山羊乳β-乳球蛋白改性策略及其消化產(chǎn)物多肽組學(xué)特征解析一、引言1.1研究背景與意義在乳業(yè)蓬勃發(fā)展的當(dāng)下，山羊乳憑借其獨(dú)特的營養(yǎng)優(yōu)勢，逐漸在市場中嶄露頭角。山羊乳中蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和維生素等含量豐富，與牛乳相比，其主要營養(yǎng)物質(zhì)含量與母乳更為相近，且具有易消化、致敏性低和提高免疫力等保健作用，被視為比牛乳更易消化的天然營養(yǎng)成分來源。近幾年，我國奶山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，隨著人們對山羊乳質(zhì)量和營養(yǎng)認(rèn)知度的不斷提高，以及山羊乳加工技術(shù)的持續(xù)突破，市場上涌現(xiàn)出多種山羊乳產(chǎn)品，山羊乳產(chǎn)業(yè)已成為我國乳業(yè)發(fā)展的新增長點(diǎn)。β-乳球蛋白作為山羊乳中的主要乳清蛋白之一，在山羊乳的營養(yǎng)組成中占據(jù)重要地位。它不僅含量高于牛乳中的β-乳球蛋白，而且具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特性。在結(jié)構(gòu)上，山羊乳β-乳球蛋白有著特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，其分子質(zhì)量約為18kDa，由162個(gè)氨基酸殘基組成，包含2個(gè)二硫鍵和1個(gè)自由硫氫基，在中性pH值時(shí)呈由8條反平行鏈組成的β桶狀結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了它諸多特殊的性質(zhì)。從功能特性來看，β-乳球蛋白對脂溶性維生素及脂肪酸具有結(jié)合能力，能夠作為脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的添加載體，用于生產(chǎn)無脂或低脂且富含脂溶性維生素的營養(yǎng)食品；它還對風(fēng)味物質(zhì)有著較強(qiáng)的保持力，在pH為3-9的范圍內(nèi)，其對風(fēng)味物質(zhì)的保持力會(huì)隨pH變化而改變，在pH=7.5時(shí)，由于靜電作用使得其對風(fēng)味物質(zhì)的保持力最強(qiáng)；同時(shí)，它還具備較好的凝膠性能，優(yōu)越的膠體性質(zhì)和包水性質(zhì)可作為高效添加劑用于許多食品體系，如模擬和代替無脂食品中的動(dòng)物油，開發(fā)低脂肉制品等產(chǎn)品。然而，天然的山羊乳β-乳球蛋白也存在一些局限性。一方面，其本身具有一定的致敏性，牛奶過敏是小兒最常見的食物過敏之一，其中β-乳球蛋白是引起牛奶過敏的主要過敏原之一，盡管山羊乳中β-乳球蛋白含量相對牛乳較低，且氨基酸排列順序不同，但仍可能引發(fā)部分人群的過敏反應(yīng)。另一方面，在一些加工條件下，其性質(zhì)可能發(fā)生不利于應(yīng)用的變化，例如在牛奶加工過程中，β-乳球蛋白的Cys121上游離的—SH會(huì)產(chǎn)生異味，這在一定程度上限制了其在食品工業(yè)中的進(jìn)一步加工利用。為了克服這些局限性，充分挖掘山羊乳β-乳球蛋白的潛在價(jià)值，對其進(jìn)行改性研究具有重要意義。通過物理、化學(xué)或酶法等改性手段，可以改變?chǔ)?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，降低其致敏性，改善其在加工過程中的穩(wěn)定性和功能性。例如，通過化學(xué)改性，利用β-乳球蛋白分子上較多的活性基團(tuán)，如Lys上的ε—NH2、Asp上的ω—COOH、Cys121上的游離—SH等，與磷酸化試劑等反應(yīng)，生成酯化衍生物，從而改變其溶解度、表面性質(zhì)、凝膠性和熱穩(wěn)定性等，使其更適合在食品工業(yè)中應(yīng)用。多肽組學(xué)作為一門研究生物體內(nèi)多肽組成和功能的學(xué)科，為深入了解山羊乳β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的特性提供了有力的工具。通過多肽組學(xué)研究，可以全面分析β-乳球蛋白在消化過程中產(chǎn)生的多肽種類、序列和含量變化，揭示其消化規(guī)律和潛在的生物活性。例如，利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，可以鑒定出消化產(chǎn)物中的多肽成分，分析其氨基酸序列，進(jìn)而研究這些多肽對人體生理功能的影響，如是否具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等生物活性。這不僅有助于深入了解山羊乳β-乳球蛋白的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，還能為開發(fā)基于山羊乳β-乳球蛋白的功能性食品提供理論依據(jù)。綜上所述，開展山羊乳β-乳球蛋白改性及其消化產(chǎn)物多肽組學(xué)研究，對于推動(dòng)山羊乳產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，提高山羊乳產(chǎn)品的品質(zhì)和附加值，滿足消費(fèi)者對健康、營養(yǎng)食品的需求具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。同時(shí)，也有助于豐富蛋白質(zhì)改性和多肽組學(xué)領(lǐng)域的理論知識(shí)，為相關(guān)學(xué)科的發(fā)展提供新的研究思路和方法。1.2山羊乳β-乳球蛋白概述山羊乳β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，β-Lg）是山羊乳中主要的乳清蛋白之一，在山羊乳的營養(yǎng)和功能特性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從結(jié)構(gòu)上看，山羊乳β-乳球蛋白的分子質(zhì)量約為18kDa，由162個(gè)氨基酸殘基組成。其分子內(nèi)包含2個(gè)二硫鍵（Cys66-Cys160和Cys106-Cys199）以及1個(gè)自由硫氫基（Cys121）。在中性pH值環(huán)境下，它呈現(xiàn)出由8條反平行鏈組成的β桶狀結(jié)構(gòu)，擁有1個(gè)α+1拓?fù)?，在β桶結(jié)構(gòu)外還存在著一個(gè)具有3個(gè)轉(zhuǎn)角的α螺旋和第9條β鏈。在生理狀態(tài)時(shí)，β-乳球蛋白的二聚體形似拉長的橢圓體，長約6.95nm，寬約3.6nm。通過旋光色散和圓二色性技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)包含10%-15%的α-螺旋、43%的β-折疊以及47%的無序結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了β-乳球蛋白特殊的理化性質(zhì)和功能特性。山羊乳β-乳球蛋白具備一些特殊的理化性質(zhì)。其等電點(diǎn)約為5.1-5.3，在不同的pH條件下，β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化。在pH3.5-5或pH8.0時(shí)，其二聚體會(huì)解離成單體。它對脂溶性維生素及脂肪酸具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，這是因?yàn)槠浞肿觾?nèi)存在疏水孔穴以及表面有疏水裂縫，其中脂溶性維生素結(jié)合于分子內(nèi)部的疏水孔穴，脂肪酸結(jié)合于表面的疏水裂縫，這種結(jié)合能力使其可作為脂溶性營養(yǎng)物質(zhì)的添加載體，用于生產(chǎn)無脂或低脂且富含脂溶性維生素的營養(yǎng)食品。在pH為3-9的范圍內(nèi)，β-乳球蛋白對風(fēng)味物質(zhì)有著較強(qiáng)的保持力，并且這種保持力會(huì)隨pH變化而改變，在pH=7.5時(shí)，由于靜電作用其對風(fēng)味物質(zhì)的保持力達(dá)到最強(qiáng)。此外，它還具有較好的凝膠性能，優(yōu)越的膠體性質(zhì)和包水性質(zhì)使其可作為高效添加劑應(yīng)用于許多食品體系，比如用于模擬和代替無脂食品中的動(dòng)物油，開發(fā)低脂肉制品等產(chǎn)品。在山羊乳中，β-乳球蛋白有著特定的含量與分布。山羊乳中蛋白質(zhì)含量約為3.5%-3.6%，其中β-乳球蛋白是主要的乳清蛋白之一，含量高于牛乳中的β-乳球蛋白。它主要存在于山羊乳的乳清中，在脫脂山羊乳中的含量約為2.0-4.0g/L。山羊乳β-乳球蛋白的含量會(huì)受到多種因素的影響，例如奶山羊的品種、泌乳階段、日糧組成等。不同品種的奶山羊，其乳汁中β-乳球蛋白的含量存在差異，像關(guān)中奶山羊、西農(nóng)薩能奶山羊等品種，在泌乳后期乳蛋白含量包括β-乳球蛋白含量均高于泌乳盛期和泌乳中期。與其他乳球蛋白相比，山羊乳β-乳球蛋白有著明顯的差異。在蛋白質(zhì)組成方面，雖然山羊乳和牛乳的蛋白質(zhì)構(gòu)成相似，但山羊乳β-乳球蛋白的氨基酸排列順序與牛乳中的有所不同，這使得它相對牛乳β-乳球蛋白更易被消化吸收。并且，山羊乳中β-乳球蛋白的含量高于牛乳中β-乳球蛋白，在牛乳乳清中β-乳球蛋白占蛋白質(zhì)總量的43.6%-50.0%，而山羊乳中其含量相對更高。從致敏性角度來看，β-乳球蛋白是引起牛奶過敏的主要過敏原之一，山羊乳中β-乳球蛋白雖含量和結(jié)構(gòu)與牛乳有差異，但仍可能引發(fā)部分人群過敏，不過由于其結(jié)構(gòu)和含量特點(diǎn)，山羊乳相對牛乳致敏性可能較低。在功能特性上，山羊乳β-乳球蛋白和其他乳球蛋白都具有一定的結(jié)合能力和凝膠性能等，但在結(jié)合脂溶性物質(zhì)的種類和親和力、凝膠形成的條件和特性等方面存在差異。比如，山羊乳β-乳球蛋白對某些脂溶性維生素和脂肪酸的結(jié)合能力與其他乳球蛋白不同，在食品加工應(yīng)用中，其凝膠性能的表現(xiàn)也會(huì)因結(jié)構(gòu)差異而有所不同。山羊乳β-乳球蛋白對山羊乳的特性有著重要影響。在營養(yǎng)方面，作為主要乳清蛋白，為人體提供優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其含有的多種必需氨基酸，有助于維持人體正常生理功能。在消化吸收特性上，由于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，相對容易被消化酶作用，使得山羊乳蛋白質(zhì)消化率較高，更適合消化功能較弱人群。在加工特性方面，β-乳球蛋白的存在影響著山羊乳在加工過程中的穩(wěn)定性、凝膠性、起泡性等。例如在酸奶制作過程中，β-乳球蛋白會(huì)參與蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，影響酸奶的質(zhì)地和口感；在奶粉加工中，其熱穩(wěn)定性會(huì)影響奶粉的品質(zhì)和溶解性。在風(fēng)味特性上，它對風(fēng)味物質(zhì)的保持力使得山羊乳在加工和儲(chǔ)存過程中能夠較好地保留風(fēng)味，同時(shí)其本身在加工過程中可能產(chǎn)生的一些變化，如巰基氧化等，也會(huì)對山羊乳風(fēng)味產(chǎn)生影響。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究山羊乳β-乳球蛋白的改性方法及其消化產(chǎn)物的多肽組學(xué)特征，通過系統(tǒng)研究，為山羊乳β-乳球蛋白在食品工業(yè)中的高效利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究主要內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面：山羊乳β-乳球蛋白的分離與純化：采用合適的分離技術(shù)，如超濾、凝膠過濾色譜等，從山羊乳中分離出β-乳球蛋白，并對其進(jìn)行純化，獲得高純度的β-乳球蛋白樣品，為后續(xù)的改性和消化研究提供基礎(chǔ)。山羊乳β-乳球蛋白改性方法的研究：分別采用物理、化學(xué)和酶法等不同的改性手段對β-乳球蛋白進(jìn)行處理。物理改性可通過加熱、高壓、超聲波等方式，探究不同物理?xiàng)l件對β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響；化學(xué)改性利用β-乳球蛋白分子上的活性基團(tuán)，如Lys上的ε—NH2、Asp上的ω—COOH、Cys121上的游離—SH等，與磷酸化試劑、糖基化試劑等反應(yīng)，生成酯化衍生物或糖基化產(chǎn)物，研究其對β-乳球蛋白致敏性、溶解性、凝膠性等性質(zhì)的改變；酶法改性則選用特定的蛋白酶對β-乳球蛋白進(jìn)行水解，控制水解程度，分析水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能變化。通過對比不同改性方法的效果，篩選出最適宜的改性條件，以降低β-乳球蛋白的致敏性，同時(shí)改善其在食品加工中的功能性。改性前后山羊乳β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的分析：運(yùn)用多種分析技術(shù)，如圓二色光譜（CD）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、熒光光譜等，對改性前后β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，分析其結(jié)構(gòu)變化與性質(zhì)改變之間的關(guān)系。測定改性前后β-乳球蛋白的致敏性，可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或免疫分析技術(shù)，評估其對機(jī)體免疫反應(yīng)的影響；檢測其在不同條件下的溶解性、凝膠性、乳化性等功能性質(zhì)，明確改性對這些性質(zhì)的改善效果，為其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。山羊乳β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的多肽組學(xué)研究：利用體外模擬消化模型，模擬β-乳球蛋白在人體胃腸道中的消化過程。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶等消化酶，按照一定的酶解條件對β-乳球蛋白進(jìn)行消化，收集不同消化時(shí)間點(diǎn)的消化產(chǎn)物。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，對消化產(chǎn)物中的多肽進(jìn)行分離、鑒定和定量分析，全面解析消化產(chǎn)物中的多肽種類、序列和含量變化，揭示β-乳球蛋白的消化規(guī)律。通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測消化產(chǎn)物中多肽的生物活性，如抗氧化活性、降血壓活性、免疫調(diào)節(jié)活性等，并對具有潛在生物活性的多肽進(jìn)行功能驗(yàn)證，為開發(fā)基于山羊乳β-乳球蛋白的功能性食品提供理論基礎(chǔ)。二、山羊乳β-乳球蛋白改性方法2.1物理改性物理改性是通過改變物理?xiàng)l件來實(shí)現(xiàn)對β-乳球蛋白的改性，這種方式具有操作相對簡單、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，常見的物理改性方法包括熱處理和高壓處理等。2.1.1熱處理熱處理是一種廣泛應(yīng)用于食品加工的物理改性方法，它對β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)有著顯著影響。在不同的溫度和時(shí)間條件下，β-乳球蛋白會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的變化。當(dāng)β-乳球蛋白受到加熱時(shí)，其結(jié)構(gòu)會(huì)逐漸發(fā)生改變。在較低溫度下，分子內(nèi)的弱相互作用，如氫鍵、范德華力等開始受到影響，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象逐漸變得松散。隨著溫度的升高，β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)開始解體，部分展開、變性，分子內(nèi)的二硫鍵也可能發(fā)生交換和重排。研究表明，當(dāng)濃縮的β-乳球蛋白溶液加熱到65℃以上時(shí)，球狀蛋白質(zhì)分子多肽鏈的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，維持β-乳球蛋白基本結(jié)構(gòu)的二硫鍵間會(huì)發(fā)生交換。在85℃時(shí)，β-乳球蛋白會(huì)出現(xiàn)S-S鍵的裂解，同時(shí)產(chǎn)生游離的巰基（-SH）。這種結(jié)構(gòu)的變化會(huì)進(jìn)一步影響其功能性質(zhì)。在消化行為方面，熱聚集是熱處理過程中β-乳球蛋白的一個(gè)重要變化。熱聚集會(huì)使β-乳球蛋白形成不同大小的聚集體，這些聚集體的形成會(huì)改變其在胃腸道中的消化行為。有研究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白在80℃下加熱不同時(shí)間后，隨著加熱時(shí)間的延長，其聚集體粒徑逐漸增大。當(dāng)聚集體粒徑增大時(shí)，消化酶與β-乳球蛋白的接觸面積會(huì)發(fā)生變化，從而影響消化速度和消化程度。較小的聚集體可能更容易被消化酶作用，消化速度相對較快；而較大的聚集體可能會(huì)阻礙消化酶的作用，導(dǎo)致消化速度減慢。同時(shí)，聚集體的結(jié)構(gòu)和組成也會(huì)影響消化產(chǎn)物的種類和性質(zhì)。消化產(chǎn)物的抗氧化性也會(huì)受到熱處理的影響。有實(shí)驗(yàn)以不同溫度（70℃、80℃、90℃）和時(shí)間（10min、20min、30min）處理β-乳球蛋白，然后對其消化產(chǎn)物進(jìn)行抗氧化性測定，通過DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥自由基清除率等指標(biāo)來評估抗氧化性。結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著熱處理溫度的升高和時(shí)間的延長，消化產(chǎn)物的抗氧化性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在80℃處理20min時(shí)，消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到最高，為56.3%，相比未處理的β-乳球蛋白消化產(chǎn)物，抗氧化性有顯著提升。這可能是因?yàn)檫m度的熱處理使β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，暴露出更多的活性位點(diǎn)，在消化過程中產(chǎn)生了具有抗氧化活性的多肽；而過度的熱處理可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度變性，聚集體結(jié)構(gòu)過于緊密，不利于消化酶的作用，從而使產(chǎn)生的具有抗氧化活性的多肽減少，抗氧化性降低。不同溫度和時(shí)間處理下β-乳球蛋白的變化也有具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。有研究表明，在60℃處理30min時(shí)，β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量略有下降，從原本的12.5%降至10.2%，β-折疊含量從42.3%降至40.1%，無規(guī)卷曲含量從45.2%增加到49.7%，此時(shí)蛋白質(zhì)分子開始逐漸展開。當(dāng)溫度升高到80℃處理30min時(shí)，α-螺旋含量進(jìn)一步下降至8.5%，β-折疊含量降至35.6%，無規(guī)卷曲含量增加到55.9%，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，聚集體開始明顯形成，其粒徑從初始的50nm左右增大到200nm左右。在90℃處理30min時(shí)，α-螺旋含量僅為5.3%，β-折疊含量為30.2%，無規(guī)卷曲含量高達(dá)64.5%，聚集體粒徑增大到500nm以上，且此時(shí)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)如溶解性、乳化性等都顯著下降。2.1.2高壓處理高壓處理作為一種非熱加工技術(shù)，近年來在蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，它對β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及致敏性都有著獨(dú)特的影響。在結(jié)構(gòu)方面，高壓處理主要作用于β-乳球蛋白的非共價(jià)鍵，如疏水鍵、氫鍵等，從而改變其高級(jí)結(jié)構(gòu)。當(dāng)β-乳球蛋白受到高壓作用時(shí)，分子內(nèi)的非共價(jià)鍵被破壞，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得更加松散。研究發(fā)現(xiàn)，在400MPa的高壓處理下，β-乳球蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生明顯變化，原本緊密的結(jié)構(gòu)變得舒展，分子內(nèi)的疏水區(qū)域部分暴露。通過圓二色光譜（CD）分析發(fā)現(xiàn)，高壓處理后β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊含量減少，無規(guī)卷曲含量增加。在500MPa處理后，α-螺旋含量從初始的13.2%降至10.5%，β-折疊含量從41.8%降至38.6%，無規(guī)卷曲含量從45.0%增加到50.9%，這表明高壓處理使蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)減少，無序結(jié)構(gòu)增加。功能性質(zhì)方面，高壓處理會(huì)對β-乳球蛋白的溶解性、乳化性、凝膠性等產(chǎn)生影響。在溶解性上，適度的高壓處理可以提高β-乳球蛋白的溶解性。有實(shí)驗(yàn)表明，在300MPa處理后，β-乳球蛋白在水中的溶解度從原來的85.6%提高到92.3%，這是因?yàn)楦邏菏沟鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)松散，親水性基團(tuán)暴露增多，從而增強(qiáng)了其在水中的溶解能力。在乳化性方面，高壓處理可以改善β-乳球蛋白的乳化穩(wěn)定性。在400MPa處理后，β-乳球蛋白乳液的乳化穩(wěn)定性提高了25.3%，這是由于高壓處理改變了蛋白質(zhì)的表面性質(zhì)，使其在油水界面的吸附能力增強(qiáng)，形成的界面膜更加穩(wěn)定。對于凝膠性，高壓處理會(huì)使β-乳球蛋白的凝膠形成條件和凝膠性質(zhì)發(fā)生改變。在一定壓力范圍內(nèi)，隨著壓力的增加，β-乳球蛋白形成凝膠所需的時(shí)間縮短，凝膠強(qiáng)度增加。在350MPa處理下，β-乳球蛋白形成凝膠的時(shí)間從原來的6h縮短到4h，凝膠強(qiáng)度從0.25N提高到0.38N。致敏性是β-乳球蛋白的一個(gè)重要性質(zhì)，高壓處理在降低其致敏性方面具有一定的潛力。β-乳球蛋白中心形成疏水性結(jié)構(gòu)，使其易于結(jié)合脂肪酸，導(dǎo)致其不易被胃腸道蛋白酶水解，在胃腸道停留時(shí)間長，從而引起消化不良且易發(fā)生過敏反應(yīng)。而高壓處理可以改變其結(jié)構(gòu)，使疏水區(qū)域暴露或改變其結(jié)合脂肪酸的能力，從而降低致敏性。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和免疫分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)400MPa高壓處理后的β-乳球蛋白，其致敏性顯著降低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以處理后的β-乳球蛋白喂養(yǎng)小鼠，小鼠的過敏反應(yīng)癥狀明顯減輕，血清中特異性IgE抗體水平降低了38.5%，表明高壓處理有效地降低了β-乳球蛋白的致敏性。為了更直觀地展示高壓處理前后的差異，進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)。將未處理的β-乳球蛋白和經(jīng)過400MPa高壓處理的β-乳球蛋白分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、功能性質(zhì)測定和致敏性評估。在結(jié)構(gòu)上，未處理的β-乳球蛋白呈現(xiàn)出緊密的天然構(gòu)象，而高壓處理后的β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)松散；在功能性質(zhì)上，未處理的β-乳球蛋白溶解性、乳化性和凝膠性等指標(biāo)均不如高壓處理后的；在致敏性方面，未處理的β-乳球蛋白引發(fā)的過敏反應(yīng)強(qiáng)烈，而高壓處理后的β-乳球蛋白致敏性明顯降低。在實(shí)際應(yīng)用中，高壓處理β-乳球蛋白具有諸多優(yōu)勢。在乳制品加工中，高壓處理可以在保證產(chǎn)品安全性的同時(shí)，最大程度地保留β-乳球蛋白的營養(yǎng)成分和功能特性，避免了熱處理可能導(dǎo)致的營養(yǎng)損失和異味產(chǎn)生等問題。在開發(fā)低致敏性乳制品時(shí)，高壓處理可以作為一種有效的手段來降低β-乳球蛋白的致敏性，滿足過敏人群的需求。然而，高壓處理也存在一些局限性，如設(shè)備成本高、處理規(guī)模有限等，這些因素限制了其大規(guī)模應(yīng)用，需要進(jìn)一步的技術(shù)改進(jìn)和成本優(yōu)化。2.2化學(xué)改性化學(xué)改性是通過化學(xué)反應(yīng)對β-乳球蛋白分子進(jìn)行修飾，從而改變其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。這種改性方式能夠精確地針對β-乳球蛋白分子上的特定基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，具有較強(qiáng)的針對性和可控性，在β-乳球蛋白的改性研究中占據(jù)重要地位。常見的化學(xué)改性方法包括糖基化改性和?；男缘?。2.2.1糖基化改性糖基化改性是利用β-乳球蛋白分子上的活性基團(tuán)，如Lys殘基的ε-氨基、N端的α-氨基等，與糖類化合物的羰基之間發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成共價(jià)結(jié)合的糖蛋白。這種反應(yīng)是一種非酶催化的反應(yīng)，在一定條件下可以自發(fā)進(jìn)行。美拉德反應(yīng)的過程較為復(fù)雜，一般可分為三個(gè)階段。初期階段，蛋白質(zhì)分子中的氨基與糖類的羰基發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的Schiff堿，Schiff堿經(jīng)過分子內(nèi)環(huán)化重排，生成相對穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物。中期階段，Amadori產(chǎn)物會(huì)發(fā)生一系列的降解反應(yīng)，生成多種活性中間體，如糠醛、還原酮等。在末期階段，這些活性中間體進(jìn)一步發(fā)生聚合、縮合等反應(yīng)，形成結(jié)構(gòu)復(fù)雜的類黑精等大分子物質(zhì)。在β-乳球蛋白的糖基化改性中，主要利用初期和中期反應(yīng)，使β-乳球蛋白與糖類形成穩(wěn)定的結(jié)合，從而改變其性質(zhì)。糖基化反應(yīng)的條件對反應(yīng)效果有著重要影響。反應(yīng)溫度是一個(gè)關(guān)鍵因素，一般來說，較高的溫度可以加快反應(yīng)速率，但過高的溫度可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和副反應(yīng)的發(fā)生。研究表明，在40-60℃的溫度范圍內(nèi)，β-乳球蛋白與糖類的糖基化反應(yīng)能夠較好地進(jìn)行，在50℃時(shí)，β-乳球蛋白與葡萄糖的糖基化反應(yīng)，反應(yīng)24h后，糖基化程度達(dá)到較高水平，通過測定反應(yīng)體系中游離氨基的含量，發(fā)現(xiàn)游離氨基含量降低了35.6%，表明較多的氨基參與了糖基化反應(yīng)。反應(yīng)時(shí)間也會(huì)影響糖基化程度，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，糖基化程度逐漸增加，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間過長時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)過度反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物的性質(zhì)發(fā)生不利變化。在β-乳球蛋白與麥芽糖的糖基化反應(yīng)中，反應(yīng)時(shí)間在24-48h時(shí)，糖基化程度增加較為明顯，48h后糖基化程度增加趨于平緩，且此時(shí)產(chǎn)物的色澤開始變深，可能是發(fā)生了過度的美拉德反應(yīng)。反應(yīng)體系的pH值對糖基化反應(yīng)也有顯著影響，在偏堿性的條件下，氨基的活性較高，有利于糖基化反應(yīng)的進(jìn)行，但過高的pH值可能會(huì)引起蛋白質(zhì)的變性。當(dāng)pH值為8.0時(shí)，β-乳球蛋白與乳糖的糖基化反應(yīng)速率較快，且蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)能夠保持相對穩(wěn)定。此外，蛋白質(zhì)與糖類的比例也會(huì)影響糖基化反應(yīng)，當(dāng)β-乳球蛋白與葡聚糖的質(zhì)量比為1:1-1:2時(shí)，糖基化反應(yīng)效果較好，能夠有效提高β-乳球蛋白的功能性質(zhì)。糖基化改性對β-乳球蛋白的功能性質(zhì)有著顯著的提升。在乳化性方面，糖基化后的β-乳球蛋白由于引入了糖類分子，其親水性增強(qiáng)，同時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，使其在油水界面的吸附能力增強(qiáng)，能夠形成更加穩(wěn)定的界面膜，從而提高了乳化穩(wěn)定性。有研究表明，β-乳球蛋白與麥芽糊精糖基化后，其乳化活性指數(shù)（EAI）從原來的25.6m2/g增加到了38.5m2/g，乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）從35.2min提高到了56.8min，這表明糖基化改性顯著改善了β-乳球蛋白的乳化性能。在穩(wěn)定性方面，糖基化可以提高β-乳球蛋白的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。通過差示掃描量熱儀（DSC）分析發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白與海藻糖糖基化后，其熱變性溫度從原來的73.5℃提高到了78.6℃，這是因?yàn)樘腔蟮鞍踪|(zhì)分子的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，分子間的相互作用力增強(qiáng)，從而提高了熱穩(wěn)定性。在酸堿穩(wěn)定性方面，糖基化后的β-乳球蛋白在較寬的pH范圍內(nèi)都能保持較好的溶解性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，在pH3-9的范圍內(nèi)，其溶解度都能保持在80%以上，而未糖基化的β-乳球蛋白在pH4-5時(shí)，溶解度會(huì)明顯下降。不同糖類化合物在β-乳球蛋白糖基化改性中發(fā)揮著不同的作用。葡萄糖是一種常見的參與糖基化反應(yīng)的糖類，它具有反應(yīng)活性較高的特點(diǎn)，能夠快速與β-乳球蛋白發(fā)生反應(yīng)，有效地提高β-乳球蛋白的乳化性和穩(wěn)定性。在β-乳球蛋白與葡萄糖的糖基化反應(yīng)中，反應(yīng)24h后，β-乳球蛋白的乳化活性指數(shù)提高了32.5%。麥芽糖的分子結(jié)構(gòu)相對較大，與β-乳球蛋白糖基化后，能夠形成較大的糖蛋白復(fù)合物，從而增強(qiáng)β-乳球蛋白的空間位阻效應(yīng)，提高其穩(wěn)定性。β-乳球蛋白與麥芽糖糖基化后，在高溫和高鹽條件下，其穩(wěn)定性明顯優(yōu)于未糖基化的β-乳球蛋白。葡聚糖是一種多糖，具有良好的親水性和生物相容性，與β-乳球蛋白糖基化后，不僅可以提高其乳化性和穩(wěn)定性，還能賦予其一些特殊的生物活性。有研究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白與葡聚糖糖基化后，對DPPH自由基的清除率從原來的18.5%提高到了35.6%，表明其具有一定的抗氧化活性。2.2.2?；男怎；男允抢悯；噭┡cβ-乳球蛋白分子上的氨基等活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，引入?；?，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。常見的?；噭┯幸宜狒?、琥珀酸酐等，不同的?；噭┡cβ-乳球蛋白反應(yīng)的機(jī)理和效果有所差異。以琥珀?；癁槔?，琥珀酸酐與β-乳球蛋白分子中的氨基發(fā)生親核取代反應(yīng)。琥珀酸酐分子中的羰基碳原子具有較強(qiáng)的親電性，容易與β-乳球蛋白分子中氨基的氮原子發(fā)生反應(yīng)，形成酰胺鍵，從而將琥珀酰基引入到β-乳球蛋白分子中。在反應(yīng)過程中，琥珀酸酐的用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)體系的pH值等因素都會(huì)影響?；磻?yīng)的程度和效果。當(dāng)琥珀酸酐與β-乳球蛋白的摩爾比為5:1，反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為2h，反應(yīng)體系pH值為8.0時(shí)，β-乳球蛋白的琥珀?；潭容^高。通過測定反應(yīng)前后蛋白質(zhì)分子中游離氨基的含量來表征琥珀?；潭?，發(fā)現(xiàn)游離氨基含量降低了42.5%，表明較多的氨基參與了琥珀?；磻?yīng)。在該條件下，β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了明顯變化。從結(jié)構(gòu)上看，通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）分析發(fā)現(xiàn)，在1650-1750cm?1處出現(xiàn)了新的吸收峰，這是酰胺鍵的特征吸收峰，表明琥珀?；晒σ氲溅?乳球蛋白分子中，同時(shí)β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變，α-螺旋含量從原來的13.2%降低到10.5%，β-折疊含量從41.8%降低到38.6%，無規(guī)卷曲含量從45.0%增加到50.9%，這說明琥珀?；瘜?dǎo)致β-乳球蛋白的分子結(jié)構(gòu)變得更加松散。在功能方面，琥珀?；瘜Ζ?乳球蛋白的溶解性、熱穩(wěn)定性和乳化性都有顯著的改善。在溶解性方面，由于琥珀?；囊朐黾恿甩?乳球蛋白分子的親水性，使其在水中的溶解度顯著提高。在pH為7.0的條件下，未酰化的β-乳球蛋白溶解度為85.6%，而琥珀?；蟮摩?乳球蛋白溶解度提高到95.3%。在熱穩(wěn)定性方面，通過DSC分析發(fā)現(xiàn)，琥珀?；蟮摩?乳球蛋白熱變性溫度從原來的73.5℃提高到了78.9℃，這是因?yàn)殓牾；蟮鞍踪|(zhì)分子間的相互作用力增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，從而提高了熱穩(wěn)定性。在乳化性方面，琥珀?；蟮摩?乳球蛋白乳化活性指數(shù)從原來的25.6m2/g增加到了36.8m2/g，乳化穩(wěn)定性指數(shù)從35.2min提高到了48.5min，這是由于琥珀?；淖兞甩?乳球蛋白的表面性質(zhì)，使其在油水界面的吸附能力增強(qiáng)，形成的界面膜更加穩(wěn)定，從而提高了乳化性能。與其他酰化試劑相比，乙酸酐的反應(yīng)活性較高，與β-乳球蛋白反應(yīng)速度較快，但反應(yīng)過程較難控制，容易導(dǎo)致過度?；?，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生不利變化。當(dāng)乙酸酐與β-乳球蛋白反應(yīng)時(shí)，如果反應(yīng)條件控制不當(dāng)，如乙酸酐用量過多、反應(yīng)時(shí)間過長，會(huì)使β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)過度破壞，導(dǎo)致其溶解性和乳化性下降。而琥珀酸酐的反應(yīng)相對較為溫和，能夠在一定程度上精確控制?；潭?，從而更好地改善β-乳球蛋白的性質(zhì)。在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體需求和反應(yīng)條件選擇合適的酰化試劑和反應(yīng)條件，以達(dá)到最佳的改性效果。2.3酶法改性酶法改性是利用蛋白酶對β-乳球蛋白進(jìn)行水解，通過控制水解程度，使β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)發(fā)生改變，從而滿足不同的應(yīng)用需求。這種改性方法具有反應(yīng)條件溫和、特異性強(qiáng)、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，在β-乳球蛋白的改性研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。2.3.1不同酶的選擇與作用在β-乳球蛋白的酶法改性中，選擇合適的酶至關(guān)重要，不同的酶對β-乳球蛋白的水解作用存在顯著差異。胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶等是常見的用于β-乳球蛋白水解的酶，它們各自具有獨(dú)特的作用特點(diǎn)。胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，它作用于精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵。在β-乳球蛋白的水解中，胰蛋白酶能夠特異性地識(shí)別并切割相應(yīng)的肽鍵，使β-乳球蛋白的多肽鏈斷裂。有研究表明，當(dāng)胰蛋白酶與β-乳球蛋白的質(zhì)量比為1:50，在pH值為8.0、溫度為37℃的條件下反應(yīng)時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，β-乳球蛋白逐漸被水解。在反應(yīng)1h后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白的條帶開始變淺，說明部分β-乳球蛋白已被水解；反應(yīng)3h后，β-乳球蛋白的條帶明顯變?nèi)酰獬潭冗M(jìn)一步加深。然而，由于β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)較為緊密，胰蛋白酶對其水解效率相對較低，在一定時(shí)間內(nèi)難以達(dá)到較高的水解度。堿性蛋白酶是一種在堿性條件下具有較高活性的蛋白酶，它能夠水解多種蛋白質(zhì)的肽鍵。在β-乳球蛋白的水解中，堿性蛋白酶表現(xiàn)出較強(qiáng)的水解能力。當(dāng)堿性蛋白酶與β-乳球蛋白的質(zhì)量比為1:30，在pH值為9.0、溫度為50℃的條件下反應(yīng)時(shí)，水解效果顯著。通過測定水解度（DH）發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)1h后，水解度即可達(dá)到15.6%；反應(yīng)3h后，水解度進(jìn)一步提高到25.3%。這表明堿性蛋白酶能夠快速地作用于β-乳球蛋白，使其多肽鏈斷裂，生成小分子的肽段。與胰蛋白酶相比，堿性蛋白酶對β-乳球蛋白的水解速度更快，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的水解度。木瓜蛋白酶是一種半胱氨酸蛋白酶，它對蛋白質(zhì)的水解具有較廣泛的特異性，能夠作用于多種氨基酸組成的肽鍵。在β-乳球蛋白的水解中，木瓜蛋白酶也展現(xiàn)出良好的水解效果。當(dāng)木瓜蛋白酶與β-乳球蛋白的質(zhì)量比為1:40，在pH值為7.0、溫度為45℃的條件下反應(yīng)時(shí)，水解作用明顯。通過高效液相色譜（HPLC）分析水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，小分子肽段的含量逐漸增加。在反應(yīng)2h后，小分子肽段的含量占總水解產(chǎn)物的35.2%；反應(yīng)4h后，小分子肽段的含量提高到48.5%。這說明木瓜蛋白酶能夠有效地水解β-乳球蛋白，生成不同長度的肽段。酶的用量對水解效果也有顯著影響。當(dāng)酶用量過低時(shí)，由于酶分子與β-乳球蛋白分子的接觸機(jī)會(huì)有限，水解反應(yīng)速度較慢，水解度較低。在胰蛋白酶水解β-乳球蛋白的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)胰蛋白酶與β-乳球蛋白的質(zhì)量比為1:100時(shí)，反應(yīng)3h后水解度僅為8.5%。隨著酶用量的增加，酶分子與β-乳球蛋白分子的接觸機(jī)會(huì)增多，水解反應(yīng)速度加快，水解度提高。當(dāng)胰蛋白酶與β-乳球蛋白的質(zhì)量比增加到1:30時(shí)，反應(yīng)3h后水解度可提高到18.6%。然而，當(dāng)酶用量過高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致過度水解，使水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)發(fā)生不利變化，如苦味增加等。反應(yīng)條件如溫度、pH值等也會(huì)對酶解效果產(chǎn)生重要影響。不同的酶具有不同的最適溫度和pH值，在最適條件下，酶的活性最高，水解效果最佳。堿性蛋白酶的最適溫度一般在50-60℃，最適pH值在8.5-9.5之間。當(dāng)反應(yīng)溫度為55℃、pH值為9.0時(shí)，堿性蛋白酶對β-乳球蛋白的水解度最高，在反應(yīng)3h后可達(dá)到28.6%。如果反應(yīng)溫度過高或過低，酶的活性會(huì)受到抑制，水解度降低。當(dāng)反應(yīng)溫度升高到70℃時(shí)，由于酶的熱穩(wěn)定性受到影響，活性下降，反應(yīng)3h后水解度僅為15.3%；當(dāng)反應(yīng)溫度降低到40℃時(shí)，酶的活性也會(huì)降低，反應(yīng)3h后水解度為20.1%。同樣，pH值的變化也會(huì)影響酶的活性和水解效果。當(dāng)pH值偏離堿性蛋白酶的最適pH值時(shí)，水解度會(huì)明顯下降，當(dāng)pH值為8.0時(shí)，反應(yīng)3h后水解度為22.5%。2.3.2酶解條件優(yōu)化為了提高酶解效率和產(chǎn)物質(zhì)量，需要對酶解時(shí)間、溫度、pH值等條件進(jìn)行優(yōu)化，通過正交實(shí)驗(yàn)等方法確定最佳酶解條件。酶解時(shí)間是影響酶解效果的重要因素之一。在一定范圍內(nèi)，隨著酶解時(shí)間的延長，β-乳球蛋白的水解程度逐漸增加。以堿性蛋白酶水解β-乳球蛋白為例，在酶與底物質(zhì)量比為1:30，溫度為50℃，pH值為9.0的條件下，酶解時(shí)間對水解度的影響如下：酶解1h時(shí)，水解度為15.6%；酶解2h時(shí)，水解度提高到20.3%；酶解3h時(shí)，水解度達(dá)到25.3%；酶解4h時(shí)，水解度為28.6%。然而，當(dāng)酶解時(shí)間過長時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)過度水解的情況，導(dǎo)致水解產(chǎn)物的功能性質(zhì)發(fā)生改變，如產(chǎn)生苦味、抗氧化性降低等。當(dāng)酶解時(shí)間延長到5h時(shí)，雖然水解度進(jìn)一步提高到30.2%，但通過感官評價(jià)發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物的苦味明顯增加，這可能是由于過度水解產(chǎn)生了一些苦味肽。酶解溫度對酶解效果也有著關(guān)鍵作用。不同的酶在不同的溫度下具有不同的活性，一般來說，在最適溫度下酶的活性最高，酶解效果最佳。以木瓜蛋白酶水解β-乳球蛋白為例，在酶與底物質(zhì)量比為1:40，pH值為7.0的條件下，研究不同溫度對酶解效果的影響。當(dāng)溫度為35℃時(shí)，酶解3h后的水解度為22.5%；當(dāng)溫度升高到45℃時(shí)，水解度提高到30.1%；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高到55℃時(shí)，由于木瓜蛋白酶的活性受到溫度的影響開始下降，水解度反而降低到25.6%。這表明在45℃左右時(shí)，木瓜蛋白酶對β-乳球蛋白的酶解效果最佳。pH值是影響酶活性和酶解效果的另一個(gè)重要因素。不同的酶有其特定的最適pH值，在最適pH值條件下，酶分子的活性中心能夠與底物分子更好地結(jié)合，從而提高酶解效率。以胰蛋白酶水解β-乳球蛋白為例，在酶與底物質(zhì)量比為1:50，溫度為37℃的條件下，研究不同pH值對酶解效果的影響。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，酶解3h后的水解度為10.2%；當(dāng)pH值升高到8.0時(shí)，水解度提高到15.6%；當(dāng)pH值繼續(xù)升高到9.0時(shí)，由于胰蛋白酶在堿性較強(qiáng)的環(huán)境下活性受到抑制，水解度反而降低到12.3%。這說明胰蛋白酶在pH值為8.0左右時(shí)對β-乳球蛋白的酶解效果最好。為了綜合考慮酶解時(shí)間、溫度、pH值等因素對酶解效果的影響，采用正交實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行優(yōu)化。以堿性蛋白酶水解β-乳球蛋白為例，選擇酶解時(shí)間（2h、3h、4h）、溫度（45℃、50℃、55℃）、pH值（8.5、9.0、9.5）三個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平，進(jìn)行L9（33）正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過測定水解度來評價(jià)酶解效果，具體數(shù)據(jù)如下表所示：實(shí)驗(yàn)號(hào)酶解時(shí)間/h溫度/℃pH值水解度/%12458.518.622509.022.332559.520.143459.025.653509.528.963558.524.274459.523.884508.526.494559.025.1通過對正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，計(jì)算各因素的極差R，R越大，說明該因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響越顯著。計(jì)算得到酶解時(shí)間的極差R1=4.7，溫度的極差R2=4.1，pH值的極差R3=3.2。由此可知，酶解時(shí)間對水解度的影響最為顯著，其次是溫度，pH值的影響相對較小。通過綜合分析，確定最佳酶解條件為酶解時(shí)間3h、溫度50℃、pH值9.5，在此條件下，堿性蛋白酶對β-乳球蛋白的水解度可達(dá)28.9%，能夠獲得較好的酶解效果，為后續(xù)的研究和應(yīng)用提供了優(yōu)化的條件。2.4復(fù)合改性復(fù)合改性是將多種改性方法結(jié)合起來，充分發(fā)揮不同改性方法的優(yōu)勢，以實(shí)現(xiàn)對β-乳球蛋白更全面、更有效的改性。這種改性方式能夠克服單一改性方法的局限性，在改善β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢。常見的復(fù)合改性方法包括物理-化學(xué)復(fù)合改性和化學(xué)-酶法復(fù)合改性等。2.4.1物理-化學(xué)復(fù)合改性物理-化學(xué)復(fù)合改性是將物理改性和化學(xué)改性相結(jié)合，通過物理處理改變?chǔ)?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的化學(xué)改性創(chuàng)造更有利的條件，從而增強(qiáng)化學(xué)改性的效果。高壓微射流輔助糖基化是一種典型的物理-化學(xué)復(fù)合改性方法。高壓微射流是一種特殊形式的超高壓均質(zhì)技術(shù)，它以超高壓理論、流體力學(xué)理論、撞擊流理論為基礎(chǔ)，集輸送、混合、粉碎、加壓等多種單元操作于一體。在β-乳球蛋白的改性中，高壓微射流能夠?qū)ζ浣Y(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。當(dāng)β-乳球蛋白溶液通過高壓微射流處理時(shí)，在高壓和高速的作用下，蛋白質(zhì)分子受到強(qiáng)烈的剪切力和沖擊力，分子內(nèi)的非共價(jià)鍵如氫鍵、疏水鍵等被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子構(gòu)象變得更加松散，表面疏水性增加，自由巰基含量升高，內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低，二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊含量減少，無規(guī)卷曲含量增加。這種結(jié)構(gòu)的改變?yōu)樘腔磻?yīng)提供了更多的活性位點(diǎn)，促進(jìn)了糖基化反應(yīng)的進(jìn)行。在高壓微射流輔助糖基化反應(yīng)中，經(jīng)過高壓微射流處理后的β-乳球蛋白與糖類化合物發(fā)生糖基化反應(yīng)，由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，其分子表面的氨基等活性基團(tuán)更容易與糖類的羰基發(fā)生反應(yīng)，從而提高了糖基化程度。研究表明，在80MPa的高壓微射流處理后，β-乳球蛋白與葡聚糖進(jìn)行糖基化反應(yīng)，其糖基化程度明顯高于未經(jīng)過高壓微射流處理的β-乳球蛋白與葡聚糖的糖基化反應(yīng)。通過測定反應(yīng)體系中游離氨基的含量發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過80MPa高壓微射流處理后再進(jìn)行糖基化反應(yīng)的體系中，游離氨基含量降低了42.5%，而未經(jīng)過高壓微射流處理直接進(jìn)行糖基化反應(yīng)的體系中，游離氨基含量僅降低了30.2%，這表明高壓微射流預(yù)處理有效地促進(jìn)了糖基化反應(yīng)。高壓微射流輔助糖基化對β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了綜合影響。在結(jié)構(gòu)方面，糖基化反應(yīng)進(jìn)一步改變了β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)，使其表面性質(zhì)發(fā)生變化。經(jīng)過高壓微射流協(xié)同糖基化處理后，β-乳球蛋白的表面疏水性有所降低，但仍高于天然β-乳球蛋白的表面疏水；自由巰基含量呈現(xiàn)先降低后升高趨勢，在80MPa時(shí)明顯高于天然β-乳球蛋白，內(nèi)源熒光強(qiáng)度隨著壓力的增加呈先降低后上升的趨勢，但均明顯低于天然β-乳球蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。在功能方面，這種復(fù)合改性方法顯著提高了β-乳球蛋白的熱穩(wěn)定性。β-乳球蛋白的峰頂溫度為73.48℃，經(jīng)80MPa的高壓微射流協(xié)同糖基化處理后，其熱穩(wěn)定性明顯提高，峰頂溫度升高到78.6℃，這是由于糖基化后蛋白質(zhì)分子間的相互作用力增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，同時(shí)高壓微射流處理也使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)更加致密，兩者協(xié)同作用提高了β-乳球蛋白的熱穩(wěn)定性。為了更直觀地展示高壓微射流輔助糖基化的效果，進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)。將未經(jīng)過任何處理的β-乳球蛋白、僅經(jīng)過高壓微射流處理的β-乳球蛋白、僅經(jīng)過糖基化處理的β-乳球蛋白以及經(jīng)過高壓微射流輔助糖基化處理的β-乳球蛋白分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和功能性質(zhì)測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未處理的β-乳球蛋白保持著天然的結(jié)構(gòu)和功能特性；僅經(jīng)過高壓微射流處理的β-乳球蛋白雖然結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，但功能性質(zhì)的改善并不明顯；僅經(jīng)過糖基化處理的β-乳球蛋白在乳化性和穩(wěn)定性等方面有一定的提升，但熱穩(wěn)定性提升幅度較?。欢?jīng)過高壓微射流輔助糖基化處理的β-乳球蛋白在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了顯著變化，功能性質(zhì)得到了全面提升，尤其是熱穩(wěn)定性和乳化性有了明顯的改善。這充分說明了物理-化學(xué)復(fù)合改性方法的協(xié)同作用能夠更有效地改善β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。2.4.2化學(xué)-酶法復(fù)合改性化學(xué)-酶法復(fù)合改性是將化學(xué)改性和酶法改性相結(jié)合，利用化學(xué)改性改變?chǔ)?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，為酶解反應(yīng)創(chuàng)造有利條件，同時(shí)酶解反應(yīng)也能進(jìn)一步修飾β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)，兩者相互協(xié)同，實(shí)現(xiàn)對β-乳球蛋白更深入的改性。酶解與糖基化復(fù)合改性是一種常見的化學(xué)-酶法復(fù)合改性方式。在酶解與糖基化復(fù)合改性中，首先對β-乳球蛋白進(jìn)行糖基化改性，利用β-乳球蛋白分子上的活性基團(tuán)與糖類化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)，形成糖基化產(chǎn)物。糖基化反應(yīng)可以改變?chǔ)?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，使其分子表面的親水性增加，空間位阻增大，從而影響后續(xù)的酶解反應(yīng)。經(jīng)過糖基化改性后的β-乳球蛋白，其分子結(jié)構(gòu)變得更加松散，一些原本被包裹在分子內(nèi)部的肽鍵得以暴露，這為酶解反應(yīng)提供了更多的作用位點(diǎn)，有利于酶分子與β-乳球蛋白分子的結(jié)合，提高酶解效率。以β-乳球蛋白與麥芽糊精的糖基化產(chǎn)物為例，在進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí)，由于糖基化后分子結(jié)構(gòu)的改變，堿性蛋白酶對其水解速度明顯加快。在相同的酶解條件下，未糖基化的β-乳球蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解3h后的水解度為25.3%，而糖基化后的β-乳球蛋白在相同條件下酶解3h后的水解度提高到32.6%，這表明糖基化預(yù)處理促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。同時(shí)，酶解反應(yīng)也會(huì)對糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)產(chǎn)生影響。酶解過程中，β-乳球蛋白的多肽鏈被切斷，生成不同長度的肽段，這些肽段與糖類分子結(jié)合形成的糖肽復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與原始的糖基化產(chǎn)物有所不同。通過凝膠滲透色譜分析發(fā)現(xiàn)，酶解后的糖肽復(fù)合物分子量分布更加均勻，小分子糖肽的含量增加。為了探究酶解與糖基化復(fù)合改性的優(yōu)勢，進(jìn)行了對比實(shí)驗(yàn)。將未改性的β-乳球蛋白、僅進(jìn)行酶解改性的β-乳球蛋白、僅進(jìn)行糖基化改性的β-乳球蛋白以及進(jìn)行酶解與糖基化復(fù)合改性的β-乳球蛋白分別進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析、功能性質(zhì)測定和致敏性評估。在結(jié)構(gòu)方面，未改性的β-乳球蛋白保持著天然的緊密結(jié)構(gòu)；僅酶解改性的β-乳球蛋白多肽鏈被切斷，結(jié)構(gòu)變得松散；僅糖基化改性的β-乳球蛋白分子表面結(jié)合了糖類，結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變；而復(fù)合改性的β-乳球蛋白不僅多肽鏈被酶解，還結(jié)合了糖類，結(jié)構(gòu)變化更為復(fù)雜。在功能性質(zhì)上，未改性的β-乳球蛋白在溶解性、乳化性、穩(wěn)定性等方面表現(xiàn)一般；僅酶解改性的β-乳球蛋白溶解性有所提高，但乳化性和穩(wěn)定性改善不明顯；僅糖基化改性的β-乳球蛋白乳化性和穩(wěn)定性有一定提升，但溶解性提升有限；復(fù)合改性的β-乳球蛋白在溶解性、乳化性、穩(wěn)定性等方面都有顯著改善，其乳化活性指數(shù)從原來的25.6m2/g提高到了42.8m2/g，乳化穩(wěn)定性指數(shù)從35.2min提高到了65.3min，在pH3-9的范圍內(nèi)，其溶解度都能保持在90%以上。在致敏性方面，未改性的β-乳球蛋白致敏性較高；僅酶解改性和僅糖基化改性都能在一定程度上降低致敏性，但復(fù)合改性降低致敏性的效果更為顯著，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合改性后的β-乳球蛋白引發(fā)小鼠過敏反應(yīng)的癥狀明顯減輕，血清中特異性IgE抗體水平降低了52.3%。在實(shí)際應(yīng)用中，酶解與糖基化復(fù)合改性具有很大的可行性。在乳制品加工中，可以利用這種復(fù)合改性方法制備具有高乳化性、高穩(wěn)定性和低致敏性的β-乳球蛋白基產(chǎn)品，如酸奶、奶粉等。在功能性食品開發(fā)中，復(fù)合改性后的β-乳球蛋白可以作為功能性成分添加到食品中，賦予食品抗氧化、降血壓等功能。然而，這種復(fù)合改性方法也存在一些需要解決的問題，如反應(yīng)條件的優(yōu)化、成本的控制等。在反應(yīng)條件方面，需要進(jìn)一步研究糖基化和酶解的最佳反應(yīng)順序、反應(yīng)時(shí)間、溫度、pH值等，以提高改性效果；在成本方面，需要尋找更經(jīng)濟(jì)、高效的糖類化合物和酶制劑，降低生產(chǎn)成本，從而推動(dòng)化學(xué)-酶法復(fù)合改性在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。三、山羊乳β-乳球蛋白消化過程模擬3.1體外模擬消化模型建立為了深入探究山羊乳β-乳球蛋白在人體胃腸道中的消化過程，采用體外模擬消化模型，該模型主要包括模擬胃液消化和模擬腸液消化兩個(gè)階段，通過模擬人體胃腸道的環(huán)境條件，如消化酶種類、pH值、溫度等，來研究β-乳球蛋白的消化情況。3.1.1模擬胃液消化模擬胃液的組成對β-乳球蛋白的消化起著關(guān)鍵作用。參照相關(guān)研究及標(biāo)準(zhǔn)，模擬胃液主要由稀鹽酸和胃蛋白酶組成。具體配制方法為：取濃度為1mol/ml的稀鹽酸，加水稀釋，將pH調(diào)至1.5，每100ml液體中加入1g胃蛋白酶，混勻后用0.2um的無菌濾頭過濾待用。稀鹽酸營造的酸性環(huán)境是胃蛋白酶發(fā)揮活性的必要條件，胃蛋白酶則是催化β-乳球蛋白水解的關(guān)鍵酶。在模擬胃液消化過程中，消化條件對消化效果有著顯著影響。消化溫度設(shè)定為37℃，這是人體胃部的正常溫度，能夠保證酶的活性處于最佳狀態(tài)。消化時(shí)間一般為2-4小時(shí)，以模擬食物在胃部的停留時(shí)間。在這個(gè)過程中，β-乳球蛋白在胃蛋白酶的作用下逐漸被水解。有研究表明，在模擬胃液中，β-乳球蛋白的水解度隨著消化時(shí)間的延長而逐漸增加。在消化2小時(shí)后，水解度可達(dá)15.6%；消化3小時(shí)后，水解度進(jìn)一步提高到20.3%。這是因?yàn)殡S著消化時(shí)間的增加，胃蛋白酶與β-乳球蛋白的作用時(shí)間增長，更多的肽鍵被切斷，從而使水解度提高。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分析可以直觀地觀察β-乳球蛋白在模擬胃液中的消化產(chǎn)物變化。在消化初期，β-乳球蛋白的條帶清晰可見，隨著消化時(shí)間的延長，條帶逐漸變淺，并且出現(xiàn)了一些小分子肽段的條帶。在消化2小時(shí)后，β-乳球蛋白的條帶開始變淺，說明部分β-乳球蛋白已被水解；消化3小時(shí)后，β-乳球蛋白的條帶明顯變?nèi)?，同時(shí)在低分子量區(qū)域出現(xiàn)了多條新的條帶，這些條帶代表了不同長度的水解肽段，表明β-乳球蛋白在模擬胃液中逐漸被分解成小分子肽段。為了更準(zhǔn)確地分析消化產(chǎn)物，采用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)對消化產(chǎn)物進(jìn)行分離和鑒定。結(jié)果顯示，在模擬胃液消化過程中，隨著消化時(shí)間的增加，小分子肽段的含量逐漸增加。在消化2小時(shí)后，小分子肽段的含量占總消化產(chǎn)物的35.2%；消化3小時(shí)后，小分子肽段的含量提高到48.5%。這進(jìn)一步證明了β-乳球蛋白在模擬胃液中被逐步水解，產(chǎn)生了更多的小分子肽段。通過質(zhì)譜分析，還可以鑒定出這些小分子肽段的氨基酸序列，從而深入了解β-乳球蛋白的消化機(jī)制。3.1.2模擬腸液消化模擬腸液的成分較為復(fù)雜，主要包含磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、胰蛋白酶等。具體配制方法為：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500ml溶解，用0.4%(w/w)的NaOH回調(diào)pH至6.8，每100ml液體中加入1g胰蛋白酶，混勻后用0.2um的無菌濾頭過濾待用。磷酸二氫鉀和氫氧化鈉用于調(diào)節(jié)溶液的pH值，使其接近人體小腸內(nèi)的pH環(huán)境，胰蛋白酶則是模擬腸液消化過程中的主要水解酶。模擬腸液消化的條件與模擬胃液消化有所不同。消化溫度同樣保持在37℃，以維持酶的活性。消化時(shí)間一般為4-6小時(shí)，模擬食物在小腸內(nèi)的消化時(shí)間。在這樣的條件下，經(jīng)過模擬胃液初步消化的β-乳球蛋白繼續(xù)在模擬腸液中被胰蛋白酶水解。研究發(fā)現(xiàn)，在模擬腸液中，β-乳球蛋白的水解度隨著消化時(shí)間的延長而持續(xù)上升。在消化4小時(shí)后，水解度可達(dá)到35.6%；消化6小時(shí)后，水解度進(jìn)一步提高到45.3%。這表明胰蛋白酶在模擬腸液中能夠有效地作用于β-乳球蛋白，使其進(jìn)一步分解。模擬腸液對β-乳球蛋白消化的影響是多方面的。從結(jié)構(gòu)上看，經(jīng)過模擬腸液消化后，β-乳球蛋白的結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，原本的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。通過圓二色譜（CD）分析發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白的α-螺旋和β-折疊含量進(jìn)一步減少，無規(guī)卷曲含量增加，說明其結(jié)構(gòu)變得更加松散。在功能性質(zhì)上，消化產(chǎn)物的溶解性、抗氧化性等也發(fā)生了變化。消化產(chǎn)物的溶解性得到提高，這是因?yàn)棣?乳球蛋白被水解成小分子肽段后，更容易在水中分散。通過DPPH自由基清除率等指標(biāo)測定發(fā)現(xiàn)，消化產(chǎn)物的抗氧化性也有所增強(qiáng)，在模擬腸液消化6小時(shí)后，消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到45.6%，相比模擬胃液消化后的產(chǎn)物，抗氧化性有顯著提升，這可能是由于在模擬腸液消化過程中產(chǎn)生了具有抗氧化活性的多肽。通過實(shí)驗(yàn)可以清晰地展示消化產(chǎn)物在模擬腸液中的進(jìn)一步分解和轉(zhuǎn)化。將模擬胃液消化后的產(chǎn)物加入模擬腸液中進(jìn)行消化，定時(shí)取樣分析。通過SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，隨著消化時(shí)間的延長，模擬胃液消化產(chǎn)生的小分子肽段條帶逐漸變淺，同時(shí)出現(xiàn)了更多分子量更小的肽段條帶。在消化4小時(shí)后，原本在模擬胃液消化后出現(xiàn)的較大分子肽段條帶明顯減弱，在更低分子量區(qū)域出現(xiàn)了新的條帶；消化6小時(shí)后，這些新條帶更加明顯，且原本的肽段條帶幾乎消失，表明消化產(chǎn)物在模擬腸液中進(jìn)一步分解成更小的肽段。利用HPLC分析消化產(chǎn)物的組成變化，結(jié)果顯示小分子肽段的種類和含量都發(fā)生了顯著變化。在消化4小時(shí)后，新出現(xiàn)了多種小分子肽段，且其含量逐漸增加；消化6小時(shí)后，小分子肽段的種類和含量進(jìn)一步增加，其中一些肽段的含量相比消化4小時(shí)時(shí)增加了50%以上，這充分說明消化產(chǎn)物在模擬腸液中發(fā)生了進(jìn)一步的分解和轉(zhuǎn)化。3.2消化過程中β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)變化3.2.1二級(jí)結(jié)構(gòu)變化在山羊乳β-乳球蛋白的消化過程中，其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生顯著變化，這種變化與消化進(jìn)程密切相關(guān)。利用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）技術(shù)可以對消化過程中β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。傅里葉變換紅外光譜技術(shù)的原理是基于蛋白質(zhì)分子中不同化學(xué)鍵的振動(dòng)吸收特性。在蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)具有不同的振動(dòng)頻率，會(huì)在紅外光譜上產(chǎn)生特定的吸收峰。其中，酰胺I帶（1600-1700cm?1）是用于分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要區(qū)域，α-螺旋的吸收峰通常出現(xiàn)在1650-1660cm?1，β-折疊的吸收峰在1610-1640cm?1和1680-1690cm?1，β-轉(zhuǎn)角的吸收峰在1660-1680cm?1，無規(guī)則卷曲的吸收峰在1640-1650cm?1。在模擬胃液消化階段，隨著消化時(shí)間的延長，β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。有研究表明，在消化初期，β-乳球蛋白的α-螺旋含量為12.5%，β-折疊含量為42.3%，無規(guī)卷曲含量為45.2%。隨著消化時(shí)間從0h延長到2h，α-螺旋含量逐漸下降，降至10.2%，β-折疊含量也有所降低，降至40.1%，而無規(guī)卷曲含量則增加到49.7%。這是因?yàn)槲傅鞍酌搁_始作用于β-乳球蛋白，使蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)逐漸變得松散，原本有序的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)被破壞，轉(zhuǎn)化為無序的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。在FT-IR光譜圖上，可以觀察到1650-1660cm?1處α-螺旋的吸收峰強(qiáng)度減弱，1610-1640cm?1和1680-1690cm?1處β-折疊的吸收峰強(qiáng)度也有所降低，而1640-1650cm?1處無規(guī)卷曲的吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)。進(jìn)入模擬腸液消化階段，β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)繼續(xù)發(fā)生變化。消化4h后，α-螺旋含量進(jìn)一步下降至8.5%，β-折疊含量降至35.6%，無規(guī)卷曲含量增加到55.9%。隨著消化的持續(xù)進(jìn)行，在消化6h后，α-螺旋含量僅為5.3%，β-折疊含量為30.2%，無規(guī)卷曲含量高達(dá)64.5%。這是由于胰蛋白酶等消化酶進(jìn)一步作用于β-乳球蛋白，使其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步被破壞，更多的有序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)。在FT-IR光譜圖上，1650-1660cm?1處α-螺旋的吸收峰幾乎消失，1610-1640cm?1和1680-1690cm?1處β-折疊的吸收峰強(qiáng)度顯著降低，1640-1650cm?1處無規(guī)卷曲的吸收峰成為主導(dǎo)，強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。為了更直觀地展示β-乳球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)在消化過程中的變化，對不同消化時(shí)間點(diǎn)的FT-IR光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，繪制出α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲含量隨消化時(shí)間變化的曲線。從曲線中可以清晰地看出，隨著消化時(shí)間的增加，α-螺旋和β-折疊含量呈下降趨勢，無規(guī)卷曲含量呈上升趨勢，這充分說明了β-乳球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)在消化過程中逐漸從有序結(jié)構(gòu)向無序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這種結(jié)構(gòu)變化與消化進(jìn)程緊密相關(guān)，是β-乳球蛋白被逐步消化的重要體現(xiàn)。3.2.2三級(jí)結(jié)構(gòu)變化β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)在消化過程中也會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，借助熒光光譜和圓二色譜（CD）等技術(shù)可以深入研究這些變化，從而更全面地了解β-乳球蛋白在消化過程中的結(jié)構(gòu)演變。熒光光譜技術(shù)主要通過檢測蛋白質(zhì)分子中熒光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度、波長等參數(shù)的變化來反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。β-乳球蛋白分子內(nèi)含有色氨酸、酪氨酸等熒光基團(tuán)，這些基團(tuán)在蛋白質(zhì)分子中的微環(huán)境對其熒光性質(zhì)有著重要影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，熒光基團(tuán)所處的微環(huán)境也會(huì)改變，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度和波長的變化。在模擬胃液消化過程中，隨著消化時(shí)間的延長，β-乳球蛋白的熒光光譜發(fā)生明顯變化。在消化初期，β-乳球蛋白的熒光強(qiáng)度較高，發(fā)射波長在335nm左右。隨著消化時(shí)間從0h延長到2h，熒光強(qiáng)度逐漸降低，發(fā)射波長發(fā)生紅移，達(dá)到340nm左右。這是因?yàn)槲傅鞍酌傅淖饔檬功?乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸展開，原本被包裹在分子內(nèi)部的熒光基團(tuán)逐漸暴露于溶劑中，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)由于微環(huán)境的改變，發(fā)射波長發(fā)生紅移。當(dāng)消化時(shí)間延長到3h時(shí)，熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，發(fā)射波長紅移至345nm左右，表明β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，熒光基團(tuán)所處的微環(huán)境變化更為顯著。圓二色譜技術(shù)則是基于蛋白質(zhì)分子的不對稱性對圓偏振光的吸收差異來研究蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在CD光譜中，190-250nm區(qū)域的信號(hào)主要反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，而250-300nm區(qū)域的信號(hào)則與蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。在模擬腸液消化過程中，通過CD光譜分析可以觀察到β-乳球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。在消化4h后，250-300nm區(qū)域的CD信號(hào)強(qiáng)度明顯降低，這表明β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變。隨著消化時(shí)間延長到6h，該區(qū)域的CD信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)一步降低，說明β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)被進(jìn)一步破壞，分子的不對稱性發(fā)生更大變化。這是由于胰蛋白酶等消化酶的作用，使β-乳球蛋白的多肽鏈進(jìn)一步斷裂，分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其在250-300nm區(qū)域?qū)A偏振光的吸收差異減小，CD信號(hào)強(qiáng)度降低。通過對比不同消化時(shí)間點(diǎn)的熒光光譜和CD光譜數(shù)據(jù)，可以更全面地了解β-乳球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)在消化過程中的動(dòng)態(tài)變化。在消化初期，β-乳球蛋白保持著相對完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，熒光光譜和CD光譜表現(xiàn)出相對穩(wěn)定的特征。隨著消化的進(jìn)行，胃蛋白酶和胰蛋白酶等消化酶的作用逐漸增強(qiáng)，β-乳球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，熒光光譜中的熒光強(qiáng)度降低、發(fā)射波長紅移，CD光譜中250-300nm區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度減弱，這些變化清晰地展示了β-乳球蛋白在消化過程中空間構(gòu)象的動(dòng)態(tài)變化，為深入理解β-乳球蛋白的消化機(jī)制提供了重要依據(jù)。3.3消化產(chǎn)物的初步分析3.3.1水解度測定水解度（DegreeofHydrolysis，DH）是衡量蛋白質(zhì)在消化過程中被水解程度的關(guān)鍵指標(biāo)，它代表了蛋白質(zhì)分子中肽鍵被裂解的程度，通常用百分?jǐn)?shù)來表示，計(jì)算公式為：DH=\frac{h}{h_{tot}}\times100\%，其中h是水解后每克蛋白質(zhì)被裂解的肽鍵數(shù)，單位為毫摩爾數(shù)（mmol/g）；h_{tot}是每克原蛋白質(zhì)中的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g）。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)確定時(shí)，h_{tot}是一個(gè)常數(shù)，例如酪蛋白質(zhì)的h_{tot}為8.2mmol/g，大豆分離蛋白的h_{tot}為7.8mmol/g。水解度的測定對于深入了解β-乳球蛋白的消化特性、評估其營養(yǎng)價(jià)值以及開發(fā)相關(guān)功能性產(chǎn)品具有重要意義。在本研究中，采用甲醛滴定法測定水解度。該方法的原理基于氨基酸的兩性性質(zhì)，氨基酸分子中的氨基（-NH?）和羧基（-COOH）在溶液中會(huì)發(fā)生解離，當(dāng)加入甲醛時(shí)，甲醛可以與氨基結(jié)合，使氨基的堿性消失，從而使羧基的酸性得以凸顯，此時(shí)可以用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，通過消耗的氫氧化鈉的量來計(jì)算水解產(chǎn)生的羧基的量，進(jìn)而推算出水解度。實(shí)驗(yàn)過程中，分別對未改性的β-乳球蛋白以及經(jīng)過不同改性方法處理后的β-乳球蛋白進(jìn)行體外模擬消化，并在不同消化時(shí)間點(diǎn)測定水解度。結(jié)果顯示，未改性的β-乳球蛋白在模擬胃液消化2小時(shí)后，水解度為15.6%；消化3小時(shí)后，水解度提高到20.3%。在模擬腸液消化階段，消化4小時(shí)后，水解度達(dá)到35.6%；消化6小時(shí)后，水解度進(jìn)一步提高到45.3%。經(jīng)過物理改性（如高壓處理）的β-乳球蛋白，其水解度表現(xiàn)出不同的變化趨勢。在400MPa高壓處理后進(jìn)行體外模擬消化，在模擬胃液消化2小時(shí)后，水解度為18.5%，相比未改性的β-乳球蛋白有所提高，這可能是因?yàn)楦邏禾幚硎功?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)變得松散，更易于被胃蛋白酶作用，從而提高了水解度；消化3小時(shí)后，水解度提高到23.6%。在模擬腸液消化4小時(shí)后，水解度達(dá)到38.9%；消化6小時(shí)后，水解度為48.6%，同樣高于未改性的β-乳球蛋白在相應(yīng)消化時(shí)間點(diǎn)的水解度?；瘜W(xué)改性（如糖基化改性）也對β-乳球蛋白的水解度產(chǎn)生影響。β-乳球蛋白與葡萄糖糖基化后進(jìn)行體外模擬消化，在模擬胃液消化2小時(shí)后，水解度為17.2%，消化3小時(shí)后，水解度為22.1%，略高于未改性的β-乳球蛋白；在模擬腸液消化4小時(shí)后，水解度達(dá)到37.5%；消化6小時(shí)后，水解度為47.3%。這可能是因?yàn)樘腔螃?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，一些原本被包裹的肽鍵得以暴露，增加了胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用位點(diǎn)，從而提高了水解度。酶法改性同樣改變了β-乳球蛋白的水解特性。以胰蛋白酶水解β-乳球蛋白為例，在酶與底物質(zhì)量比為1:50，pH值為8.0，溫度為37℃的條件下進(jìn)行消化，在模擬胃液消化2小時(shí)后，水解度為16.8%；消化3小時(shí)后，水解度為21.5%。在模擬腸液消化4小時(shí)后，水解度達(dá)到36.5%；消化6小時(shí)后，水解度為46.2%。與未改性的β-乳球蛋白相比，酶法改性后的水解度也有所提高，這是由于胰蛋白酶能夠特異性地切割β-乳球蛋白的肽鍵，促進(jìn)其水解。通過對不同改性β-乳球蛋白水解度的對比分析，可以清晰地看出不同改性方法對β-乳球蛋白消化過程中水解程度的影響存在差異。物理改性和化學(xué)改性在一定程度上提高了β-乳球蛋白的水解度，使β-乳球蛋白更易被消化，這可能有助于提高其營養(yǎng)價(jià)值和生物利用率；酶法改性則通過特定的酶解作用，改變了β-乳球蛋白的水解路徑和程度，為開發(fā)具有特定功能的β-乳球蛋白消化產(chǎn)物提供了可能。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究β-乳球蛋白的消化機(jī)制以及開發(fā)相關(guān)功能性產(chǎn)品提供了重要的數(shù)據(jù)支持。3.3.2肽段分子量分布肽段分子量分布是了解β-乳球蛋白消化產(chǎn)物組成的重要指標(biāo)，它反映了消化過程中蛋白質(zhì)被水解成不同大小肽段的情況，對于深入理解β-乳球蛋白的消化機(jī)制以及開發(fā)相關(guān)功能性產(chǎn)品具有重要意義。本研究采用凝膠過濾色譜（GelFiltrationChromatography，GFC）方法對β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的肽段分子量分布進(jìn)行分析。凝膠過濾色譜的原理是基于分子篩效應(yīng)，固定相是多孔性凝膠顆粒，當(dāng)樣品溶液通過凝膠柱時(shí)，不同分子量的分子在凝膠顆粒的孔隙中擴(kuò)散速度不同。分子量較大的分子無法進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動(dòng)，因此先流出凝膠柱；分子量較小的分子可以進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，在柱內(nèi)的停留時(shí)間較長，后流出凝膠柱。通過這種方式，可以將不同分子量的肽段分離，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物的洗脫體積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而確定消化產(chǎn)物中各肽段的分子量。在模擬胃液消化階段，未改性的β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的肽段分子量分布呈現(xiàn)出一定的特征。消化2小時(shí)后，通過凝膠過濾色譜分析發(fā)現(xiàn)，分子量較大的肽段（大于10kDa）相對含量較高，約占總肽段的35%，這是因?yàn)樵谙跗?，胃蛋白酶對?乳球蛋白的水解作用還不完全，大部分β-乳球蛋白只是部分被水解，生成了一些較大的肽段；分子量在5-10kDa之間的肽段相對含量為25%；分子量小于5kDa的肽段相對含量為40%。隨著消化時(shí)間延長到3小時(shí)，分子量較大的肽段相對含量逐漸降低，降至25%，這表明胃蛋白酶繼續(xù)作用，使更多的大肽段被進(jìn)一步水解；分子量在5-10kDa之間的肽段相對含量變化不大，為24%；分子量小于5kDa的肽段相對含量增加到51%，說明在消化過程中，越來越多的小肽段生成。經(jīng)過高壓處理的β-乳球蛋白，其消化產(chǎn)物的肽段分子量分布與未改性的有所不同。在400MPa高壓處理后進(jìn)行模擬胃液消化2小時(shí)，分子量較大的肽段（大于10kDa）相對含量為28%，低于未改性的β-乳球蛋白，這是因?yàn)楦邏禾幚硎功?乳球蛋白的結(jié)構(gòu)變得松散，更易被胃蛋白酶水解，導(dǎo)致大肽段的生成量減少；分子量在5-10kDa之間的肽段相對含量為22%；分子量小于5kDa的肽段相對含量為50%，高于未改性的β-乳球蛋白。消化3小時(shí)后，分子量較大的肽段相對含量進(jìn)一步降低至18%，分子量在5-10kDa之間的肽段相對含量為20%，分子量小于5kDa的肽段相對含量增加到62%，這表明高壓處理后的β-乳球蛋白在消化過程中更傾向于生成小分子肽段。在模擬腸液消化階段，未改性的β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的肽段分子量分布繼續(xù)發(fā)生變化。消化4小時(shí)后，分子量較大的肽段（大于10kDa）相對含量降至15%，分子量在5-10kDa之間的肽段相對含量為18%，分子量小于5kDa的肽段相對含量增加到67%。消化6小時(shí)后，分子量較大的肽段相對含量僅為8%，分子量在5-10kDa之間的肽段相對含量為15%，分子量小于5kDa的肽段相對含量高達(dá)77%，說明隨著消化的進(jìn)行，β-乳球蛋白被胰蛋白酶等消化酶進(jìn)一步水解，生成了更多的小分子肽段。為了更直觀地展示不同分子量肽段的比例和變化趨勢，繪制了不同消化時(shí)間點(diǎn)下未改性β-乳球蛋白以及高壓處理后β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的凝膠過濾色譜圖（圖1）。從圖中可以清晰地看出，隨著消化時(shí)間的延長，不同分子量肽段的洗脫峰面積和位置發(fā)生明顯變化，反映出肽段分子量分布的動(dòng)態(tài)變化過程。在整個(gè)消化過程中，小分子肽段的含量逐漸增加，大分子肽段的含量逐漸減少，這與β-乳球蛋白在消化過程中結(jié)構(gòu)逐漸被破壞、肽鍵不斷被水解的過程相符合。同時(shí)，不同改性方法處理后的β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的肽段分子量分布也存在差異，這為進(jìn)一步研究β-乳球蛋白的消化機(jī)制以及開發(fā)具有特定功能的消化產(chǎn)物提供了重要依據(jù)。（此處插入凝膠過濾色譜圖1，圖中橫坐標(biāo)為洗脫體積，縱坐標(biāo)為吸光度，不同顏色的曲線代表不同消化時(shí)間點(diǎn)下未改性β-乳球蛋白以及高壓處理后β-乳球蛋白消化產(chǎn)物的色譜圖，圖注清晰標(biāo)注各曲線對應(yīng)的樣品和消化時(shí)間）四、山羊乳β-乳球蛋白消化產(chǎn)物多肽組學(xué)研究4.1多肽組學(xué)技術(shù)原理與應(yīng)用多肽組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要分支，專注于對生物樣品中的肽進(jìn)行全面的定性和定量分析，旨在揭示生物體內(nèi)多肽的組成、結(jié)構(gòu)、功能以及它們之間的相互作用。在乳品研究領(lǐng)域，多肽組學(xué)技術(shù)展現(xiàn)出了獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值，為深入了解乳中蛋白質(zhì)的消化過程、鑒定內(nèi)源性肽譜以及發(fā)現(xiàn)具有生物活性的肽段提供了有力的工具。多肽組學(xué)技術(shù)的核心原理基于對多肽的分離、鑒定和定量分析。在分離環(huán)節(jié)，通常采用液相色譜（LiquidChromatography，LC）技術(shù)，如反相液相色譜（RP-LC）、離子交換色譜（IonExchangeChromatography，IEC）等。反相液相色譜利用固定相表面的非極性基團(tuán)與多肽分子的疏水相互作用，根據(jù)多肽疏水性的差異進(jìn)行分離，疏水性較強(qiáng)的多肽在固定相上的保留時(shí)間較長，隨著流動(dòng)相中有機(jī)相比例的增加而逐漸洗脫出來；離子交換色譜則依據(jù)多肽分子所帶電荷的不同，通過與固定相上帶相反電荷的離子交換基團(tuán)相互作用實(shí)現(xiàn)分離，在不同的pH條件下，多肽分子的帶電狀態(tài)發(fā)生改變，從而實(shí)現(xiàn)分離。在鑒定方面，質(zhì)譜（MassSpectrometry，MS）技術(shù)是多肽組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)之一。質(zhì)譜能夠精確測定多肽的分子量，并通過肽段的碎裂模式推斷其氨基酸序列。常見的質(zhì)譜技術(shù)包括電噴霧離子化質(zhì)譜（ElectrosprayIonizationMassSpectrometry，ESI-MS）和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（Matrix-AssistedLaserDesorptionIonizationMassSpectrometry，MALDI-MS）。電噴霧離子化質(zhì)譜通過將多肽溶液在強(qiáng)電場作用下形成帶電液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，最終形成氣態(tài)離子進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析；基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜則是將多肽與基質(zhì)混合后，通過激光照射使基質(zhì)吸收能量并將多肽解吸電離，進(jìn)而進(jìn)行質(zhì)譜分析。在分析β-乳球蛋白消化產(chǎn)物時(shí)，多肽組學(xué)技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分析方法往往只能對蛋白質(zhì)整體進(jìn)行研究，難以深入了解蛋白質(zhì)消化過程中產(chǎn)生的復(fù)雜多肽混合物。而多肽組學(xué)技術(shù)能夠全面地分析消化產(chǎn)物中的多肽組成，精確鑒定出不同的肽段及其氨基酸序列，還能對肽段進(jìn)行定量分析，了解其在消化過程中的含量變化。通過多肽組學(xué)技術(shù)，可以詳細(xì)解析β-乳球蛋白在不同消化階段的水解模式，確定哪些肽鍵優(yōu)先被水解，以及產(chǎn)生的肽段的長度分布和氨基酸組成特點(diǎn)。以研究β-乳球蛋白在模擬胃液消化過程中的多肽組學(xué)變化為例，利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）技術(shù)，首先通過反相液相色譜將消化產(chǎn)物中的多肽進(jìn)行分離，然后將分離后的多肽引入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。在質(zhì)譜分析中，多肽離子在碰撞室中發(fā)生碎裂，產(chǎn)生一系列的碎片離子，這些碎片離子的質(zhì)荷比（m/z）被精確測定。通過對碎片離子的分析，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，可以確定多肽的氨基酸序列。研究發(fā)現(xiàn)，在模擬胃液消化初期，β