ICS67.120.30B50DB34QuickScreeningofresiduesofmalachitegreenanditsmetaboliteinaqu安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局DB34/T1421—2011DB34/T1421—2011本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由安徽省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測中心提出。本標準由安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局批準。本標準起草單位：安徽省漁業(yè)環(huán)境監(jiān)測中心。本標準主要起草人：孫德祥、鮑鳴、周作友、董星宇、楊瑞、程金明。I1水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量的快速篩選測定-酶聯(lián)免疫吸附法green，LMG）殘留總量的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測方法。本標準適用于水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的快速篩選測定。陽性樣品須用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/MS-MS）確證。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法SC/T3016-2004水產(chǎn)品抽樣方法3原理本方法基于競爭性酶聯(lián)免疫方法原理。樣品中MG或LMG經(jīng)提取液和乙腈等提取純化后，LMG通過氧化劑被氧化為MG，與MG-生物素競爭微孔板上包被的MG抗體，沒有結(jié)合的MG-生物素在洗板中被去除。再加入過量的酶標記的鏈親和素，與結(jié)合了抗體的MG-生物素結(jié)合，多余的酶標記的鏈親和素在洗板中被去除。結(jié)合的酶使隨后加入的HRP底物(TMB)顯色，樣品中MG和LMG含量越少，則結(jié)合的酶越多，顏色則越深，反之，顏色則越淺。結(jié)果用酶標儀在波長450nm處，測定吸光度值，在一定濃度范圍內(nèi)吸光度值與樣品中MG和LMG含量成反比。4試劑和材料4.1實驗室用試劑：所用試劑除另有規(guī)定外，均為分析純。水為符合GB/T6682規(guī)定的二級水。4.3正己烷。4.4孔雀石綠標準溶液：0ng/mL、0.05ng/mL、0.15ng/mL、0.5ng/mL、1.5ng/mL、4.5ng/mL。4.5孔雀石綠酶聯(lián)免疫試劑盒應在有效期內(nèi)。超過1個月不使用，生物素耦合物、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素以及標準品應保存在-20℃。其它試劑應在2℃~8℃的溫度下貯存。不同批次的試劑盒不可混用。4.5.1微孔板：包被有孔雀石綠抗體。4.5.2提取液A：使用前，取出提取物A，用90mL雙蒸餾水溶解至完全溶解。4.5.3提取液B：使用前，根據(jù)需要量，用雙蒸餾水稀釋10倍。2DB34/T1421—20114.5.4純化試劑。4.5.5氧化劑液：使用前，根據(jù)需要量，用乙腈稀釋10倍。4.5.6提取液C：使用前，根據(jù)需要量，用雙蒸餾水稀釋10倍。4.5.7MG-生物素耦合物稀釋液。4.5.8MG-生物素耦合物：使用前5min按需要量，用MG-生物素耦合物稀釋液（4.3.7）稀釋100倍。4.5.9辣根過氧化物酶標記的鏈親和素稀釋液。4.5.10辣根過氧化物酶標記的鏈親和素：使用前10min按需要量，用辣根過氧化物酶標記的鏈親和素稀釋液（4.3.9）稀釋100倍。4.5.11洗液。使用前10min，用雙蒸餾水稀釋20倍。4.5.12TMB底物。4.5.13終止液。5儀器和設(shè)備5.1酶標儀：配備450nm濾光片。5.2分析天平：感量0.001g，感量0.0001g。5.3恒溫培養(yǎng)箱。5.4均質(zhì)器。5.5旋渦振蕩器。5.6離心機：離心力≥4000g。5.7氮吹儀5.9水浴鍋。5.10聚四氟乙烯離心管：5mL，50mL，具塞。6測定方法6.1制備與保存6.1.1抽樣：按SC/T3016-2004水產(chǎn)品抽樣方法。6.1.2食用樣品取可食部分，勻質(zhì)到粉碎均勻（糊狀裝入干凈容器，標明標記，-20℃保存。6.1.3苗種樣品直接勻質(zhì)到粉碎均勻（糊狀裝入干凈容器，標明標記，-20℃保存。6.2提取與純化6.2.1操作之前將試劑盒中所有試劑在室溫（20℃~25℃)下放置1h～2h。6.2.2稱取2.00g(±0.0001g）勻質(zhì)好的樣品于50mL離心管內(nèi)，依次加入1.0mL樣品提取液A（4.3.2）、0.4mL樣品提取液B（4.3.3）和6.0mL乙腈，渦旋振蕩4min或者振搖20min。4000g離心10min，取2.0mL上清液到預先加入300mg±20mg純化試劑（4.3.4）的5mL離心管中，2500r/min渦旋振蕩1min，靜置10min。4000g離心10min，取1.0mL上清液到另一5mL離心管中，減壓蒸餾或者50℃~60℃水浴氮氣吹干。加入100μL的氧化劑液（4.3.5渦旋振蕩1min，4000g后，4000g離心5min。棄除上層有機溶液，下清液備用（在24h內(nèi)有效）。稀釋倍數(shù)：1.5。3DB34/T1421—20116.3酶聯(lián)免疫測定6.3.1測定在室溫20℃~25℃條件下操作。6.3.2將測定所需的微孔條插入框架，記錄標準和樣品的位置，每個標準和樣品應作兩個平行。6.3.3分別在各孔中加入90μL標準品或制備好的樣品（6.2.2）。6.3.4分別在各孔中加入30μLMG-生物素耦合物（4.3.8輕敲微孔板邊緣混勻1min。6.3.5蓋好蓋板膜，室溫下避光孵育30min。6.3.6傾出微孔中的液體，每孔加入250μL的洗液（4.3.11輕敲微孔板邊緣混勻1min。傾出微孔中的洗液，在吸水紙上拍打，徹底清除微孔中的殘留液和氣泡，重復上述操作3次。6.3.7每孔中加入100μL的辣根過氧化物酶標記的鏈親和素（4.3.10室溫下避光孵育15min。6.3.8洗板，方法同6.3.7，重復操作3次。6.3.9迅速在每孔中加入100μLTMB底物（推薦使用多通道移液器，底物本身是無色的，顏色發(fā)生變化則不能使用)，輕敲微孔板邊緣混勻1min，蓋好蓋板膜，室溫下避光孵育10min～15min。6.3.10迅速在每孔中加入100μL的終止液（4.3.135min內(nèi)在450nm處測定OD值(吸光度值)。6.4結(jié)果計算6.4.1計算相對吸光度值分別計算標準和樣品的平均吸光值。按下列公式(1)計算標準液和樣液的相對吸光度值。A=B/B0.100%....................................(1)式中：A--相對吸光度值B--標準液和樣液的平均吸光度值B0--0ng/mL標準液的平均吸光度值6.4.2繪制標準曲線以相對吸光度值為縱坐標，標準濃度的對數(shù)值（log10）為橫坐標繪制標準曲線。每次實驗均需重新繪制標準曲線。6.4.3樣品結(jié)果計算通過標準曲線可以計算出樣品的濃度值；樣品的孔雀石綠殘留的總量按（2）式計算：X=C.n.......................................(2)式中：X--樣品待測組分的量，單位為微克每千克(μg/kg）C--樣品待測組分的濃度n--稀釋倍數(shù)7方法的檢出限、回收率、重復性7.1檢出限本方法孔雀石綠及其代謝殘留物的檢出限為0.1μg/kg。DB34/T1421—201147.2回收率在樣品中添加0.1