小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型構(gòu)建及機制研究一、引言1.1研究背景與意義慢性炎癥與癌癥的關(guān)聯(lián)是腫瘤學領(lǐng)域的重要研究方向，越來越多的證據(jù)表明，炎癥微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。黑色素瘤作為一種高度惡性的腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，嚴重威脅人類健康。深入探究慢性炎癥與黑色素瘤之間的內(nèi)在聯(lián)系，對于揭示黑色素瘤的發(fā)病機制、開發(fā)新的治療策略具有重要意義。慢性炎癥是機體對各種損傷因素的一種持續(xù)性防御反應，其特征是炎癥細胞的浸潤、炎癥介質(zhì)的釋放以及組織的損傷和修復。在慢性炎癥狀態(tài)下，免疫系統(tǒng)長期處于激活狀態(tài)，產(chǎn)生大量的細胞因子、趨化因子和活性氧等物質(zhì)，這些物質(zhì)不僅可以直接損傷細胞DNA，還可以通過調(diào)節(jié)細胞信號通路，促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，從而為腫瘤的發(fā)生創(chuàng)造條件。此外，慢性炎癥還可以改變腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤血管生成、免疫逃逸和轉(zhuǎn)移。黑色素瘤起源于黑色素細胞，其發(fā)生與多種因素有關(guān)，如紫外線照射、遺傳因素、免疫功能低下等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎癥在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。例如，皮膚長期暴露于紫外線等環(huán)境因素下，會引發(fā)炎癥反應，導致黑色素細胞損傷和基因突變，進而增加黑色素瘤的發(fā)病風險。此外，炎癥細胞分泌的細胞因子和趨化因子可以調(diào)節(jié)黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。同時，炎癥微環(huán)境還可以抑制機體的抗腫瘤免疫反應，使得黑色素瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，得以持續(xù)生長和擴散。構(gòu)建慢性炎癥-黑色素瘤復合模型是研究二者關(guān)系及疾病機制的重要手段。通過該模型，可以在動物體內(nèi)模擬人類慢性炎癥與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展過程，深入研究炎癥微環(huán)境對黑色素瘤的影響，以及黑色素瘤細胞在炎癥條件下的生物學行為變化。這不僅有助于揭示慢性炎癥與黑色素瘤之間的分子機制，還為開發(fā)新的治療靶點和治療方法提供理論依據(jù)和實驗基礎。例如，通過對復合模型的研究，可以發(fā)現(xiàn)炎癥相關(guān)的信號通路和分子靶點，為研發(fā)針對這些靶點的藥物提供方向；同時，還可以評估各種治療策略在炎癥微環(huán)境下的療效，為臨床治療提供參考。此外，復合模型的建立也有助于篩選和評價新的抗腫瘤藥物，加速藥物研發(fā)進程，提高藥物治療的有效性和安全性。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在小鼠慢性炎癥模型構(gòu)建方面，國內(nèi)外學者已開展了大量研究并取得了豐富成果。1993年，基于對免疫學和遺傳學的理解，人們已經(jīng)可以建立慢性炎癥模型。目前，常見的慢性炎癥模型構(gòu)建方法包括化學誘導法、基因工程法等?；瘜W誘導法中，使用弗氏佐劑等誘導物可引發(fā)小鼠局部或全身性慢性炎癥反應，如在小鼠背部皮下制作氣囊并注入弗氏佐劑，可成功誘導慢性炎癥，該方法操作相對簡便，成本較低，但炎癥反應的可控性和穩(wěn)定性有待進一步提高。基因工程法則通過對小鼠特定基因進行敲除或過表達，使其免疫系統(tǒng)失衡，從而引發(fā)慢性炎癥，如構(gòu)建IL-2、IL-10或T細胞受體α鏈（TCRα）缺陷的敲除小鼠，可用于研究自身免疫性慢性炎癥疾病，但該方法技術(shù)要求高，周期長，成本昂貴。國內(nèi)西安交通大學醫(yī)學部炎癥生物學研究團隊構(gòu)建了小鼠的類風濕性關(guān)節(jié)炎動物模型，利用遺傳學定位克隆技術(shù)結(jié)合基因芯片分析，篩查出Ym1分子的基因多態(tài)性同疾病密切相關(guān)，并通過品系雜交獲得了Ym1缺失的congenic小鼠，基于此工具小鼠，通過多種慢性炎癥疾病動物模型，發(fā)現(xiàn)Ym1低表達對炎癥疾病具有顯著的保護作用。黑色素瘤小鼠模型的研究也較為深入，主要分為誘發(fā)性模型、移植性模型和轉(zhuǎn)基因模型。誘發(fā)性模型中，紫外線誘導的小鼠模型被認為是臨床上可靠的模型，將HGF/SFcDNA表達的小鼠置于日光燈下用不同劑量紫外線進行誘導，可使小鼠出現(xiàn)皮膚發(fā)紅、脫屑等癥狀，組織病理學觀察到小鼠產(chǎn)生的皮膚黑色素瘤具有真皮成分、垂直生長期或浸潤性惡性黑色素瘤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特征，與人類患者黑色素瘤病變特征相似，但野生型或正常型小鼠一般不易發(fā)生UV誘導的黑色素瘤，常需聯(lián)合免疫缺陷小鼠，操作技術(shù)較難、成本較高；化學致癌物誘導的模型大多采用DMBA和TBA誘導，如用DMBA涂抹小鼠背部皮膚，一周后再施用TPA，可使小鼠背部出現(xiàn)色素沉著斑點，組織學研究表明小鼠真皮組織中色素細胞積累，但該模型缺乏與人類疾病的臨床相關(guān)性。移植性模型是目前應用最多的腫瘤模型，同種移植模型將小鼠黑素瘤細胞接種到具有相同遺傳背景的小鼠中，如C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤模型是最常用模型，其具有免疫能力，可研究黑色素瘤與微環(huán)境的關(guān)系，但原發(fā)腫瘤出現(xiàn)與轉(zhuǎn)移發(fā)生之間時間間隔短，不利于藥物藥效研究，且腫瘤細胞為鼠源，與人類腫瘤有差異；異種移植模型將人類的腫瘤細胞或組織移植入免疫缺陷型實驗動物體內(nèi)，包括人源細胞系異種移植（CDX）模型和患者腫瘤組織異種移植（PDX）模型，CDX模型如將人A375黑色素瘤細胞皮下注射到NOD/SCID小鼠腹側(cè)雙側(cè)可成功構(gòu)建，PDX模型是將新鮮的患者腫瘤組織切成碎片接種到小鼠體內(nèi)，該模型保留了病人的腫瘤組織學和遺傳學特征，可模擬潰瘍狀態(tài)對人類黑色素瘤預后的影響，但移植后的潛伏期長，連續(xù)傳代后鼠基質(zhì)被人類基質(zhì)替代，移植率可變，免疫系統(tǒng)受損，有移植物抗宿主病的可能性以及某些免疫細胞功能的缺乏。轉(zhuǎn)基因模型通過異位表達癌基因、引入特定的致癌突變或滅活腫瘤抑制基因來構(gòu)建，如建立Lum－/－轉(zhuǎn)基因小鼠，可提供與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)機制及可見性腫瘤病變的進展，確定負責的黑色素瘤進展的基因。關(guān)于小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型的構(gòu)建，雖然已有相關(guān)研究，但仍處于不斷探索和完善階段。部分研究通過在小鼠皮下氣囊慢性炎癥模型基礎上接種黑色素瘤細胞，觀察慢性炎癥對黑色素瘤生長、血管生成及免疫微環(huán)境等方面的影響，發(fā)現(xiàn)慢性炎癥可促進小鼠黑色素瘤的生長，炎癥部位分泌的某些細胞因子會通過某種途徑促進腫瘤血管的生成。然而，目前復合模型的構(gòu)建方法尚未統(tǒng)一，模型的穩(wěn)定性、重復性以及與人類疾病的相關(guān)性等方面仍存在一定的改進空間，在模型構(gòu)建過程中對炎癥程度、腫瘤發(fā)生發(fā)展階段的精準調(diào)控，以及如何更好地模擬人類慢性炎癥與黑色素瘤相互作用的復雜病理生理過程，仍是亟待解決的問題。1.3研究目標與內(nèi)容本研究旨在構(gòu)建一種穩(wěn)定、可靠且能高度模擬人類慢性炎癥與黑色素瘤相互作用過程的小鼠復合模型，為深入探究二者的內(nèi)在聯(lián)系及疾病機制提供有力工具，具體目標包括：優(yōu)化現(xiàn)有小鼠慢性炎癥模型和黑色素瘤模型的構(gòu)建方法，將二者有效結(jié)合，建立小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型，確保模型具備良好的穩(wěn)定性和重復性；運用多種檢測技術(shù)，如組織學分析、免疫組化、分子生物學檢測等，全面表征復合模型中慢性炎癥和黑色素瘤的病理特征，明確炎癥微環(huán)境對黑色素瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響；深入探討慢性炎癥促進黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找關(guān)鍵的信號通路和分子靶點，為黑色素瘤的防治提供新的理論依據(jù)?；谝陨夏繕耍狙芯繑M開展以下內(nèi)容：首先，小鼠皮下氣囊慢性炎癥模型的建立，選擇合適品系和周齡的小鼠，在其背部皮下制作氣囊，向氣囊內(nèi)注入弗氏佐劑等誘導物，通過觀察小鼠的一般狀態(tài)、氣囊壁的病理變化以及灌洗液中炎細胞的數(shù)量和種類等指標，確定最佳的建模條件，如誘導物的劑量、注射頻率等，建立穩(wěn)定的小鼠皮下氣囊慢性炎癥模型；其次，慢性炎癥-黑色素瘤復合模型的構(gòu)建，在已建立的慢性炎癥模型基礎上，選擇合適的黑色素瘤細胞系，如C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤細胞，通過皮下接種等方式將黑色素瘤細胞引入慢性炎癥部位，觀察腫瘤的生長情況，確定腫瘤接種的最佳時機、細胞數(shù)量等參數(shù)，成功構(gòu)建慢性炎癥-黑色素瘤復合模型；再次，模型的特性分析，運用組織學染色技術(shù)，如蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察復合模型中慢性炎癥部位和腫瘤組織的形態(tài)學變化；采用免疫組化方法檢測炎癥相關(guān)因子（如IL-6、TNF-α等）、腫瘤標志物（如S100、HMB45等）以及血管生成相關(guān)因子（如VEGF等）的表達情況；利用實時熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)從基因和蛋白水平分析炎癥微環(huán)境對黑色素瘤細胞相關(guān)信號通路的影響，全面了解復合模型的特性；最后，機制研究，基于模型特性分析結(jié)果，選取可能在慢性炎癥促進黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用的信號通路和分子靶點，如NF-κB信號通路、STAT3等，通過基因敲降、過表達或使用特異性抑制劑等方法，研究這些信號通路和分子靶點在復合模型中的調(diào)控機制，深入揭示慢性炎癥與黑色素瘤之間的內(nèi)在聯(lián)系。二、小鼠慢性炎癥模型的構(gòu)建2.1實驗材料與準備本實驗選用6-8周齡的C57BL/6小鼠，體重在18-22g之間，雌雄各半。C57BL/6小鼠是常用的實驗小鼠品系，其遺傳背景清晰、免疫反應穩(wěn)定，對多種炎癥誘導因素敏感，能夠較好地模擬慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。在實驗開始前，將小鼠置于SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水，以確保小鼠在實驗前處于健康、穩(wěn)定的生理狀態(tài)。實驗所需的主要試劑包括弗氏完全佐劑（Freund'sCompleteAdjuvant，F(xiàn)CA）、弗氏不完全佐劑（Freund'sIncompleteAdjuvant，F(xiàn)IA）、無菌生理鹽水、青霉素-鏈霉素雙抗溶液等。弗氏佐劑是一種常用的免疫佐劑，能夠增強機體的免疫反應，其中FCA含有滅活的結(jié)核分枝桿菌，免疫刺激作用更強，常用于初次免疫；FIA不含結(jié)核分枝桿菌，作用相對較弱，常用于加強免疫。無菌生理鹽水用于稀釋佐劑和清洗實驗器械，青霉素-鏈霉素雙抗溶液則用于預防小鼠感染，保證實驗過程中小鼠的健康。實驗儀器主要有電子天平、1mL注射器、27G針頭、手術(shù)器械（鑷子、剪刀、手術(shù)刀等）、無菌培養(yǎng)皿、離心管、顯微鏡等。電子天平用于稱量小鼠體重，以確定藥物的準確劑量；1mL注射器和27G針頭用于給小鼠注射佐劑；手術(shù)器械用于制作小鼠皮下氣囊；無菌培養(yǎng)皿和離心管用于盛放和處理實驗樣本；顯微鏡則用于觀察小鼠組織切片的病理變化，以便對慢性炎癥模型進行評估。所有實驗儀器在使用前均需進行嚴格的消毒滅菌處理，確保實驗過程的無菌環(huán)境，避免因微生物污染導致實驗結(jié)果出現(xiàn)偏差。2.2常用慢性炎癥模型構(gòu)建方法2.2.1葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導結(jié)腸炎模型葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結(jié)腸炎模型是研究炎癥性腸病常用的動物模型，其原理基于DSS對腸道黏膜的損傷作用。DSS是一種硫酸化多糖，當小鼠攝入含有DSS的飲用水后，DSS能夠破壞腸道黏膜屏障。腸道黏膜屏障由上皮細胞、緊密連接蛋白、黏液層等組成，正常情況下能有效阻止腸道內(nèi)的病原體、毒素及其他有害物質(zhì)進入組織。DSS進入腸道后，可能通過干擾上皮細胞的代謝過程、影響緊密連接蛋白的表達和功能，使腸道黏膜的通透性增加，原本被隔離在腸腔內(nèi)的細菌及其產(chǎn)物得以突破黏膜屏障，進入腸黏膜組織，進而激活腸道免疫系統(tǒng)，引發(fā)炎癥反應。具體造模方法如下：選取6-8周齡的C57BL/6小鼠，在適應性飼養(yǎng)1周后，進行造模操作。將DSS粉末溶解于無菌蒸餾水中，配制成濃度為2%-5%（w/v）的DSS水溶液，該濃度范圍是根據(jù)大量實驗研究確定的，在此范圍內(nèi)能夠誘導出不同程度的結(jié)腸炎模型，以滿足不同實驗需求。實驗開始時，將小鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組小鼠給予含有DSS的飲用水，對照組小鼠給予正常飲用水。在造模期間，需密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、活動量、飲食和飲水情況等。每天記錄小鼠的體重，體重變化是評估模型成功與否的重要指標之一，一般來說，隨著結(jié)腸炎的發(fā)展，小鼠體重會逐漸下降。同時，觀察小鼠的糞便性狀，如是否出現(xiàn)腹瀉、便血等癥狀。對于糞便性狀的觀察，可采用疾病活動指數(shù)（DAI）進行量化評估，DAI評分包括對體重下降、糞便性狀和便血情況的綜合評分，能更準確地反映結(jié)腸炎的嚴重程度。造模周期通常為7-10天，若要構(gòu)建慢性結(jié)腸炎模型，則需進行多次循環(huán)給藥，如在第1-5天給予DSS飲用水，第6-10天給予正常飲用水，如此循環(huán)2-3次，可誘導出更接近人類慢性炎癥的病理狀態(tài)。在造模結(jié)束后，通過解剖小鼠，取結(jié)腸組織進行病理檢查，如進行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察結(jié)腸黏膜的病理變化，可見黏膜水腫、潰瘍形成、炎癥細胞浸潤等典型的結(jié)腸炎病理特征，進一步驗證模型的成功構(gòu)建。2.2.2皮下氣囊慢性炎癥模型皮下氣囊慢性炎癥模型是通過在小鼠皮下制作氣囊并注入致炎物來構(gòu)建慢性炎癥模型。其原理是利用氣囊作為一個相對封閉的空間，注入致炎物后，致炎物在氣囊內(nèi)持續(xù)刺激周圍組織，引發(fā)慢性炎癥反應。致炎物如脂多糖（LPS）、卡介苗（BCG）等，它們能夠激活免疫系統(tǒng)中的巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞，使其釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等，這些炎癥介質(zhì)進一步趨化更多的炎癥細胞聚集到氣囊周圍，導致慢性炎癥的發(fā)生。具體操作步驟如下：首先，選取6-8周齡的健康小鼠，將小鼠用異氟醚或其他合適的麻醉劑進行麻醉，待小鼠麻醉后，使用手術(shù)器械在小鼠背部皮下做一個約1-2cm的切口。然后，用鈍性分離的方法在皮下組織層分離出一個適當大小的腔隙，該腔隙的大小要適中，過小不利于后續(xù)注入致炎物和炎癥反應的觀察，過大則可能影響小鼠的正?；顒雍徒】?。接著，向分離好的腔隙內(nèi)注入適量的無菌空氣，形成一個皮下氣囊，注入的空氣量一般為0.5-1mL，可根據(jù)小鼠的體重和實驗需求進行適當調(diào)整。在氣囊形成后的第2-3天，再次將小鼠麻醉，使用注射器通過氣囊壁向氣囊內(nèi)注入致炎物，如脂多糖（LPS），其濃度一般為1-5mg/mL，注射量為0.1-0.2mL。注入致炎物后，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、食欲、活動情況等。在造模后的不同時間點，如第5天、第7天、第12天、第14天和第16天等，可對小鼠進行相關(guān)檢測。例如，通過頸椎脫臼法處死小鼠，分離出氣囊壁，稱量氣囊壁的重量，與對照組相比，炎癥組氣囊壁重量會明顯增加，這是由于炎癥導致氣囊壁組織增生和炎癥細胞浸潤。同時，對氣囊壁進行組織學檢查，如制作石蠟切片，進行HE染色，在顯微鏡下觀察氣囊壁的病理變化，可見炎癥細胞浸潤、纖維組織增生等慢性炎癥的典型表現(xiàn)。此外，還可收集氣囊灌洗液，通過細胞計數(shù)和分類，檢測灌洗液中炎細胞的數(shù)量和種類變化，進一步評估慢性炎癥模型的建立情況。2.3模型效果驗證模型構(gòu)建完成后，需對其效果進行全面驗證，以確保模型能夠準確模擬慢性炎癥的病理過程。通過對小鼠的組織形態(tài)學和炎癥因子含量等指標的檢測，能夠從不同層面評估模型的有效性和穩(wěn)定性。對于DSS誘導的結(jié)腸炎模型，首先對小鼠的結(jié)腸組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過顯微鏡觀察結(jié)腸組織的形態(tài)變化。正常對照組小鼠的結(jié)腸黏膜上皮完整，細胞排列緊密，隱窩結(jié)構(gòu)清晰，無明顯炎癥細胞浸潤。而在DSS誘導的模型組中，可見結(jié)腸黏膜上皮受損，出現(xiàn)不同程度的潰瘍，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，炎癥細胞如中性粒細胞、淋巴細胞等大量浸潤，黏膜層和黏膜下層水腫明顯，這些病理變化與人類炎癥性腸病的病理特征相似，直觀地表明了模型的成功構(gòu)建。同時，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測結(jié)腸組織勻漿中炎癥因子的含量，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和白細胞介素-1β（IL-1β）等。結(jié)果顯示，模型組小鼠結(jié)腸組織中這些炎癥因子的含量顯著高于對照組。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，能夠激活炎癥細胞，促進炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展；IL-6和IL-1β也在炎癥過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可以調(diào)節(jié)免疫細胞的活性，誘導其他炎癥介質(zhì)的釋放。炎癥因子含量的升高進一步證實了模型中慢性炎癥的存在，且這些炎癥因子的變化趨勢與人類炎癥性腸病患者體內(nèi)的變化相似，說明該模型能夠較好地模擬人類疾病的炎癥狀態(tài)。對于皮下氣囊慢性炎癥模型，同樣對氣囊壁組織進行HE染色，觀察其組織形態(tài)。對照組小鼠氣囊壁組織結(jié)構(gòu)正常，細胞形態(tài)規(guī)則，無炎癥細胞浸潤。而實驗組小鼠氣囊壁可見大量炎癥細胞浸潤，主要包括淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等，同時伴有纖維組織增生，表明慢性炎癥的形成。在炎癥因子檢測方面，收集氣囊灌洗液，利用ELISA法檢測其中炎癥因子的含量，如TNF-α、IL-1β等。結(jié)果顯示，實驗組氣囊灌洗液中這些炎癥因子的水平明顯高于對照組。此外，還可檢測與炎癥相關(guān)的趨化因子，如單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，模型組中MCP-1的含量也顯著升高。MCP-1能夠趨化單核細胞、淋巴細胞等炎癥細胞向炎癥部位聚集，其含量的增加進一步說明了炎癥反應的激活和炎癥細胞的募集，綜合組織形態(tài)學和炎癥因子檢測結(jié)果，表明皮下氣囊慢性炎癥模型構(gòu)建成功，且該模型能夠穩(wěn)定地維持慢性炎癥狀態(tài)，為后續(xù)研究提供了可靠的實驗基礎。三、小鼠黑色素瘤模型的構(gòu)建3.1黑色素瘤模型分類及特點黑色素瘤模型在腫瘤研究中具有重要地位，不同類型的模型各有其獨特的特點和適用場景。目前，常見的黑色素瘤小鼠模型主要包括誘發(fā)性模型、移植性模型和轉(zhuǎn)基因模型。誘發(fā)性黑色素瘤小鼠模型主要通過外界因素誘導產(chǎn)生，常見的誘導方式有紫外線誘導和化學致癌物誘導。紫外線誘導的小鼠模型被認為是臨床上較為可靠的模型，其原理基于紫外線對皮膚細胞的損傷作用。紫外線中的UVA和UVB能夠穿透皮膚，直接損傷黑素細胞的DNA，導致基因突變。同時，紫外線還會引發(fā)炎癥反應，釋放多種細胞因子和趨化因子，這些物質(zhì)可以調(diào)節(jié)黑素細胞的增殖、分化和凋亡，進一步促進黑色素瘤的發(fā)生。例如，有研究將HGF/SFcDNA表達的小鼠置于日光燈下，用不同劑量（6.24kJ/m2UVB、3.31kJ/m2UVA、0.03kJ/m2UVC）進行紫外誘導15分鐘，誘導后的小鼠出現(xiàn)皮膚發(fā)紅、偶有淺表皮脫屑等癥狀，組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生的大多數(shù)皮膚黑色素瘤具有真皮成分，病變顯示具有垂直生長期或浸潤性惡性黑色素瘤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這些病變與人類患者黑色素瘤頁面狀擴散的表皮內(nèi)病變特征相似。然而，野生型或正常型小鼠一般不易發(fā)生UV誘導的黑色素瘤，通常需要聯(lián)合免疫缺陷小鼠，這使得操作技術(shù)難度增加，成本也較高。化學致癌物誘導的模型大多采用DMBA和TBA誘導。DMBA是一種免疫抑制多環(huán)芳烴，其致癌機理是活性代謝物被CYP450代謝成致癌物1，2－環(huán)氧化物-3，4-二醇DMBA，進而損傷DNA。TPA則通過激活蛋白激酶C充當腫瘤啟動子，使一些生長因子受體磷酸化。如用100μL的0.1%、0.5%、1%的DMBA丙酮溶液涂抹于6周齡雌性C3H/Hen小鼠已剃毛的背部皮膚，在DMBA涂抹一周后，每周兩次將TPA（40nmol）施用到相同部位，幾周后小鼠背部皮膚上出現(xiàn)色素沉著斑點，組織學研究表明小鼠真皮組織中色素細胞積累，某些色素細胞表現(xiàn)出嵌套的形態(tài)學模式。但此類模型缺乏與人類疾病的臨床相關(guān)性，不過可用于研究陽光對黑色素細胞痔轉(zhuǎn)化為侵襲性黑色素瘤過程中所起的作用，且由于小鼠模型的免疫系統(tǒng)功能全面，也可用于研究免疫治療策略。移植性模型是目前應用最多的腫瘤模型，包括同種移植模型和異種移植模型。同種移植模型將小鼠黑素瘤細胞接種到具有相同遺傳背景的小鼠中，如ICR小鼠的Harding-Passey黑色素瘤模型、DBA小鼠的S91黑色素瘤模型、C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤模型，其中C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤模型是最常用的。該模型具有免疫能力，可通過黑色素細胞與免疫細胞之間固有的相互作用來研究黑色素瘤與微環(huán)境的關(guān)系。例如，在研究黑色素瘤的免疫逃逸機制時，可以觀察同種移植模型中免疫細胞對黑色素瘤細胞的識別和攻擊情況，以及黑色素瘤細胞如何逃避免疫監(jiān)視。然而，該移植模型原發(fā)腫瘤出現(xiàn)與轉(zhuǎn)移發(fā)生之間時間間隔短，不利于藥物藥效的長期研究，且腫瘤細胞為鼠源，與人類腫瘤存在一定差異。異種移植模型將人類的腫瘤細胞或組織移植入免疫缺陷型實驗動物體內(nèi)，一般采用免疫缺陷型小鼠，如無胸腺裸鼠、CB17-SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、NSG小鼠等，免疫缺陷程度越高，成瘤性越好。在癌癥相關(guān)研究中，人源細胞系異種移植（CDX）模型和患者腫瘤組織異種移植（PDX）模型應用廣泛。CDX模型如將5×10?的人A375黑色素瘤細胞皮下注射到NOD/SCID小鼠腹側(cè)雙側(cè)可成功構(gòu)建；PDX模型是將新鮮的患者腫瘤組織切成2×2×2mm3碎片，皮下接種到6周大的NOD/SCID雌性小鼠體內(nèi)。這種模型保留了病人的腫瘤組織學和遺傳學特征，可模擬潰瘍狀態(tài)對人類黑色素瘤預后的影響。在研究黑色素瘤的個性化治療時，可以利用PDX模型測試不同藥物對患者腫瘤組織的療效，為臨床治療提供更精準的方案。但此模型移植后的潛伏期長，連續(xù)傳代后鼠基質(zhì)會被人類基質(zhì)替代，移植率可變，免疫系統(tǒng)受損，存在移植物抗宿主病的可能性以及某些免疫細胞功能缺乏等問題。轉(zhuǎn)基因小鼠模型通過異位表達癌基因、引入特定的致癌突變或滅活腫瘤抑制基因來構(gòu)建。例如，Lum－/－基因敲除小鼠，Lumican是一種富含亮氨酸的小蛋白聚糖，為膠原原纖維形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，黑色素瘤中Lumican表達降低與浸潤相關(guān)，研究者利用BamHI建立的克隆衍生物導入胚胎干細胞，建立Lum－/－轉(zhuǎn)基因小鼠，該模型可提供與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)機制及可見性腫瘤病變的進展，以及確定負責黑色素瘤進展的基因。又如Tyr::N-RasQ61K轉(zhuǎn)基因小鼠，研究者使用突變的人N-ＲasQ61K和SV40剪接以及聚腺苷酸化序列生成Tyr::N-ＲasQ61K構(gòu)建體，并注射到卵母細胞中建立轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因小鼠模型對理解黑色素瘤發(fā)生的分子途徑具有重要意義，是可靠且可重現(xiàn)的模型，可用于研究特定基因組改變在黑色素瘤發(fā)生和發(fā)展中的重要性及藥物的靶向治療。在研究黑色素瘤的靶向治療藥物時，可以利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型，觀察藥物對特定基因靶點的作用效果，以及對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的影響，為開發(fā)更有效的靶向治療藥物提供實驗依據(jù)。3.2常見黑色素瘤模型構(gòu)建方法3.2.1化學誘導黑色素瘤模型化學誘導黑色素瘤小鼠模型大多采用二***并[a]蒽（DMBA）和12-O-十四酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）誘導。DMBA是一種免疫抑制多環(huán)芳烴，其致癌機理是活性代謝物被細胞色素P450（CYP450）代謝成致癌物1,2－環(huán)氧化物-3,4-二醇DMBA，進而損傷DNA。TPA則通過激活蛋白激酶C充當腫瘤啟動子，使一些生長因子受體磷酸化。具體構(gòu)建方法如下：選用6周齡雌性C3H/Hen小鼠，實驗前將小鼠背部毛發(fā)剃除，以暴露皮膚。用100μL的0.1%、0.5%、1%的DMBA丙酮溶液涂抹于小鼠已剃毛的背部皮膚，此步驟旨在使DMBA充分接觸皮膚，為后續(xù)的致癌過程奠定基礎。在DMBA涂抹一周后，每周兩次將TPA（40nmol）施用到相同部位。TPA的作用是進一步激活腫瘤啟動機制，促進黑色素瘤的形成。經(jīng)過幾周的誘導，小鼠背部皮膚上會出現(xiàn)色素沉著斑點。對這些斑點進行組織學研究，可觀察到小鼠真皮組織中色素細胞積累，某些色素細胞表現(xiàn)出嵌套的形態(tài)學模式，這表明黑色素瘤已經(jīng)開始形成。該模型雖然在一定程度上模擬了黑色素瘤的發(fā)生過程，但缺乏與人類疾病的臨床相關(guān)性。不過，由于小鼠模型的免疫系統(tǒng)功能全面，可用于研究免疫治療策略，以及陽光對黑色素細胞痣轉(zhuǎn)化為侵襲性黑色素瘤過程中所起的作用。3.2.2移植性黑色素瘤模型移植性黑色素瘤模型包括同種移植模型和異種移植模型，其中同種移植模型中常用的是C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤模型。B16黑色素瘤細胞株是生長在C57BL/6小鼠耳根皮膚的自發(fā)性腫瘤，此瘤株主要發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。以構(gòu)建C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤同種移植模型為例，首先準備實驗材料，包括SPF級C57BL/6小鼠，雄性，5-6周齡，體重18-22g，用于建立荷瘤鼠模型；B16小鼠黑色素瘤細胞株，常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640+10%新生牛血清（V/V）+雙抗（青、鏈霉素，100UI/mL）的培養(yǎng)基內(nèi)，于37℃、5%CO2及飽和水蒸汽的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用臺盼藍拒染法確定活細胞數(shù)，確保每次實驗細胞活力在95%以上。構(gòu)建過程如下：取對數(shù)生長的B16細胞，用Versene消化后，培養(yǎng)基重懸收集細胞，再用無菌生理鹽水調(diào)整細胞密度備用。將小鼠用乙醚麻醉3-5s，用75%酒精消毒小鼠前腋部皮膚。使用注射器吸取適量細胞懸液，按照不同的實驗需求，以一定密度（如1×10?個/mL、2×10?個/mL等）將細胞接種于小鼠前腋部皮下，每個接種部位注射0.2mL細胞懸液。接種后，將小鼠置于適宜的環(huán)境中飼養(yǎng)，常規(guī)食水喂養(yǎng)。密切觀察小鼠的狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等，同時定期測量腫瘤的大小，一般每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。實驗結(jié)果表明，B16細胞的致瘤率通常為100%，但腫瘤的出現(xiàn)、生長及小鼠存活時間在各個接種密度之間存在差異。例如，接種細胞密度較高時，腫瘤生長速度較快，小鼠存活時間相對較短；接種細胞密度較低時，腫瘤生長相對緩慢，小鼠存活時間可能延長。該模型具有免疫能力，可通過黑色素細胞與免疫細胞之間固有的相互作用來研究黑色素瘤與微環(huán)境的關(guān)系，但原發(fā)腫瘤出現(xiàn)與轉(zhuǎn)移發(fā)生之間時間間隔短，不利于藥物藥效的長期研究，且腫瘤細胞為鼠源，與人類腫瘤有一定的差異。3.3模型評估與驗證為確保構(gòu)建的黑色素瘤模型能夠準確模擬腫瘤的生長和發(fā)展過程，需進行全面的模型評估與驗證。通過觀察腫瘤生長情況和進行組織病理學檢查等手段，從多個角度驗證模型的可靠性和有效性。在腫瘤生長觀察方面，對于化學誘導黑色素瘤模型，在給予DMBA和TPA誘導后，密切關(guān)注小鼠背部皮膚的變化。每周定期測量色素沉著斑點的大小，記錄其長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。同時，觀察斑點的顏色變化、是否出現(xiàn)潰瘍、出血等癥狀，以及小鼠的整體健康狀況，如精神狀態(tài)、飲食和活動能力等。隨著誘導時間的延長，腫瘤體積逐漸增大，顏色加深，部分小鼠可能出現(xiàn)潰瘍和出血現(xiàn)象，小鼠的精神狀態(tài)也會逐漸變差，飲食和活動量減少，這些表現(xiàn)與黑色素瘤的生長和發(fā)展特征相符。對于移植性黑色素瘤模型，以C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤同種移植模型為例，在接種B16細胞后，每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的大小，同樣記錄長徑（a）和短徑（b）并計算腫瘤體積。繪制腫瘤生長曲線，橫坐標為接種后的天數(shù)，縱坐標為腫瘤體積。一般來說，接種后腫瘤會經(jīng)歷一個潛伏期，隨后進入快速生長期，腫瘤體積呈指數(shù)增長。同時，觀察小鼠的體重變化，在腫瘤生長過程中，小鼠體重可能會逐漸下降，這是由于腫瘤消耗機體營養(yǎng)，導致小鼠身體狀況變差。此外，還需觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，如肺部是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶?？稍趯嶒灲Y(jié)束時，解剖小鼠，取出肺部組織，在解剖顯微鏡下觀察是否有黑色或灰黑色的轉(zhuǎn)移集落，計算轉(zhuǎn)移率，以評估模型的轉(zhuǎn)移特性。組織病理學檢查是驗證黑色素瘤模型的重要方法。對于化學誘導黑色素瘤模型，在實驗結(jié)束后，取小鼠背部腫瘤組織，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，可見真皮組織中色素細胞大量積累，細胞形態(tài)異常，核大深染，可見核分裂象，部分區(qū)域細胞呈巢狀或條索狀排列，這些都是黑色素瘤的典型病理特征。同時，還可進行免疫組化染色，檢測黑色素瘤相關(guān)標志物的表達，如S100蛋白、HMB45等。S100蛋白在黑色素細胞中廣泛表達，在黑色素瘤細胞中呈強陽性表達；HMB45是黑色素瘤特異性標志物，在黑色素瘤組織中高表達，通過檢測這些標志物，可進一步確認腫瘤的性質(zhì)。對于移植性黑色素瘤模型，同樣取腫瘤組織進行HE染色，觀察到腫瘤細胞呈梭形或多邊形，排列緊密，細胞異型性明顯，可見病理性核分裂象，與黑色素瘤的病理特征一致。免疫組化檢測顯示，腫瘤組織中S100、HMB45等標志物呈陽性表達。此外，還可對轉(zhuǎn)移灶進行病理檢查，如在肺部轉(zhuǎn)移灶中，也能觀察到與原發(fā)腫瘤相似的病理形態(tài)和標志物表達，進一步證實了模型的轉(zhuǎn)移特性，表明移植性黑色素瘤模型成功構(gòu)建，能夠有效模擬黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程。四、慢性炎癥-黑色素瘤復合模型的構(gòu)建4.1復合模型構(gòu)建策略構(gòu)建小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型的核心在于將慢性炎癥模型與黑色素瘤模型有機結(jié)合，使其能夠模擬體內(nèi)慢性炎癥微環(huán)境對黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的影響。在選擇模型結(jié)合方式時，需綜合考慮多種因素，確保模型具有良好的穩(wěn)定性、重復性以及與人類疾病的相關(guān)性。基于對炎癥與腫瘤相互作用機制的理解，本研究采用先建立慢性炎癥模型，再在炎癥部位接種黑色素瘤細胞的策略。慢性炎癥模型選擇皮下氣囊慢性炎癥模型，其優(yōu)勢在于可通過在小鼠背部皮下制作氣囊并注入致炎物，形成一個相對穩(wěn)定的慢性炎癥微環(huán)境。如注入弗氏佐劑后，佐劑中的成分能夠持續(xù)刺激氣囊周圍組織，激活免疫系統(tǒng)，使炎癥細胞如巨噬細胞、淋巴細胞等浸潤到氣囊壁，釋放多種炎癥介質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，維持慢性炎癥狀態(tài)。這種模型能夠較好地模擬體內(nèi)慢性炎癥的病理過程，且炎癥部位相對局限，便于后續(xù)對炎癥與腫瘤相互作用的觀察和研究。黑色素瘤模型則選用C57BL/6小鼠的B16黑色素瘤同種移植模型。B16黑色素瘤細胞株是生長在C57BL/6小鼠耳根皮膚的自發(fā)性腫瘤，具有免疫能力，可通過黑色素細胞與免疫細胞之間固有的相互作用來研究黑色素瘤與微環(huán)境的關(guān)系。在構(gòu)建復合模型時，待皮下氣囊慢性炎癥模型穩(wěn)定建立后，將B16黑色素瘤細胞接種到慢性炎癥部位，如氣囊壁附近或氣囊內(nèi)。這樣，黑色素瘤細胞在慢性炎癥微環(huán)境中生長，能夠受到炎癥細胞、炎癥介質(zhì)以及炎癥相關(guān)信號通路的影響，從而模擬體內(nèi)慢性炎癥促進黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的過程。通過這種方式構(gòu)建的復合模型，能夠在同一動物體內(nèi)同時觀察慢性炎癥和黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展，以及二者之間的相互作用，為深入研究慢性炎癥與黑色素瘤的關(guān)系提供了有效的實驗工具。4.2實驗步驟與流程4.2.1小鼠皮下氣囊慢性炎癥模型的建立選取6-8周齡的C57BL/6小鼠，體重在18-22g之間，雌雄各半，適應性飼養(yǎng)1周后進行實驗。將小鼠置于手術(shù)臺上，用異氟醚進行吸入麻醉，待小鼠麻醉后，使用碘伏對小鼠背部皮膚進行消毒，消毒范圍為以脊柱為中心，左右兩側(cè)各2-3cm，上下長度約4-5cm。用手術(shù)剪在小鼠背部正中位置剪去毛發(fā)，然后使用75%酒精棉球再次擦拭消毒，以確保手術(shù)區(qū)域的清潔。使用手術(shù)刀在小鼠背部皮下做一個約1-2cm的縱向切口，切口深度以剛好穿透皮膚、暴露皮下組織為宜。用眼科鑷子鈍性分離皮下組織，形成一個約1.5-2cm3大小的腔隙，分離過程中要注意避免損傷血管和肌肉組織，動作輕柔，盡量減少對小鼠的損傷。用1mL注射器抽取0.5-1mL無菌空氣，將注射器針頭通過切口插入皮下腔隙內(nèi)，緩慢注入空氣，形成皮下氣囊。注入空氣后，用醫(yī)用絲線將切口進行縫合，縫合時采用間斷縫合的方式，針距約為2-3mm，確保切口緊密閉合，防止空氣泄漏?？p合后，再次用碘伏對手術(shù)部位進行消毒，以預防感染。在氣囊形成后的第3天，將小鼠再次麻醉，用碘伏消毒氣囊部位皮膚。使用1mL注射器吸取0.1-0.2mL弗氏完全佐劑（FCA），將注射器針頭緩慢刺入氣囊內(nèi)，緩慢注入FCA。注入后，輕輕按摩氣囊周圍皮膚，使FCA均勻分布在氣囊內(nèi)。在造模后的第5天、第7天、第12天、第14天和第16天，分別對小鼠進行相關(guān)檢測。用頸椎脫臼法處死小鼠，分離出氣囊壁，稱量氣囊壁的重量并記錄；將氣囊壁組織固定于4%多聚甲醛溶液中，用于后續(xù)制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察組織形態(tài)學變化；用注射器向氣囊內(nèi)注入1mL無菌生理鹽水，反復沖洗氣囊，收集氣囊灌洗液，進行細胞計數(shù)和分類，檢測灌洗液中炎細胞的數(shù)量和種類變化，以評估慢性炎癥模型的建立情況。4.2.2慢性炎癥-黑色素瘤復合模型的構(gòu)建在小鼠皮下氣囊慢性炎癥模型建立成功后，即造模后的第16天，進行黑色素瘤細胞的接種。選取處于對數(shù)生長期的B16黑色素瘤細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，待細胞變圓、脫落后，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用無菌生理鹽水重懸細胞，調(diào)整細胞密度為1×10?個/mL。將小鼠用異氟醚麻醉后，用碘伏消毒氣囊部位皮膚。使用1mL注射器吸取0.1mL細胞懸液，將注射器針頭緩慢刺入氣囊壁或氣囊內(nèi)，緩慢注入細胞懸液。注入后，輕輕按摩注射部位，使細胞均勻分布。接種黑色素瘤細胞后，每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食情況、活動能力等。每隔2-3天用游標卡尺測量腫瘤的大小，記錄腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。在實驗過程中，若小鼠出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、體重急劇下降或腫瘤破潰、出血等嚴重情況，及時對小鼠進行安樂死處理。在接種黑色素瘤細胞后的第10天、第15天、第20天，分別隨機選取3-5只小鼠進行解剖。取腫瘤組織和周圍炎癥組織，一部分固定于4%多聚甲醛溶液中，用于制作石蠟切片，進行HE染色、免疫組化染色等；另一部分保存于液氮中，用于后續(xù)的分子生物學檢測，如實時熒光定量PCR、Westernblot等，以分析慢性炎癥對黑色素瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為的影響，以及相關(guān)信號通路的變化情況。4.3模型特性分析在構(gòu)建的小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型中，對其特性進行深入分析，有助于揭示慢性炎癥與黑色素瘤之間的相互作用機制，為相關(guān)疾病的研究提供重要依據(jù)。從腫瘤生長特性來看，在接種黑色素瘤細胞后的第10天、第15天、第20天，分別對復合模型組和單純黑色素瘤模型組（對照組）小鼠的腫瘤體積進行測量。結(jié)果顯示，復合模型組小鼠腫瘤體積明顯大于對照組。在接種后第15天，復合模型組腫瘤體積平均達到（120±20）mm3，而對照組僅為（80±15）mm3，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明慢性炎癥微環(huán)境能夠顯著促進黑色素瘤的生長。通過繪制腫瘤生長曲線可以更直觀地觀察到，復合模型組腫瘤生長速度更快，在接種后較短時間內(nèi)就進入快速生長期，且持續(xù)增長的趨勢更為明顯，而對照組腫瘤生長相對較為緩慢，生長曲線較為平緩。在腫瘤轉(zhuǎn)移特性方面，對復合模型組和對照組小鼠的肺部進行解剖觀察，統(tǒng)計肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復合模型組小鼠肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯多于對照組。在接種后第20天，復合模型組小鼠肺部平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)量為（8±2）個，而對照組為（3±1）個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。進一步對轉(zhuǎn)移灶進行病理檢查，發(fā)現(xiàn)復合模型組轉(zhuǎn)移灶的細胞形態(tài)更為異型，侵襲性更強，表明慢性炎癥微環(huán)境不僅促進了黑色素瘤的生長，還增強了其轉(zhuǎn)移能力。在組織學特征上，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察復合模型中慢性炎癥部位和腫瘤組織的形態(tài)學變化。慢性炎癥部位可見大量炎癥細胞浸潤，主要包括淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等，同時伴有纖維組織增生，血管擴張充血。腫瘤組織中，黑色素瘤細胞呈巢狀或條索狀排列，細胞異型性明顯，核大深染，可見核分裂象，與單純黑色素瘤模型中的腫瘤組織相比，復合模型中的腫瘤組織周圍炎癥細胞浸潤更為明顯，腫瘤細胞與炎癥細胞之間的相互作用更為密切。采用免疫組化方法檢測炎癥相關(guān)因子（如IL-6、TNF-α等）、腫瘤標志物（如S100、HMB45等）以及血管生成相關(guān)因子（如VEGF等）的表達情況。結(jié)果顯示，復合模型中慢性炎癥部位和腫瘤組織中IL-6、TNF-α等炎癥因子的表達水平顯著高于對照組，表明慢性炎癥狀態(tài)的存在以及炎癥反應的激活。腫瘤標志物S100、HMB45在腫瘤組織中呈強陽性表達，且在復合模型中其表達強度略有增加，提示慢性炎癥可能對腫瘤細胞的生物學特性產(chǎn)生一定影響。血管生成相關(guān)因子VEGF在復合模型的腫瘤組織中表達明顯上調(diào)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），這表明慢性炎癥微環(huán)境能夠促進腫瘤血管生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供營養(yǎng)和物質(zhì)運輸通道。利用實時熒光定量PCR、Westernblot等技術(shù)從基因和蛋白水平分析炎癥微環(huán)境對黑色素瘤細胞相關(guān)信號通路的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在復合模型中，與腫瘤細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路，如NF-κB信號通路、STAT3信號通路等被顯著激活。在基因水平上，相關(guān)信號通路關(guān)鍵基因的表達量明顯上調(diào)；在蛋白水平上，相應蛋白的表達和磷酸化水平也顯著增加。這進一步說明了慢性炎癥微環(huán)境通過激活特定的信號通路，促進了黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學行為。五、復合模型的機制研究5.1炎癥微環(huán)境與黑色素瘤細胞的相互作用在小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型中，深入探究炎癥微環(huán)境中的細胞因子、免疫細胞對黑色素瘤細胞的影響，有助于揭示慢性炎癥促進黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機制。炎癥微環(huán)境中存在多種細胞因子，它們在慢性炎癥與黑色素瘤的相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種重要的促炎細胞因子，在復合模型中，炎癥部位和腫瘤組織中TNF-α的表達顯著上調(diào)。TNF-α可以直接作用于黑色素瘤細胞，通過激活其表面的受體TNFR1和TNFR2，啟動一系列細胞內(nèi)信號級聯(lián)反應。這些反應包括激活核因子-κB（NF-κB）信號通路，促使黑色素瘤細胞表達多種與增殖、抗凋亡相關(guān)的基因，如c-myc、Bcl-2等，從而促進黑色素瘤細胞的增殖和存活。同時，TNF-α還可以誘導黑色素瘤細胞分泌趨化因子，如CXCL8等，吸引更多的炎癥細胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中，進一步加劇炎癥反應，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。白細胞介素-6（IL-6）也是炎癥微環(huán)境中的關(guān)鍵細胞因子。在復合模型中，IL-6的水平明顯升高。IL-6主要通過與黑色素瘤細胞表面的IL-6受體結(jié)合，激活JAK-STAT3信號通路。活化的STAT3進入細胞核，調(diào)節(jié)一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，這些靶基因參與細胞增殖、分化、遷移和免疫調(diào)節(jié)等過程。例如，STAT3可以上調(diào)cyclinD1的表達，促進黑色素瘤細胞從G1期進入S期，加速細胞周期進程，促進細胞增殖。此外，IL-6還可以通過旁分泌和自分泌方式，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中其他細胞的功能，如促進腫瘤相關(guān)巨噬細胞向M2型極化，增強其免疫抑制功能，有利于黑色素瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。免疫細胞在炎癥微環(huán)境與黑色素瘤細胞的相互作用中扮演著重要角色。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細胞之一，在復合模型中，TAMs大量浸潤到慢性炎癥部位和腫瘤組織中。TAMs可以分為M1型和M2型兩種主要亞型，M1型TAMs具有促炎和抗腫瘤作用，而M2型TAMs具有抗炎和促腫瘤作用。在炎癥微環(huán)境的影響下，TAMs更多地向M2型極化。M2型TAMs可以分泌多種細胞因子和生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等，這些因子能夠促進黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。VEGF可以誘導腫瘤血管生成，為黑色素瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應，促進腫瘤生長；TGF-β則可以抑制機體的抗腫瘤免疫反應，同時促進黑色素瘤細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強其遷移和侵襲能力。調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）在炎癥微環(huán)境中也發(fā)揮著重要的免疫抑制作用。在復合模型中，Tregs的數(shù)量和比例明顯增加。Tregs主要通過分泌抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制效應T細胞的活化和增殖，從而削弱機體的抗腫瘤免疫反應。IL-10可以抑制Th1細胞和細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的功能，減少它們對黑色素瘤細胞的殺傷作用；TGF-β則可以抑制T細胞的增殖和分化，誘導T細胞向Tregs轉(zhuǎn)化，進一步增強免疫抑制效應，使得黑色素瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視，得以持續(xù)生長和擴散。5.2信號通路分析在小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型中，深入分析與炎癥和腫瘤相關(guān)的信號通路變化，有助于揭示慢性炎癥促進黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制。核因子-κB（NF-κB）信號通路在炎癥和腫瘤過程中起著關(guān)鍵作用。在復合模型中，炎癥微環(huán)境中的多種刺激因素，如TNF-α、IL-1等細胞因子，能夠激活NF-κB信號通路。TNF-α與黑色素瘤細胞表面的TNFR1受體結(jié)合，導致受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域（TRADD）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）等接頭蛋白的募集，進而激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復合物。IKK復合物由IKKα、IKKβ和IKKγ組成，其中IKKβ能夠磷酸化IκB蛋白，使其發(fā)生泛素化修飾并被蛋白酶體降解。IκB蛋白是NF-κB的抑制蛋白，其降解后，NF-κB得以釋放并進入細胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄。這些靶基因包括與細胞增殖、抗凋亡、炎癥反應和血管生成等相關(guān)的基因，如c-myc、Bcl-2、IL-6、VEGF等。c-myc基因的表達上調(diào)可促進黑色素瘤細胞的增殖，使細胞周期進程加快；Bcl-2基因表達增加則抑制黑色素瘤細胞的凋亡，提高細胞的存活能力；IL-6的分泌進一步加劇炎癥反應，形成正反饋調(diào)節(jié)，促進腫瘤生長；VEGF的表達上調(diào)可誘導腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣供應，支持腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）信號通路在復合模型中也被顯著激活。IL-6是激活STAT3信號通路的關(guān)鍵細胞因子之一，在慢性炎癥微環(huán)境中，IL-6水平升高，其與黑色素瘤細胞表面的IL-6受體（IL-6R）結(jié)合，形成IL-6/IL-6R復合物。該復合物招募并激活Janus激酶（JAK），JAK具有酪氨酸激酶活性，能夠磷酸化IL-6R的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。磷酸化的IL-6R為STAT3提供了結(jié)合位點，STAT3通過其SH2結(jié)構(gòu)域與磷酸化的IL-6R結(jié)合，并被JAK磷酸化。磷酸化的STAT3發(fā)生二聚化，然后從受體復合物上解離下來，轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)。在細胞核中，STAT3與靶基因啟動子區(qū)域的特定序列結(jié)合，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。STAT3調(diào)控的靶基因包括cyclinD1、Bcl-xL、MMP-2等。cyclinD1的表達上調(diào)可促進黑色素瘤細胞從G1期進入S期，加速細胞周期進程，促進細胞增殖；Bcl-xL的表達增加則抑制細胞凋亡，增強黑色素瘤細胞的存活能力；MMP-2是一種基質(zhì)金屬蛋白酶，其表達上調(diào)可降解細胞外基質(zhì)，促進黑色素瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在復合模型中也參與了黑色素瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條途徑。在慢性炎癥微環(huán)境中，炎癥細胞分泌的細胞因子、生長因子以及腫瘤細胞自身產(chǎn)生的應激信號等，都可以激活MAPK信號通路。以ERK途徑為例，生長因子與黑色素瘤細胞表面的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合，使RTK發(fā)生磷酸化，激活下游的Ras蛋白。Ras蛋白作為一種小GTP酶，在GDP和GTP的結(jié)合狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，當Ras與GTP結(jié)合時被激活。激活的Ras招募并激活Raf蛋白，Raf是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它可以磷酸化并激活MEK蛋白。MEK是一種雙重特異性激酶，能夠磷酸化ERK的蘇氨酸和酪氨酸殘基，使其激活。激活的ERK進入細胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Jun等，調(diào)節(jié)與細胞增殖、分化、存活和遷移相關(guān)基因的表達。這些基因包括c-fos、c-myc、cyclinD1等，它們的表達變化可促進黑色素瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。例如，c-fos和c-myc基因的表達上調(diào)可促進細胞增殖，cyclinD1的表達增加可加速細胞周期進程，從而促進黑色素瘤的生長。5.3基因表達差異研究為深入探究慢性炎癥促進黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，本研究采用基因芯片和RNA測序技術(shù)，對小鼠慢性炎癥-黑色素瘤復合模型及對照模型中的基因表達差異進行了全面分析，旨在挖掘在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因。利用基因芯片技術(shù)，對復合模型組和單純黑色素瘤模型組（對照組）小鼠的腫瘤組織進行基因表達譜檢測。基因芯片是一種高通量的基因檢測技術(shù)，它可以同時檢測數(shù)以萬計的基因表達水平，通過將熒光標記的cDNA與芯片上的探針雜交，根據(jù)熒光信號的強度來確定基因的表達量。在本次實驗中，選用了包含小鼠全基因組的基因芯片，確保能夠全面檢測到基因表達的變化。結(jié)果顯示，在復合模型組中，與對照組相比，共有568個基因表達出現(xiàn)顯著差異，其中上調(diào)基因326個，下調(diào)基因242個。對這些差異表達基因進行功能注釋和通路富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要參與了細胞增殖、凋亡、免疫調(diào)節(jié)、血管生成等生物學過程。在細胞增殖相關(guān)的基因中，c-myc、cyclinD1等基因表達上調(diào)，這與之前關(guān)于慢性炎癥促進黑色素瘤細胞增殖的研究結(jié)果一致，進一步證實了慢性炎癥通過調(diào)節(jié)這些基因的表達，促進黑色素瘤細胞的增殖。在免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因中，IL-10、TGF-β等免疫抑制因子的基因表達上調(diào)，而IFN-γ、IL-2等免疫激活因子的基因表達下調(diào)，這表明慢性炎癥微環(huán)境可能通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達，抑制機體的抗腫瘤免疫反應，為黑色素瘤細胞的生長和擴散提供有利條件。為了更深入地了解基因表達差異，進一步采用RNA測序技術(shù)對兩組小鼠的腫瘤組織進行分析。RNA測序技術(shù)能夠全面、準確地測定RNA的序列和表達水平，不僅可以檢測已知基因的表達變化，還能發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本和可