培養(yǎng)基的配制及質(zhì)量控制

2017年8月

一、培養(yǎng)基的配制

培養(yǎng)基是絕大多數(shù)微生物試驗的基礎(chǔ)。因此，培養(yǎng)基的質(zhì)量是微生物試驗成功與否的關(guān)鍵因素。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。

⑴培養(yǎng)基可按處方制備也可使用按處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的商品化成品培養(yǎng)基，脫水培養(yǎng)基除附有處方和使用說明外還應注明有效期、貯存條件、適用性試驗的質(zhì)控菌株和用途。配制時應按使用說明上的要求操作，受潮結(jié)塊不能使用，以確保培養(yǎng)基的質(zhì)量符合要求。

⑵使用容器

配制培養(yǎng)基使用的容器應是玻璃器皿或搪瓷器皿如搪瓷筒、量筒、漏斗、三角燒瓶、刻度吸管、試管、培養(yǎng)皿等。禁用金屬容器如鐵、銅、鋁容器，避免金屬離子與培養(yǎng)基成分結(jié)合，生成有害物質(zhì)，影響細菌生長。

⑶使用的器皿應洗凈，用蒸餾水或純化水完全沖洗以消除清潔劑和外來物質(zhì)的殘留，并進行清除污物的確認后方可使用。若于非潔凈的玻璃器皿中制備，可能導致抑菌物質(zhì)進入培養(yǎng)基中。抑菌物質(zhì)可能是殘留的玻璃器皿清潔用的清潔劑或之前玻璃器皿所盛裝的物質(zhì)。

⑷配制培養(yǎng)基最常用的溶劑是純化水，特殊情況下需要用去離子水和蒸餾水，對熱敏感的培養(yǎng)基應用滅菌水和無菌容器配制與分裝，配制時若需加熱助溶應注意溫度不要過高。

⑸對配制培養(yǎng)基的過程作詳細的記錄，記錄內(nèi)容包括：配制日期、培養(yǎng)基名稱、成分、配制數(shù)量、質(zhì)量監(jiān)控結(jié)果等進行全面詳細記錄。

1、培養(yǎng)基的制備方法

稱量

為保證培養(yǎng)基質(zhì)量的穩(wěn)定可靠，在配制培養(yǎng)基時，在稱量前要詳細了解處方和使用說明，按照產(chǎn)品說明書的規(guī)定稱量，各稱量物的重量應記錄。各脫水培養(yǎng)基或組成培養(yǎng)基的組分應準確稱量，并要求有一定的精確度。

配制將準確稱量的各組分或脫水培養(yǎng)基加入溶劑中，完全溶解，如需要可適當加熱。所有的培養(yǎng)基對熱都有或多或少的敏感，因此當培養(yǎng)基需要加熱溶解時，應注意不要加熱過度，否則會使培養(yǎng)基顏色變深。配制培養(yǎng)基所用的器具應能方便控制加熱和不斷攪拌。當培養(yǎng)基需要添加其它組分時，添加后也應將其充分混勻。

分裝⑴配制的培養(yǎng)基根據(jù)試驗需要分裝試管、傾注平皿、制備斜面。經(jīng)滅菌的培養(yǎng)基分裝，應在無菌環(huán)境下按無菌要求操作，避免污染。

⑵對熱敏感的培養(yǎng)基如糖發(fā)酵培養(yǎng)基其分裝容器一般應預先進行滅菌，以保證培養(yǎng)基的無菌性。

矯正pH

配制培養(yǎng)基必須矯正pH，干燥培養(yǎng)基也必須對pH進行驗證，高壓滅菌前的pH應比最終pH值高0.2左右。矯正pH后的培養(yǎng)基應加熱、過濾，使培養(yǎng)基澄清。

2、培養(yǎng)基的滅菌

滅菌方法及條件不當可直接影響培養(yǎng)基質(zhì)量，培養(yǎng)基滅菌方法和條件,商品化的成品培養(yǎng)基或自配的培養(yǎng)基若采用不適當?shù)募訜岷蜏缇鷹l件，有可能引起顏色變化、透明度降低、瓊脂凝固力或pH的變化，而不符合培養(yǎng)基質(zhì)量的要求。

培養(yǎng)基的滅菌應按照生產(chǎn)商提供或使用者驗證的參數(shù)進行。商品化的成品培養(yǎng)基必須附有所用滅菌方法的資料。

不同種類培養(yǎng)基應采用不同的滅菌方法，配制好的培養(yǎng)基滅菌一般多用流通蒸汽滅菌和濾膜過濾除菌。

流通蒸汽滅菌是最常用的最有效的滅菌法，

121℃，15min(121℃，30min)或116℃，40min可殺死所有的細菌芽孢。

3、培養(yǎng)基的貯藏

⑴商品化培養(yǎng)基應根據(jù)使用說明書上的要求進行儲存。培養(yǎng)基標簽上應標有批號，生產(chǎn)日期、有效期及培養(yǎng)基的有關(guān)特性。所采用的保藏和運輸條件應使培養(yǎng)基最低限度失去水分并提供機械保護。

脫水培養(yǎng)基或單獨配方組分應在適當?shù)臈l件下貯存，如低溫、干燥和避光，所有的容器應密閉，尤其是盛有脫水培養(yǎng)基的容器.

⑵配制好的培養(yǎng)基應保存在2～25℃避光的環(huán)境。若保存于非密閉容器中，一般在三周內(nèi)使用,若保存于密閉容器中，一般在一年內(nèi)使用.

⑶瓊脂培養(yǎng)基不得在0℃或0℃以下存放，防止冷凍破壞凝膠特性。瓊脂平板最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如置冰箱保存，一般不超過一周，且應密閉包裝，若延長保存，保存期需經(jīng)驗證確定。⑷培養(yǎng)基滅菌后應立即取出，不得儲藏在高壓滅菌器中，避免影響培養(yǎng)基的質(zhì)量。

⑸固體培養(yǎng)基滅菌后的再融化應在加熱的水浴中或采用流通蒸汽進行，只允許一次，融化的培養(yǎng)基應放在45～50℃的烘箱中，不得超過8小時。⑹使用過的培養(yǎng)基（包括失效的培養(yǎng)基）應按照國家污染廢物處理相關(guān)規(guī)定進行。

二、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制

經(jīng)實驗室配制或由生產(chǎn)廠生產(chǎn)的培養(yǎng)基的質(zhì)量高度依賴于其如何制備，采用不適宜方法制備的培養(yǎng)基將影響微生物的生長或復蘇，從而影響試驗結(jié)果的可靠性。

所有配制好的培養(yǎng)基均應進行驗證，驗證方法參照《中國藥典2015年版》附錄無菌檢查或微生物限度檢查項下有關(guān)規(guī)定進行。

實驗室配制的培養(yǎng)基監(jiān)控項目外觀、性狀、pH、促生長試驗、定期的穩(wěn)定性檢查以及培養(yǎng)基有效期的確定。

驗證時間由同一批脫水培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基時，若采用已驗證的配制和滅菌程序，那么可不進行批批促生長試驗。如果培養(yǎng)基制備的方法未經(jīng)驗證，那么，配制的每一批培養(yǎng)基必須進行促生長試驗。

試驗方法根據(jù)培養(yǎng)基的用途參照《中國藥典2015年版》附錄無菌檢查或微生物限度檢查項下有關(guān)規(guī)定進行。

培養(yǎng)基的有效期是指已通過促生長試驗的培養(yǎng)基在整個有效期內(nèi)均需符合這些相應的標準。每批培養(yǎng)基儲存的時間將取決于一定存放條件（包括容器和密封性）的培養(yǎng)基組成成分的穩(wěn)定性。

試驗結(jié)果處理

⑴當批培養(yǎng)基不符合促生長試驗，應尋找造成不合格的原因。⑵這個調(diào)查包括采取適當?shù)男袆右苑乐箚栴}的重復出現(xiàn)。⑶如果未找到原因或還沒有解決有關(guān)培養(yǎng)基的促生長問題，那么任何不符合要求的批次均不能使用。

1、測定PH值

每批培養(yǎng)基滅菌后均應測定pH值；在冷卻至室溫（25℃）后，以無菌操作取出少量培養(yǎng)基進行測定。除非經(jīng)驗證表明培養(yǎng)基的pH允許的變化范圍很寬，否則，培養(yǎng)基的pH的范圍不得超過規(guī)定的±0.2。

2、一般性狀

⑴制成平板或分裝于試管的培養(yǎng)基應檢查；容器和蓋子的破裂，裝量。⑵固體培養(yǎng)基因水分流失而造成表面產(chǎn)生裂縫或漣漪。⑶其他如溶血，可能冷藏溫度下形成的結(jié)晶，大量的汽泡，微生物污染，氧化還原指示劑的狀況，批數(shù)量和有效期的檢查和記錄，培養(yǎng)基的無菌檢查等。

⑷液體培養(yǎng)基應觀察培養(yǎng)基的顏色，是否有沉淀，微生物污染，氧化還原指示劑的狀況，批數(shù)量和有效期的檢查和記錄等。3、培養(yǎng)基的促生長和抑制性能試驗

⑴無菌檢查用培養(yǎng)基使用前應進行適用性試驗，適用性試驗包括無菌性檢查和靈敏度檢查，無菌性試驗是檢查培養(yǎng)基滅菌是否完全，靈敏度檢查是確定培養(yǎng)基的質(zhì)量好壞、穩(wěn)定與否，這對檢驗結(jié)果有極為重要的影響。培養(yǎng)基的靈敏度檢查法如下：

靈敏度檢查

菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]

枯草芽胞桿菌[CMCC(B)63501]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

白色念珠菌[CMCC(F)98001]

黑曲霉[CMCC(F)98003]

金黃色葡萄球菌好氧性革蘭陽性菌銅綠假單胞菌好氧性革蘭陰性菌枯草芽胞桿菌好氧性芽胞桿菌生孢梭菌厭氧菌白色念珠菌酵母菌黑曲霉真菌這幾類菌基本上代表了自然界常見的微生物,也是藥品中常見的污染菌；。

靈敏度檢查培養(yǎng)基接種量

結(jié)果判定

空白對照管應無菌生長。⑴若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。⑵若加菌的培養(yǎng)基管不生長或生長不好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查不符合規(guī)定，不能用于無菌試驗，并尋找造成不合格的原因。培養(yǎng)基的適用性檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。

⑵微生物限度檢查(計數(shù)培養(yǎng)基)培養(yǎng)基的適用性檢查微生物限度檢查(計數(shù)培養(yǎng)基)

使用前應進行適用性試驗，適用性試驗包括促生長、抑制及指示能力檢查。菌種

銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]白色念珠球菌[CMCC（B）98001]黑曲霉[CMCC（F）98003]

檢查方法

菌懸液制備后在室溫下放置應在2小時內(nèi)使用，若保存在2～8℃可以在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。

結(jié)果判定

被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不得小于對照培養(yǎng)基菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)、大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。

說明1、在實驗室中，培養(yǎng)基若使用同一批脫水培養(yǎng)基，并采用已驗證過的配制和滅菌方法配制．那么由同一批脫水培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)基可以不必批批進行靈敏度檢查。如果培養(yǎng)基制備的方法不經(jīng)驗證，那么，必須對每一批配制的培養(yǎng)基進行靈敏度試驗。

2、使用商品化培養(yǎng)基必須注意其有效期，有效期是指已通過促生長試驗的培養(yǎng)基在整個有效期內(nèi)均需符合這些相應的標準。每批培養(yǎng)基的存放時間將取決于存放條件（包括容器和密封性）和培養(yǎng)基組成成分的穩(wěn)定性。

3、當批培養(yǎng)基不符合促生長試驗，應尋找造成不合格的原因。這個調(diào)查包括采取適當?shù)男袆右苑乐?/p>