親和分離技術(shù)1 生物親和作用

由于不是整個分子或物質(zhì)參與親和結(jié)合，親和作用的分子(物質(zhì))對可以是：大分子-小分子例，大分子-大分子例，大分子-細胞例，細胞-細胞例。親和作用的作用力

具有“鑰匙和鎖孔”的關(guān)系是產(chǎn)生親和結(jié)合作用的必要條件，但并不充分。除此之外，還需要分子或原子水平的各種相互作用2 親和作用的影響因素

1)．離子強度 如Affinity主要源于靜電引力或氫鍵，則提高I無疑會減弱或完全破壞Affinity。

疏水性作用隨I提高而增大,因此，當(dāng)Affinity作用主要源于疏水性相互作用時，增大I則可提高Affinity。

許多親和吸附的目標(biāo)蛋白質(zhì)可用高濃度鹽溶液洗脫，說明靜電引力在Affinity中占有重要地位。2)．pH

在親和分離操作中,溶液pH值的選擇是非常重要的.3).抑制氫鍵形成的物質(zhì) 脲和鹽酸胍的存在可抑制氫鍵配基配體

的形成.因此,如果Affinity中存在氫鍵,則加入脲或鹽酸胍可減弱Affinity。但他們?yōu)閺娏易冃詣?)．溫度T T

使分子和原子的熱運動

，結(jié)合中心的靜電作用、氫鍵及金屬配位鍵

，但可使疏水性作用

。5)．離液離子

SCN-，I-和ClO-4等半徑較大的陰離子能降低疏水相互作用。故，則這此離子會降低Affinity。6).表面活性劑/乙二醇7)．鰲合劑

如果Affinity源于親和分子對與金屬離子形成的配位鍵，則加入乙二胺四乙酸EDTA等鰲合劑除去金屬離子，可使Affinity消失。結(jié)合中心3 一般操作

關(guān)鍵:?商品化的親和吸附介質(zhì)亞胺二乙酸4 親和吸附介質(zhì)Home-made親和吸附介質(zhì)Home-made所需材料1st

親和配基2nd

載體Home-made基本方法 親和配基+載體

=載體-親和配基天然吸附介質(zhì)

如植物凝集素與糖具有親和結(jié)合作用，因此，天然瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠可直接用做外源凝集素的親和吸附介質(zhì)。 例如:1st

Sephadex凝膠是葡萄糖通過a-1.6結(jié)合與交聯(lián)制備的葡萄糖凝膠,可親和吸附伴刀豆球蛋白A(一種植物凝集素);2nd

Sepharose

凝膠中含有半乳糖,在Ca2+離子存在下可親和吸附蛇毒凝集素.已介紹?5 親和配基A蛋白(proteinAorA抗原)

分子量約42kD，存在于金黃色葡萄球菌的細胞壁中，占細胞壁構(gòu)成成分的約5%。

A蛋白與動物IgG具有很強的親和結(jié)合作用，每個A蛋白含有5個Fc片段結(jié)合部位。除IgG外，還與人IgG和人IgA也具有親和結(jié)合作用，但較弱。凝集素lectin

與糖特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的總稱(酶和抗體除外)，大部分凝集素為多聚體。如。常用做親和配基的伴刀豆球蛋白A(concanavalinA,conA)與葡萄糖和甘露糖的親和結(jié)合作用較強,麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)與N-乙酰葡萄糖胺親和結(jié)合作用較強?？贵w

抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，結(jié)合常數(shù)一般為107~1012dm3/mol。因此，利用以單抗為配基的免疫和色譜法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子物質(zhì)的有效手段。酶抑制劑 可與酶的活性部位結(jié)合,但結(jié)合后抑制酶的活性。如1st

大分子抑制劑：如胰蛋白酶有胰臟蛋白酶抑制劑PTI、卵粘蛋白(ovomucoid)和大豆胰蛋白酶抑制劑,STI)等,2nd

小分子抑制劑：如有芐脒、精氨酸和賴氨酸均可抑制胰蛋白酶的活性，并可作為親和純化胰蛋白酶的配基。5 親和配基輔酶和磷酸腺苷

脫氫酶和激酶需要在輔酶co-enzyme的存在下表現(xiàn)其生物催化活性，即脫氫酶和激酶與輔酶之間具有親和結(jié)合作用。輔酶主要有輔酶I(NAD)、輔酶II(NADP)和ATP等。此外，AMP,ADP的腺苷部分與上述輔酶的結(jié)構(gòu)類似，與脫氫和激酶同樣具有Affinity。三嗪類色素

三嗪類色素(triazinedyes)是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成活性染料，與各種需要在NAD的存在下表現(xiàn)其生物活性的脫氫酶和激酶具有結(jié)合作用。這類結(jié)合具有抑制酶活性的作用。 三嗪類色素還與白蛋白、INF、核酸酶和糖解酶等具有很高的親和結(jié)合能力的.

CibacronBlue3GA(又稱ReactiveBlue2)是最常用的活性色素過渡金屬離子

Cu2+、Ni2+，Zn2+和Co2+等過渡金屬離子可與N，S和O等供電子原子產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸(His)的咪唑基、半胱氨酸(Cys)的巰基和色氨酸(Trp)的吲哚基發(fā)生親和作用，其中以His的咪唑基發(fā)生親和作用最強。過渡金屬離子與咪唑基的結(jié)合強弱順序是Cu2+>Ni2+>Zn2+Co2+

。肝素heparin

是存在于哺乳動物臟器中的酸性多糖類物質(zhì)，M為5-30kD，具有抗凝血作用。肝素與脂肪酶、甾體受體，限制性核酸內(nèi)切酶、抗凝酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用.配基連接？6 配基連接溴化腈活化法固定配基：R-NH2應(yīng)用：多糖凝膠的活化，適用于R-NH2型配基的修飾，如蛋白質(zhì)配基IgG方法：反應(yīng)在碳酸鹽buffer下進行，注意：CNBr劇毒藥品，且具有揮發(fā)性，上述操作南非在通櫥中進行 至少二人在場

急救藥品二價鐵鹽活化交連連接6 配基連接環(huán)氧基活化法

應(yīng)用對象： 用于多糖凝膠和表面為氨基的載體的活化，固定分子結(jié)構(gòu)為R-NH2、R-OH和R-SH的配基。步驟：1st

活化2nd

直接固化法

反應(yīng)速度很慢，所需固定化時間較長(24h以上)2nd

間接固定化法環(huán)氧氯丙烷

活性環(huán)氧基

直接固化

活化：間接固定EDC6 配基連接硅膠上連接活化

-氨丙基三甲氧基硅烷

環(huán)氧丙基三甲氧基硅烷

活性氨基

活性環(huán)氧基

在酸溶液中環(huán)氧基發(fā)生二醇化反應(yīng)

配基連接6 配基連接金屬配位

固定化HIS亞胺二乙酸iminodiaceticacid,IDA配基His性質(zhì)獨特:具有弱疏水性、咪唑環(huán)為弱電性。因此HIS可與pro發(fā)生親和合作用。在鹽濃度較低的pH約等于目標(biāo)pro的pI溶液中，固定化His親和作用最強，隨鹽濃度

，親和作用

。因此利用HIS為配基可分離pI相差較大的pro。

空間位阻6 配基連接間隔臂空間位阻：當(dāng)較小的配基直接固定在載體下，會由于載體的空間位陰，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用。辦法：在配基與載體之間連接一個“間隔臂”(spacer)。

間隔臂長度有一定限制，當(dāng)間隔臂含有6~8個亞甲基(-CH2-)時親和力最大，亞甲基數(shù)超過8(長度>1.0nm)時，親和力下降。7 親和作用體系

高度特異性親和體系 抗原與其單克隆抗體的結(jié)合基本上是一對一的關(guān)系，即該單克隆抗體不能與其他抗原結(jié)合。 群特異性親和體系

外源凝素可與任何含有糖基的蛋白質(zhì)結(jié)合。

8 親和吸附吸附類型：Freundlich’styporLangmuirtype

矩形type8 親和吸附吸附的影響因素1st

離子強度2nd

離子種類疏水性雜蛋白親水性雜蛋白親水性目標(biāo)產(chǎn)物疏水性目標(biāo)產(chǎn)物3rdpHValue4th

雜蛋白吸附-洗脫？9 親和色譜洗脫可控制的條件1st

離子強度2ndpH3rd

抑制氫鍵形成的物質(zhì)4th

溫度5th

離液離子

SCN-，I-和ClO-6th

乙二醇、丙三醇7th

表面活性劑8th

鰲合劑

EDTA鰲合劑除金屬離子９th

游離配基：如NAD,etal.按選擇性高分類1st

非特異性洗脫(1-7)2nd

特異性洗脫(8-9)

優(yōu)點：？缺點：？8 親和色譜洗脫按洗脫方式分類1st

線性洗脫2ndstepwise洗脫(最常用）8 親和色譜洗脫洗脫速度的控制

料液流速是影響柱效和分離速度的重要因素。提高流速雖可提高分離速度，但柱效降低，穿透曲線平緩，親和色譜柱的有效利用率降低。因此，吸附操作要在適當(dāng)?shù)牧魉傧逻M行，即要保證高速度，又要保證高效率。此外，瓊脂糖凝膠等低強度載體容易受壓變形，存在最大允許線速度。圖示:在一定操壓力以上，繼續(xù)增大壓力流速反而降低，并且最大允許線速度隨柱徑和柱高增大而降低。其它層析過程同樣存在類似現(xiàn)象，在放大設(shè)計中須特別注意這一問題。

8 親和色譜洗脫清洗:

目的是洗去吸附介質(zhì)內(nèi)部及柱空隙中存在的雜質(zhì)，一般使用與吸附操作相同的緩沖液，必要時加入表面活性劑，保證目標(biāo)產(chǎn)物的吸附和雜質(zhì)的除去。由于親和吸附是可逆的，清洗過度會使目標(biāo)產(chǎn)物的損失增多，特別是對于親和結(jié)合較弱的親和體系，而清洗不充分則使洗脫回收的目標(biāo)產(chǎn)物純度降低。因此，應(yīng)利用分析方法，或?qū)嶒炗^察，確定適宜的清洗操作時間。10 Applicationst-PA

組織纖溶酶原激活劑(t-PA)是一種糖蛋白，具有激活纖溶酶原、促進血FD降解，治療血栓等心腦血管疾病。t-PA主要存在于心臟組織中，但含量低，目前t-PA主要利用重組DNA動力細胞培養(yǎng)生產(chǎn)。賴氨酸、精氨酸、氨基芐脒和FD與t-PA具有affinity。

原料為豬心丙酮粉經(jīng)醋酸鉀抽提、硫酸銨沉淀、FD-Sepharose4B親和層析和SephacylS-300凝膠過濾柱純化后的活性部分。親和吸附的t-PA用鹽酸胍（GuHCl）為洗脫液梯度洗脫，回收斜線所示部分，t-PA的活性提高近7倍，收率為56%. 10 Applications干擾素(interferonIFN)

IFN對癌癥、肝炎等疾病具有特殊療效。根據(jù)一級結(jié)構(gòu)差別，IFN分為α、β和γ三種，三嗪類色素對IFN具有親和結(jié)合作用，故色素親和層是純化IFN的主要方法之一。固定化金屬離子親和層析也可用于IFN純化。 圖是利用單抗免疫親和層析法純化原于大腸桿菌的重組人白細胞干擾素(rhIFN-α)的操作條件和結(jié)果。以破碎細胞抽提液的硫酸銨沉淀活為原料，經(jīng)一步單抗免疫親和層析，rhIFN-α的比活提高了1150倍，收率達95%。10 Applications色素親和層析 色素的特點是化學(xué)穩(wěn)定性高、價格便宜、適用范圍廣、親和結(jié)合力適中、蛋白質(zhì)結(jié)合容量大。因此，操作成本低廉，有很高的實用價值。

圖為純化脫氫酶實例。加入3dm3菌體細胞抽提液后，用低濃度鹽溶液A清洗，除去未被吸附的雜蛋白。之后，逐次用高濃度鹽溶液B和輔酶I溶液C洗脫，分別獲得了3-HDH和MDH活性峰。收集的3-HDH活性部分超濾濃縮至200cm3后透析脫鹽，再加入到另一個色素親和柱，繼續(xù)進行純化，結(jié)果示于下圖。經(jīng)過兩步色素親和層析純化，3-HDH比活提高213倍(第一步34.4倍，第二步6.2倍)，最終收率為78%(第一步為99%)。10 Applications固定化金屬離子親和色譜 固定化金屬離子親和層析(IMAC)根據(jù)蛋白質(zhì)表面與金屬離子螯合的氨基酸殘基(如咪唑基、巰基和吲哚基等)的含量和分布的差別分離純化蛋白質(zhì)，適用范圍廣，無毒副作用，吸附容量高。IMAC的洗脫操作通常采用提高離子強度或降低pH值的逐次或線性梯度洗脫法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的親和吸附作用很強，一般的方法難于洗脫時，可利用EDTA等螯合劑，將蛋白質(zhì)和金屬離子一起洗脫下來。Cu-IDA-Seph-aroseCL-6B

IDA-Sepha-roseCL-6B

0.05mol/dm3Tris-HCl,0.15mol/dm3NaCl,pH7.5清洗

α-淀粉酶抑制劑抽提液

0.05mol/dm3Gly0.2mol/dm3Gly

10 Applications對應(yīng)的色譜圖10 Applications基因重組融合蛋白的純化

基因重組