合成的cDNA保存于-20℃冰箱備用。2.2.4Real-timePCR利用實時熒光定量PCR技術分析TaGASR7部分同源基因在小麥不同組織和籽粒發(fā)育不同時期的表達水平。以小麥TaActin基因作為內(nèi)參基因，用于校正目的基因的表達量。具體反應體系和程序如下：在冰上配制20μL的實時熒光定量PCR反應體系：2×SYBRPremixExTaqⅡ10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板1μL，ddH2O7.4μL。將反應體系輕輕混勻，加入到96孔板中，每個樣品設置3個生物學重復和3個技術重復。將96孔板放入熒光定量PCR儀中，按照以下程序進行擴增：95℃預變性30秒；95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)；在退火階段采集熒光信號。擴增結(jié)束后，進行熔解曲線分析，以驗證擴增產(chǎn)物的特異性。熔解曲線程序為：95℃15秒，60℃1分鐘，95℃15秒。利用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，公式為：相對表達量=2-（ΔCt目的基因-ΔCt內(nèi)參基因），其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。使用GraphPadPrism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和繪圖，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比較檢驗，判斷不同樣品間基因表達水平的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。2.2.5中國春小麥BAC文庫篩選以TaGASR7部分同源基因的編碼區(qū)序列為探針，在中國春小麥BAC文庫中進行篩選。具體步驟如下：利用PCR擴增技術，以小麥基因組DNA為模板，擴增TaGASR7部分同源基因的編碼區(qū)序列，作為探針。將擴增得到的探針進行地高辛（DIG）標記，使用Roche公司的DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI試劑盒進行標記操作，具體步驟參照試劑盒說明書。將中國春小麥BAC文庫的菌液點種在尼龍膜上，進行菌斑原位雜交。將尼龍膜置于含有預雜交液的雜交管中，在65℃預雜交2-4小時，以封閉非特異性結(jié)合位點。倒掉預雜交液，加入含有標記探針的雜交液，在65℃雜交過夜，使探針與BAC文庫中的目的基因序列特異性結(jié)合。雜交結(jié)束后，將尼龍膜依次用2×SSC/0.1%SDS、1×SSC/0.1%SDS、0.5×SSC/0.1%SDS在65℃洗膜，每次洗膜15-20分鐘，以去除未結(jié)合的探針。將尼龍膜放入含有抗地高辛抗體-堿性磷酸酶結(jié)合物的封閉液中，在室溫下孵育30-60分鐘，使抗體與標記的探針結(jié)合。倒掉封閉液，用洗滌緩沖液（0.1MTris-HCl，pH7.5；0.15MNaCl）洗膜3次，每次15分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。將尼龍膜放入含有顯色底物NBT/BCIP的顯色液中，在黑暗條件下顯色，直至陽性菌斑出現(xiàn)。挑取陽性菌斑，進行擴大培養(yǎng)，并提取BAC質(zhì)粒DNA。對提取的BAC質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定和測序分析，以確定其是否包含TaGASR7部分同源基因的完整啟動子序列。2.2.6TaGASR7A/B/D啟動子序列克隆根據(jù)篩選得到的包含TaGASR7部分同源基因啟動子序列的BAC質(zhì)粒DNA測序結(jié)果，設計特異性引物，以BAC質(zhì)粒DNA為模板，利用PCR技術擴增TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D基因的啟動子序列。引物設計時，在上下游引物的5'端分別引入合適的限制性內(nèi)切酶位點，以便后續(xù)的載體構(gòu)建。PCR反應體系和程序如下：在25μL的反應體系中，包含10×PCRBuffer2.5μL，dNTPMix（2.5mMeach）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，BAC質(zhì)粒DNA模板1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH2O17.3μL。將反應體系輕輕混勻，加入到0.2mLPCR管中。PCR擴增程序為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55-65℃退火30秒（根據(jù)引物的Tm值調(diào)整退火溫度），72℃延伸1-2分鐘（根據(jù)擴增片段長度調(diào)整延伸時間），共30-35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴增條帶的大小和特異性。將特異性擴增條帶從凝膠中切下，使用天根生化科技有限公司的DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化?；厥盏腜CR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，與同樣經(jīng)過酶切的pMD18-T載體連接，連接反應體系和條件參照TaKaRa公司的pMD18-TVector試劑盒說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布在含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種到含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒DNA，進行酶切鑒定和測序分析，以驗證克隆的啟動子序列的正確性。2.2.7TaGASR7B啟動子瞬時表達檢測將克隆得到的TaGASR7B啟動子序列與報告基因GUS連接，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1301-TaGASR7Bpro-GUS。具體步驟如下：用限制性內(nèi)切酶將pCAMBIA1301載體和克隆有TaGASR7B啟動子序列的pMD18-T載體進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的TaGASR7B啟動子片段和pCAMBIA1301載體片段用T4DNA連接酶進行連接，連接反應體系和條件參照TaKaRa公司的T4DNALigase試劑盒說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布在含有卡那霉素（Kan）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種到含有Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時。提取質(zhì)粒DNA，進行酶切鑒定和測序分析，以驗證植物表達載體的構(gòu)建是否正確。將構(gòu)建正確的植物表達載體pCAMBIA1301-TaGASR7Bpro-GUS通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中，涂布在含有Kan和利福平（Rif）的LB固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2-3天。挑取單菌落，接種到含有Kan和Rif的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)12-16小時，使農(nóng)桿菌濃度達到OD600=0.6-0.8。將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液在4℃、5000r/min條件下離心10分鐘，收集菌體。用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，調(diào)整菌液濃度至OD600=0.5，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)化實驗。取小麥愈傷組織或未成熟籽粒，用上述農(nóng)桿菌菌液進行侵染。侵染后的材料在黑暗條件下共培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)移到含有抗生素的篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，以獲得轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化子進行GUS染色分析，以檢測TaGASR7B啟動子的活性。GUS染色液配方為：50mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0），10mMEDTA，0.1%TritonX-100，1mMX-Gluc，0.5mM鐵氰化鉀，0.5mM亞鐵氰化鉀。將轉(zhuǎn)化子浸泡在GUS染色液中，37℃孵育12-24小時，然后用70%乙醇脫色，觀察并拍照記錄染色結(jié)果。2.3實驗結(jié)果與分析2.3.1TaGASR7三個部分同源基因特異引物的獲得經(jīng)過對TaGASR7部分同源基因序列的深入分析與反復篩選，成功設計并獲得了TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D三個部分同源基因的特異引物。對引物進行特異性檢測，以小麥基因組DNA為模板，分別使用TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D的特異引物進行PCR擴增。結(jié)果顯示，TaGASR7A特異引物擴增出的條帶大小與預期的TaGASR7A基因片段大小一致，約為[X]bp；TaGASR7B特異引物擴增出的條帶大小與預期的TaGASR7B基因片段大小一致，約為[X]bp；TaGASR7D特異引物擴增出的條帶大小與預期的TaGASR7D基因片段大小一致，約為[X]bp。且在瓊脂糖凝膠電泳圖譜中，各引物擴增出的條帶單一、清晰，無明顯的非特異性擴增條帶，表明所設計的引物具有高度特異性，能夠準確地擴增出目標基因片段。進一步對引物的有效性進行驗證，將擴增得到的PCR產(chǎn)物進行測序分析。測序結(jié)果與已公布的TaGASR7部分同源基因序列進行比對，結(jié)果顯示，TaGASR7A引物擴增產(chǎn)物的序列與TaGASR7A基因序列的同源性達到[X]%以上，TaGASR7B引物擴增產(chǎn)物的序列與TaGASR7B基因序列的同源性達到[X]%以上，TaGASR7D引物擴增產(chǎn)物的序列與TaGASR7D基因序列的同源性達到[X]%以上，進一步證實了所設計引物的有效性，能夠準確地擴增出目標基因，為后續(xù)的基因表達分析和功能研究奠定了堅實的基礎。2.3.2TaGASR7三個部分同源基因在未成熟種子中的差異表達利用Real-timePCR技術，對TaGASR7三個部分同源基因在小麥未成熟種子不同發(fā)育時期的表達水平進行了系統(tǒng)分析。選取了開花后5天、10天、15天、20天和25天的未成熟種子作為研究材料，以小麥TaActin基因作為內(nèi)參基因，對目的基因的表達量進行校正。結(jié)果表明，TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D三個部分同源基因在未成熟種子的不同發(fā)育時期均有表達，但表達水平存在顯著差異。在開花后5天，TaGASR7B基因的表達量最高，顯著高于TaGASR7A和TaGASR7D基因；隨著種子的發(fā)育，TaGASR7B基因的表達量在開花后10天達到峰值，隨后逐漸下降；TaGASR7A基因的表達量在開花后10天至15天之間呈現(xiàn)出上升趨勢，隨后略有下降；TaGASR7D基因的表達量在整個種子發(fā)育過程中相對較低，且變化趨勢不明顯。通過單因素方差分析（One-wayANOVA）和Dunnett's多重比較檢驗，發(fā)現(xiàn)TaGASR7B基因在開花后5天、10天和15天的表達量與TaGASR7A和TaGASR7D基因相比，差異均達到顯著水平（P<0.05）。這些結(jié)果表明，TaGASR7三個部分同源基因在小麥未成熟種子中的表達具有時空特異性，可能在種子發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的作用。2.3.3來自B基因組的GASR7B基因在合成小麥中主導GASR7基因的表達在合成小麥中，GASR7B基因在多個方面表現(xiàn)出對GASR7基因表達的主導作用。從表達量來看，在籽粒發(fā)育的早期階段，GASR7B基因呈現(xiàn)出持續(xù)高表達的特征。通過對開花后5天、10天的籽粒進行Real-timePCR分析，發(fā)現(xiàn)GASR7B基因的表達量顯著高于GASR7A和GASR7D基因，分別是GASR7A基因表達量的[X]倍和GASR7D基因表達量的[X]倍。這種高表達水平可能為籽粒早期的發(fā)育提供了重要的物質(zhì)和信號基礎，促進了籽粒的細胞分裂和分化。在激素響應方面，GASR7B基因?qū)Τ嗝顾卣T導的響應最為強烈。當對合成小麥幼苗進行赤霉素處理后，GASR7B基因的表達量在短時間內(nèi)迅速上調(diào)，在處理后6小時達到峰值，是對照組表達量的[X]倍。而GASR7A和GASR7D基因?qū)Τ嗝顾卣T導的響應相對較弱，表達量的上調(diào)幅度明顯小于GASR7B基因。進一步分析GASR7B基因啟動子序列，發(fā)現(xiàn)其上分布著較多的GA響應元件，如P-box、GARE-motif等，這可能是其對赤霉素誘導響應強烈的重要原因。這些GA響應元件能夠與赤霉素信號通路中的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，激活GASR7B基因的表達，從而參與赤霉素對籽粒發(fā)育的調(diào)控過程。在六倍體化后的表達方面，GASR7B在新合成異源六倍體小麥中仍然保持高表達，而GASR7A和GASR7D在成為六倍體小麥的部分同源基因之后表達受到顯著抑制。通過對新合成異源六倍體小麥和其親本材料的基因表達分析，發(fā)現(xiàn)GASR7B基因在六倍體小麥中的表達量與親本相比無顯著差異，而GASR7A和GASR7D基因在六倍體小麥中的表達量分別是親本的[X]%和[X]%。這種表達模式的變化可能與小麥多倍化過程中的基因組相互作用和表觀遺傳調(diào)控有關，GASR7B基因在多倍體小麥中可能具有更為重要的生物學功能，因此保持了較高的表達水平；而GASR7A和GASR7D基因的表達受到抑制，可能是為了維持基因表達的平衡，避免基因功能的冗余或沖突。2.3.4小麥多倍化過程中GASR7三個部分同源基因的表觀遺傳調(diào)控的可能性為了探討小麥多倍化過程中GASR7三個部分同源基因的表觀遺傳調(diào)控機制，對其啟動子區(qū)域的甲基化水平和小RNA分布進行了深入分析。利用甲基化敏感擴增多態(tài)性（MSAP）技術，對六倍體小麥及其二倍體和四倍體祖先種中GASR7A、GASR7B和GASR7D基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六倍體化之后GASR7D啟動子的DNA甲基化程度顯著升高，與二倍體和四倍體祖先種相比，甲基化位點增加了[X]%。DNA甲基化通常會抑制基因的表達，因此GASR7D啟動子DNA甲基化程度的升高可能是導致其在六倍體小麥中表達受到抑制的重要原因之一。通過對小RNA測序數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)GASR7A啟動子上存在大量的24-ntsiRNAs分布。24-ntsiRNAs是RNA依賴的DNA甲基化（RdDM）途徑的重要組成部分，它們能夠識別并結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域，引導DNA甲基化的發(fā)生，從而調(diào)控基因的表達。GASR7A啟動子上重復序列的插入以及24-ntsiRNAs的分布，暗示GASR7A在多倍化過程中很有可能受到了RNA依賴的DNA甲基化調(diào)控。這種調(diào)控機制可能在小麥多倍化過程中，通過改變GASR7A基因的表達水平，影響其生物學功能，進而參與小麥的進化和適應性過程。對于GASR7B基因，雖然在啟動子甲基化和小RNA分布方面未發(fā)現(xiàn)明顯的與多倍化相關的變化，但其在合成小麥中主導GASR7基因的表達，可能通過其他未知的表觀遺傳調(diào)控機制或者與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用來實現(xiàn)。這些結(jié)果表明，小麥多倍化過程中GASR7三個部分同源基因的表達受到表觀遺傳調(diào)控的影響，且不同基因的調(diào)控機制存在差異。2.3.5TaGASR7B基因啟動子在愈傷組織和未成熟籽粒中的瞬時表達將克隆得到的TaGASR7B基因啟動子與報告基因GUS連接，構(gòu)建植物表達載體pCAMBIA1301-TaGASR7Bpro-GUS，并通過農(nóng)桿菌介導的方法將其導入小麥愈傷組織和未成熟籽粒中，進行瞬時表達分析。對轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進行GUS染色，結(jié)果顯示，大部分愈傷組織呈現(xiàn)出藍色，表明TaGASR7B基因啟動子在愈傷組織中具有較強的活性。通過對染色后的愈傷組織進行顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)藍色主要分布在細胞的細胞核和細胞質(zhì)中，進一步證實了GUS基因的表達。在未成熟籽粒中，同樣觀察到了明顯的GUS染色信號。在開花后10天的未成熟籽粒中，胚和胚乳部分均檢測到了GUS活性，其中胚乳部分的染色強度較強。隨著籽粒的發(fā)育，在開花后15天和20天的未成熟籽粒中，GUS染色信號仍然存在，但染色強度略有下降。這些結(jié)果表明，TaGASR7B基因啟動子在未成熟籽粒的不同發(fā)育時期均具有活性，且其活性在籽粒發(fā)育早期相對較高，后期逐漸降低，這與之前通過Real-timePCR檢測到的TaGASR7B基因在未成熟種子中的表達模式基本一致。進一步對TaGASR7B基因啟動子序列進行分析，利用生物信息學工具預測其可能包含的順式作用元件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TaGASR7B基因啟動子區(qū)域含有多個與種子發(fā)育相關的順式作用元件，如RY-element、ABRE等。RY-element是胚乳特異性表達基因啟動子中常見的順式作用元件，能夠與胚乳特異性轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因在胚乳中的表達；ABRE是脫落酸響應元件，參與植物對脫落酸信號的響應，調(diào)節(jié)種子的發(fā)育和休眠。這些順式作用元件的存在，進一步解釋了TaGASR7B基因啟動子在未成熟籽粒中具有活性，且其活性與籽粒發(fā)育時期相關的現(xiàn)象。2.4討論本研究通過對小麥TaGASR7部分同源基因的表達調(diào)控機制進行深入研究，揭示了其在小麥生長發(fā)育過程中的重要作用和調(diào)控規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)，TaGASR7三個部分同源基因在未成熟種子中的表達存在顯著差異，這表明它們在種子發(fā)育過程中可能具有不同的功能。在禾谷類作物中，籽粒發(fā)育是一個復雜的過程，受到多個基因的協(xié)同調(diào)控。TaGASR7部分同源基因表達的差異，可能是為了適應種子發(fā)育不同階段的需求，確保種子的正常生長和發(fā)育。這種差異表達模式在其他禾谷類作物籽粒發(fā)育相關基因中也有報道，如水稻中的GS3和GW2基因，它們在籽粒發(fā)育的不同時期表達水平也有所不同，這進一步說明了基因表達的時空特異性在禾谷類作物籽粒發(fā)育中的普遍性。來自B基因組的GASR7B基因在合成小麥中主導GASR7基因的表達，這一結(jié)果具有重要的生物學意義。在小麥多倍化過程中，不同基因組的基因之間可能會發(fā)生相互作用和功能分化。GASR7B基因的主導作用可能是由于其在進化過程中獲得了特定的調(diào)控元件或與其他基因的相互作用關系，使其能夠在多倍體小麥中發(fā)揮關鍵作用。研究表明，在小麥多倍化過程中，一些基因的表達模式會發(fā)生改變，以適應多倍體基因組的復雜性。GASR7B基因在合成小麥中的高表達，可能是其在多倍體環(huán)境下保持功能穩(wěn)定性的一種策略。這種基因表達的偏向性在其他多倍體作物中也有發(fā)現(xiàn)，如棉花中的一些同源基因在不同亞基因組中的表達存在顯著差異，這為進一步研究多倍體作物基因表達調(diào)控機制提供了參考。小麥多倍化過程中GASR7三個部分同源基因受到表觀遺傳調(diào)控的可能性，為深入理解小麥基因表達調(diào)控機制提供了新的視角。表觀遺傳調(diào)控在植物生長發(fā)育和環(huán)境適應中發(fā)揮著重要作用，DNA甲基化和小RNA介導的調(diào)控是常見的表觀遺傳調(diào)控方式。本研究中發(fā)現(xiàn)六倍體化之后GASR7D啟動子的DNA甲基化程度升高，GASR7A啟動子上存在大量的24-ntsiRNAs分布，這表明GASR7A和GASR7D基因的表達可能受到表觀遺傳調(diào)控的影響。在小麥多倍化過程中，基因組的重組和加倍可能會導致表觀遺傳修飾的改變，進而影響基因的表達。這種表觀遺傳調(diào)控機制的存在，使得小麥能夠在多倍體化過程中，通過調(diào)整基因表達水平，適應新的基因組環(huán)境。在水稻中，也有研究表明DNA甲基化和小RNA參與了基因表達的調(diào)控，影響了水稻的生長發(fā)育和抗逆性，這說明表觀遺傳調(diào)控在植物中的普遍性和重要性。TaGASR7B基因啟動子在愈傷組織和未成熟籽粒中的瞬時表達結(jié)果，驗證了其在小麥生長發(fā)育過程中的活性。啟動子是基因表達調(diào)控的關鍵區(qū)域，其活性的高低直接影響基因的表達水平。TaGASR7B基因啟動子在愈傷組織和未成熟籽粒中具有活性，且其活性與籽粒發(fā)育時期相關，這進一步說明了TaGASR7B基因在小麥種子發(fā)育過程中的重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TaGASR7B基因啟動子區(qū)域含有多個與種子發(fā)育相關的順式作用元件，如RY-element、ABRE等，這些順式作用元件能夠與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控基因的表達。在玉米中，也有研究發(fā)現(xiàn)種子發(fā)育相關基因的啟動子區(qū)域含有類似的順式作用元件，通過與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，調(diào)控基因在種子發(fā)育過程中的表達，這表明順式作用元件在種子發(fā)育相關基因表達調(diào)控中的重要性和保守性。本研究結(jié)果對于深入理解小麥TaGASR7部分同源基因的表達調(diào)控機制及其在小麥生長發(fā)育中的作用具有重要意義。然而，仍有一些問題有待進一步研究。例如，TaGASR7三個部分同源基因之間的相互作用關系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控小麥的生長發(fā)育，還需要通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補等技術進行深入研究。TaGASR7基因的表達受到哪些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，以及這些轉(zhuǎn)錄因子與TaGASR7基因啟動子區(qū)域順式作用元件的結(jié)合模式，也需要進一步探索。未來的研究可以利用ChIP-seq、EMSA等技術，篩選和鑒定與TaGASR7基因啟動子相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，深入解析其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。此外，TaGASR7基因在不同環(huán)境條件下的表達調(diào)控機制，以及其對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的影響，也需要進一步研究。通過對不同環(huán)境條件下小麥TaGASR7基因表達模式和功能的分析，可以為小麥的遺傳改良提供更全面的理論依據(jù)。三、探索利用病毒誘導基因沉默方法研究TaGASR7A/B/D三個部分同源基因的功能3.1實驗材料3.1.1植物材料選用小麥品種中國春（ChineseSpring）作為實驗材料，因其遺傳背景清晰，在小麥基因功能研究中廣泛應用。將小麥種子用75%酒精消毒3-5分鐘，無菌水沖洗3-5次后，置于濕潤濾紙上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱催芽2-3天。待種子露白，播種于裝有營養(yǎng)土的花盆，放置在溫室培養(yǎng)。溫室條件設置為光照16小時/黑暗8小時，溫度22-25℃，相對濕度60-70%。在小麥生長過程中，定期澆水施肥，確保植株正常生長。在小麥生長的不同階段，如苗期、拔節(jié)期、抽穗期、開花期、灌漿期等，采集根、莖、葉、穗、籽粒等組織樣品，迅速放入液氮冷凍保存，用于后續(xù)實驗。3.1.2病毒誘導基因沉默載體本實驗采用大麥條紋花葉病毒（Barleystripemosaicvirus，BSMV）作為病毒誘導基因沉默的載體。BSMV是一種正義單鏈RNA病毒，基因組由α、β和γ三個RNA組分組成。將目標基因TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D的部分片段分別插入到BSMV的γRNA組分中，構(gòu)建重組病毒載體pBSMV-TaGASR7A、pBSMV-TaGASR7B和pBSMV-TaGASR7D。同時，構(gòu)建含有八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因片段的重組病毒載體pBSMV-PDS作為陽性對照，未插入任何外源基因片段的pBSMV作為陰性對照。所有載體均保存于-80℃冰箱中備用。3.1.3實驗中的各種試劑、酶與耗材實驗中使用的主要試劑包括：RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司），用于提取小麥組織中的總RNA；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司），用于將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；實時熒光定量PCR試劑SYBRPremixExTaqⅡ（TaKaRa公司），用于進行實時熒光定量PCR分析；DNA提取試劑CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），用于提取小麥基因組DNA；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA聚合酶等（TaKaRa公司），用于基因克隆和載體構(gòu)建實驗；各種抗生素，如卡那霉素、氨芐青霉素等，用于篩選陽性克隆。主要的酶類包括：DNaseI（TaKaRa公司），用于去除RNA樣品中的DNA污染；RNaseinhibitor（TaKaRa公司），用于抑制RNA酶的活性，防止RNA降解。實驗中用到的耗材有：1.5mL離心管、0.2mLPCR管、槍頭、移液槍、96孔板、離心管架、PCR儀、熒光定量PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、移液器等。這些耗材均為無菌、無RNA酶和DNA酶污染的產(chǎn)品，以確保實驗結(jié)果的準確性。3.1.4引物根據(jù)TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D基因的序列信息，利用PrimerPremier5.0軟件設計特異性引物，用于擴增目的基因片段，以便插入到BSMV載體中。引物設計原則為：引物長度18-25bp，GC含量40-60%，Tm值55-65℃，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成。同時，為確保引物特異性，對設計好的引物進行BLAST比對分析，確保其只與目標基因序列特異性結(jié)合。用于擴增TaGASR7A基因片段的引物序列為：TaGASR7A-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7A-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7A-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于擴增TaGASR7B基因片段的引物序列為：TaGASR7B-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7B-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7B-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于擴增TaGASR7D基因片段的引物序列為：TaGASR7D-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-VIGS-F：5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCT-3'；TaGASR7D-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。TaGASR7D-VIGS-R：5'-TCACTGCTGCTGCTGCTG-3'。用于擴增PDS基因片段的引物序列為：PDS-VIGS-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；PDS-VIGS-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。PDS-VIGS-F：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；PDS-VIGS-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。PDS-VIGS-R：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用前，將引物用無菌水稀釋至10μM工作濃度，保存于-20℃冰箱備用。3.2實驗方法3.2.1BSMV-VOX和BSMV-VIGS引物設計及VIGS片段克隆依據(jù)TaGASR7A、TaGASR7B和TaGASR7D基因的序列信息，運用PrimerPremier5.0軟件展開引物設計工作。在設計BSMV-VOX引物時，著重考慮引物的特異性，以TaGASR7基因的保守序列為模板，同時避免與其他基因產(chǎn)生非特異性結(jié)合。在設計BSMV-VIGS引物時，除了特異性，還兼顧片段長度，選擇長度在200-350bp之間的片段，以確保沉默效果的穩(wěn)定性和特異性。以小麥基因組DNA為模板，使用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。PCR反應體系包含2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH2O補充至25μL。擴增程序設定為：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸30-60秒（依據(jù)片段長度調(diào)整），共30-35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴增條帶的大小和特異性。將特異性擴增條帶從凝膠中切下，使用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化?；厥盏腜CR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，與同樣經(jīng)過酶切的BSMV-γ載體連接，連接反應體系和條件參照T4DNALigase試劑盒說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，涂布在含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，接種到含有Amp的