液相色譜儀操作規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)化手冊(cè)一、前言本手冊(cè)旨在規(guī)范高效液相色譜儀（HPLC）的操作流程，確保分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性及儀器的穩(wěn)定運(yùn)行，適用于實(shí)驗(yàn)室HPLC的日常操作、維護(hù)及故障處置。手冊(cè)涵蓋儀器組成、標(biāo)準(zhǔn)化操作、維護(hù)保養(yǎng)、故障排查等核心內(nèi)容，為實(shí)驗(yàn)人員提供實(shí)操性指導(dǎo)。二、儀器組成及原理概述（一）核心模塊功能1.輸液泵：提供穩(wěn)定流速的流動(dòng)相，支持等度/梯度洗脫，通過流速與洗脫比例控制組分保留行為。2.進(jìn)樣系統(tǒng)：手動(dòng)/自動(dòng)進(jìn)樣，將樣品引入流動(dòng)相，需保證進(jìn)樣精度與重復(fù)性（RSD≤2%）。3.色譜柱：分離核心，基于分配、吸附等作用實(shí)現(xiàn)組分分離，柱效（理論塔板數(shù)）、選擇性決定分離效果。4.柱溫箱：控制色譜柱溫度（±0.5℃精度），穩(wěn)定保留時(shí)間與分離度（溫度波動(dòng)會(huì)顯著影響保留行為）。5.檢測(cè)器：（如紫外-可見、熒光、蒸發(fā)光散射等）將組分濃度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，輸出色譜圖（需定期校準(zhǔn)波長(zhǎng)/響應(yīng)值）。6.工作站：控制儀器參數(shù)、采集/處理數(shù)據(jù)、生成報(bào)告，需定期備份方法與數(shù)據(jù)（避免丟失）。三、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程（一）開機(jī)前準(zhǔn)備1.環(huán)境與安全檢查實(shí)驗(yàn)室溫度（20-25℃）、濕度（≤60%）穩(wěn)定，遠(yuǎn)離強(qiáng)電磁干擾、震源。流動(dòng)相（甲醇、乙腈、水、緩沖鹽等）新鮮（含緩沖鹽流動(dòng)相應(yīng)≤48h），經(jīng)0.22μm濾膜過濾、超聲脫氣（10-15min）。廢液瓶液位低于警戒線，電源接地良好，儀器模塊無物理損壞。2.色譜柱與管路檢查色譜柱保存液與流動(dòng)相兼容：若柱保存液為純甲醇（反相柱），流動(dòng)相含高比例水時(shí)，需用10%甲醇水過渡（流速0.2-0.5ml/min，10-20倍柱體積），避免柱床塌陷。管路接頭（泵出口、進(jìn)樣器、柱、檢測(cè)器）旋緊，無漏液痕跡；手動(dòng)進(jìn)樣針無堵塞、變形。（二）開機(jī)與系統(tǒng)啟動(dòng)1.模塊開機(jī)順序依次打開泵→柱溫箱→檢測(cè)器→工作站（遵循“先硬件后軟件”原則，等待各模塊自檢完成，指示燈顯示“Ready”）。2.工作站參數(shù)設(shè)置調(diào)用/新建方法：設(shè)置流動(dòng)相比例（等度/梯度）、流速（0.5-2ml/min，依柱規(guī)格調(diào)整）、柱溫（常為30-40℃）、檢測(cè)器波長(zhǎng)（或激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)）、進(jìn)樣體積（手動(dòng)/自動(dòng)進(jìn)樣量）。泵參數(shù)：設(shè)置壓力上限（一般≤40MPa），梯度方法需設(shè)置時(shí)間-比例程序。（三）流動(dòng)相排氣與系統(tǒng)平衡1.泵排氣泡打開泵排氣閥（或“Purge”功能），設(shè)置流速5ml/min，持續(xù)1-2min，觀察氣泡排出后關(guān)閉排氣閥，等待泵壓力穩(wěn)定（波動(dòng)≤0.5MPa）。2.色譜柱平衡以初始流動(dòng)相（方法起始比例）、方法流速的80%沖洗色譜柱，持續(xù)10-20min（或至基線穩(wěn)定：紫外檢測(cè)器基線噪聲≤0.5mAU，漂移≤1mAU/h）。（四）樣品分析1.手動(dòng)進(jìn)樣操作進(jìn)樣針處理：吸取流動(dòng)相排氣泡，吸取過量樣品（如進(jìn)樣量20μl，吸30μl），排出多余至刻度。進(jìn)樣：快速將進(jìn)樣閥從“Load”轉(zhuǎn)“Inject”，同時(shí)點(diǎn)擊工作站“開始采集”，記錄進(jìn)樣時(shí)間。2.自動(dòng)進(jìn)樣操作樣品盤設(shè)置：按序列擺放樣品瓶（含內(nèi)標(biāo)/質(zhì)控樣），設(shè)置進(jìn)樣體積（1-20μl）、洗針次數(shù)（避免交叉污染）、進(jìn)樣順序。啟動(dòng)序列：點(diǎn)擊“運(yùn)行”，監(jiān)控序列狀態(tài)（避免樣品瓶錯(cuò)位、進(jìn)樣針堵塞）。3.分析監(jiān)控實(shí)時(shí)觀察壓力曲線（波動(dòng)≤2%方法流速對(duì)應(yīng)的壓力）、基線穩(wěn)定性（無尖銳噪聲、漂移）、峰形與保留時(shí)間（與對(duì)照品一致，RSD≤2%）。異常時(shí)立即暫停分析，排查故障（見“故障排查”章節(jié)）。（五）關(guān)機(jī)與后處理1.色譜柱沖洗緩沖鹽流動(dòng)相：先以10%甲醇水（或純水）沖洗30min（流速0.5ml/min），再以純甲醇/乙腈沖洗30min（保存反相柱，避免鹽析/長(zhǎng)菌）。純有機(jī)相流動(dòng)相：直接以純甲醇/乙腈沖洗20min，確保柱內(nèi)無殘留。2.儀器關(guān)機(jī)降低泵流速至0.2ml/min，依次關(guān)閉泵→檢測(cè)器→柱溫箱→模塊電源，最后關(guān)閉工作站、斷開總電源。色譜柱兩端加蓋堵頭，放置于柱盒；手動(dòng)進(jìn)樣針用甲醇沖洗后晾干，自動(dòng)進(jìn)樣器清潔進(jìn)樣針、樣品盤。四、維護(hù)保養(yǎng)規(guī)范（一）日常維護(hù)（每周/每批樣品后）1.流動(dòng)相管理：過濾新配置流動(dòng)相，棄用超期含緩沖鹽流動(dòng)相，定期更換在線脫氣膜。2.進(jìn)樣系統(tǒng)：手動(dòng)進(jìn)樣針每月甲醇超聲清洗，自動(dòng)進(jìn)樣器每周清潔樣品盤、進(jìn)樣針外壁。3.泵維護(hù)：每季度檢查泵密封墊（漏液時(shí)聯(lián)系工程師更換），每周用異丙醇沖洗泵頭（排除緩沖鹽結(jié)晶）。（二）色譜柱維護(hù)（每100針或柱效下降10%時(shí)）1.污染清洗：反相柱若保留強(qiáng)組分污染，用5-10%甲醇-水+0.1%甲酸沖洗（流速0.5ml/min，20倍柱體積），再用純甲醇沖洗。2.保存：柱內(nèi)充滿純甲醇/乙腈，兩端堵頭密封，避光、室溫保存，避免劇烈震動(dòng)。（三）檢測(cè)器維護(hù)（每季度）1.紫外燈：記錄使用時(shí)間（壽命約2000h），能量低于60%時(shí)更換。2.流通池：基線噪聲大時(shí)，用10%硝酸+水（或甲醇）超聲清洗流通池（斷開管路，注意防護(hù)），晾干后裝回。五、常見故障排查與解決（一）壓力異常壓力過高：依次斷開色譜柱（壓力降為0→柱堵；壓力不變→管路/泵堵）。柱堵時(shí)，低流速反向沖洗（若柱允許）；管路堵時(shí)，更換濾芯、清洗單向閥。壓力過低：檢查接頭漏液（旋緊/換密封墊）、泵密封墊老化（更換）、流動(dòng)相不足（補(bǔ)充）。（二）基線異常噪聲大：檢查燈能量（更換紫外燈）、流通池污染（清洗）、電源干擾（遠(yuǎn)離大功率設(shè)備）。漂移大：流動(dòng)相污染（更換）、柱溫波動(dòng)（校準(zhǔn)柱溫箱）、檢測(cè)器氘燈老化（更換）。（三）峰形/保留時(shí)間異常峰拖尾：柱污染（清洗）、進(jìn)樣量過大（減小）、流動(dòng)相pH不適（調(diào)整緩沖鹽pH）。保留時(shí)間漂移：流動(dòng)相比例變化（重新配置）、柱溫變化（校準(zhǔn)）、泵流速不穩(wěn)（排氣泡、換泵密封墊）。六、安全與質(zhì)量控制注意事項(xiàng)（一）安全操作有機(jī)溶劑（甲醇、乙腈）需在通風(fēng)櫥操作，佩戴丁腈手套，避免皮膚接觸；廢液集中收集，交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。高壓部件（泵、色譜柱）操作前需泄壓（泵流速調(diào)0，打開排氣閥），避免高壓噴液。（二）質(zhì)量控制分析前進(jìn)行系統(tǒng)適用性測(cè)試：對(duì)照品連續(xù)進(jìn)樣6針，保留時(shí)間RSD≤2%，峰面積RSD≤3%，分離度≥1.5。數(shù)據(jù)備份：工作站數(shù)據(jù)每周備份至移動(dòng)硬盤，方法文件加密保存，避免誤刪。七、附錄不同品牌儀器操作差異對(duì)照表（如Waters、