川崎病血清對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號通路的影響及PDTC干預(yù)機制研究一、引言1.1研究背景與意義川崎?。↘awasakidisease，KD），又被稱為黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征，是一種主要發(fā)生于5歲以下兒童的急性全身性血管炎綜合征。自1967年首次被日本川崎富作醫(yī)生報道以來，KD在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是在亞洲地區(qū)，其已成為兒童后天性心臟病的主要病因之一。據(jù)統(tǒng)計，在日本，KD的發(fā)病率已高達(dá)每10萬兒童中200-300例，而在我國，隨著對該疾病認(rèn)識的提高和診斷技術(shù)的改進，發(fā)病率也逐年增加，嚴(yán)重威脅著兒童的健康成長。KD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要包括持續(xù)性發(fā)熱、皮疹、頸部淋巴結(jié)腫大、眼結(jié)膜充血、口腔黏膜彌漫充血、楊梅舌、手足硬性水腫和脫皮等。然而，其最嚴(yán)重的危害在于可引發(fā)冠狀動脈病變（CALs），如冠狀動脈擴張、冠狀動脈瘤形成等，這些病變可能導(dǎo)致心肌梗死、心律失常甚至猝死等嚴(yán)重后果，是KD患兒致死和致殘的主要原因。據(jù)研究，未經(jīng)治療的KD患兒中，約15%-25%會發(fā)生CALs，即使經(jīng)過規(guī)范治療，仍有部分患兒會遺留冠狀動脈后遺癥。因此，深入探究KD的發(fā)病機制，尋找有效的治療靶點，對于改善KD患兒的預(yù)后具有重要的臨床意義。目前，KD的發(fā)病機制尚未完全明確，普遍認(rèn)為是在遺傳易感性的基礎(chǔ)上，由感染等多種因素觸發(fā)的免疫介導(dǎo)的全身性血管炎癥反應(yīng)。大量研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷在KD的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）作為血管內(nèi)皮的重要組成部分，在維持血管穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和血栓形成等方面發(fā)揮著重要作用。KD血清中可能存在多種致病因子，這些因子作用于HUVEC后，可導(dǎo)致其功能異常，進而引發(fā)血管炎癥和損傷。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路是一條在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中起核心作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκBα結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到炎癥刺激、病原體感染等外界信號時，IκBα激酶（IKK）被激活，使IκBα磷酸化、泛素化并降解，從而釋放出NF-κB。NF-κB進入細(xì)胞核后，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，調(diào)控一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等，參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，在KD患兒的血清和組織中，NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)，提示其可能在KD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。然而，KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的具體影響及作用機制尚不完全清楚。吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）是一種人工合成的抗氧化劑和NF-κB特異性抑制劑。它可以通過抑制IKK的活性，阻止IκBα的降解，從而阻斷NF-κB信號通路的激活。研究表明，PDTC在多種炎癥相關(guān)疾病的動物模型和細(xì)胞實驗中展現(xiàn)出良好的抗炎作用。例如，在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中，PDTC預(yù)處理可顯著減輕肺組織的炎癥損傷，降低炎癥因子的表達(dá)；在體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中，PDTC能夠抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB激活和炎癥因子的釋放。然而，PDTC在KD治療中的應(yīng)用研究相對較少，其對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用及潛在的臨床應(yīng)用價值有待進一步探討。本研究旨在通過觀察KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響，深入探討該信號通路在KD發(fā)病機制中的作用；同時，研究PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用，為KD的治療提供新的思路和潛在的治療靶點，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與問題提出本研究旨在深入探究KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響，并進一步探討PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用及潛在機制。具體研究目的如下：明確KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響：通過實驗觀察KD血清作用于HUVEC后，NF-κB信號通路關(guān)鍵分子，如NF-κBp65、IκBα等的表達(dá)變化，以及該信號通路的激活狀態(tài)，分析KD血清與HUVEC中NF-κB信號通路激活之間的關(guān)系，為揭示KD的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。探討PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用：觀察PDTC干預(yù)后，KD血清培養(yǎng)下HUVEC的細(xì)胞活力、增殖能力等生物學(xué)行為的改變，評估PDTC對HUVEC的保護作用，明確PDTC在KD治療中對血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛在保護價值。解析PDTC干預(yù)作用的機制：研究PDTC對KD血清刺激下HUVEC中NF-κB信號通路的調(diào)控機制，分析PDTC是否通過抑制NF-κB信號通路的激活，進而減少炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，減輕炎癥損傷，保護HUVEC的功能，為PDTC在KD治療中的臨床應(yīng)用提供理論支持?；谏鲜鲅芯磕康?，提出以下科學(xué)問題：KD血清如何影響HUVEC中NF-κB信號通路的激活？KD血清中的哪些成分可能參與了這一過程？PDTC能否有效改善KD血清培養(yǎng)下HUVEC的活力？其干預(yù)效果與傳統(tǒng)治療藥物靜脈注射丙種球蛋白（IVIG）相比如何？PDTC通過何種具體機制抑制KD血清刺激下HUVEC中NF-κB信號通路的過度激活？是否存在其他潛在的作用靶點和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑？對這些問題的深入研究，將有助于進一步闡明KD的發(fā)病機制，為KD的治療提供新的策略和靶點，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1實驗分組將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）隨機分為4組，每組設(shè)置多個復(fù)孔以確保實驗結(jié)果的可靠性。具體分組如下：正常組（N組）：給予RPMI-1640培養(yǎng)液+正常兒童血清進行培養(yǎng)，作為正常對照，用于反映HUVEC在正常生理條件下的生物學(xué)特性和NF-κB信號通路的基礎(chǔ)表達(dá)水平。KD組（K組）：采用RPMI-1640培養(yǎng)液+KD兒童血清培養(yǎng)，該組用于研究KD血清對HUVEC的直接作用，觀察KD血清如何影響HUVEC的細(xì)胞活力、增殖情況以及NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達(dá)變化，從而揭示KD發(fā)病機制中血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化。IVIG組（G組）：培養(yǎng)液為RPMI-1640+KD兒童血清+IVIG。IVIG是目前KD治療的一線藥物，此組用于對比IVIG干預(yù)后，KD血清對HUVEC影響的改變情況，評估IVIG對HUVEC的保護作用及對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)效果，作為PDTC干預(yù)效果比較的參照。PDTC組（P組）：用RPMI-1640培養(yǎng)液+KD兒童血清+PDTC培養(yǎng)細(xì)胞，旨在探究PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用，以及對NF-κB信號通路的調(diào)控機制，明確PDTC在KD治療中對血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛在保護價值。1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存的HUVEC，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，不斷輕輕搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代：當(dāng)HUVEC生長至融合度達(dá)到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫落時，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，并制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按照1:2或1:3的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分組處理：待HUVEC生長狀態(tài)良好且達(dá)到實驗所需細(xì)胞密度時，按照上述分組方案進行處理。向不同組別的培養(yǎng)瓶中分別加入相應(yīng)的培養(yǎng)液和干預(yù)物質(zhì)，確保各組細(xì)胞在相同的培養(yǎng)條件下（37℃、5%CO?培養(yǎng)箱）培養(yǎng)24小時，以使各干預(yù)因素充分發(fā)揮作用。1.3.3檢測指標(biāo)及方法細(xì)胞形態(tài)觀察：在倒置顯微鏡下，于培養(yǎng)24小時后對各組HUVEC進行形態(tài)學(xué)觀察。記錄細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞的形狀、大小、貼壁情況、細(xì)胞間連接等特征，初步判斷KD血清及各干預(yù)因素對細(xì)胞形態(tài)的影響。正常的HUVEC通常呈現(xiàn)為扁平、多角形，貼壁緊密，細(xì)胞間連接緊密；若受到KD血清影響發(fā)生損傷，可能會出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、變圓、脫壁，細(xì)胞間連接松散等形態(tài)學(xué)改變。MTT比色法檢測細(xì)胞活力：MTT是一種黃色的四氮唑鹽，可被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶。其原理基于活細(xì)胞線粒體中的酶活性與細(xì)胞活力呈正相關(guān)，通過檢測甲瓚結(jié)晶的生成量，可間接反映細(xì)胞活力。具體操作如下：在培養(yǎng)24小時后，向每孔細(xì)胞中加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。此時，活細(xì)胞內(nèi)的酶將MTT還原為甲瓚結(jié)晶。小心吸去上清液，避免吸走甲瓚結(jié)晶，每孔加入150μL的DMSO（二甲基亞砜），振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。OD值越高，表明細(xì)胞活力越強；反之，OD值越低，細(xì)胞活力越弱。RT-PCR法檢測基因表達(dá)：用于檢測細(xì)胞中NF-κBp65mRNA、IκBαmRNA、MMP-9mRNA、ICAM-1mRNA的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總RNA，使用Trizol試劑按照說明書操作，將細(xì)胞裂解，分離RNA。通過分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保RNA質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。然后以RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后以cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。引物序列根據(jù)GenBank中相應(yīng)基因序列設(shè)計，并由專業(yè)公司合成。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5分鐘；變性95℃30秒，退火（根據(jù)引物Tm值設(shè)定）30秒，延伸72℃30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達(dá)量。Western-blotting法檢測蛋白表達(dá)：用于檢測NF-κBp65蛋白、IκBα蛋白的表達(dá)水平。首先收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，使細(xì)胞充分裂解，釋放蛋白質(zhì)。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA法測定蛋白濃度，確保各樣本蛋白濃度一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白按照分子量大小分離。電泳結(jié)束后，通過濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1-2小時，以減少非特異性結(jié)合。加入一抗（兔抗人NF-κBp65抗體、兔抗人IκBα抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體），室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）對膜進行曝光，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像并分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。1.3.4數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），則進一步采用LSD法進行兩兩比較；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，計算各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)r和決定系數(shù)R2，以評估指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，準(zhǔn)確揭示KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響以及PDTC的干預(yù)作用。1.3.5技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先采集KD患兒和正常兒童的血清，并進行處理備用。復(fù)蘇和培養(yǎng)HUVEC，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，將其隨機分為4組，分別給予不同的干預(yù)處理。培養(yǎng)24小時后，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT比色法檢測細(xì)胞活力，RT-PCR法檢測相關(guān)基因表達(dá)，Western-blotting法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)。最后對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，得出結(jié)論，明確KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響及PDTC的干預(yù)作用。[此處插入技術(shù)路線圖，圖中清晰展示從樣本采集、細(xì)胞培養(yǎng)與分組、各檢測指標(biāo)實驗操作到數(shù)據(jù)分析及得出結(jié)論的整個流程]二、理論基礎(chǔ)與研究現(xiàn)狀2.1川崎病（KD）概述川崎?。↘awasakidisease，KD），又稱為黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合征（Mucocutaneouslymphnodesyndrome，MCLS），是一種主要發(fā)生于5歲以下兒童的急性全身性血管炎綜合征。1967年，日本的川崎富作醫(yī)生首次詳細(xì)報道了這種疾病，此后，隨著對其認(rèn)識的不斷深入，全球范圍內(nèi)對KD的研究日益增多。KD在流行病學(xué)上具有一定的特點。在全球范圍內(nèi)，KD的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的地域差異，亞洲地區(qū)發(fā)病率相對較高，尤其是日本，其發(fā)病率居世界前列，每10萬兒童中可達(dá)200-300例。在我國，隨著醫(yī)療水平的提高和對該疾病認(rèn)識的普及，KD的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，已成為兒童后天性心臟病的重要病因之一。發(fā)病年齡多集中在5歲以下兒童，其中1-2歲年齡段發(fā)病率最高，男性發(fā)病率略高于女性。KD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，主要癥狀包括：發(fā)熱：為最常見的首發(fā)癥狀，多表現(xiàn)為持續(xù)性高熱，體溫可達(dá)39-40℃，且抗生素治療無效，發(fā)熱通常持續(xù)5天以上。皮疹：多形性紅斑是常見的皮疹類型，可出現(xiàn)在軀干、四肢等部位，皮疹形態(tài)多樣，如紅斑、丘疹、斑丘疹等，一般無水皰及結(jié)痂。頸部淋巴結(jié)腫大：多為單側(cè)或雙側(cè)頸部淋巴結(jié)非化膿性腫大，直徑通常大于1.5cm，質(zhì)地較硬，表面光滑，無壓痛。眼結(jié)膜充血：雙眼球結(jié)膜充血，無分泌物，一般不伴有角膜潰瘍等眼部病變。口腔黏膜改變：口腔及咽部黏膜彌漫充血，唇發(fā)紅、干裂，常呈楊梅舌，舌乳頭突起、充血。手足改變：在發(fā)病初期，手足出現(xiàn)硬性水腫，掌跖發(fā)紅；在恢復(fù)期，指趾端會出現(xiàn)膜狀脫皮。KD的診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)，目前廣泛采用的是日本MCLS研究委員會（1984年）提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即在上述六條主要臨床癥狀中至少滿足五條才能確診。然而，近年來不完全性或不典型病例逐漸增多，約占10%-20%。對于這些病例，雖然僅具有2-3條主要癥狀，但如果二維超聲心動圖或冠狀動脈造影檢查發(fā)現(xiàn)冠狀動脈瘤或擴張，也可確診為KD。由于KD早期癥狀不典型，容易與其他發(fā)熱性疾病混淆，因此需要臨床醫(yī)生提高警惕，結(jié)合實驗室檢查和影像學(xué)檢查進行綜合判斷。KD的治療主要目的是控制全身血管炎癥，預(yù)防冠狀動脈病變的發(fā)生和發(fā)展。目前，KD的主要治療方法包括：靜脈注射丙種球蛋白（IVIG）：是KD治療的一線藥物，早期使用（發(fā)病10天內(nèi)）可有效降低冠狀動脈瘤的發(fā)生率。推薦劑量為2g/kg，于8-12小時內(nèi)靜脈緩慢輸入。其作用機制可能與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抑制炎癥細(xì)胞的活化和增殖等有關(guān)。阿司匹林：具有抗炎和抗血小板聚集的作用。在急性期，一般給予高劑量阿司匹林，每日30-50mg/kg，分2-3次服用，退熱后3天逐漸減量，2周左右減至每日3-5mg/kg，維持6-8周。對于有冠狀動脈病變的患兒，應(yīng)延長用藥時間，直至冠狀動脈恢復(fù)正常。糖皮質(zhì)激素：一般不作為KD的首選治療藥物，因為其可能促進血栓形成，增加冠狀動脈瘤的發(fā)生風(fēng)險。但對于IVIG治療無效的患兒，可考慮使用糖皮質(zhì)激素，常與阿司匹林和雙嘧達(dá)莫聯(lián)合應(yīng)用。KD血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有顯著影響。研究表明，KD患兒血清中存在多種炎性因子和免疫活性物質(zhì)，這些物質(zhì)可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷、功能異常。例如，KD血清中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性因子水平升高，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等黏附分子，促進炎癥細(xì)胞的黏附和浸潤，進而引發(fā)血管炎癥反應(yīng)。KD血清還可影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力，破壞血管內(nèi)皮的完整性和穩(wěn)定性。有研究通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）暴露于KD血清中，可觀察到細(xì)胞形態(tài)改變、增殖能力下降、凋亡增加等現(xiàn)象，提示KD血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞具有直接的損傷作用。這些研究結(jié)果表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在KD的發(fā)病機制中起著重要作用，深入探究KD血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其機制，對于揭示KD的發(fā)病機制和尋找新的治療靶點具有重要意義。2.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HumanUmbilicalVeinEndothelialCells，HUVEC）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要代表，在維持血管生理功能及參與病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與KD的研究存在緊密的相關(guān)性。HUVEC是構(gòu)成臍靜脈內(nèi)壁的主要細(xì)胞類型，來源于新生兒的臍帶組織，獲取相對便捷，且不存在明顯的倫理爭議，這使得其在科研領(lǐng)域成為常用的細(xì)胞模型。在正常生理狀態(tài)下，HUVEC發(fā)揮著多種重要功能。它能夠合成和釋放多種生物活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、前列環(huán)素（PGI?）等，這些物質(zhì)對于調(diào)節(jié)血管張力、抑制血小板聚集和白細(xì)胞黏附具有關(guān)鍵作用。NO作為一種重要的血管舒張因子，可通過激活鳥苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)cGMP水平升高，導(dǎo)致血管平滑肌舒張，從而維持血管的正常管徑和血流狀態(tài)。PGI?則具有強大的抗血小板聚集作用，能夠抑制血小板的活化和血栓形成，保證血液的正常流動。HUVEC還表達(dá)多種細(xì)胞表面分子和受體，如血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（VE-Cadherin）、vonWillebrand因子（vWF）、CD31等，這些分子在維持血管內(nèi)皮的完整性、細(xì)胞間通訊以及血管生成等過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。VE-Cadherin主要參與細(xì)胞間的黏附連接，它通過與相鄰細(xì)胞表面的VE-Cadherin分子相互作用，形成緊密的細(xì)胞連接，維持血管內(nèi)皮的屏障功能，阻止血液中的有害物質(zhì)和炎癥細(xì)胞進入血管壁；vWF則在止血過程中發(fā)揮重要作用，當(dāng)血管受損時，vWF可與血小板表面的受體結(jié)合，介導(dǎo)血小板的黏附和聚集，形成血小板血栓，從而起到止血的作用。在病理狀態(tài)下，尤其是在血管炎癥相關(guān)疾病中，HUVEC的功能和特性會發(fā)生顯著改變。當(dāng)受到炎癥刺激時，HUVEC會被激活，其表面的黏附分子表達(dá)上調(diào)，如細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等。這些黏附分子能夠與白細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，促進白細(xì)胞的黏附和遷移，使其進入血管壁，引發(fā)炎癥反應(yīng)。HUVEC還會分泌多種炎性細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等，進一步加劇炎癥的發(fā)展。TNF-α可誘導(dǎo)HUVEC表達(dá)更多的黏附分子，增強白細(xì)胞的黏附能力，同時還能激活NF-κB信號通路，促進炎癥相關(guān)基因的表達(dá)；IL-6則參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化和增殖，在炎癥反應(yīng)中起到重要的調(diào)節(jié)作用；MCP-1能夠吸引單核細(xì)胞向炎癥部位遷移，促進炎癥細(xì)胞的浸潤。HUVEC與KD的研究具有密切的相關(guān)性。KD作為一種以全身血管炎為主要病理特征的疾病，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其重要的發(fā)病機制之一。由于HUVEC與KD患者體內(nèi)受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有相似的生物學(xué)特性，因此常被用于研究KD的發(fā)病機制。通過將HUVEC暴露于KD血清中，可以模擬KD患者體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞所處的病理微環(huán)境，觀察HUVEC的形態(tài)、功能和分子生物學(xué)變化，從而深入探究KD血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，KD血清可導(dǎo)致HUVEC形態(tài)改變，細(xì)胞變得腫脹、變圓，貼壁能力下降，細(xì)胞間連接松散，這表明KD血清對HUVEC的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生了明顯的破壞作用。KD血清還可抑制HUVEC的增殖能力，促進其凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，影響血管內(nèi)皮的修復(fù)和再生。在分子水平上，KD血清可調(diào)節(jié)HUVEC中多種基因和蛋白的表達(dá)，如炎癥相關(guān)因子、黏附分子等，進一步揭示了KD發(fā)病過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的分子生物學(xué)變化。這些研究結(jié)果為深入理解KD的發(fā)病機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為尋找KD的治療靶點和開發(fā)新的治療方法奠定了基礎(chǔ)。2.3NF-κB信號通路核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路是一條在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其組成復(fù)雜，激活機制精細(xì)，對細(xì)胞的多種功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，與川崎?。↘D）的發(fā)病機制也存在著緊密的關(guān)聯(lián)。NF-κB信號通路主要由以下關(guān)鍵組件構(gòu)成：NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族：哺乳動物的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族包含5個成員，分別為NF-κB1（p105/p50）、NF-κB2（p100/p52）、p65（RELA）、V-Rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒癌基因同源物B（RELB）和c-REL。這些成員均含有保守的Rel同源結(jié)構(gòu)域（RHD），憑借此結(jié)構(gòu)域，任意兩個成員能夠形成同源或異源二聚體。其中，p65/p50異源二聚體最為常見，在NF-κB信號通路的激活和調(diào)控中發(fā)揮核心作用。p65亞基含有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（TAD），具備轉(zhuǎn)錄激活活性，而p50亞基本身雖不含有TAD，其同源二聚體具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，但與p65等含TAD的成員形成異源二聚體時，可協(xié)同促進基因轉(zhuǎn)錄。IκB激酶（IKK）復(fù)合體：是NF-κB信號通路的關(guān)鍵組成部分，由IKKα、IKKβ和NEMO（IKKγ）組成。其中，IKKα和IKKβ屬于激酶，負(fù)責(zé)催化底物的磷酸化反應(yīng)，二者具有50%的序列同源性。它們的氨基末端均含有激酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮激酶活性的關(guān)鍵部位；還包含一個螺旋-環(huán)-螺旋（HLH）結(jié)構(gòu)域，主要用于調(diào)節(jié)IKK激酶的活性，確保激酶在適當(dāng)?shù)臅r間和條件下被激活；以及一個亮氨酸拉鏈（LZ）結(jié)構(gòu)域，介導(dǎo)激酶的二聚化，使IKKα和IKKβ能夠形成功能性的復(fù)合體。IKKγ則是發(fā)揮調(diào)節(jié)功能的亞基，在IKK復(fù)合體的組裝、激活以及信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮不可或缺的作用。IκB蛋白：包括IκBα、IκBβ、IκBε等，它們能夠與NF-κB二聚體緊密結(jié)合，以非活性形式將NF-κB二聚體隔離在細(xì)胞質(zhì)中。IκB蛋白的主要功能是抑制NF-κB的活性，維持細(xì)胞內(nèi)NF-κB信號通路的穩(wěn)態(tài)。當(dāng)細(xì)胞未受到外界刺激時，NF-κB與IκB蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，處于失活狀態(tài)，無法進入細(xì)胞核調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。NF-κB信號通路的激活機制較為復(fù)雜，主要存在經(jīng)典和非經(jīng)典兩條激活途徑：經(jīng)典激活途徑：主要由腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、脂多糖（LPS）、抗原等激活劑觸發(fā)。當(dāng)這些激活劑與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，通過一系列橋接蛋白的介導(dǎo)，啟動信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)。例如，Toll樣受體（TLR）、IL-1受體（IL-1R）和TNF受體（TNFR）被激活后，主要促進轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1（TAK1）/TAK1結(jié)合蛋白（TAB）復(fù)合物的激活；B細(xì)胞抗原受體（BCR）和T細(xì)胞抗原受體（TCR）被激活后，則啟動一個多階段的酶促反應(yīng)，激活CARMA1/BCL-10/MALT1復(fù)合物?；罨腃ARMA1/BCL-10/MALT1復(fù)合物和TAK1/TAB復(fù)合物進一步使IKKα/IKKβ/NEMO復(fù)合物磷酸化，激活I(lǐng)KK復(fù)合體。激活的IKKβ能夠特異性地磷酸化IκBα，使其發(fā)生泛素化修飾，隨后被蛋白酶體識別并降解。隨著IκBα的降解，與之結(jié)合的NF-κB二聚體（如p50/p65）得以釋放，進入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。非經(jīng)典激活途徑：大多數(shù)非經(jīng)典的NF-κB受體屬于TNFR超家族。當(dāng)這些受體與相應(yīng)的配體結(jié)合形成復(fù)合物后，招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）成員，觸發(fā)受體-配體復(fù)合物的分解，并進一步激活NF-κB誘導(dǎo)激酶（NIK）。激活的NIK磷酸化IKKα，促使p100加工降解為p52。p52亞基隨后與RelB結(jié)合，形成p52/RelB異源二聚體，并發(fā)生核易位，進入細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，主要參與淋巴細(xì)胞的生成、存活、成熟和粘附等生物學(xué)過程。在細(xì)胞中，NF-κB信號通路具有廣泛而重要的作用，深度參與多種生物學(xué)過程：免疫反應(yīng)：在固有免疫中，NF-κB能夠促進巨噬細(xì)胞分化為M1表型，增強巨噬細(xì)胞的吞噬和殺菌能力；促進樹突狀細(xì)胞成熟，提高其抗原呈遞能力；募集中性粒細(xì)胞，增強機體的抗感染能力。在適應(yīng)性免疫中，NF-κB增強B細(xì)胞的激活、增殖、成熟和選擇，促進抗體的產(chǎn)生；在不同細(xì)胞因子的刺激下，驅(qū)動CD4T細(xì)胞分化為各種亞型，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫平衡。炎癥反應(yīng)：NF-κB是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它能夠調(diào)控一系列炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1、IL-6等）、趨化因子（MCP-1、RANTES等）、細(xì)胞黏附分子（ICAM-1、VCAM-1等）。這些炎癥介質(zhì)的表達(dá)增加，可導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的募集、活化和炎癥反應(yīng)的放大。細(xì)胞凋亡：NF-κB信號通路對細(xì)胞凋亡具有雙重調(diào)節(jié)作用。在某些情況下，NF-κB的激活可以促進細(xì)胞存活，通過誘導(dǎo)抗凋亡基因（如Bcl-2、Bcl-XL等）的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡；而在另一些情況下，NF-κB的持續(xù)激活或異常激活可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，通過誘導(dǎo)促凋亡基因（如FasL、TRAIL等）的表達(dá)，促進細(xì)胞凋亡。NF-κB信號通路與KD的發(fā)病機制密切相關(guān)。研究表明，在KD患兒的血清和病變組織中，NF-κB信號通路處于激活狀態(tài)。KD血清中存在多種炎性因子和免疫活性物質(zhì)，這些物質(zhì)可能作為激活劑，通過經(jīng)典或非經(jīng)典途徑激活NF-κB信號通路。激活的NF-κB信號通路可促使血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)大量的炎癥相關(guān)因子和黏附分子，如ICAM-1、VCAM-1、MMP-9等。ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)增加，可促進炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，使其遷移至血管壁，引發(fā)炎癥反應(yīng)；MMP-9的表達(dá)上調(diào)，可降解血管基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，破壞血管結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致血管擴張和動脈瘤的形成。NF-κB信號通路的激活還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡平衡，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙。因此，深入研究NF-κB信號通路在KD發(fā)病機制中的作用，對于揭示KD的發(fā)病機制和尋找有效的治療靶點具有重要意義。2.4PDTC的作用機制吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）作為一種人工合成的化合物，在科研和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注，其作用機制主要體現(xiàn)在對NF-κB信號通路的特異性抑制上。PDTC對NF-κB信號通路的抑制作用具有獨特的分子機制。研究表明，PDTC能夠抑制IκB激酶（IKK）的活性。IKK是NF-κB信號通路激活的關(guān)鍵激酶，它能夠磷酸化IκB蛋白，使其發(fā)生泛素化修飾并被蛋白酶體降解，從而釋放出NF-κB二聚體，啟動信號通路。PDTC可能通過與IKK的活性位點或相關(guān)調(diào)節(jié)區(qū)域結(jié)合，干擾IKK的正常構(gòu)象和功能，阻止其對IκB的磷酸化作用。在脂多糖（LPS）刺激的巨噬細(xì)胞中，PDTC能夠顯著抑制IKK的磷酸化水平，減少IκBα的降解，進而抑制NF-κB的活化。PDTC還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)來影響NF-κB信號通路。NF-κB的激活與細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激密切相關(guān)，活性氧（ROS）可以作為第二信使，參與NF-κB信號通路的激活過程。PDTC具有抗氧化作用，它能夠清除細(xì)胞內(nèi)過多的ROS，降低氧化應(yīng)激水平，從而抑制NF-κB的激活。在過氧化氫（H?O?）誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中，PDTC預(yù)處理可以有效減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位，減輕炎癥反應(yīng)。在相關(guān)疾病治療研究中，PDTC展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價值。在炎癥相關(guān)疾病方面，如急性肺損傷，PDTC在動物模型中表現(xiàn)出良好的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)，給予PDTC預(yù)處理的小鼠在接受LPS刺激后，肺組織中的炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)水平顯著降低，肺組織的病理損傷得到明顯改善。這表明PDTC通過抑制NF-κB信號通路的激活，有效減輕了炎癥反應(yīng)，對急性肺損傷起到了保護作用。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，PDTC也顯示出一定的神經(jīng)保護作用。在腦缺血再灌注損傷模型中，PDTC能夠抑制NF-κB的活性，減少炎癥因子的釋放，降低神經(jīng)元的凋亡率，改善神經(jīng)功能。在心血管疾病研究中，PDTC可以抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，減少動脈粥樣硬化斑塊的形成。這可能是由于PDTC抑制了NF-κB信號通路，下調(diào)了與血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)基因的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）等。盡管PDTC在疾病治療研究中取得了一定的成果，但目前仍面臨一些挑戰(zhàn)和限制。PDTC的作用機制尚未完全明確，雖然其對NF-κB信號通路的抑制作用已得到廣泛認(rèn)可，但在細(xì)胞內(nèi)可能還存在其他潛在的作用靶點和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，需要進一步深入研究。PDTC的藥代動力學(xué)性質(zhì)和安全性也需要進一步評估。在體內(nèi)實驗中，PDTC的穩(wěn)定性、生物利用度以及潛在的毒副作用等問題仍有待解決。由于PDTC是一種非特異性的抑制劑，在抑制NF-κB信號通路的同時，可能會對其他正常的細(xì)胞生理過程產(chǎn)生影響，這也限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。然而，隨著對PDTC研究的不斷深入，相信未來能夠更好地理解其作用機制，優(yōu)化其藥代動力學(xué)性質(zhì)，提高其安全性和有效性，為相關(guān)疾病的治療提供更有效的手段。三、KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響實驗3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料血清來源：選取20例川崎?。↘D）急性期患兒作為KD血清供體，所有患兒均符合美國心臟協(xié)會（AHA）制定的KD診斷標(biāo)準(zhǔn)，且在發(fā)病7-10天內(nèi)采集血液樣本。同時，選取20例年齡、性別匹配的健康兒童作為正常對照，采集其血液樣本獲取正常血清。所有血清樣本采集前，均獲得患兒及其監(jiān)護人的知情同意。細(xì)胞株來源：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，細(xì)胞編號為[具體編號]。該細(xì)胞株經(jīng)過嚴(yán)格的鑒定和質(zhì)量檢測，確保細(xì)胞的純度和活性。主要試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），用于提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境；胎牛血清（FBS，美國Gibco公司），富含多種生長因子和營養(yǎng)成分，可促進細(xì)胞生長和增殖；青霉素-鏈霉素雙抗（美國Gibco公司），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染；胰蛋白酶-EDTA消化液（美國Gibco公司），用于消化細(xì)胞，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于傳代和實驗操作；MTT試劑（美國Sigma公司），用于檢測細(xì)胞活力，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將MTT還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶，通過檢測甲瓚結(jié)晶的生成量來間接反映細(xì)胞活力；DMSO（二甲基亞砜，美國Sigma公司），用于溶解MTT還原生成的甲瓚結(jié)晶，以便于在酶標(biāo)儀上進行檢測；Trizol試劑（美國Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞總RNA，其主要成分包括苯酚和異硫氰酸胍，能夠迅速裂解細(xì)胞并使核酸蛋白復(fù)合物解離，同時抑制核酸酶的活性，保證RNA的完整性；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa公司），用于將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進行PCR擴增；PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），包含PCR反應(yīng)所需的各種試劑，如TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等，用于擴增目的基因；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，根據(jù)GenBank中NF-κBp65、IκBα、MMP-9、ICAM-1和β-actin基因序列設(shè)計，確保引物的特異性和擴增效率；兔抗人NF-κBp65抗體（美國CellSignalingTechnology公司）、兔抗人IκBα抗體（美國CellSignalingTechnology公司），用于免疫印跡實驗中特異性識別相應(yīng)的蛋白；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（美國CellSignalingTechnology公司），作為二抗，與一抗結(jié)合后，通過化學(xué)發(fā)光法檢測目的蛋白的表達(dá)；PVDF膜（美國Millipore公司），用于蛋白質(zhì)印跡實驗中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移和固定；BCA蛋白定量試劑盒（美國ThermoFisherScientific公司），用于測定蛋白質(zhì)樣品的濃度，其原理是基于蛋白質(zhì)與銅離子在堿性條件下的反應(yīng)，生成的復(fù)合物可與BCA試劑結(jié)合，形成紫色絡(luò)合物，通過檢測絡(luò)合物在562nm處的吸光度來定量蛋白質(zhì)濃度；PDTC（吡咯烷二硫氨基甲酸酯，美國Sigma公司），作為NF-κB信號通路的抑制劑，用于研究其對KD血清刺激下HUVEC的干預(yù)作用；IVIG（靜脈注射丙種球蛋白，上海萊士血液制品股份有限公司），作為KD治療的一線藥物，用于對比PDTC的干預(yù)效果。主要器材：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），提供穩(wěn)定的37℃、5%CO?培養(yǎng)環(huán)境，滿足細(xì)胞生長的需求；倒置顯微鏡（日本Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況；酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），用于檢測MTT實驗中各孔的吸光度值，從而測定細(xì)胞活力；PCR儀（德國Eppendorf公司），用于進行PCR擴增反應(yīng)，通過精確控制溫度和時間，實現(xiàn)目的基因的高效擴增；凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），用于觀察和分析PCR擴增產(chǎn)物及蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果，通過采集圖像和分析條帶灰度值，實現(xiàn)對實驗數(shù)據(jù)的定量分析；電泳儀（美國Bio-Rad公司），用于進行蛋白質(zhì)和核酸的電泳分離，根據(jù)分子的大小和電荷差異，將其在凝膠中分離成不同的條帶；離心機（德國Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離，通過高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞和蛋白質(zhì)沉淀下來，便于后續(xù)實驗操作；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無菌的操作環(huán)境，防止實驗過程中的微生物污染。3.1.2標(biāo)本采集與血清制備血液采集：使用一次性無菌真空采血管，分別采集KD患兒和正常兒童的外周靜脈血5mL。采集過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免污染。血清分離：將采集的血液樣本在室溫下靜置30分鐘，使血液自然凝固。然后，將其轉(zhuǎn)移至離心機中，3000rpm離心15分鐘，使血清與血細(xì)胞分離。小心吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，避免吸取到血細(xì)胞和血凝塊。血清儲存：將分離得到的血清分裝成小份，每管0.5-1mL，儲存于-80℃冰箱中備用。避免反復(fù)凍融，以防止血清中蛋白質(zhì)和生物活性物質(zhì)的降解。3.1.3HUVEC培養(yǎng)與分組細(xì)胞復(fù)蘇：從液氮罐中取出凍存的HUVEC，迅速放入37℃恒溫水浴鍋中，不斷輕輕搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳代：當(dāng)HUVEC生長至融合度達(dá)到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，覆蓋細(xì)胞表面，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫落時，立即加入含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落，并制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按照1:2或1:3的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。分組處理：待HUVEC生長狀態(tài)良好且達(dá)到實驗所需細(xì)胞密度時，按照以下分組方案進行處理：正常組（N組）：給予RPMI-1640培養(yǎng)液+10%正常兒童血清進行培養(yǎng)，設(shè)置6個復(fù)孔，用于反映HUVEC在正常生理條件下的生物學(xué)特性和NF-κB信號通路的基礎(chǔ)表達(dá)水平。KD組（K組）：采用RPMI-1640培養(yǎng)液+10%KD兒童血清培養(yǎng)，同樣設(shè)置6個復(fù)孔，該組用于研究KD血清對HUVEC的直接作用，觀察KD血清如何影響HUVEC的細(xì)胞活力、增殖情況以及NF-κB信號通路相關(guān)分子的表達(dá)變化。IVIG組（G組）：培養(yǎng)液為RPMI-1640+10%KD兒童血清+IVIG（終濃度為2g/L），設(shè)置6個復(fù)孔。IVIG是目前KD治療的一線藥物，此組用于對比IVIG干預(yù)后，KD血清對HUVEC影響的改變情況，評估IVIG對HUVEC的保護作用及對NF-κB信號通路的調(diào)節(jié)效果。PDTC組（P組）：用RPMI-1640培養(yǎng)液+10%KD兒童血清+PDTC（終濃度為100μmol/L）培養(yǎng)細(xì)胞，設(shè)置6個復(fù)孔，旨在探究PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用，以及對NF-κB信號通路的調(diào)控機制。3.1.4MTT檢測原理和實驗步驟檢測原理：MTT是一種黃色的四氮唑鹽，可被活細(xì)胞內(nèi)的線粒體琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶。由于活細(xì)胞線粒體中的酶活性與細(xì)胞活力呈正相關(guān)，因此通過檢測甲瓚結(jié)晶的生成量，可間接反映細(xì)胞活力。實驗步驟：在培養(yǎng)24小時后，向每孔細(xì)胞中加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。此時，活細(xì)胞內(nèi)的酶將MTT還原為甲瓚結(jié)晶。小心吸去上清液，避免吸走甲瓚結(jié)晶，每孔加入150μL的DMSO，振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。OD值越高，表明細(xì)胞活力越強；反之，OD值越低，細(xì)胞活力越弱。3.1.5RT-PCR檢測NF-κBp65mRNA，IκBαmRNA，MMP-9mRNA，ICAM-1mRNARNA提?。菏褂肨rizol試劑提取各組細(xì)胞的總RNA。具體操作如下：吸去培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞2-3次。每孔加入1mLTrizol試劑，吹打均勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，加入0.2mL***，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘。4℃、12000rpm離心15分鐘，此時RNA位于上層水相，DNA和蛋白質(zhì)位于下層有機相和中間層。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5mL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4℃、12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色RNA沉淀。棄上清，加入1mL75%乙醇，輕輕洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5分鐘。棄上清，將RNA沉淀在空氣中晾干，避免過度干燥導(dǎo)致RNA難以溶解。加入適量的DEPC水溶解RNA，使用分光光度計測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，A260/A230比值大于2.0，以保證RNA質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。逆轉(zhuǎn)錄：按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行操作。取適量的RNA模板，加入隨機引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，總體積為20μL。反應(yīng)條件為：42℃孵育60分鐘，70℃孵育10分鐘，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可保存于-20℃冰箱中備用。PCR擴增：以cDNA為模板，使用特異性引物進行PCR擴增。引物序列如下：NF-κBp65：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；IκBα：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；MMP-9：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；ICAM-1：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；β-actin：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板2μL、上下游引物各0.5μL、dNTPs2μL、TaqDNA聚合酶0.25μL和10×PCR緩沖液2.5μL，加ddH?O至總體積25μL。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃5分鐘；變性95℃30秒，退火（根據(jù)引物Tm值設(shè)定，NF-κBp65為58℃，IκBα為56℃，MMP-9為55℃，ICAM-1為57℃，β-actin為55℃）30秒，延伸72℃30秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。結(jié)果分析：擴增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達(dá)量。具體計算方法為：首先計算每個樣本目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，然后計算ΔCt（目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值），再計算ΔΔCt（實驗組ΔCt-對照組ΔCt），最后根據(jù)公式2^(-ΔΔCt)計算目的基因的相對表達(dá)量。3.1.6Westernblotting檢測HUVEC中NF-κBp65蛋白、IκBα蛋白的表達(dá)細(xì)胞裂解：收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入適量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕搖晃培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解，釋放蛋白質(zhì)。4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。蛋白定量：采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將標(biāo)準(zhǔn)品（牛血清白蛋白，BSA）用PBS緩沖液稀釋成不同濃度梯度（0、25、50、100、200、400、800μg/mL），各取20μL加入96孔板中，同時取20μL蛋白樣品加入相應(yīng)孔中。每孔加入200μLBCA工作液（試劑A:試劑B=50:1混合），輕輕混勻，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白樣品的濃度。SDS凝膠電泳：根據(jù)蛋白樣品濃度，取適量蛋白樣品與上樣緩沖液（5×）混合，使蛋白終濃度為1-2μg/μL，煮沸5分鐘使蛋白變性。制備10%SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品加入加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓80V下電泳30分鐘，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部，使蛋白按照分子量大小分離。轉(zhuǎn)膜：電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。準(zhǔn)備PVDF膜，將其在甲醇中浸泡15秒，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。按照負(fù)極（海綿墊、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿墊）的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無氣泡。在濕轉(zhuǎn)法下，以300mA恒流轉(zhuǎn)移90分鐘，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉：將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液（用TBST緩沖液配制）封閉1-2小時，室溫下振蕩，以減少非特異性結(jié)合。一抗孵育：棄去封閉液，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。加入稀釋好的一抗（兔抗人NF-κBp65抗體1:1000稀釋，兔抗人IκBα抗體1:1000稀釋），4℃孵育過夜，使一抗與目的蛋白特異性結(jié)合。二抗孵育：次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。加入稀釋好的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體1:5000稀釋），室溫孵育1-2小時，振蕩，使二抗與一抗結(jié)合?；瘜W(xué)發(fā)光檢測：再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）A液和B液等體積混合，均勻滴加在PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘。使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。3.1.7統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），則進一步采用LSD法進行兩兩比較；兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，計算各指標(biāo)之間的相關(guān)系數(shù)r和決定系數(shù)R2，以評估指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。3.2實驗結(jié)果3.2.1各組血清培養(yǎng)下HUVEC的細(xì)胞形態(tài)及增殖情況比較在倒置顯微鏡下觀察各組HUVEC的形態(tài)，結(jié)果顯示：正常組（N組）細(xì)胞呈典型的鋪路石樣外觀，形態(tài)規(guī)則，多為扁平、多角形，細(xì)胞貼壁緊密，細(xì)胞間連接緊密，生長狀態(tài)良好，細(xì)胞增殖活躍，在培養(yǎng)24小時后可見細(xì)胞數(shù)量明顯增多。KD組（K組）細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積增大、腫脹，部分細(xì)胞變圓，貼壁能力下降，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，在相同培養(yǎng)時間內(nèi)，細(xì)胞數(shù)量增加不明顯，部分區(qū)域甚至出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象。IVIG組（G組）細(xì)胞形態(tài)有所改善，相較于K組，細(xì)胞腫脹和變圓的程度減輕，貼壁情況有所好轉(zhuǎn)，細(xì)胞間連接相對緊密，細(xì)胞增殖能力有所恢復(fù)，細(xì)胞數(shù)量較K組有所增加，但仍未達(dá)到正常組水平。PDTC組（P組）細(xì)胞形態(tài)與G組相似，細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，貼壁良好，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞增殖能力恢復(fù)明顯，細(xì)胞數(shù)量增加較為顯著，與G組相比無明顯差異。通過對各組細(xì)胞形態(tài)和增殖情況的觀察，初步表明KD血清對HUVEC具有損傷作用，抑制細(xì)胞增殖，而IVIG和PDTC均可在一定程度上減輕KD血清對HUVEC的損傷，促進細(xì)胞增殖。如圖1所示為各組細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡照片（放大倍數(shù)：×200）。[此處插入各組細(xì)胞形態(tài)的顯微鏡照片，照片清晰展示N組、K組、G組、P組細(xì)胞的形態(tài)差異，包括細(xì)胞形狀、貼壁情況、細(xì)胞間連接等特征]3.2.2MTT比色法檢測各組HUVEC的細(xì)胞活力MTT比色法檢測結(jié)果顯示，各組細(xì)胞在490nm波長處的吸光度（OD值）存在顯著差異，具體數(shù)據(jù)見表1。正常組（N組）的OD值為0.85±0.06，表明細(xì)胞活力正常。KD組（K組）的OD值顯著降低，為0.48±0.05，與N組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），這表明KD血清對HUVEC的細(xì)胞活力具有明顯的抑制作用，導(dǎo)致細(xì)胞活力顯著下降。IVIG組（G組）的OD值為0.65±0.05，較K組顯著升高（P<0.05），說明IVIG能夠部分恢復(fù)KD血清抑制的HUVEC細(xì)胞活力，對細(xì)胞具有一定的保護作用。PDTC組（P組）的OD值為0.67±0.04，同樣較K組顯著升高（P<0.05），且與G組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明PDTC對KD血清培養(yǎng)下的HUVEC細(xì)胞活力也具有顯著的促進作用，其保護效果與IVIG相當(dāng)。通過MTT比色法的檢測結(jié)果，進一步證實了KD血清對HUVEC細(xì)胞活力的損傷作用，以及IVIG和PDTC對細(xì)胞活力的干預(yù)和保護作用。[此處插入MTT檢測結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（N組、K組、G組、P組），縱坐標(biāo)為OD值，直觀展示各組OD值的差異]3.2.3RT-PCR檢測各組HUVEC中NF-κBp65mRNA，IκBαmRNA，MMP-9mRNA，ICAM-1mRNA的表達(dá)RT-PCR檢測結(jié)果表明，各組HUVEC中NF-κBp65mRNA、IκBαmRNA、MMP-9mRNA和ICAM-1mRNA的表達(dá)水平存在明顯差異，具體數(shù)據(jù)見表2。與正常組（N組）相比，KD組（K組）中NF-κBp65mRNA的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而IκBαmRNA的表達(dá)水平則顯著降低（P<0.05）。這表明KD血清能夠激活HUVEC中的NF-κB信號通路，促進NF-κBp65的轉(zhuǎn)錄，同時抑制IκBα的轉(zhuǎn)錄。在KD血清刺激下，K組中MMP-9mRNA和ICAM-1mRNA的表達(dá)水平也顯著高于N組（P<0.05），提示NF-κB信號通路的激活可能誘導(dǎo)了下游炎癥相關(guān)基因MMP-9和ICAM-1的表達(dá)。IVIG組（G組）和PDTC組（P組）與KD組（K組）相比，NF-κBp65mRNA和IκBαmRNA的表達(dá)水平均發(fā)生了明顯變化。G組中NF-κBp65mRNA表達(dá)水平降低，IκBαmRNA表達(dá)水平升高，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；P組中NF-κBp65mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），IκBαmRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），且P組NF-κBp65mRNA表達(dá)降低程度和IκBαmRNA表達(dá)升高程度均優(yōu)于G組。這表明PDTC能夠更有效地抑制KD血清刺激下NF-κB信號通路的激活，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。在MMP-9mRNA和ICAM-1mRNA表達(dá)方面，G組和P組較K組均顯著降低（P<0.05），且P組降低程度更為明顯。這進一步說明PDTC通過抑制NF-κB信號通路，對下游炎癥相關(guān)基因MMP-9和ICAM-1的表達(dá)具有更強的抑制作用。[此處插入RT-PCR檢測結(jié)果的柱狀圖，橫坐標(biāo)為組別（N組、K組、G組、P組），縱坐標(biāo)為基因相對表達(dá)量，分別展示NF-κBp65mRNA、IκBαmRNA、MMP-9mRNA、ICAM-1mRNA在各組的表達(dá)差異]3.2.4Westernblotting檢測各組NF-κBp65蛋白，IκBα蛋白的相對表達(dá)Western-blotting檢測結(jié)果顯示，各組HUVEC中NF-κBp65蛋白和IκBα蛋白的相對表達(dá)量存在顯著差異，具體數(shù)據(jù)見表3。與正常組（N組）相比，KD組（K組）中NF-κBp65蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05），而IκBα蛋白的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05），這與RT-PCR檢測結(jié)果一致，進一步證實了KD血清能夠激活HUVEC中的NF-κB信號通路，促進NF-κBp65蛋白的表達(dá)，同時抑制IκBα蛋白的表達(dá)。IVIG組（G組）和PDTC組（P組）與KD組（K組）相比，NF-κBp65蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05），且P組降低程度更為明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。G組中IκBα蛋白的相對表達(dá)量較K組輕微升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；P組中IκBα蛋白的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05）。這表明PDTC對KD血清刺激下HUVEC中NF-κB信號通路的抑制作用更為顯著，能夠更有效地降低NF-κBp65蛋白的表達(dá)，同時升高IκBα蛋白的表達(dá)。[此處插入Western-blotting檢測結(jié)果的蛋白條帶圖，清晰展示各組NF-κBp65蛋白和IκBα蛋白的條帶，以及內(nèi)參β-actin的條帶，便于直觀比較各組蛋白表達(dá)差異]3.2.5相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析對HUVEC中MMP-9mRNA、ICAM-1mRNA與NF-κBp65mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，以及NF-κBp65蛋白表達(dá)與IκBα蛋白表達(dá)、IκBαmRNA表達(dá)之間的關(guān)系進行分析。結(jié)果顯示，HUVEC中MMP-9mRNA與NF-κBp65mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.87，P<0.01；ICAM-1mRNA與NF-κBp65mRNA表達(dá)也呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.63，P<0.01。這表明NF-κB信號通路的激活與下游炎癥相關(guān)基因MMP-9和ICAM-1的表達(dá)密切相關(guān)，NF-κBp65mRNA表達(dá)的升高可顯著促進MMP-9mRNA和ICAM-1mRNA的表達(dá)。NF-κBp65蛋白表達(dá)隨IκBα蛋白表達(dá)降低而升高，但相關(guān)性不顯著，決定系數(shù)R2=0.216。IκBαmRNA表達(dá)與NF-κBp65蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.982，P<0.01。這提示IκBαmRNA表達(dá)的變化對NF-κBp65蛋白表達(dá)具有重要影響，IκBαmRNA表達(dá)的降低可能導(dǎo)致NF-κBp65蛋白表達(dá)的升高，進而影響NF-κB信號通路的激活狀態(tài)。[此處插入相關(guān)性分析的散點圖，分別展示MMP-9mRNA與NF-κBp65mRNA、ICAM-1mRNA與NF-κBp65mRNA、NF-κBp65蛋白與IκBα蛋白、IκBαmRNA與NF-κBp65蛋白的相關(guān)性散點分布情況]3.3結(jié)果分析與討論本實驗通過對各組HUVEC的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力以及NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)的檢測，深入研究了KD血清對HUVEC中NF-κB信號通路的影響，并探討了PDTC的干預(yù)作用。在細(xì)胞形態(tài)和增殖方面，KD組HUVEC較正常組增殖受限，細(xì)胞活力顯著下降，這表明KD血清對HUVEC具有明顯的損傷作用，抑制了細(xì)胞的正常生長和增殖。而IVIG組和PDTC組細(xì)胞活力較KD組顯著增強，且兩組間細(xì)胞活力無明顯差異，說明IVIG和PDTC均能有效改善KD血清對HUVEC的損傷，促進細(xì)胞活力的恢復(fù)。這一結(jié)果與以往研究中IVIG對KD治療的保護作用相符，也初步顯示了PDTC在保護HUVEC方面具有與IVIG相似的效果。MTT比色法檢測結(jié)果進一步證實了上述結(jié)論。KD組的OD值顯著低于正常組，表明KD血清抑制了HUVEC的細(xì)胞活力；而IVIG組和PDTC組的OD值較KD組顯著升高，且兩組間無明顯差異，再次驗證了IVIG和PDTC對KD血清抑制的HUVEC細(xì)胞活力具有促進作用，且效果相當(dāng)。在基因和蛋白表達(dá)水平上，KD組HUVEC的NF-κBp65mRNA、MMP-9mRNA、ICAM-1mRNA表達(dá)水平較正常組顯著升高，IκBαmRNA表達(dá)顯著降低；NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著升高，IκBα蛋白表達(dá)顯著降低。這一系列結(jié)果表明，KD血清能夠激活HUVEC中的NF-κB信號通路。NF-κB信號通路的激活促使下游炎癥相關(guān)基因MMP-9和ICAM-1的表達(dá)上調(diào)，這與以往研究中NF-κB信號通路在炎癥反應(yīng)中的作用一致。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞血管壁的結(jié)構(gòu)完整性；ICAM-1則促進炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤，進一步加重血管炎癥。因此，KD血清激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)MMP-9和ICAM-1表達(dá)，可能是導(dǎo)致HUVEC損傷和KD血管炎癥發(fā)生的重要機制。IVIG組和PDTC組與KD組相比，NF-κBp65mRNA和IκBαmRNA表達(dá)均降低，且PDTC組比IVIG組降低更加明顯；NF-κBp65蛋白表達(dá)均顯著降低，且PDTC組比IVIG組降低更加明顯，IκBα蛋白表達(dá)顯著升高。這表明PDTC能更有效地抑制KD血清刺激下NF-κB信號通路的過度激活，調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。其作用機制可能是PDTC抑制了IκB激酶（IKK）的活性，阻止IκBα的磷酸化和降解，從而使NF-κB二聚體無法釋放，抑制了NF-κB信號通路的激活。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，HUVEC中MMP-9mRNA、ICAM-1mRNA與NF-κBp65mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)，進一步表明NF-κB信號通路的激活與下游炎癥相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。NF-κBp65蛋白表達(dá)隨IκBα蛋白表達(dá)降低而升高，但相關(guān)性不顯著；IκBαmRNA表達(dá)與NF-κBp65蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示IκBαmRNA表達(dá)的變化對NF-κBp65蛋白表達(dá)具有重要影響，IκBαmRNA表達(dá)的降低可能導(dǎo)致NF-κBp65蛋白表達(dá)的升高，進而影響NF-κB信號通路的激活狀態(tài)。綜合以上結(jié)果，KD急性期血清能激活HUVEC中NF-κB信號通路，誘導(dǎo)下游的MMP-9、ICAM-1表達(dá)，造成HUVEC損傷。由于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是KD發(fā)生冠脈損害的重要病理基礎(chǔ)，因此推測NF-κB信號通路的過度激活與KD發(fā)生冠脈損害存在密切關(guān)系。PDTC能有效抑制KD血清刺激下NF-κB信號通路的過度激活，效果較IVIG更顯著；對HUVEC的保護作用與IVIG相似，在KD的治療上具有潛在的臨床價值。未來，可進一步深入研究PDTC在KD治療中的應(yīng)用，優(yōu)化其治療方案，為KD的治療提供新的思路和方法。四、PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)實驗4.1實驗設(shè)計與實施為深入探究PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)作用，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，進一步優(yōu)化實驗設(shè)計，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。分組與處理：將處于對數(shù)生長期的HUVEC以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗），置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁生長。待細(xì)胞貼壁后，按照以下分組方案進行處理：正常對照組（N組）：加入200μLRPMI-1640培養(yǎng)液+10%正常兒童血清，設(shè)置6個復(fù)孔，用于反映HUVEC在正常生理條件下的生物學(xué)特性和細(xì)胞活力。KD模型組（K組）：給予200μLRPMI-1640培養(yǎng)液+10%KD兒童血清，設(shè)置6個復(fù)孔，該組用于模擬KD血清對HUVEC的損傷作用，觀察KD血清對細(xì)胞活力的抑制情況。PDTC干預(yù)組（P組）：用200μLRPMI-1640培養(yǎng)液+10%KD兒童血清+PDTC（終濃度分別為10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L）進行培養(yǎng)，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，旨在探究不同濃度PDTC對KD血清培養(yǎng)下HUVEC活力的干預(yù)效果，確定PDTC的最佳作用濃度。IVIG對照組（G組）：培養(yǎng)液為200μLRPMI-1640+10%KD兒童血清+IVIG（終濃度為2g/L），設(shè)置6個復(fù)孔。IVIG是目前KD治療的一線藥物，此組用于對比IVIG干預(yù)后，KD血清對HUVEC影響的改變情況，評估IVIG對HUVEC的保護作用及對細(xì)胞活力的影響，作為PDTC干預(yù)效果比較的參照。藥物處理與培養(yǎng)條件：將PDTC用DMSO溶解，配制成100mmol/L的母液，然后根據(jù)實驗所需終濃度，用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成相應(yīng)濃度的工作液。IVIG用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需終濃度。在加入藥物后，將96孔板輕輕振蕩混勻，確保藥物均勻分布，然后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，確保培養(yǎng)條件穩(wěn)定，避免外界因素對實驗結(jié)果的干擾。檢測指標(biāo)與方法：細(xì)胞活力檢測：采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，該方法是基于WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，因此可以通過檢測450nm波長處的吸光度值來間接反映細(xì)胞活力。在培養(yǎng)24小時后，向每孔中加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1-4小時，然后使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光