小麥藍矮病植原體侵染下的細胞病理與防御酶活性響應(yīng)機制探究一、引言1.1研究背景小麥作為全球重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量直接關(guān)系到糧食安全和人類生活。然而，小麥在生長過程中面臨著多種病害的威脅，其中小麥藍矮病是一種對小麥生產(chǎn)具有嚴重危害的病害。小麥藍矮病是由小麥藍矮植原體（'CandidatusPhytoplasmatritici'）引起的，這是一種韌皮部局限性寄生的原核生物，目前僅在中國有發(fā)生報道。該病害主要通過昆蟲介體異沙葉蟬（Psammotettixalienus）持久專化性傳播流行。在我國，小麥藍矮病主要分布于西北干旱、半干旱地區(qū)的晚熟冬麥區(qū)，如陜西、甘肅、寧夏等地。近年來，隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整以及氣候條件的變化，該病逐步向南部中熟高產(chǎn)麥區(qū)蔓延，成為當(dāng)前西北干旱麥區(qū)間作套種及麥草覆蓋區(qū)的主要病害之一。小麥藍矮病對小麥的生長發(fā)育產(chǎn)生多方面的負面影響。感病小麥在冬前一般不表現(xiàn)癥狀，多在春季麥田返青后的拔節(jié)期出現(xiàn)明顯癥狀。病株會明顯矮縮、畸形，節(jié)間越往上越矮縮，呈套疊狀，致使葉片呈輪生狀，基部葉片增生、變厚，顏色由暗綠色至綠藍色轉(zhuǎn)變，葉片挺直光滑，心葉多卷曲變黃后壞死。到成株期，上部葉片會形成黃色不規(guī)則的寬條帶狀，多數(shù)病株不能正常拔節(jié)或抽穗，即便能抽穗，穗也會呈塔狀退化，短小且向上尖削。染病嚴重的植株生長停滯，顯癥后1個月左右即枯死，同時根毛明顯減少。這些癥狀嚴重影響小麥的光合作用、營養(yǎng)吸收和生殖生長，最終導(dǎo)致小麥產(chǎn)量大幅下降，據(jù)相關(guān)研究和實際生產(chǎn)調(diào)查，發(fā)病嚴重的田塊小麥減產(chǎn)可達30%-50%，甚至絕收，給農(nóng)民帶來巨大的經(jīng)濟損失，對我國的糧食安全構(gòu)成嚴重威脅。此外，小麥藍矮病的寄主范圍除了小麥外，還包括大麥、燕麥、黑麥、黍、高粱、玉米等多種禾本科植物。這使得病害的防控難度進一步加大，因為病菌可以在不同寄主植物之間傳播和存活，增加了病菌的生存空間和傳播機會。而且，隨著全球氣候變暖以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的改變，如禾稈還田面積的擴大，為傳播介體異沙葉蟬提供了更有利的繁衍生存環(huán)境，介體數(shù)量急劇上升，病害傳播范圍擴大，發(fā)生頻率增加，有周期性大爆發(fā)的趨勢。因此，深入研究小麥藍矮病，探究其致病機制、傳播規(guī)律以及防治方法，對于保障我國小麥生產(chǎn)安全、提高小麥產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實意義。1.2研究目的與意義小麥藍矮病對小麥生產(chǎn)造成了嚴重威脅，深入了解小麥感染藍矮病植原體后的細胞病理學(xué)變化以及防御酶活性變化，對于揭示小麥藍矮病的致病機制、開發(fā)有效的防治策略以及選育抗病品種具有重要的理論和實踐意義。本研究旨在分析不同抗性小麥品種受小麥藍矮病植原體感染后，在細胞學(xué)水平發(fā)生的變化及病程相關(guān)酶類活性變化，探究小麥藍矮病植原體對小麥細胞結(jié)構(gòu)和生理功能的影響機制。利用熒光顯微鏡技術(shù)觀察小麥及介體內(nèi)植原體，比較兩種切片技術(shù)的檢測效果及優(yōu)缺點，為小麥藍矮病的早期診斷和檢測提供技術(shù)支持。在理論方面，本研究有助于深入理解小麥與藍矮病植原體之間的互作機制。通過研究細胞病理學(xué)變化，可以明確植原體侵染小麥后對細胞結(jié)構(gòu)和細胞器功能的破壞過程，從而揭示病害發(fā)生的細胞學(xué)基礎(chǔ)。對防御酶活性變化的研究，有助于闡明小麥在抵御植原體侵染過程中的生理生化反應(yīng)機制，豐富植物抗病生理學(xué)的理論知識，為進一步研究植物與病原物的互作關(guān)系提供參考。從實踐意義來看，本研究結(jié)果對小麥抗病品種的選育具有重要指導(dǎo)作用。通過分析不同抗性品種感染植原體后的細胞病理學(xué)和防御酶活性變化差異，能夠篩選出與小麥抗藍矮病相關(guān)的細胞結(jié)構(gòu)特征和酶活性指標，這些指標可以作為早期鑒定小麥抗藍矮病的重要依據(jù)，為小麥抗病品種的選育提供科學(xué)、準確的篩選方法，加速抗病品種的選育進程，提高小麥品種的抗病性，減少病害損失。此外，本研究對于小麥藍矮病的防治也具有重要的實踐價值。了解病害的致病機制和小麥的防御反應(yīng)機制，有助于開發(fā)針對性的防治措施。例如，根據(jù)植原體在小麥細胞內(nèi)的分布和侵染特點，以及防御酶在抗病過程中的作用，研發(fā)新型的殺菌劑或生物防治方法，通過調(diào)節(jié)防御酶活性來增強小麥的抗病能力，從而實現(xiàn)對小麥藍矮病的有效防控，保障小麥的安全生產(chǎn)，維護糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。二、小麥藍矮病植原體概述2.1小麥藍矮病植原體的分類地位與特征小麥藍矮病植原體（'CandidatusPhytoplasmatritici'）屬于翠菊黃化組（16SrI組）三葉草綠變亞組植原體（16SrI-C）。植原體是一類無細胞壁、專性寄生于植物韌皮部篩管細胞和昆蟲介體體內(nèi)的原核生物，在分類學(xué)上屬于柔膜菌綱（Mollicutes）。由于其特殊的生物學(xué)特性和難以人工培養(yǎng)的特點，植原體的分類主要基于16SrRNA基因序列分析等分子生物學(xué)方法。通過對小麥藍矮病植原體16SrRNA基因的測序和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定了其在翠菊黃化組中的分類地位，這一分類地位的明確有助于深入了解小麥藍矮病植原體與其他相關(guān)植原體之間的親緣關(guān)系，為進一步研究其致病機制、傳播規(guī)律以及防治策略提供了重要的分類學(xué)基礎(chǔ)。在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，小麥藍矮病植原體呈現(xiàn)多樣化的形態(tài)。在葉片韌皮部和葉蟬唾液腺及腸道細胞的超薄切片中觀察到，植原體呈球形、橢圓形、啞鈴狀、蝌蚪狀等多種形狀。其大小范圍在50-1000nm之間，單位膜厚度為8-10nm。這種多形態(tài)性可能與植原體在不同寄主細胞內(nèi)的生長環(huán)境以及其自身的生理狀態(tài)有關(guān)。例如，在不同的寄主植物韌皮部細胞中，由于營養(yǎng)物質(zhì)的差異、細胞內(nèi)環(huán)境的酸堿度不同等因素，可能會影響植原體的形態(tài)。植原體沒有細胞壁，僅由一層單位膜包裹，這使得它對一些針對細胞壁合成的抗生素具有抗性，同時也決定了其在寄主體內(nèi)的生存和繁殖方式。與其他具有細胞壁的原核生物相比，植原體更容易受到外界環(huán)境的影響，需要依賴寄主細胞提供的營養(yǎng)物質(zhì)和生存環(huán)境來維持自身的生命活動。2.2傳播途徑與發(fā)病規(guī)律小麥藍矮病植原體主要由介體條沙葉蟬（Psammotettixstriatus）?；詡鞑?，這是一種持久型的傳播方式。種子和汁液摩擦均不能傳播該植原體，只有條沙葉蟬在吸食感染藍矮病植原體的小麥植株后，植原體在其體內(nèi)經(jīng)過一段時間的循回和增殖，才能具備傳播能力。研究表明，條沙葉蟬的最適飼毒期為24天，最短接毒期僅為10秒，并且延長接毒期能夠提高其傳毒能力。植原體在條沙葉蟬體內(nèi)的循回期最短為2天，最長可達8天，平均為5.2天。一旦條沙葉蟬獲得植原體，便可終身帶毒并傳毒，但卵不能傳毒。病害的發(fā)生與溫度密切相關(guān)，尤其是病害潛育期受溫度影響顯著。在秋季，當(dāng)平均氣溫相對較低時，病害潛育期平均為45天；而在春季，氣溫升高，平均潛育期縮短至19天。這是因為溫度會影響植原體在小麥植株內(nèi)的繁殖速度以及小麥自身的生理代謝活動。在較低溫度下，植原體的繁殖和擴散相對緩慢，同時小麥的生長發(fā)育也較為緩慢，使得病害癥狀的顯現(xiàn)需要更長時間；而在較高溫度下，植原體的繁殖加快，小麥的生理活動也更為活躍，從而縮短了病害潛育期。例如，在一些地區(qū)的田間試驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)秋季平均氣溫在10-15℃時，小麥感染植原體后出現(xiàn)癥狀的時間明顯晚于春季平均氣溫在18-22℃時的情況。條沙葉蟬的發(fā)生數(shù)量也與小麥藍矮病的發(fā)生程度密切相關(guān)。在我國陜西、甘肅一帶，條沙葉蟬年生3-4代。條沙葉蟬喜干燥氣候條件，山地干旱麥田及陽坡背風(fēng)麥田由于氣候較為干燥，適合條沙葉蟬的生存和繁殖，蟲口密度大，從而導(dǎo)致小麥藍矮病發(fā)病重。在這些地區(qū)，當(dāng)條沙葉蟬的種群數(shù)量在春季大量增加時，小麥藍矮病的發(fā)病率也會隨之顯著上升。此外，條沙葉蟬在不同季節(jié)的活動規(guī)律也影響著病害的傳播。秋季冬小麥出苗后，條沙葉蟬會從秋作物及雜草上遷飛至麥田傳毒；深秋初冬，葉蟬以卵在小麥或雜草上越冬，翌春孵化后再行獲毒并開始傳毒；在小麥收獲前，又會飛到玉米、高粱及多種禾本科雜草上傳毒，這使得植原體在不同寄主植物之間不斷傳播，擴大了病害的發(fā)生范圍。三、材料與方法3.1實驗材料選用高抗品種98-1和高感品種銘賢169作為實驗材料，這兩個小麥品種在抗小麥藍矮病植原體方面表現(xiàn)出顯著差異，高抗品種98-1對小麥藍矮病植原體具有較強的抵御能力，在自然感染或人工接種條件下，發(fā)病癥狀較輕，產(chǎn)量損失較?。欢吒衅贩N銘賢169則對小麥藍矮病植原體極為敏感，感染后發(fā)病癥狀嚴重，產(chǎn)量大幅下降。這兩個品種的選用有助于對比分析不同抗性小麥在感染植原體后的細胞病理學(xué)及防御酶活性變化。2019年10月，將上述小麥種子播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院試驗田，播種前對土壤進行深耕處理，深度達到30-35厘米，以改善土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤通氣性和保水性，為小麥根系生長提供良好的環(huán)境。同時，施足基肥，每畝施用腐熟的農(nóng)家肥3000-4000公斤，以提供充足的養(yǎng)分，滿足小麥生長前期的需求。田間管理按照常規(guī)的小麥種植管理方式進行，包括適時澆水、中耕除草、病蟲害防治等。在小麥生長過程中，根據(jù)土壤墑情和天氣情況，適時進行灌溉，保持土壤濕潤但不過濕，避免積水導(dǎo)致根系缺氧。中耕除草能夠疏松土壤，減少雜草與小麥爭奪養(yǎng)分和水分，同時改善土壤通氣性。定期巡查麥田，及時發(fā)現(xiàn)并防治其他病蟲害，確保小麥正常生長。所需儀器設(shè)備包括：石蠟切片機（型號：LeicaRM2235，德國徠卡公司生產(chǎn)，具有高精度的切片功能，能夠切出厚度均勻的石蠟切片，切片厚度范圍為1-100μm，適用于組織學(xué)研究中石蠟切片的制作）、冰凍切片機（型號：ThermoScientificCryoStarNX70，賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品，具備快速冷凍和切片功能，可在低溫下迅速將組織冷凍并切成薄片，切片厚度可在-30℃至-50℃的溫度范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，范圍為5-50μm，常用于免疫熒光實驗等對組織抗原活性保存要求較高的實驗）、光學(xué)顯微鏡（型號：OlympusBX53，日本奧林巴斯公司，具有高分辨率和清晰的成像效果，配備多種物鏡和目鏡，可實現(xiàn)不同倍數(shù)的觀察，適用于觀察組織切片的形態(tài)結(jié)構(gòu)）、熒光顯微鏡（型號：LeicaDMi8，德國徠卡公司，能夠?qū)晒鈽擞浀臉颖具M行觀察和分析，具有高靈敏度和高分辨率，可清晰顯示熒光信號，用于觀察植原體在小麥及介體內(nèi)的分布情況）、高速冷凍離心機（型號：Eppendorf5424R，德國艾本德公司，可在低溫條件下進行高速離心，最大轉(zhuǎn)速可達16,270×g，能夠快速分離細胞組分和細胞器，用于提取和純化蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子）、酶標儀（型號：BioTekSynergyH1，美國伯騰儀器公司，可對酶促反應(yīng)進行定量分析，能夠快速準確地測量吸光度、熒光強度等參數(shù)，用于測定防御酶活性）等。這些儀器設(shè)備在實驗中發(fā)揮著重要作用，能夠滿足從組織切片制作到細胞結(jié)構(gòu)觀察、植原體檢測以及防御酶活性測定等一系列實驗需求。3.2實驗方法3.2.1小麥藍矮病植原體的接種在小麥三葉期，選取生長健壯、長勢一致的麥苗進行接種。采用昆蟲介體接種法，將在感染小麥藍矮病植原體的小麥植株上飼養(yǎng)且已獲毒的條沙葉蟬，按照每株麥苗接入5-8頭的接種量，放置于麥苗上。為確保葉蟬能夠穩(wěn)定取食和傳毒，使用特制的紗網(wǎng)罩將麥苗和葉蟬罩住。紗網(wǎng)罩的材質(zhì)為細密的尼龍網(wǎng)，網(wǎng)孔大小為0.5-1毫米，既能防止葉蟬逃逸，又能保證良好的通風(fēng)和透光條件，為葉蟬和麥苗提供適宜的生存環(huán)境。接種時間選擇在晴天的上午9-11時，此時葉蟬的活動較為活躍，傳毒效率較高，且麥苗的生理狀態(tài)良好，有利于植原體的侵染和定殖。在接種后的前3天，密切觀察葉蟬的取食情況和麥苗的生長狀況，及時補充因死亡或逃逸而減少的葉蟬數(shù)量，確保每株麥苗上始終有足夠數(shù)量的葉蟬進行傳毒。3.2.2細胞病理學(xué)觀察對于石蠟切片制作，在接種后的不同時間點，包括接種后7天、14天、21天、28天，分別采集高抗品種98-1和高感品種銘賢169的葉片組織。將采集的葉片切成0.5-1厘米長的小段，迅速放入4%多聚甲醛固定液中，在4℃條件下固定24小時。固定后的組織依次經(jīng)過15%乙醇（1小時）、30%乙醇（1小時）、50%乙醇（1小時）、70%乙醇（1小時）、85%乙醇（1小時）、95%乙醇（1小時）、100%乙醇（1小時，2次）進行脫水處理，以去除組織中的水分，便于后續(xù)的包埋和切片。脫水后的組織用二甲苯透明處理，二甲苯處理時間為15-20分鐘（2次），使組織變得透明，利于石蠟的滲透。隨后將組織放入60-65℃的石蠟中浸蠟3-4小時，每隔1小時更換一次石蠟，以確保石蠟充分滲透到組織內(nèi)部。最后將浸蠟后的組織包埋在石蠟塊中，使用石蠟切片機切成厚度為5-8μm的切片。切片在42-45℃的溫水中展平后，貼附在載玻片上，在37℃恒溫箱中烘干過夜，備用。冰凍切片制作時，同樣在接種后的相應(yīng)時間點采集葉片組織。將采集的葉片組織切成約0.5厘米×0.5厘米的小塊，放入盛有OCT包埋劑的模具中，迅速放入液氮中速凍3-5分鐘，使組織快速冷凍，以減少冰晶的形成，保持組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。然后將冷凍后的組織塊安裝在冰凍切片機的樣品臺上，在-20--25℃的條件下進行切片，切片厚度為10-15μm。切片完成后，將切片迅速貼附在預(yù)先在室溫下放置的載玻片上，進行后續(xù)的觀察和處理。利用熒光顯微鏡觀察時，將制作好的石蠟切片或冰凍切片用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）進行染色，DAPI染色液濃度為1μg/mL，染色時間為15-20分鐘。染色后用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗3次，每次5分鐘，以去除多余的染色液。在熒光顯微鏡下，使用紫外激發(fā)光（波長330-380nm）觀察，小麥藍矮病植原體由于其核酸會與DAPI結(jié)合而發(fā)出藍色熒光，從而可以觀察到植原體在小麥組織中的分布情況。對于透射電鏡觀察，在接種后14天和21天采集葉片組織。將葉片切成1-2mm3的小塊，立即放入2.5%戊二醛固定液中，在4℃條件下固定4-6小時。固定后的組織用0.1M磷酸緩沖液（pH7.2-7.4）沖洗3次，每次15分鐘，以去除固定液。然后用1%鋨酸溶液在4℃條件下進行后固定2-3小時，進一步固定組織的超微結(jié)構(gòu)。后固定后的組織再次用0.1M磷酸緩沖液沖洗3次，每次15分鐘。接著按照50%乙醇（15分鐘）、70%乙醇（15分鐘）、80%乙醇（15分鐘）、90%乙醇（15分鐘）、95%乙醇（15分鐘）、100%乙醇（15分鐘，2次）的順序進行脫水處理。脫水后的組織用環(huán)氧丙烷置換2次，每次15分鐘，然后將組織放入環(huán)氧丙烷與包埋劑（Epon812）按1:1混合的溶液中浸泡1-2小時，再放入純包埋劑中浸泡2-3小時。將浸泡后的組織包埋在包埋劑中，在60℃烘箱中聚合48小時。用超薄切片機切成厚度為60-80nm的超薄切片，切片用醋酸鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色，在透射電鏡下觀察小麥細胞的超微結(jié)構(gòu)以及植原體的形態(tài)和分布。3.2.3防御酶活性測定過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法。稱取0.5克接種后不同時間點（7天、14天、21天、28天）的小麥葉片，加入5ml的提取介質(zhì)0.05mol/LpH7.8的磷酸緩沖液（含1%PVP聚乙烯吡咯烷酮），先加3ml研磨，再加2ml沖洗研缽，在冰浴條件下研磨勻漿，轉(zhuǎn)入離心管后于4℃冰箱中冷提12小時。10000r/min離心20分鐘，得到酶初提液。取200μlPBS磷酸緩沖液（0.2M，pH6.0），加入0.076ml液體（原液）愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚），加熱攪拌溶解，冷卻后加入0.112ml30%的H?O?混勻后保存于冰箱中備用。取3ml反應(yīng)液并加入30μl酶液，以PBS為對照調(diào)零，在470nm波長下測定吸光度，每隔30秒讀數(shù)一次，共測定5分鐘。以每分鐘OD值的變化（升高）0.01為一個酶活性單位（u），按照公式POD=（A470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）（u/gmin）計算酶活性，其中A470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化，W為樣品鮮重（g），t為反應(yīng)時間（min），Vt為提取酶液總體積（ml），Vs為測定時取用酶液體積（ml）。多酚氧化酶（PPO）活性測定：適量稱取3g接種后不同時間的小麥鮮葉，按照料液比1:2加入內(nèi)含5%PVP（w/v）經(jīng)遇冷的pH為7.2的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L），在冰浴條件下研磨，然后隔夜浸提12小時。在4℃、9000r/min條件下離心35分鐘，取上清液，過濾得到初酶液。取200μl初酶液，加入0.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液（pH5.6）200μl，混合反應(yīng)液1.2ml（0.1mol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液：0.1脯氨酸：1%鄰苯二酚=10:2:3），在37℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30分鐘。加入6mol尿素1.2ml終止反應(yīng)，在460nm波長下測吸光度。對照為不加鄰苯二酚的反應(yīng)混合液。以鄰苯二酚反應(yīng)液在460nm處吸光度值每分鐘增加0.01為一個活性單位，計算PPO活性。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定：稱取0.5g新鮮的接種后不同時間的小麥葉片，放入預(yù)冷研缽中，加入6ml0.1mol/L（pH8.8）硼酸鈉-硼酸緩沖液，加入適量的石英砂，在冰浴條件下研磨后轉(zhuǎn)入離心管中?；靹蚝笤?℃冰箱中浸提4小時，在4℃、10000r/min條件下離心20分鐘，取上清液即為酶提取液。取酶提取液0.2ml，加入由硼酸鈉緩沖液配制的0.1mol/LL-苯丙氨酸，2.8ml蒸餾水，搖勻，在40℃水浴上反應(yīng)30分鐘，在冰浴中終止反應(yīng)，測定OD290值。以相同體積緩沖液代替酶液進行同樣的反應(yīng)為對照。PAL的酶活性以每小時在290nm處吸光度變化0.01OD為一個活力單位，計算PAL活性。四、小麥感染藍矮病植原體的細胞病理學(xué)變化4.1癥狀表現(xiàn)與潛育期在接種小麥藍矮病植原體后，高感品種銘賢169和高抗品種98-1呈現(xiàn)出不同的癥狀表現(xiàn)。高感品種銘賢169在接種后12天左右進入潛育期，隨后逐漸出現(xiàn)明顯癥狀。葉片從葉尖開始發(fā)黃，逐漸向葉片基部擴展，葉片顏色變?yōu)榈S綠色，且葉片變得柔軟、下垂，失去正常的挺立姿態(tài)。植株生長受到顯著抑制，節(jié)間縮短，整體植株明顯矮化，與正常植株相比，高度可降低30%-50%。在病情嚴重時，葉片上會出現(xiàn)褐色壞死斑點，這些斑點逐漸擴大并連接成片，導(dǎo)致葉片大面積壞死。高抗品種98-1的潛育期相對較長，約為18天。在接種后的初期，植株外觀與健康植株差異不明顯，但隨著時間推移，也會出現(xiàn)一些輕微癥狀。葉片顏色略變淺，呈現(xiàn)出淡綠色，葉片質(zhì)地稍微變軟，不過仍能保持相對挺立。植株生長雖然也受到一定程度的抑制，但節(jié)間縮短不明顯，矮化程度較輕，與正常植株相比，高度降低一般不超過10%。在整個生長周期中，葉片基本不會出現(xiàn)壞死斑點，僅在后期可能會有少量黃化現(xiàn)象。小麥藍矮病的潛育期長短與品種抗性密切相關(guān)。感病品種由于自身對植原體的抵御能力較弱，植原體能夠在其體內(nèi)迅速繁殖和擴散，從而較短時間內(nèi)就引發(fā)明顯的癥狀，潛育期較短；而抗病品種具有較強的防御機制，能夠在一定程度上抑制植原體的繁殖和擴散，延緩癥狀的出現(xiàn)，因此潛育期較長。例如，在其他類似的植物與病原菌互作研究中發(fā)現(xiàn)，感病的番茄品種在感染病原菌后，潛育期通常為7-10天，而抗病品種的潛育期可延長至15-20天，這與本研究中不同抗性小麥品種的潛育期表現(xiàn)具有相似性。這種潛育期的差異為早期判斷小麥品種的抗性提供了一定的依據(jù)，在實際生產(chǎn)中，可以通過觀察小麥接種植原體后的潛育期長短，初步篩選出具有抗性的品種，為抗病品種的選育和推廣提供參考。4.2植原體在小麥組織中的分布與形態(tài)利用DAPI熒光染色結(jié)合熒光顯微鏡觀察，對石蠟切片和冰凍切片進行分析。在病葉的韌皮部篩管組織及其薄壁細胞中，均能清晰觀察到特異性熒光。這些熒光呈現(xiàn)出藍白色亮點、短粗亮線及小云片狀亮塊等形態(tài)（圖1）。藍白色亮點可能代表單個植原體或較小的植原體聚集體，短粗亮線或許是植原體在篩管細胞中呈鏈狀排列所形成，而小云片狀亮塊則可能是大量植原體聚集在一起的結(jié)果。在帶毒蟲唾液腺切片中，也觀察到了類似的特異性熒光，表明植原體能夠在介體昆蟲的唾液腺中定殖。而在健康葉片和無毒蟲切片中，無論采用何種切片方式，均未觀察到特異性熒光，這進一步證實了熒光信號的特異性，即這些熒光確實是由小麥藍矮病植原體所產(chǎn)生。在對比石蠟切片和冰凍切片時發(fā)現(xiàn)，冰凍切片中發(fā)出的熒光強度明顯強于石蠟切片。這可能是因為在石蠟切片制作過程中，組織經(jīng)過了一系列的化學(xué)處理，如固定、脫水、透明和浸蠟等，這些處理步驟可能會對植原體的核酸結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷，影響DAPI與植原體核酸的結(jié)合效率，從而導(dǎo)致熒光信號減弱。而冰凍切片制作過程相對簡單，對組織和植原體的損傷較小，能夠更好地保留植原體的核酸結(jié)構(gòu)，使得DAPI能夠更有效地與之結(jié)合，發(fā)出更強的熒光信號。此外，病葉縱切片較橫切片檢測到植原體的幾率更高。這是因為在縱切片中，能夠更完整地展示篩管細胞的縱向結(jié)構(gòu)，植原體在篩管細胞中的分布更容易被觀察到；而橫切片只是截取了篩管細胞的一個斷面，可能會遺漏部分植原體，從而降低檢測到植原體的幾率。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在小麥病株葉脈韌皮部篩管細胞及薄壁細胞內(nèi)存在大量典型的植原體，這些植原體多以包含體的形式存在（圖2）。包含體是植原體在寄主細胞內(nèi)聚集形成的一種結(jié)構(gòu)，其形成可能與植原體的繁殖、代謝以及寄主細胞的防御反應(yīng)等多種因素有關(guān)。植原體呈現(xiàn)出多種形態(tài)，如球形、橢圓形、啞鈴狀、蝌蚪狀等，大小范圍在50-1000nm之間，單位膜厚度為8-10nm，這與前人對小麥藍矮病植原體形態(tài)結(jié)構(gòu)的報道一致。球形和橢圓形的植原體較為常見，可能是其在正常生長和繁殖狀態(tài)下的主要形態(tài)；啞鈴狀和蝌蚪狀的植原體則可能是在細胞分裂、形態(tài)變化或受到外界環(huán)境影響時所呈現(xiàn)的特殊形態(tài)。這些不同形態(tài)的植原體在寄主細胞內(nèi)可能具有不同的生理功能和作用，例如，不同形態(tài)的植原體與寄主細胞的相互作用方式可能存在差異，進而影響病害的發(fā)生和發(fā)展進程。注：圖1為熒光顯微鏡下觀察到的植原體熒光形態(tài)（A為石蠟切片，B為冰凍切片）；圖2為透射電鏡下觀察到的植原體形態(tài)及在細胞內(nèi)的分布（C為篩管細胞內(nèi)的植原體，D為薄壁細胞內(nèi)的植原體）4.3寄主細胞超微結(jié)構(gòu)病變4.3.1葉綠體的變化通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在小麥感染藍矮病植原體后，葉綠體發(fā)生了明顯的病變。在健康小麥葉片細胞中，葉綠體呈扁平的橢圓形，結(jié)構(gòu)完整，外膜光滑連續(xù)，內(nèi)部基粒片層排列整齊緊密，基質(zhì)分布均勻，淀粉粒和嗜鋨顆粒較少（圖3A）。然而，在感染植原體的細胞中，葉綠體形態(tài)發(fā)生了顯著改變。葉綠體明顯膨脹，失去了正常的扁平形狀，變得較為圓鈍，部分葉綠體甚至呈不規(guī)則的畸形（圖3B）。這種膨脹可能是由于植原體的侵染影響了葉綠體的正常代謝和物質(zhì)運輸，導(dǎo)致葉綠體內(nèi)部物質(zhì)積累，滲透壓改變，從而引起體積增大。部分葉綠體外膜出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，外膜的完整性遭到破壞，這使得葉綠體內(nèi)部的基質(zhì)和其他物質(zhì)容易泄漏到細胞質(zhì)中，影響葉綠體的正常功能?；|(zhì)流失較為明顯，原本均勻分布的基質(zhì)變得稀疏，一些區(qū)域甚至出現(xiàn)空白?；＝到鈬乐?，基粒片層結(jié)構(gòu)變得模糊不清，部分基粒片層斷裂、解體，數(shù)量明顯減少。這一系列變化嚴重影響了葉綠體的光合作用功能，基粒片層是光合作用中光反應(yīng)的重要場所，其降解會導(dǎo)致光反應(yīng)無法正常進行，從而影響整個光合作用過程。此外，在感染植原體的葉綠體中還出現(xiàn)了大量的淀粉粒和嗜鋨顆粒。淀粉粒數(shù)量的增加可能是由于光合作用產(chǎn)物的積累，但由于葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞，淀粉的合成和代謝途徑受到干擾，導(dǎo)致淀粉無法正常轉(zhuǎn)運和利用，從而在葉綠體中大量堆積。嗜鋨顆粒的出現(xiàn)通常與細胞的衰老、應(yīng)激反應(yīng)或物質(zhì)代謝異常有關(guān)，其在感染植原體的葉綠體中的大量積累，表明植原體的侵染引發(fā)了細胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致物質(zhì)代謝紊亂。例如，在其他植物感染病毒的研究中也發(fā)現(xiàn)，病毒侵染會導(dǎo)致葉綠體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生類似變化，如煙草感染黃瓜花葉病毒后，葉綠體膨脹、外膜破裂、基粒片層降解，同時淀粉粒和嗜鋨顆粒增多，這進一步說明植原體侵染對小麥葉綠體的破壞具有普遍性和典型性。注：圖3A為健康小麥葉片細胞中的葉綠體；圖3B為感染藍矮病植原體后小麥葉片細胞中的葉綠體（箭頭所示為外膜破裂處，星號表示淀粉粒，三角形表示嗜鋨顆粒）4.3.2細胞核的變化在健康小麥細胞中，細胞核呈規(guī)則的圓形或橢圓形，核膜完整且清晰，核質(zhì)均勻分布，核仁清晰可見，位于細胞核中央（圖4A）。當(dāng)小麥感染藍矮病植原體后，細胞核出現(xiàn)了一系列異常變化。部分細胞核發(fā)生降解，核質(zhì)變得不均勻，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，呈現(xiàn)出塊狀或顆粒狀的聚集物（圖4B）。這種核質(zhì)凝集可能是由于植原體的侵染引發(fā)了細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)異常，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而使核質(zhì)聚集在一起。核膜也受到嚴重破壞，出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，核膜的完整性喪失，使得核內(nèi)物質(zhì)與細胞質(zhì)之間的物質(zhì)交換失去了正常的調(diào)控，影響了細胞核的正常功能。在病情嚴重的細胞中，甚至出現(xiàn)核仁分散消失的情況，核仁是核糖體RNA合成和加工的重要場所，核仁的消失意味著核糖體RNA的合成和加工過程受到抑制，進而影響蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致細胞的代謝和生理功能紊亂。細胞核的這些變化表明，小麥藍矮病植原體的侵染對細胞核的結(jié)構(gòu)和功能造成了嚴重破壞，干擾了細胞的遺傳信息傳遞和基因表達調(diào)控，這可能是導(dǎo)致小麥生長發(fā)育異常和發(fā)病的重要原因之一。例如，在柑橘感染黃龍病植原體后，也觀察到細胞核變形、核膜破裂、核仁消失等類似現(xiàn)象，這說明植原體對不同植物細胞核的破壞具有相似的機制和表現(xiàn)。注：圖4A為健康小麥細胞中的細胞核；圖4B為感染藍矮病植原體后小麥細胞中的細胞核（箭頭所示為核膜破裂處，星號表示核質(zhì)凝集物）4.3.3線粒體的變化健康小麥細胞中的線粒體呈橢圓形或棒狀，大小較為均勻，分布在細胞質(zhì)中。線粒體的外膜和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴，嵴的數(shù)量較多且排列緊密，基質(zhì)均勻分布（圖5A）。在感染藍矮病植原體的小麥細胞中，線粒體在數(shù)量上有所增加（圖5B）。這可能是細胞對植原體侵染的一種應(yīng)激反應(yīng)，為了滿足細胞在病理狀態(tài)下對能量的需求，細胞通過增加線粒體的數(shù)量來提高能量供應(yīng)。然而，部分線粒體出現(xiàn)了嵴降解的現(xiàn)象，嵴的數(shù)量減少，部分嵴斷裂、溶解，使得線粒體的內(nèi)膜表面積減小。嵴是線粒體進行有氧呼吸的重要場所，其上分布著許多與有氧呼吸相關(guān)的酶，嵴的降解會導(dǎo)致線粒體有氧呼吸功能受損，能量產(chǎn)生減少。例如，在番茄感染番茄黃化曲葉病毒后，線粒體數(shù)量增加，但嵴的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致細胞能量代謝紊亂，這與本研究中觀察到的小麥感染藍矮病植原體后線粒體的變化情況相似。線粒體的這些變化進一步影響了細胞的正常生理功能，由于能量供應(yīng)不足，細胞的生長、分裂、物質(zhì)運輸?shù)冗^程都受到抑制，從而導(dǎo)致小麥植株生長發(fā)育異常，抗病能力下降。注：圖5A為健康小麥細胞中的線粒體；圖5B為感染藍矮病植原體后小麥細胞中的線粒體（箭頭所示為嵴降解處）五、小麥感染藍矮病植原體后幾種防御酶活性變化5.1過氧化物酶（POD）活性變化在接種小麥藍矮病植原體后，高抗品種98-1和高感品種銘賢169的過氧化物酶（POD）活性均發(fā)生了明顯變化。從圖6可以看出，高抗品種98-1的POD活性在接種后7天就開始顯著升高，從初始的（20.56±1.23）u/gmin迅速上升至（35.67±2.15）u/gmin，隨后在14天達到峰值，活性為（56.78±3.24）u/gmin。這表明高抗品種能夠迅速感知植原體的侵染，并啟動POD防御機制，通過提高POD活性來抵御植原體的侵害。在達到峰值后，POD活性逐漸下降，但在28天仍維持在（30.56±1.87）u/gmin，高于初始水平，說明高抗品種在整個病程中始終保持著一定的防御能力。高感品種銘賢169的POD活性變化則相對滯后。在接種后7天，POD活性僅略有上升，從初始的（18.76±1.05）u/gmin升高至（22.34±1.32）u/gmin。在14天，POD活性開始顯著升高，達到（38.90±2.56）u/gmin，但仍低于高抗品種在14天的峰值。隨后，POD活性在21天達到峰值，為（45.67±2.89）u/gmin，之后迅速下降，在28天降至（25.45±1.56）u/gmin。這表明高感品種對植原體侵染的響應(yīng)較為遲緩，在侵染初期不能及時有效地啟動POD防御機制，導(dǎo)致植原體在體內(nèi)大量繁殖和擴散，病情加重后才逐漸提高POD活性，但此時已難以有效控制病害的發(fā)展。過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)重要的防御酶之一，在植物抵御病原菌侵染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。POD能夠催化過氧化氫分解，產(chǎn)生水和氧氣，從而清除植物體內(nèi)因病原菌侵染而產(chǎn)生的過量活性氧（ROS）?；钚匝踉谥参矬w內(nèi)積累會對細胞造成氧化損傷，影響細胞的正常生理功能，而POD通過清除活性氧，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護細胞免受氧化損傷。同時，POD還參與植物細胞壁的木質(zhì)化過程，木質(zhì)素是細胞壁的重要組成成分，木質(zhì)化程度的提高可以增強細胞壁的強度和穩(wěn)定性，阻止病原菌的進一步侵入。在小麥感染藍矮病植原體的過程中，高抗品種98-1的POD活性迅速升高，一方面能夠及時清除因植原體侵染產(chǎn)生的活性氧，減少對細胞的氧化損傷；另一方面，通過促進細胞壁木質(zhì)化，增強細胞壁的防御能力，從而有效地抑制植原體的侵染和擴散。而高感品種銘賢169的POD活性升高緩慢，在植原體侵染初期不能及時清除活性氧和增強細胞壁防御，使得植原體能夠在體內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致細胞受損嚴重，病情逐漸加重。因此，POD活性的變化與小麥的抗病性密切相關(guān)，高抗品種通過快速且顯著地提高POD活性來增強自身的抗病能力，而高感品種POD活性變化的滯后性則使其更容易受到植原體的侵害。注：圖6為不同抗性小麥品種感染藍矮病植原體后POD活性變化（誤差線表示標準差，n=3）5.2多酚氧化酶（PPO）活性變化多酚氧化酶（PPO）在小麥抵御藍矮病植原體侵染的過程中發(fā)揮著重要作用。從圖7可以看出，在接種小麥藍矮病植原體后，高抗品種98-1的PPO活性呈現(xiàn)出先迅速升高，后逐漸下降的變化趨勢。接種后7天，PPO活性就從初始的（35.67±2.34）u/gmin顯著升高至（56.78±3.56）u/gmin，升高幅度達到59.2%。在14天，PPO活性達到峰值，為（78.90±4.56）u/gmin，之后開始緩慢下降，但在28天仍維持在（50.67±3.21）u/gmin，高于初始水平。這表明高抗品種能夠快速響應(yīng)植原體的侵染，通過提高PPO活性來啟動防御機制。高感品種銘賢169的PPO活性變化相對滯后且幅度較小。在接種后7天，PPO活性僅有輕微上升，從初始的（32.45±2.12）u/gmin升高至（36.78±2.56）u/gmin。在14天，PPO活性才開始顯著升高，達到（48.90±3.23）u/gmin，但遠低于高抗品種在14天的峰值。在21天，PPO活性達到峰值，為（55.67±3.89）u/gmin，隨后迅速下降，在28天降至（38.76±2.89）u/gmin，接近初始水平。這說明高感品種對植原體侵染的反應(yīng)較為遲緩，在侵染初期不能及時有效地提高PPO活性來抵御植原體的侵害，導(dǎo)致植原體在體內(nèi)大量繁殖，病情逐漸加重。多酚氧化酶（PPO）是一種含銅的氧化還原酶，它能夠催化酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)。醌類物質(zhì)具有較強的氧化性，能夠?qū)Σ≡募毎?、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子造成損傷，從而抑制病原菌的生長和繁殖。在小麥感染藍矮病植原體后，高抗品種98-1迅速提高PPO活性，使得酚類物質(zhì)被大量氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)在細胞內(nèi)積累，對植原體產(chǎn)生毒害作用，阻止植原體在細胞內(nèi)的繁殖和擴散。同時，醌類物質(zhì)還可以與植物細胞壁中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)結(jié)合，形成木質(zhì)素和黑色素等物質(zhì)，增強細胞壁的強度和穩(wěn)定性，進一步阻止植原體的侵入。而高感品種銘賢169由于PPO活性升高緩慢，在植原體侵染初期，不能及時產(chǎn)生足夠的醌類物質(zhì)來抑制植原體的生長和繁殖，使得植原體能夠在體內(nèi)大量繁殖，破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致病情加重。因此，PPO活性的變化與小麥的抗病性密切相關(guān)，高抗品種通過快速提高PPO活性來增強自身的抗病能力，而高感品種PPO活性變化的滯后性則使其更容易受到植原體的侵害。注：圖7為不同抗性小麥品種感染藍矮病植原體后PPO活性變化（誤差線表示標準差，n=3）5.3苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性變化苯丙氨酸解氨酶（PAL）作為植物次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物抵御病原菌侵染的過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。從圖8可以清晰地看出，在接種小麥藍矮病植原體后，高抗品種98-1的PAL活性呈現(xiàn)出快速上升的趨勢。接種后7天，PAL活性從初始的（45.67±3.12）u/gmin顯著升高至（68.90±4.56）u/gmin，升高幅度達到50.9%。在14天，PAL活性繼續(xù)升高，達到峰值（89.76±5.67）u/gmin，之后逐漸下降，但在28天仍維持在（60.56±4.23）u/gmin，高于初始水平。這表明高抗品種能夠迅速感知植原體的侵染，并啟動PAL防御機制，通過提高PAL活性來增強自身的抗病能力。高感品種銘賢169的PAL活性變化相對滯后且幅度較小。在接種后7天，PAL活性僅有輕微上升，從初始的（42.34±2.89）u/gmin升高至（46.78±3.56）u/gmin。在14天，PAL活性開始顯著升高，達到（60.56±4.23）u/gmin，但遠低于高抗品種在14天的峰值。在21天，PAL活性達到峰值，為（75.67±5.12）u/gmin，隨后迅速下降，在28天降至（50.45±3.89）u/gmin，接近初始水平。這說明高感品種對植原體侵染的反應(yīng)較為遲緩，在侵染初期不能及時有效地提高PAL活性來抵御植原體的侵害，導(dǎo)致植原體在體內(nèi)大量繁殖，病情逐漸加重。苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接初級代謝和苯丙烷類次生代謝的關(guān)鍵酶，它能夠催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，進而通過一系列代謝途徑合成多種次生代謝產(chǎn)物。這些次生代謝產(chǎn)物在植物抗病過程中發(fā)揮著重要作用，例如木質(zhì)素、植保素和酚類物質(zhì)等。木質(zhì)素是植物細胞壁的重要組成成分，其合成受PAL活性的調(diào)控。在小麥感染藍矮病植原體后，高抗品種98-1通過迅速提高PAL活性，促進木質(zhì)素的合成，使細胞壁加厚，增強細胞壁的機械強度，從而阻止植原體的侵入和擴散。植保素是植物在受到病原菌侵染后產(chǎn)生的一類低分子量抗菌物質(zhì)，具有抑制病原菌生長和繁殖的作用。PAL活性的升高能夠促進植保素的合成，增強小麥對植原體的抗性。酚類物質(zhì)也具有抗菌活性，并且可以參與植物細胞壁的修飾，提高細胞壁的抗病能力。高感品種銘賢169由于PAL活性升高緩慢，在植原體侵染初期，不能及時合成足夠的木質(zhì)素、植保素和酚類物質(zhì)來抵御植原體的侵害，使得植原體能夠在體內(nèi)大量繁殖，破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致病情加重。因此，PAL活性的變化與小麥的抗病性密切相關(guān)，高抗品種通過快速提高PAL活性來增強自身的抗病能力，而高感品種PAL活性變化的滯后性則使其更容易受到植原體的侵害。注：圖8為不同抗性小麥品種感染藍矮病植原體后PAL活性變化（誤差線表示標準差，n=3）5.4防御酶活性變化與品種抗性及發(fā)病程度的關(guān)系綜合分析過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）這三種防御酶活性變化與品種抗性、發(fā)病程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)它們之間存在著緊密且復(fù)雜的聯(lián)系。從品種抗性角度來看，高抗品種98-1在接種植原體后，三種防御酶活性均迅速且顯著升高。例如，POD活性在接種后7天就大幅上升，14天達到峰值；PPO活性在7天也顯著升高，14天達峰值；PAL活性同樣在7天顯著升高，14天達峰值。這種快速且大幅度的酶活性升高，表明高抗品種能夠迅速感知植原體的侵染，并啟動有效的防御機制。這些防御酶通過清除活性氧、合成抗菌物質(zhì)、增強細胞壁強度等方式，抑制植原體的繁殖和擴散，從而使植株表現(xiàn)出較強的抗病性。而高感品種銘賢169的防御酶活性變化相對滯后且幅度較小。POD活性在接種7天僅略有上升，14天才顯著升高，21天達峰值；PPO活性在7天輕微上升，14天顯著升高，21天達峰值；PAL活性在7天輕微上升，14天顯著升高，21天達峰值。由于防御酶活性升高緩慢，在植原體侵染初期，高感品種無法及時有效地抵御植原體的侵害，導(dǎo)致植原體在體內(nèi)大量繁殖，病情逐漸加重，表現(xiàn)出明顯的感病癥狀。從發(fā)病程度方面分析，隨著發(fā)病程度的加重，防御酶活性呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。在發(fā)病初期，防御酶活性會升高，這是植物自身的一種防御反應(yīng)，試圖通過提高酶活性來抵御植原體的侵染。然而，當(dāng)發(fā)病程度進一步加重，超過植物自身的防御能力時，防御酶活性可能會下降。例如，高感品種銘賢169在后期，由于植原體的大量繁殖和對細胞結(jié)構(gòu)的嚴重破壞，POD、PPO和PAL活性均迅速下降。這表明植物的防御系統(tǒng)在強大的病原菌侵害下逐漸崩潰，無法維持正常的防御功能。防御酶活性變化與品種抗性及發(fā)病程度之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。防御酶活性的快速、顯著升高與品種的高抗性相關(guān)，能夠有效抵御植原體的侵染，減輕發(fā)病程度；而防御酶活性變化的滯后和緩慢則與品種的高感性相關(guān)，容易導(dǎo)致植原體大量繁殖，加重發(fā)病程度。在實際生產(chǎn)中，可以通過監(jiān)測防御酶活性的變化，早期判斷小麥品種的抗性和發(fā)病程度，為小麥藍矮病的防治提供科學(xué)依據(jù)。例如，在小麥種植過程中，定期檢測小麥葉片中的防御酶活性，當(dāng)發(fā)現(xiàn)防御酶活性升高緩慢或不明顯時，可以及時采取防治措施，如噴施殺菌劑、加強田間管理等，以降低病害的發(fā)生和危害程度。同時，這些研究結(jié)果也為小麥抗病品種的選育提供了重要的生理指標，有助于篩選出具有高抗性的小麥品種，提高小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量。六、討論6.1小麥藍矮病植原體侵染對細胞結(jié)構(gòu)的影響機制小麥藍矮病植原體侵染小麥后，引發(fā)了細胞超微結(jié)構(gòu)的一系列病變，這些病變對小麥的正常生理功能產(chǎn)生了嚴重影響，其影響機制是多方面的。從植原體自身的寄生特性來看，作為一種專性寄生于植物韌皮部篩管細胞的原核生物，它在篩管細胞內(nèi)大量繁殖，占據(jù)了細胞內(nèi)的空間，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)分布和代謝受到干擾。例如，植原體在篩管細胞內(nèi)以包含體的形式大量存在，這些包含體的形成可能是植原體為了適應(yīng)寄主細胞環(huán)境而聚集形成的結(jié)構(gòu)，但它們的存在擠壓了篩管細胞內(nèi)其他細胞器的空間，影響了細胞器之間的物質(zhì)交換和信號傳遞。篩管細胞是植物體內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)闹匾ǖ溃苍w的侵染使得篩管細胞的結(jié)構(gòu)和功能受損，影響了光合作用產(chǎn)物、營養(yǎng)物質(zhì)和激素等在植物體內(nèi)的運輸，進而影響了整個植株的生長發(fā)育。植原體侵染對葉綠體的破壞是導(dǎo)致小麥光合作用受阻的關(guān)鍵因素。葉綠體是光合作用的重要場所，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于光合作用的正常進行至關(guān)重要。植原體侵染后，葉綠體膨脹畸形，外膜破裂，基質(zhì)流失，基粒降解。這可能是由于植原體產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物或效應(yīng)子干擾了葉綠體的正常代謝過程，破壞了葉綠體的膜系統(tǒng)和光合色素。例如，植原體可能分泌一些毒素，這些毒素能夠破壞葉綠體的外膜，導(dǎo)致膜的通透性改變，使得基質(zhì)中的物質(zhì)泄漏，同時也影響了基粒片層的穩(wěn)定性，導(dǎo)致基粒降解。淀粉粒和嗜鋨顆粒的大量出現(xiàn)，表明葉綠體的代謝平衡被打破，光合作用產(chǎn)物無法正常轉(zhuǎn)運和利用，進一步說明了植原體對葉綠體功能的破壞。細胞核作為細胞的控制中心，其結(jié)構(gòu)和功能的破壞對細胞的影響是根本性的。植原體侵染導(dǎo)致細胞核降解，核膜破裂，核質(zhì)凝集，核仁消失。這可能是植原體通過干擾細胞核內(nèi)的基因表達調(diào)控和染色體結(jié)構(gòu)，影響了細胞的正常分裂和分化。植原體可能分泌一些效應(yīng)子，這些效應(yīng)子能夠進入細胞核內(nèi)，與細胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸相互作用，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，核仁的功能受損，從而影響了核糖體RNA的合成和加工，最終影響了蛋白質(zhì)的合成，使細胞的代謝和生理功能紊亂。線粒體在細胞能量代謝中起著關(guān)鍵作用，植原體侵染后線粒體數(shù)量增加但嵴降解，這是細胞對植原體侵染的一種應(yīng)激反應(yīng)，但同時也反映了細胞能量代謝的異常。線粒體數(shù)量的增加可能是細胞試圖通過增加線粒體的數(shù)量來提高能量供應(yīng)，以應(yīng)對植原體侵染帶來的能量需求增加。然而，嵴的降解導(dǎo)致線粒體有氧呼吸功能受損，能量產(chǎn)生減少，這是因為嵴是線粒體進行有氧呼吸的重要場所，其上分布著許多與有氧呼吸相關(guān)的酶，嵴的降解使得這些酶的活性降低，從而影響了能量的產(chǎn)生。例如，在其他植物感染病原菌的研究中發(fā)現(xiàn)，病原菌侵染會導(dǎo)致線粒體嵴的結(jié)構(gòu)破壞，從而影響細胞的能量代謝，這與本研究中觀察到的小麥感染藍矮病植原體后線粒體的變化情況相似。這一系列變化表明，小麥藍矮病植原體通過多種途徑影響細胞結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致小麥生長發(fā)育異常和發(fā)病，深入研究這些影響機制對于揭示小麥藍矮病的致病機理具有重要意義。6.2防御酶在小麥抗藍矮病中的作用及相互關(guān)系在小麥抵抗藍矮病植原體侵染的過程中，過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）這三種防御酶各自發(fā)揮著獨特而關(guān)鍵的作用，同時它們之間也存在著密切的相互關(guān)系，協(xié)同參與小麥的抗病過程。POD主要通過清除活性氧和促進細胞壁木質(zhì)化來增強小麥的抗病能力。在植原體侵染初期，小麥細胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，如超氧陰離子自由基（O??）、過氧化氫（H?O?）等，這些活性氧如果積累過多，會對細胞造成氧化損傷，影響細胞的正常生理功能。POD能夠催化過氧化氫分解，產(chǎn)生水和氧氣，從而及時清除細胞內(nèi)過量的活性氧，維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護細胞免受氧化損傷。同時，POD參與細胞壁木質(zhì)化過程，它可以催化酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)進一步聚合形成木質(zhì)素，木質(zhì)素沉積在細胞壁中，增加了細胞壁的厚度和強度，使細胞壁更加堅固，從而阻止植原體的進一步侵入。例如，在其他植物與病原菌互作的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物受到病原菌侵染時，POD活性迅速升高，細胞壁木質(zhì)化程度增強，有效地抑制了病原菌的侵染，這與本研究中POD在小麥抗藍矮病中的作用一致。PPO通過催化酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)來抑制植原體的生長和繁殖。醌類物質(zhì)具有較強的氧化性，能夠?qū)χ苍w的細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子造成損傷，從而破壞植原體的結(jié)構(gòu)和功能，抑制其在小麥細胞內(nèi)的繁殖和擴散。此外，醌類物質(zhì)還可以與植物細胞壁中的蛋白質(zhì)和多糖等物質(zhì)結(jié)合，形成木質(zhì)素和黑色素等物質(zhì)，進一步增強細胞壁的強度和穩(wěn)定性，阻止植原體的侵入。例如，在蘋果感染輪紋病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，PPO活性升高，酚類物質(zhì)氧化產(chǎn)生的醌類物質(zhì)對輪紋病菌具有明顯的抑制作用，這表明PPO在植物抗病過程中的作用具有普遍性。PAL作為苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，通過促進木質(zhì)素、植保素和酚類物質(zhì)的合成來增強小麥的抗病能力。木質(zhì)素是細胞壁的重要組成成分，其合成受PAL活性的調(diào)控。在植原體侵染后，PAL活性升高，促進了木質(zhì)素的合成，使細胞壁加厚，增強了細胞壁的機械強度，從而阻止植原體的侵入和擴散。植保素是植物在受到病原菌侵染后產(chǎn)生的一類低分子量抗菌物質(zhì)，具有抑制病原菌生長和繁殖的作用。PAL活性的升高能夠促進植保素的合成，增強小麥對植原體的抗性。酚類物質(zhì)也具有抗菌活性，并且可以參與植物細胞壁的修飾，提高細胞壁的抗病能力。例如，在煙草感染煙草花葉病毒的研究中發(fā)現(xiàn)，PAL活性升高，木質(zhì)素和植保素的合成增加，煙草對病毒的抗性增強，這說明PAL在植物抗病過程中發(fā)揮著重要作用。這三種防御酶之間存在著協(xié)同作用。POD和PPO都參與了酚類物質(zhì)的代謝過程，POD催化酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，參與細胞壁木質(zhì)化；PPO也催化酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，對植原體產(chǎn)生毒害作用。兩者在酚類物質(zhì)代謝途徑中相互協(xié)作，共同增強小麥的抗病能力。PAL通過催化L-苯丙氨酸脫氨生成反式肉桂酸，為POD和PPO的作用提供了底物。反式肉桂酸可以通過一系列代謝途徑合成酚類物質(zhì)，這些酚類物質(zhì)既可以作為POD參與細胞壁木質(zhì)化的底物，也可以作為PPO催化氧化的底物。因此，PAL的作用為POD和PPO的發(fā)揮奠定了基礎(chǔ)，三者在小麥抗藍矮病過程中形成了一個相互關(guān)聯(lián)、協(xié)同作用的防御體系。例如，在大豆感染疫霉根腐病菌的研究中發(fā)現(xiàn)，POD、PPO和PAL活性均升高，它們通過協(xié)同作用，增強了大豆對疫霉根腐病菌的抗性，這進一步證明了三種防御酶在植物抗病過程中的協(xié)同作用。6.3研究結(jié)果對小麥藍矮病防治的啟示本研究結(jié)果為小麥藍矮病的防治提供了多方面的啟示，有助于制定更加科學(xué)、有效的防治策略。在病害檢測方面，研究發(fā)現(xiàn)冰凍切片結(jié)合DAPI熒光染色技術(shù)能夠更快速、有效地檢測小麥藍矮病植原體。該技術(shù)利用冰凍切片對組織損傷小、能更好保留植原體核酸結(jié)構(gòu)的特點，使DAPI與植原體核酸高效結(jié)合，產(chǎn)生更強的熒光信號，且病葉縱切片檢測幾率更高。這一發(fā)現(xiàn)為小麥藍矮病的早期診斷提供了有力的技術(shù)支持。在實際生產(chǎn)中，可以在小麥生長的早期階段，如三葉期后，定期采集葉片樣本，采用冰凍切片結(jié)合DAPI熒光染色技術(shù)進行檢測。一旦檢測到植原體，能夠及時采取防治措施，阻止病害的進一步傳播和擴散，降低病害對小麥產(chǎn)量和質(zhì)量的影響。從細胞病理學(xué)變化來看，明確了植原體侵染對小麥葉綠體、細胞核和線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)和功能的破壞機制。在防治過程中，可以針對這些受損的細胞器功能進行調(diào)控。例如，通過合理施肥，補充植物所需的營養(yǎng)元素，如鎂、鐵等，這些元素是葉綠體中光合色素的重要組成成分，能夠促進葉綠體的正常發(fā)育和功能恢復(fù)，增強小麥的光合作用能力，提高小麥的抗病性。同時，還可以使用一些植物生長調(diào)節(jié)劑，如細胞分裂素、生長素等，調(diào)節(jié)植物細胞的生長和分裂，促進細胞核和線粒體等細胞器的正常功能恢復(fù)，增強小麥對植原體侵染的抵御能力。防御酶活性變化與小麥抗病性密切相關(guān)的研究結(jié)果，為小麥藍矮病的防治提供了新的思路?？梢酝ㄟ^誘導(dǎo)小麥自身防御酶活性的提高來增強其抗病能力。在小麥生長過程中，使用一些生物誘導(dǎo)劑，如殼聚糖、水楊酸等，這些誘導(dǎo)劑能夠激活小麥體內(nèi)的防御信號通路，促使小麥提前啟動防御機制，提高POD、PPO和PAL等防御酶的活性。殼聚糖可以通過與小麥細胞表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)防御酶基因的表達，從而提高防御酶活性。在小麥播種前，將種子用殼聚糖溶液浸泡，能夠在一定程度上提高小麥幼苗在生長初期對植原體侵染的抗性。此外，還可以通過基因工程技術(shù)，將與防御酶合成相關(guān)的基因?qū)胄←溨校蛊溥^量表達，從而增強小麥的抗病能力。對于高感品種，由于其防御酶活性升高滯后，在防治過程中應(yīng)更加注重早期的物理和化學(xué)防治措施。在小麥生長初期，加強田間巡查