兩種制備慢性阻塞性肺病大鼠模型方法的比較摘要：目的探討一種接近臨床慢性阻塞性肺病表現(xiàn)的大鼠模型的制備方法。方法30只SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只。=1\*ROMANI組大鼠制備慢性阻塞性肺病模型，用香煙煙霧暴露+氣管內(nèi)滴注脂多糖處理；=2\*ROMANII組大鼠制備慢性阻塞性肺病模型，用香煙煙霧暴露+氣管內(nèi)滴注生理鹽水處理；=3\*ROMANIII組大鼠為正常對(duì)照組，不做任何處理。3組大鼠分別采集呼吸曲線參數(shù)、檢測(cè)動(dòng)脈血氧分壓、動(dòng)脈血二氧化碳分壓及肺組織含水量，光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)改變，透射電鏡觀察肺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。對(duì)3組大鼠上述指標(biāo)對(duì)比分析。結(jié)果Ⅰ組吸氣持續(xù)時(shí)間低于Ⅱ組、Ⅱ組低于=3\*ROMANIII組，Ⅰ組呼氣持續(xù)時(shí)間高于Ⅱ組、Ⅱ組高于與Ⅲ組；Ⅰ組大鼠動(dòng)脈血氧分壓低于Ⅱ組、Ⅱ組低于Ⅲ組，Ⅰ組大鼠動(dòng)脈血二氧化碳分壓高于Ⅱ組、Ⅱ組高于Ⅲ組；Ⅰ組肺組織含水量高于Ⅱ組、Ⅱ組高于Ⅲ組。上述結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。形態(tài)學(xué)上Ⅰ組大鼠肺組織呈現(xiàn)慢性炎性損傷的表現(xiàn)，肺泡上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯破壞。結(jié)論香煙煙霧暴露+氣管內(nèi)滴注脂多糖處理的大鼠可以作為一種慢性阻塞性肺病動(dòng)物模型，這種造模方法是一種可行可靠的慢阻肺動(dòng)物模型復(fù)制方法。關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺病；大鼠；香煙煙霧暴露；內(nèi)毒素；動(dòng)物模型分類號(hào)：R363.2ComparisonbetweentwomethodsforestablishingratmodelsofCOPDLIUYou-cai,SHIShi-qiang,LIXiao-nan,YANWei-zhen,YAOLi-zhi(ExperimentalTeachingCenterofBiologyandBasicMedicine,SanquanCollege,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000)Abstract:ObjectiveToexploreamethodtoestablisharatmodelwithclinicalmanifestationsofchronicobstructivepulmonarydisease(COPD).Methods30ratsweredividedinto3groupsrandomly,eachwith10rats.GroupIwastheexaminationgroup,preparedforCOPDmodelsandtreatedwithcigarettesmokeexposureplusintratrachealinstillationoflipopolysaccharide(LPS);GroupIIwasthecontrolgroup,establishedforCOPDmodelsbuttreatedwithcigarettesmokeexposureplusintratrachealinstillationofphysiologicalsaline;andGroupIIIwastheblankcontrolgroupwithoutanytreatment.Respiratorycurveparameterswerecollectedinthesesthreegroups,arterialbloodoxygenpartialpressure,arterialcarbondioxidepartialpressureandlungtissuewatercontentweremeasured,pathologicalchangeswereobservedunderlightmicroscope,andtheultrastructureoflungtissuecellswasobservedundertransmissionelectronmicroscope.ResultsThedurationofinhalationinGroupIwaslowerthanthatinGroupII,whichwaslowerthanthatinGroupIII,whilethedurationofexpirationinGroupIwashigherthanthatinGroupII,whichwashigherthanthatinGroupIII;thepartialpressureofarterialbloodoxygeninGroupIwaslowerthanthatinGroupII,whichwaslowerthanthatinGroupIII,whilethepartialpressureofarterialbloodcarbondioxideinGroupⅠwashigherthanthatingroupII,whichwashigherthanthatinGroupIII;andthewatercontentofthelungtissueinGroupIwashigherthanthatinGroupII,whichwashigherthanthatingroupIII.Statisticalanalysisshowedaboveresultswerestatisticallysignificantwithp<0.05.Morphologically,thelungtissueofratsinGroupImanifestedchronicinflammatoryinjury,andthestructureofalveolarepithelialcellswassignificantlydestroyed.ConclusionsRatstreatedwithcigarettesmokeexposureandintratrachealinfusionofLPScanbeusedasananimalmodelofCOPD.Keywords:chronicobstructivepulmonarydisease(COPD);rats;cigarettesmokeexposure;lipopolysaccharide(LPS);animalmodel香煙煙霧、慢性炎性刺激是引起慢性阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease，COPD)發(fā)生發(fā)展的主要因素[1,2]，以動(dòng)物模型為研究對(duì)象，探討COPD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及相關(guān)肺功能的變化，是COPD防治的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。本文對(duì)兩種方法制備的COPD模型[3]大鼠的呼吸曲線參數(shù)、動(dòng)脈血氧分壓（arterialpartialpressureofoxygen，PaO2）、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（arterialpartialpressureofcarbondioxide，PaCO2）、肺組織含水量、形態(tài)學(xué)改變及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，為科研人員選擇COPD模型大鼠制備方法提供參考依據(jù)。1材料與方法1.1材料BL-420F生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)（成都泰盟生物儀器有限公司）；I-HITACHIH600透射電鏡(日本日立公司)。散花牌過(guò)濾嘴香煙（河南中煙工業(yè)有限公司），每支含焦油量13mg、尼古丁1.0mg、一氧化碳量14mg。1.2動(dòng)物分組30只CV(conventional，CV)級(jí)健康SD(sprague-dawley，SD)大鼠，體質(zhì)量(150±10)g，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將30只大鼠隨機(jī)分為Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，每組10只。1.3實(shí)驗(yàn)方法將Ⅰ組大鼠每天置于60cm×40cm×30cm的煙霧暴露箱箱內(nèi)煙霧暴露2次，每次使用10支香煙，每次30min，持續(xù)暴露28天。1天、14天以1mg.Kg-1劑量氣管內(nèi)滴注脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）；Ⅱ組大鼠在第1天、第14天氣管內(nèi)滴注等量的生理鹽水，其余操作同=1\*ROMANI組；Ⅲ組大鼠不經(jīng)煙霧暴露處理、脂多糖處理和生理鹽水處理，其余操作同Ⅰ組。29d4%水合氯醛以10ml?Kg-1腹腔注射麻醉，頸部手術(shù)行動(dòng)脈套管插管術(shù)，劍突下1cm切口暴露膈肌，兩個(gè)針式電極掛于膈肌兩側(cè)，觀察記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸運(yùn)動(dòng)及一般情況的變化，經(jīng)BL-420F系統(tǒng)記錄呼吸曲線30min。注射器取動(dòng)脈血2ml，備測(cè)動(dòng)脈血氧分壓（arterialpartialpressureofoxygen，PaO2）、動(dòng)脈血二氧化碳分壓（arterialpartialpressureofcarbondioxide,PaCO2）。尾靜脈空氣栓塞法處死大鼠，完整取肺后剪開(kāi)左右兩肺。濾紙吸干左肺表面的血液和水分稱其濕重，后將其置于80℃真空干燥箱內(nèi)48h，充分干燥至恒溫后用天平稱重，備測(cè)左肺組織濕重/干重比值及肺組織含水量。取右肺下葉2份，一份10%中性甲醛固定并修剪為1cm3大小組織塊、石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡下觀察肺組織結(jié)構(gòu)，一份4%戊二醛固定液固定并修剪為1mm3大小組織塊，切為超薄片，檸檬酸鉛和醋酸鈾雙重染色，備透射電子顯微鏡觀察肺組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，拍攝照片分析圖像。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均帶入SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05。2結(jié)果2.1大鼠呼吸曲線參數(shù)的比較對(duì)3組大鼠呼吸曲線參數(shù)的比較可知：吸氣持續(xù)時(shí)間，Ⅰ組低于Ⅱ組（t=11.053，p=0.000）與Ⅲ組（t=9.814，p=0.000），Ⅱ組低于Ⅲ組（t=12.335，p=0.001）；呼氣持續(xù)時(shí)間，Ⅰ組高于Ⅱ組（t=10.352，p=0.000）、高于Ⅲ組（t=7.621，p=0.000），Ⅱ組高于與Ⅲ組（t=7.513，p=0.000）。見(jiàn)表1。表13組大鼠呼吸曲線參數(shù)比較（n=10，±s）組別n吸氣持續(xù)時(shí)間(ms)呼氣持續(xù)時(shí)間(ms)Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組101010293±21326±19347±22514±31461±28415±172.2大鼠PaO2和PaCO2比較大鼠PaO2，Ⅰ組低于Ⅱ組（t=12.163，p=0.000）、低于Ⅲ組（t=15.219，p=0.000），Ⅱ組低于Ⅲ組（t=11.702，p=0.000）；大鼠PaCO2，Ⅰ組高于Ⅱ組（t=11.435，p=0.000）、高于Ⅲ組（t=9.363，p=0.000），Ⅱ組高于Ⅲ組（t=14.352，p=0.001）。見(jiàn)表2。表23組大鼠PaO2及PaCO2的比較（n=10,±s）組別PaO2(mmHg)PaCO2(mmHg)Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組61.45±7.2872.59±10.2684.37±9.5557.39±7.2849.47±9.3545.22±8.522.3大鼠肺組織含水量比較肺組織W/D=組織濕重/干重，肺組織含水量=[（濕重-干重）／濕重]×100%，計(jì)算各組大鼠肺組織W/D值及含水量。肺組織W/D值，Ⅰ組高于Ⅱ組（t=13.061，p=0.000）、高于Ⅲ組（t=8.513，p=0.000），Ⅱ組高于Ⅲ組（t=11.381，p=0.001）；肺組織含水量，Ⅰ組高于Ⅱ組（t=14.372，p=0.001）、高于Ⅲ組（t=10.254，p=0.000），Ⅱ組高于Ⅲ組（t=9.261，p=0.001）。見(jiàn)表3。表33組大鼠肺組織W/D值比較（n=10，±s）組別肺組織W/D值肺組織含水量Ⅰ組Ⅱ組Ⅲ組5.24±0.415.16±0.294.73±0.2283.24±2.5280.14±2.3775.46±1.222.4大鼠一般狀態(tài)比較Ⅰ組大鼠進(jìn)食減少，反應(yīng)遲緩，體重減少，皮毛稀疏黃澀無(wú)光澤；活動(dòng)量從8天開(kāi)始減少，21天后活動(dòng)基本消失；呼吸道分泌物從8天出現(xiàn)并逐漸增加，21天表現(xiàn)出流涎、喘息。Ⅱ組大鼠上述狀態(tài)較Ⅰ組大鼠輕，在13天出現(xiàn)的呼吸道分泌物和流涎且逐漸增多，28天表現(xiàn)出流涎、喘息。Ⅲ組大鼠上述狀態(tài)未曾出現(xiàn)。2.5大鼠肺組織大體觀比較Ⅰ組大鼠肺體積增大，邊緣圓鈍，部分紋理消失，顏色灰白或褐色，壓痕不易消褪。Ⅱ組大鼠肺體積增大，邊緣圓鈍，部分肺紋理減少、顏色灰白或褐色，壓痕不易消褪。Ⅲ組大鼠肺組織紋理清晰，顏色粉紅，壓痕可迅速消褪。2.6大鼠肺組織HE染色結(jié)果比較Ⅰ組大鼠細(xì)支氣管管腔狹窄，管壁增厚，粘液腺增生，白細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞變性壞死，肺泡間隔斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，出現(xiàn)肺大泡。Ⅱ組大鼠肺組織病理學(xué)改變同實(shí)驗(yàn)組大鼠，但程度較輕，未出現(xiàn)肺大泡、氣管管腔狹窄程度較輕、管壁增厚程度較輕。Ⅲ組大鼠支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)正常。見(jiàn)圖1。50μm50μm50μmⅢ組.Ⅱ組Ⅰ組50μm50μm50μmⅢ組.Ⅱ組Ⅰ組圖13組大鼠右肺下葉組織HE染色結(jié)果（HE，×400）2.7大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)比較Ⅰ組大鼠組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體及微絨毛消失。Ⅱ組大鼠組肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹板層體空泡化，微絨毛消失。Ⅲ組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)板層小體結(jié)構(gòu)清晰，微絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，數(shù)量多，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常，線粒體結(jié)構(gòu)正常。見(jiàn)圖2。Ⅲ組Ⅱ組Ⅰ組Ⅲ組Ⅱ組Ⅰ組圖2三組大鼠右肺下葉組織透射電鏡超微結(jié)構(gòu)（TEM，×7000）3討論COPD動(dòng)物模型是COPD基礎(chǔ)研究的必要條件，一個(gè)符合臨床實(shí)際的COPD動(dòng)物模型的標(biāo)準(zhǔn)包括四點(diǎn)，即致傷因素與臨床COPD常見(jiàn)誘因基本一致[5]，有氣流阻塞存在、小氣道阻力增高、肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性下降，存在氣道重塑及伴有氣道反應(yīng)性增高[6,7]。吸煙和反復(fù)呼吸道感染是人類COPD發(fā)生、發(fā)展及演變過(guò)程中的主要誘因[8,9]。在本研究采用香煙煙霧暴露、香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素氣管滴注兩種方法模擬吸煙、吸煙并感染的COPD危險(xiǎn)因素，做為復(fù)制實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型的方法。結(jié)果表明香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素氣管滴注的大鼠的呼氣持續(xù)時(shí)間、吸氣持續(xù)時(shí)間高于煙霧暴露大鼠和正常大鼠，煙霧暴露大鼠上述呼吸參數(shù)均高于正常大鼠，提示經(jīng)氣管滴注內(nèi)毒素且煙霧暴露后的大鼠出現(xiàn)了氣道狹窄、氣流受限所致的通氣障礙并且較單純香煙煙霧暴露的大鼠通氣障礙顯著。PaO2可以反映肺通氣功能，PaCO2可以反映肺換氣功能。結(jié)果中，香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素氣管滴注的大鼠的PaO2較煙霧暴露大鼠和正常大鼠低、煙霧暴露大鼠較正常大鼠低，香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素氣管滴注的大鼠的PaCO2較煙霧暴露大鼠和正常大鼠高、煙霧暴露大鼠較正常大鼠高，提示香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素氣管滴注大鼠和煙霧暴露大鼠的肺通氣功能和肺換氣功能均減退，不僅有氣道狹窄氣流受限通氣障礙，還出現(xiàn)了呼吸膜受損血?dú)饨粨Q障礙，而且香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素大鼠的上述結(jié)果更顯著。此現(xiàn)象與臨床中重度COPD患者的吸氣、呼氣均困難的臨床表現(xiàn)一致。在對(duì)3組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)的比較可知，香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素大鼠和煙霧暴露大鼠呈現(xiàn)典型的COPD慢性炎癥損傷的病理表現(xiàn)，且香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素大鼠損傷程度較重；在超微結(jié)構(gòu)的比較中可知，香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素大鼠和煙霧暴露大鼠肺泡上皮結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)損毀，煙霧暴露大鼠肺泡上皮超微結(jié)構(gòu)[10]破壞較為輕微，這些從形態(tài)學(xué)上證實(shí)了香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素大鼠肺存在炎性損傷?？傊狙芯框?yàn)以香煙煙霧暴露+內(nèi)毒素氣管滴注模擬臨床COPD患者的吸煙和炎癥感染的危險(xiǎn)因素，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中從呼吸功能、血?dú)庵笜?biāo)和形態(tài)學(xué)上證實(shí)香煙煙霧暴露+氣管滴注內(nèi)毒素處理的大鼠出現(xiàn)了典型的COPD肺病理改變、肺通氣功能和肺換氣功能，表現(xiàn)出氣道狹窄氣流受限的通氣障礙，明確了香煙煙霧暴露+氣管滴注內(nèi)毒素造模方法是一種可行可靠COPD造模方法。參考文獻(xiàn)：[1]華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組．慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2013,36(4):255-265.[2]ArnsonY,ShoenfeldY,AmitalH.Effectsoftobaccosmokeonimmunity,inflammationandautoimmunity.[J].JournalofAutoimmunity,2010,34(3):J258-J265.[3]ChenX,LiY,HuaC,etal.Establishmentofrapidriskassessmentmodelforcigarettesmokeextractexposureinchronicobstructivepulmonarydisease[J].ToxicologyLetters,2019,316:10-19.[4]TangYM,LiuXN,ZhangQJ,etal.Chronicobstructivepulmonarydiseasedeaths,disability-adjustedlifeyears,andriskfactorsinHubeiprovinceofmid-China,1990–2015:theGlobalBurdenofDiseaseStudy2015[J].PublicHealth,2018,161:12-19.[5]張莉,李金田,劉永琦,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型病變特點(diǎn)的研究[J].四川動(dòng)物,2010(02):131-133.[6]WrightJL,CosioM