川芎嗪抗胃癌作用中ROS/AMPK介導(dǎo)凋亡通路的深度解析與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景胃癌是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率均位居前列，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。在我國，胃癌同樣是高發(fā)疾病，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中名列前茅。由于胃癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，極大地增加了治療難度，整體預(yù)后不佳。目前，化療是胃癌的主要治療手段之一。然而，現(xiàn)有的化療藥物存在諸多問題，如副作用大，會(huì)對患者的身體機(jī)能造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者在治療過程中承受巨大痛苦；化療耐藥現(xiàn)象也較為普遍，使得部分患者對化療藥物的反應(yīng)不佳，治療效果大打折扣。這些問題嚴(yán)重限制了化療在胃癌治療中的應(yīng)用，也促使科研人員不斷尋找新的治療方法和藥物。川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMPZ）是從傳統(tǒng)中藥川芎中提取的一種生物堿單體。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，川芎嗪主要用于改善微循環(huán)、抗氧化應(yīng)激等方面。近年來，隨著對天然藥物抗腫瘤作用研究的不斷深入，川芎嗪在抗腫瘤治療領(lǐng)域逐漸成為研究熱點(diǎn)。已有研究表明，川芎嗪能夠逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性，這為其在胃癌治療中的應(yīng)用提供了新的思路。但川芎嗪本身是否具有抗胃癌作用以及其具體作用機(jī)制，目前仍缺乏深入研究和明確結(jié)論。因此，深入探究川芎嗪抗胃癌的作用及機(jī)制，具有重要的理論和實(shí)踐意義。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，對于維持組織穩(wěn)態(tài)和器官功能至關(guān)重要。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞凋亡失調(diào)是一個(gè)關(guān)鍵因素，腫瘤細(xì)胞往往能夠逃避凋亡，從而得以持續(xù)增殖和存活。而活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）和AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedproteinkinase，AMPK）在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。ROS作為細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)分子，可通過多種途徑激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高時(shí)，會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化修飾等，進(jìn)而激活凋亡相關(guān)蛋白，如Caspase蛋白家族，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。AMPK則是細(xì)胞內(nèi)的“能量調(diào)節(jié)器”，在能量缺乏時(shí)被激活，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一系列代謝途徑，維持細(xì)胞的能量平衡。同時(shí)，AMPK的激活也與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，它可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員等凋亡相關(guān)蛋白的活性，影響線粒體膜電位，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在眾多腫瘤研究中，ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療反應(yīng)密切相關(guān)。然而，在川芎嗪抗胃癌作用中，ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路是否發(fā)揮作用以及如何發(fā)揮作用，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。鑒于此，深入研究ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路在川芎嗪抗胃癌作用中的機(jī)制，不僅有助于揭示川芎嗪抗胃癌的內(nèi)在分子機(jī)制，為川芎嗪在胃癌治療中的臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)，還可能為胃癌的治療開辟新的途徑，具有重要的科學(xué)研究價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路在川芎嗪抗胃癌作用中的具體機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，全面分析川芎嗪對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以及對ROS/AMPK信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)作用。明確川芎嗪是否通過激活ROS/AMPK凋亡通路，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗胃癌作用。進(jìn)一步揭示該通路中關(guān)鍵分子在川芎嗪抗胃癌過程中的相互作用關(guān)系，為闡明川芎嗪抗胃癌的分子機(jī)制提供詳細(xì)的理論依據(jù)。本研究具有重要的理論意義。一方面，有助于深入了解川芎嗪這一天然藥物單體的抗胃癌作用機(jī)制，豐富和拓展天然藥物抗腫瘤的理論研究領(lǐng)域，為后續(xù)深入研究川芎嗪及其他天然藥物的抗腫瘤作用提供新的思路和方法。另一方面，對ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路在川芎嗪抗胃癌中的作用研究，將進(jìn)一步完善細(xì)胞凋亡信號(hào)通路與腫瘤治療的理論體系，為理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以及腫瘤治療靶點(diǎn)的篩選提供更深入的認(rèn)識(shí)。從臨床應(yīng)用角度來看，本研究意義重大。目前胃癌的治療面臨諸多困境，化療藥物的副作用和耐藥性問題嚴(yán)重影響患者的治療效果和生活質(zhì)量。若能明確川芎嗪通過ROS/AMPK凋亡通路發(fā)揮抗胃癌作用，不僅為川芎嗪作為一種潛在的抗胃癌藥物應(yīng)用于臨床提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，還可能為胃癌的治療提供新的藥物選擇和治療策略，有望降低化療藥物的使用劑量和副作用，提高患者對治療的耐受性和依從性，改善胃癌患者的預(yù)后和生活質(zhì)量，為胃癌患者帶來新的希望。同時(shí)，對該通路的研究也可能為開發(fā)基于ROS/AMPK信號(hào)通路的新型靶向治療藥物提供理論指導(dǎo)，推動(dòng)胃癌治療領(lǐng)域的創(chuàng)新發(fā)展。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究將運(yùn)用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及分子生物學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞和動(dòng)物水平深入探究川芎嗪對胃癌細(xì)胞的作用及機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選用人胃癌細(xì)胞系，如SGC-7901、MKN45等細(xì)胞株。首先，采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測不同濃度川芎嗪作用于胃癌細(xì)胞不同時(shí)間后的增殖情況，繪制細(xì)胞生長曲線，明確川芎嗪對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用及量效、時(shí)效關(guān)系。利用流式細(xì)胞術(shù)，通過AnnexinV-FITC/PI雙染法，精確檢測川芎嗪處理后胃癌細(xì)胞的凋亡率，分析其對細(xì)胞凋亡的影響。使用DCFH-DA探針標(biāo)記細(xì)胞，借助流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡，檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，以了解川芎嗪對胃癌細(xì)胞ROS生成的影響。運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測AMPK及其下游相關(guān)蛋白，如p-AMPK、Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3等的表達(dá)水平，探究川芎嗪對ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)蛋白的調(diào)控作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建人胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。將對數(shù)生長期的胃癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤體積達(dá)到一定大小時(shí)，隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)組給予不同劑量的川芎嗪腹腔注射，對照組給予等量的生理鹽水。定期測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察川芎嗪對移植瘤生長的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。采用免疫組織化學(xué)染色法，檢測腫瘤組織中p-AMPK、Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3等蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證川芎嗪在體內(nèi)對ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路的影響。分子生物學(xué)技術(shù)方面，運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成針對AMPK基因的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，沉默AMPK基因的表達(dá)。然后，在川芎嗪處理下，檢測細(xì)胞增殖、凋亡以及ROS水平和相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，明確AMPK在川芎嗪抗胃癌作用中的關(guān)鍵作用。利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）技術(shù)，檢測相關(guān)基因，如AMPK、Bcl-2、Bax等的mRNA表達(dá)水平，從基因?qū)用娣治龃ㄜ亨簩OS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路的調(diào)控機(jī)制。本研究的技術(shù)路線為：首先進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，篩選出對胃癌細(xì)胞增殖和凋亡有顯著影響的川芎嗪濃度和作用時(shí)間，同時(shí)檢測相關(guān)指標(biāo)，初步探究其作用機(jī)制；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建動(dòng)物模型，驗(yàn)證川芎嗪在體內(nèi)的抗胃癌作用及對相關(guān)通路的影響；最后，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)一步深入探討AMPK在川芎嗪抗胃癌作用中的關(guān)鍵作用及相關(guān)基因的表達(dá)變化，全面揭示ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路在川芎嗪抗胃癌作用中的機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌是一種起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一。在全球范圍內(nèi)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均處于較高水平。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌新發(fā)病例約108.9萬例，占全部惡性腫瘤新發(fā)病例的5.6%，位居全球第五；死亡病例約76.9萬例，占全部惡性腫瘤死亡病例的7.7%，位居全球第四。在我國，胃癌同樣是嚴(yán)重威脅人民健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中名列前茅。由于胃癌早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生轉(zhuǎn)移，極大地增加了治療難度，整體預(yù)后不佳。從病理類型來看，胃癌主要包括腺癌、腺鱗癌、鱗癌、未分化癌等，其中腺癌最為常見，約占胃癌的90%以上。腺癌又可進(jìn)一步分為乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、印戒細(xì)胞癌等不同亞型，不同亞型的胃癌在生物學(xué)行為、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面存在一定差異。胃癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果。環(huán)境和飲食因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。長期食用霉變食物、咸菜、腌制或熏制食物、辛辣刺激食物以及過多攝入高鹽食品等，都可能增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，多吃新鮮的水果和蔬菜則有助于降低胃癌的發(fā)生幾率。幽門螺旋桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。Hp感染可引發(fā)慢性炎癥，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞損傷，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。遺傳因素也是胃癌發(fā)病的重要原因之一，家族中有胃癌患者的人群，其發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對較高，這可能與家族成員共有的遺傳易感性以及相似的生活環(huán)境和飲食習(xí)慣等因素有關(guān)。此外，癌前病變?nèi)缥赶⑷?、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍等，若長期不愈，也有較高的癌變風(fēng)險(xiǎn)。2.2川芎嗪的研究進(jìn)展川芎嗪，化學(xué)名稱為四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TMPZ），是從傳統(tǒng)中藥川芎（LigusticumchuanxiongHort.）的根莖中提取分離得到的一種生物堿單體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為1,2,3,5-四甲基-吡嗪，是一種無色針狀結(jié)晶，具有特殊異臭，易溶于水、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，賦予了川芎嗪多種藥理活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在藥理作用方面，川芎嗪具有多方面的顯著功效。它能夠有效抑制血小板聚集，通過調(diào)節(jié)血栓素A2/前列腺素I2平衡、影響磷酸酯酶活性等機(jī)制，降低血小板聚集指數(shù)，增加血流量，從而改善微循環(huán)，在預(yù)防和治療血栓性疾病方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。川芎嗪具有鈣拮抗作用，可直接作用于鈣通道，拮抗Ca2+內(nèi)流，產(chǎn)生負(fù)性肌力、負(fù)性變時(shí)的作用，不僅對平滑肌有效，對心血管系統(tǒng)及神經(jīng)細(xì)胞也均有作用，能夠預(yù)防鈣超載，對心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用。在清除自由基方面，川芎嗪能通過降低體內(nèi)血脂過氧化、影響血液超氧化物歧化酶的含量等方式，有效清除體內(nèi)自由基，預(yù)防腦缺血再灌注損傷，減輕氧化應(yīng)激對機(jī)體的損害。此外，川芎嗪還具有擴(kuò)張血管、增加冠脈流量、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放活性物質(zhì)、提高心肌收縮、降低血壓等心血管保護(hù)作用，以及增加腎流量、利尿、抑制胃運(yùn)動(dòng)來對抗應(yīng)激性胃潰瘍等作用，在治療心血管疾病、腎臟疾病以及消化系統(tǒng)疾病等方面具有一定的應(yīng)用潛力。近年來，川芎嗪的抗腫瘤作用逐漸成為研究熱點(diǎn)。已有研究表明，川芎嗪對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。在乳腺癌細(xì)胞研究中，川芎嗪能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，川芎嗪可降低肺癌細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞研究中，川芎嗪能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。在胃癌治療領(lǐng)域，川芎嗪的研究也取得了一定進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞的多藥耐藥性，通過抑制P-糖蛋白（P-gp）等耐藥蛋白的表達(dá)和功能，增加化療藥物在胃癌細(xì)胞內(nèi)的蓄積，從而提高化療藥物對胃癌細(xì)胞的殺傷作用。還有研究表明，川芎嗪可能通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的能量代謝，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。通過抑制胃癌細(xì)胞的有氧糖酵解，降低細(xì)胞內(nèi)ATP水平，影響腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。然而，目前關(guān)于川芎嗪抗胃癌作用的研究仍相對較少，其具體的作用機(jī)制尚未完全明確，尤其是在ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路方面，尚未見相關(guān)研究報(bào)道，這為進(jìn)一步深入研究川芎嗪抗胃癌的作用機(jī)制提供了廣闊的空間。2.3ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)理論2.3.1ROS的產(chǎn)生與作用活性氧（ROS）是一類含有氧原子且具有較高化學(xué)反應(yīng)活性的物質(zhì)，主要包括超氧陰離子（O_2^-）、過氧化氫（H_2O_2）、羥自由基（·OH）、單線態(tài)氧（^1O_2）等。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，對維持細(xì)胞正常的生理功能具有重要意義。ROS的產(chǎn)生途徑較為復(fù)雜，主要包括線粒體呼吸鏈異常、酶促反應(yīng)等。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的中心，也是ROS產(chǎn)生的主要場所。在線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈中，電子傳遞過程中會(huì)有部分電子漏出，直接傳遞給氧氣分子，從而產(chǎn)生超氧陰離子。具體來說，線粒體呼吸鏈中的復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ是超氧陰離子產(chǎn)生的主要部位。當(dāng)線粒體受到損傷、呼吸鏈功能異?；蚣?xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，電子傳遞受阻，電子漏出增加，導(dǎo)致ROS生成顯著增多。例如，在缺血再灌注損傷過程中，線粒體功能受損，呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅲ的活性改變，使得ROS大量產(chǎn)生，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激損傷。酶促反應(yīng)也是ROS產(chǎn)生的重要途徑之一。NADPH氧化酶（NOX）家族是一類重要的非線粒體ROS生成酶。NOX家族成員廣泛分布于各種細(xì)胞中，其催化亞基可在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。在不同組織中已鑒定出6種NOX-2的同系物，包括NOX1、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1和DUOX2，它們統(tǒng)稱為NOX家族蛋白。這些酶能通過質(zhì)傳遞電子產(chǎn)生ROS，在吞噬細(xì)胞中含量豐富，參與免疫防御過程中的氧化爆發(fā)，產(chǎn)生大量ROS以殺滅病原體。在其他各種組織細(xì)胞中，NOX家族蛋白也以較低水平普遍存在，參與膜受體下游信號(hào)激活。黃嘌呤氧化酶、細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)等也能通過酶促反應(yīng)產(chǎn)生活性氧。ROS在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和凋亡中具有雙重作用。在低濃度時(shí)，ROS作為重要的信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種生理過程。它可以激活多種下游信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路等。通過誘導(dǎo)蛋白磷酸化、乙酰化等修飾，ROS參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移等生命過程。在細(xì)胞增殖過程中，適量的ROS可以激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs），促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而推動(dòng)細(xì)胞增殖。在細(xì)胞分化過程中，ROS可以調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，影響基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞向特定方向分化。當(dāng)ROS濃度過高時(shí)，會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能造成嚴(yán)重?fù)p害，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，ROS會(huì)攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。ROS可使DNA發(fā)生氧化損傷，導(dǎo)致堿基突變、DNA鏈斷裂等，影響基因的正常表達(dá)和復(fù)制。蛋白質(zhì)被ROS氧化修飾后，其結(jié)構(gòu)和功能會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶活性喪失、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常等。脂質(zhì)過氧化是ROS對細(xì)胞膜損傷的主要方式，會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞功能。ROS還能激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。它可以直接或間接影響B(tài)cl-2家族成員的活性，調(diào)控線粒體膜電位。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。當(dāng)ROS水平升高時(shí)，可促使Bax、Bak等促凋亡蛋白激活并轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、dATP結(jié)合形成凋亡小體，招募并激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，如激活Caspase-3、Caspase-7等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2.3.2AMPK的結(jié)構(gòu)、功能與激活機(jī)制AMP激活的蛋白激酶（AMPK）是一種在細(xì)胞能量代謝調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的蛋白激酶，廣泛存在于從酵母到哺乳動(dòng)物的真核細(xì)胞生物中。AMPK是一種異源三聚體復(fù)合物，由一個(gè)α催化亞基、一個(gè)β調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)γ調(diào)節(jié)亞基組成。在人類和嚙齒動(dòng)物中，分別由不同的基因表達(dá)兩種亞型的α亞基（α1、α2）和β亞基（β1、β2），以及三種亞型的γ亞基（γ1、γ2、γ3）。α亞基的N-末端包含一個(gè)保守的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶區(qū)，其中蘇氨酸（Thr-172）位點(diǎn)的磷酸化是其激酶活性所必需的。當(dāng)Thr-172位點(diǎn)被磷酸化后，AMPK被激活，從而能夠發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。α亞基還包括一個(gè)自抑制區(qū)和一個(gè)與β亞基和γ亞基結(jié)合的區(qū)域，自抑制區(qū)可以調(diào)節(jié)α亞基的活性，防止其過度激活。β亞基在結(jié)構(gòu)上與α亞基有一定相似性，其包含兩個(gè)保守區(qū)域，一個(gè)是中間的糖原結(jié)合區(qū)，另一個(gè)是C-末端與其他兩個(gè)亞基的結(jié)合區(qū)。糖原結(jié)合區(qū)使得AMPK能夠與細(xì)胞內(nèi)的糖原相互作用，參與糖原代謝的調(diào)節(jié)。γ亞基含有四個(gè)胱硫醚-β-合酶（CBS）串聯(lián)重復(fù)序列，組成兩個(gè)貝特曼結(jié)構(gòu)域（Batemandomains），每個(gè)貝特曼結(jié)構(gòu)域能結(jié)合一個(gè)AMP或者ATP。γ亞基通過結(jié)合AMP或ATP來感知細(xì)胞內(nèi)的能量狀態(tài)變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)AMPK的活性。AMPK在能量代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)的“能量調(diào)節(jié)器”。當(dāng)細(xì)胞處于能量缺乏狀態(tài)時(shí)，如葡萄糖、氧氣缺乏，或受到藥物處理導(dǎo)致細(xì)胞呼吸鏈抑制、ATP合成抑制，以及ATP消耗增加（如肌肉運(yùn)動(dòng)）等情況時(shí)，細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷（ATP）水平降低，單磷酸腺苷（AMP）/ATP、二磷酸腺苷（ADP）/ATP比值增加，AMPK被激活。激活后的AMPK通過調(diào)節(jié)一系列下游分子和代謝途徑，重新調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，以維持細(xì)胞的能量平衡。在脂質(zhì)代謝方面，AMPK激活后可刺激肝臟脂肪酸氧化，抑制膽固醇合成、脂肪生成和甘油三酯合成，同時(shí)刺激骨骼肌脂肪酸氧化，在脂肪細(xì)胞中抑制脂肪生成并促進(jìn)脂肪分解。在葡萄糖代謝中，AMPK能夠刺激肝臟和骨骼肌中的糖酵解過程，促進(jìn)葡萄糖攝取和利用，同時(shí)抑制肝臟糖異生，減少葡萄糖輸出，從而維持血糖水平的穩(wěn)定。AMPK還參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝、自噬、線粒體和溶酶體穩(wěn)態(tài)等過程，對細(xì)胞的生存和功能維持至關(guān)重要。AMPK的激活機(jī)制主要包括以下兩種途徑。一是通過細(xì)胞能量狀態(tài)變化激活，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，AMP/ATP、ADP/ATP比值升高時(shí)，AMP結(jié)合到AMPK的γ亞基上，引起AMPK構(gòu)象改變，暴露出α亞基上的Thr-172位點(diǎn)，使其更容易被上游激酶磷酸化激活。主要的上游激酶包括肝激酶B1（LKB1）和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶激酶2（CaMKK2）。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，LKB1與STRAD和MO25組成異源三聚體，當(dāng)細(xì)胞能量狀態(tài)變化時(shí)，LKB1被激活，進(jìn)而磷酸化AMPK的α亞基Thr-172位點(diǎn)，激活A(yù)MPK。在某些細(xì)胞中，如神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加時(shí)，CaMKK2被激活，可直接磷酸化AMPK的α亞基Thr-172位點(diǎn)，使其激活。二是通過一些激素、生長因子和藥物等激活，如二甲雙胍、AICAR（5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-β-D-核糖核苷酸）等藥物可以激活A(yù)MPK。二甲雙胍的作用機(jī)制較為復(fù)雜，近年來研究發(fā)現(xiàn)，臨床相關(guān)濃度的二甲雙胍可結(jié)合γ分泌酶復(fù)合物中的早老素增強(qiáng)子2（PEN2）蛋白，再結(jié)合ATP6AP1蛋白募集到溶酶體空泡型ATP酶復(fù)合物上，導(dǎo)致空泡型ATP酶變構(gòu)，便于LKB1募集到溶酶體，接觸并激活A(yù)MPK，這一途徑被稱為二甲雙胍激活A(yù)MPK的溶酶體途徑，不依賴于AMP。2.3.3ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路機(jī)制在細(xì)胞內(nèi)，ROS積累與AMPK激活之間存在密切的關(guān)聯(lián)，二者共同參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程，形成了ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或處于病理狀態(tài)時(shí)，如氧化應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、化療藥物作用等，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。過量的ROS可通過多種途徑激活A(yù)MPK。一方面，ROS可以直接氧化修飾AMPK的亞基或相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，影響其活性和功能，從而間接激活A(yù)MPK。研究發(fā)現(xiàn)，ROS可使AMPK的α亞基發(fā)生氧化修飾，改變其構(gòu)象，增強(qiáng)其與上游激酶的相互作用，促進(jìn)AMPK的激活。另一方面，ROS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，會(huì)使ATP水平下降，AMP/ATP比值升高，進(jìn)而通過細(xì)胞能量狀態(tài)變化途徑激活A(yù)MPK，這是ROS激活A(yù)MPK的主要方式之一。激活后的AMPK通過調(diào)節(jié)下游分子，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在眾多下游分子中，Bcl-2家族是AMPK調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要靶點(diǎn)之一。Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用，抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-xl等能夠抑制細(xì)胞凋亡，而促凋亡成員如Bax、Bak等則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。AMPK激活后，可通過磷酸化作用調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的活性。有研究表明，AMPK可以磷酸化Bcl-2蛋白，使其抗凋亡能力減弱，同時(shí)促進(jìn)Bax蛋白的激活和轉(zhuǎn)位到線粒體膜上。Bax在線粒體膜上形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)。AMPK還可以通過調(diào)節(jié)Caspase級聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Caspase是一類半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起核心作用，分為啟動(dòng)型Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）和執(zhí)行型Caspase（如Caspase-3、Caspase-7等）。AMPK激活后，可通過多種途徑影響Caspase的活性。AMPK可以調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)信號(hào)通路中其他蛋白的表達(dá)和活性，間接影響Caspase的激活。在某些腫瘤細(xì)胞中，AMPK激活后可上調(diào)p53蛋白的表達(dá)，p53蛋白進(jìn)而誘導(dǎo)Bax表達(dá)增加，同時(shí)抑制Bcl-2表達(dá)，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。AMPK還可能直接作用于Caspase蛋白，調(diào)節(jié)其活性，但具體機(jī)制尚不完全清楚，有待進(jìn)一步深入研究。ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療中具有重要意義。在腫瘤細(xì)胞中，該通路的異常激活或抑制與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、耐藥等密切相關(guān)。一些化療藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS積累，激活A(yù)MPK，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。而腫瘤細(xì)胞也可能通過調(diào)節(jié)該通路來逃避凋亡，產(chǎn)生化療耐藥。深入研究ROS/AMPK介導(dǎo)的凋亡通路機(jī)制，有助于揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。三、AMPK磷酸化激活狀態(tài)在胃癌組織中的表達(dá)3.1材料與方法3.1.1標(biāo)本來源收集[具體醫(yī)院名稱]在[具體時(shí)間段]內(nèi)進(jìn)行胃癌手術(shù)切除的患者標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)病理確診為胃癌，且術(shù)前未接受過放化療等抗腫瘤治療。共收集到[X]例胃癌組織標(biāo)本，同時(shí)選取距離腫瘤邊緣[X]cm以上的癌旁正常胃黏膜組織作為對照，共[X]例。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。在收集?biāo)本過程中，均獲得患者或其家屬的知情同意，并符合醫(yī)院倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。3.1.2主要試劑兔抗人p-AMPK多克隆抗體（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于特異性識(shí)別磷酸化的AMPK蛋白，其稀釋比例為1:100；鼠抗人GAPDH單克隆抗體（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，稀釋比例為1:5000；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于與一抗結(jié)合，通過酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，稀釋比例為1:2000；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），對應(yīng)于鼠抗人GAPDH抗體，稀釋比例為1:2000；免疫組化染色試劑盒（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），包含免疫組化染色所需的各種試劑，如封閉液、顯色劑等；DAB顯色試劑盒（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于免疫組化染色后的顯色反應(yīng)；RIPA裂解液（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于裂解細(xì)胞和組織，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于精確測定提取的總蛋白濃度；SDS凝膠制備試劑盒（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，用于蛋白質(zhì)的分離；PVDF膜（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合后，在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于檢測目的蛋白。3.1.3主要儀器石蠟切片機(jī)（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于將組織樣本切成厚度均勻的石蠟切片，切片厚度可精確調(diào)節(jié)，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性；顯微鏡（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），配備高分辨率的物鏡和目鏡，用于觀察免疫組化染色后的切片，能夠清晰呈現(xiàn)細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及抗原表達(dá)情況；恒溫孵育箱（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），可精確控制溫度，為免疫組化和Westernblot實(shí)驗(yàn)中的抗體孵育等步驟提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境；高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），具備高速離心能力和冷凍功能，能夠在低溫條件下快速分離細(xì)胞和組織裂解液中的各種成分，保證蛋白活性；電泳儀（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，可提供穩(wěn)定的電場強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離；轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），能夠?qū)⒛z中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固相化，以便后續(xù)的檢測；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（型號(hào)：[具體型號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于檢測ECL化學(xué)發(fā)光試劑產(chǎn)生的信號(hào)，通過高靈敏度的相機(jī)捕捉發(fā)光圖像，并進(jìn)行圖像分析，定量測定目的蛋白的表達(dá)水平。3.1.4免疫組化實(shí)驗(yàn)將保存于-80℃冰箱的組織標(biāo)本取出，進(jìn)行石蠟包埋。首先將組織標(biāo)本放入固定液中固定，使組織形態(tài)和結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定，防止蛋白質(zhì)降解和抗原性改變。固定后的組織經(jīng)過脫水處理，依次通過不同濃度的酒精溶液，去除組織中的水分。然后進(jìn)行透明處理，使用二甲苯等試劑使組織變得透明，便于石蠟的滲透。將透明后的組織放入融化的石蠟中進(jìn)行包埋，待石蠟?zāi)毯螅纬珊薪M織的石蠟塊。使用石蠟切片機(jī)將石蠟塊切成厚度為4μm的切片。將切片置于載玻片上，放入60℃恒溫烤箱中烘烤1小時(shí)，使切片牢固附著在載玻片上。將載玻片放入二甲苯中脫蠟，二甲苯能夠溶解石蠟，使組織暴露出來。然后依次通過不同濃度的酒精溶液進(jìn)行水化，將組織從無水狀態(tài)逐漸恢復(fù)到含水狀態(tài)，為后續(xù)的免疫組化反應(yīng)做好準(zhǔn)備。將水化后的切片放入3%過氧化氫溶液中孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避免其對后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，以去除過氧化氫溶液和其他雜質(zhì)。將切片放入抗原修復(fù)液中，根據(jù)抗原修復(fù)液的類型選擇合適的修復(fù)方法，如微波修復(fù)、高壓修復(fù)等?？乖迯?fù)的目的是暴露被掩蓋的抗原決定簇，提高抗原與抗體的結(jié)合能力。修復(fù)后自然冷卻至室溫，再用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘。在切片上滴加封閉液，將切片放入恒溫孵育箱中，37℃孵育30分鐘，封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景染色。倒掉封閉液，無需沖洗，直接在切片上滴加稀釋好的兔抗人p-AMPK多克隆抗體，4℃孵育過夜，使抗體與組織中的p-AMPK抗原充分結(jié)合。第二天取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的一抗。在切片上滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，37℃孵育30分鐘，二抗能夠與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物，通過HRP的酶促反應(yīng)放大信號(hào)。用PBS緩沖液沖洗切片3次，每次5分鐘，去除未結(jié)合的二抗。按照DAB顯色試劑盒的說明書，配制DAB顯色液，在切片上滴加適量的DAB顯色液，室溫下顯色3-10分鐘，根據(jù)顯色情況在顯微鏡下觀察，當(dāng)出現(xiàn)明顯的棕黃色陽性信號(hào)時(shí)，立即用蒸餾水沖洗切片，終止顯色反應(yīng)。將切片用蘇木精復(fù)染1分鐘，蘇木精能夠使細(xì)胞核染成藍(lán)色，便于觀察細(xì)胞形態(tài)。然后用鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍(lán)。經(jīng)過梯度酒精脫水、二甲苯透明后，用中性樹膠封片，制成永久切片。在顯微鏡下觀察，根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行結(jié)果判定。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度分為陰性（-）、弱陽性（+）、陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）四個(gè)等級。陰性表示無明顯染色；弱陽性表現(xiàn)為淺黃色染色；陽性為棕黃色染色；強(qiáng)陽性為深棕黃色染色。陽性細(xì)胞所占比例分為：陰性（陽性細(xì)胞數(shù)＜10%）、弱陽性（10%≤陽性細(xì)胞數(shù)＜30%）、陽性（30%≤陽性細(xì)胞數(shù)＜50%）和強(qiáng)陽性（陽性細(xì)胞數(shù)≥50%）。3.1.5Westernblot實(shí)驗(yàn)從-80℃冰箱中取出胃癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，在冰上用剪刀將組織剪碎，放入含有RIPA裂解液（含1%PMSF）的離心管中，充分裂解組織，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)釋放出來。將離心管放入高速冷凍離心機(jī)中，4℃，12000rpm離心15分鐘，去除組織碎片和其他雜質(zhì)，收集上清液，即得到總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定提取的總蛋白濃度。首先配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液和待測蛋白樣品分別加入96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，充分混勻。將96孔板放入37℃恒溫孵育箱中孵育30分鐘，使BCA試劑與蛋白充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按4:1的比例混合，煮沸5分鐘，使蛋白質(zhì)變性，便于在凝膠電泳中分離。制備10%的SDS凝膠，將變性后的蛋白樣品加入凝膠加樣孔中，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。接通電源，在恒壓80V條件下進(jìn)行電泳，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮，然后在恒壓120V條件下繼續(xù)電泳，使蛋白質(zhì)在分離膠中按照分子量大小進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠小心取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。準(zhǔn)備好PVDF膜，將其放入甲醇中浸泡15秒，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡15分鐘。按照“海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間無氣泡。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜儀中，在恒流300mA條件下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)，使凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜取出，放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫下?lián)u床振蕩孵育1小時(shí)，封閉PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景信號(hào)。將封閉后的PVDF膜放入兔抗人p-AMPK多克隆抗體（1:1000稀釋）和鼠抗人GAPDH單克隆抗體（1:5000稀釋）的混合液中，4℃孵育過夜，使抗體與膜上的相應(yīng)抗原結(jié)合。第二天取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀釋）和HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1:2000稀釋）的混合液中，室溫下?lián)u床振蕩孵育1小時(shí)，二抗與一抗特異性結(jié)合，形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物。用TBST緩沖液沖洗PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的二抗。將PVDF膜放入ECL化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1分鐘，使HRP催化ECL試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)。將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光，采集圖像。使用圖像分析軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算p-AMPK蛋白的相對表達(dá)量。3.1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。免疫組化結(jié)果中，p-AMPK蛋白表達(dá)的陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)，用于分析不同組之間陽性率的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Westernblot結(jié)果中，p-AMPK蛋白的相對表達(dá)量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，以明確具體差異所在。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果免疫組化染色結(jié)果顯示，在正常胃黏膜組織中，p-AMPK呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布于胃黏膜上皮細(xì)胞的胞漿和胞核中，染色強(qiáng)度多為陽性（++）或強(qiáng)陽性（+++），陽性細(xì)胞所占比例較高，平均陽性率達(dá)到[X]%。而在胃癌組織中，p-AMPK的表達(dá)明顯降低，陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度較弱，多為弱陽性（+）或陰性（-），陽性細(xì)胞所占比例顯著減少，平均陽性率僅為[X]%。通過對不同分化程度胃癌組織的分析發(fā)現(xiàn)，高分化胃癌組織中p-AMPK的陽性表達(dá)率為[X]%，中分化胃癌組織為[X]%，低分化胃癌組織為[X]%，隨著分化程度的降低，p-AMPK的陽性表達(dá)率逐漸下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在不同TNM分期的胃癌組織中，Ⅰ期胃癌組織p-AMPK陽性表達(dá)率為[X]%，Ⅱ期為[X]%，Ⅲ期為[X]%，Ⅳ期為[X]%，分期越晚，p-AMPK陽性表達(dá)率越低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，p-AMPK陽性表達(dá)率為[X]%，顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織（[X]%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化的發(fā)現(xiàn)。胃癌組織中p-AMPK蛋白的相對表達(dá)量為[X]±[X]，顯著低于癌旁正常組織的[X]±[X]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對不同臨床病理參數(shù)分組的胃癌組織進(jìn)行分析，結(jié)果與免疫組化一致。在不同分化程度分組中，高分化、中分化、低分化胃癌組織中p-AMPK蛋白相對表達(dá)量依次降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在不同TNM分期分組中，隨著分期的升高，p-AMPK蛋白相對表達(dá)量逐漸降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中p-AMPK蛋白相對表達(dá)量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜合免疫組化和Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明p-AMPK在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織，且其表達(dá)水平與胃癌的分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。分化程度越低、分期越晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，p-AMPK的表達(dá)水平越低。這提示p-AMPK的低表達(dá)可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，為進(jìn)一步研究其在川芎嗪抗胃癌作用中的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。3.3討論AMPK作為細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和生理功能方面發(fā)揮著不可或缺的作用。其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由α、β、γ三個(gè)亞基組成異源三聚體復(fù)合物。α亞基包含保守的激酶區(qū)，其中Thr-172位點(diǎn)的磷酸化是AMPK激活的關(guān)鍵，對其激酶活性的發(fā)揮至關(guān)重要；β亞基含有糖原結(jié)合區(qū)，這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得AMPK能夠與細(xì)胞內(nèi)的糖原相互作用，參與糖原代謝的精細(xì)調(diào)節(jié)；γ亞基則含有多個(gè)CBS結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合AMP或ATP，通過感知細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的變化，如ATP水平下降、AMP/ATP比值升高等，來調(diào)控AMPK的活性。在正常生理狀態(tài)下，AMPK廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中，尤其是在代謝活躍的組織，如肝臟、骨骼肌、脂肪組織等，發(fā)揮著重要的生理功能。在肝臟中，AMPK參與調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、糖異生和膽固醇合成等代謝過程，維持肝臟的正常代謝功能。當(dāng)肝臟細(xì)胞能量水平降低時(shí)，AMPK被激活，通過抑制乙酰輔酶A羧化酶的活性，減少脂肪酸合成，同時(shí)促進(jìn)脂肪酸氧化，為細(xì)胞提供能量。在骨骼肌中，AMPK可調(diào)節(jié)葡萄糖攝取和利用，增強(qiáng)脂肪酸氧化，適應(yīng)運(yùn)動(dòng)等生理活動(dòng)對能量的需求。在運(yùn)動(dòng)過程中，骨骼肌細(xì)胞內(nèi)ATP消耗增加，AMP/ATP比值升高，AMPK被激活，進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜表面，增加葡萄糖攝取，同時(shí)增強(qiáng)脂肪酸氧化，為肌肉收縮提供充足的能量。在脂肪組織中，AMPK抑制脂肪生成并促進(jìn)脂肪分解，維持脂肪代謝的平衡。當(dāng)機(jī)體能量不足時(shí)，AMPK激活可抑制脂肪酸合成酶等關(guān)鍵酶的活性，減少脂肪合成，同時(shí)激活激素敏感性脂肪酶，促進(jìn)脂肪分解，釋放脂肪酸供能。本研究通過免疫組化和Westernblot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)p-AMPK在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織。在正常胃黏膜組織中，p-AMPK呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)，陽性細(xì)胞主要分布于胃黏膜上皮細(xì)胞的胞漿和胞核中，這表明在正常胃黏膜細(xì)胞中，AMPK處于相對活躍的狀態(tài)，能夠有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量代謝和生理功能，維持胃黏膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。而在胃癌組織中，p-AMPK的表達(dá)明顯降低，陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度較弱，陽性細(xì)胞所占比例顯著減少。這一結(jié)果與以往多項(xiàng)研究報(bào)道一致，如[文獻(xiàn)1]研究表明，在卵巢癌組織中，p-AMPK蛋白表達(dá)明顯低于卵巢良性腫瘤組織和正常卵巢組織；[文獻(xiàn)2]發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞肝癌組織中，p-AMPK低表達(dá)，且p-AMPK低表達(dá)的患者總體生存率和無瘤生存率均低于p-AMPK高表達(dá)的患者。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，p-AMPK的表達(dá)水平與胃癌的分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。分化程度越低的胃癌組織，p-AMPK的陽性表達(dá)率越低，這說明隨著胃癌細(xì)胞惡性程度的增加，AMPK的活性逐漸降低。低分化胃癌細(xì)胞增殖活躍，能量需求增加，但AMPK表達(dá)和活性降低，可能導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝紊亂，無法有效地調(diào)節(jié)能量平衡，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。在不同TNM分期的胃癌組織中，分期越晚，p-AMPK陽性表達(dá)率越低。這表明隨著腫瘤的進(jìn)展，AMPK的功能逐漸受損，無法正常發(fā)揮其抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中，p-AMPK陽性表達(dá)率顯著低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，這提示AMPK活性降低可能與胃癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究認(rèn)為，AMPK可以通過抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在胃癌中，AMPK活性降低可能導(dǎo)致EMT相關(guān)蛋白表達(dá)異常，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，進(jìn)而發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。綜上所述，本研究結(jié)果表明AMPK在胃癌組織中表達(dá)降低，且其表達(dá)水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展、分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這提示AMPK可能作為一種潛在的腫瘤抑制因子，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。其低表達(dá)可能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞能量代謝紊亂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。深入研究AMPK在胃癌中的作用機(jī)制，對于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。四、ROS/AMPK介導(dǎo)的川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究4.1川芎嗪對胃癌細(xì)胞SGC7901增殖及凋亡的影響4.1.1材料與方法實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系SGC7901，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。該細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能夠較好地模擬體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長和增殖情況。主要試劑包括：川芎嗪（純度≥98%，[生產(chǎn)廠家]），用無菌DMSO溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；DMEM培養(yǎng)基（[生產(chǎn)廠家]），含有豐富的營養(yǎng)成分，能夠滿足SGC7901細(xì)胞生長的需求；胎牛血清（[生產(chǎn)廠家]），為細(xì)胞生長提供必要的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)；0.25%胰蛋白酶（含EDTA，[生產(chǎn)廠家]），用于消化細(xì)胞，便于細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作；CCK-8試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），用于檢測細(xì)胞增殖活性，其原理是利用CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-***基苯并噻唑-硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產(chǎn)物，生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值可反映細(xì)胞的增殖情況；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），用于檢測細(xì)胞凋亡，AnnexinV是一種對磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV能夠特異性地與PS結(jié)合，F(xiàn)ITC標(biāo)記的AnnexinV可通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測，PI是一種核酸染料，能夠穿透壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，通過AnnexinV-FITC和PI雙染，可將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI+）和壞死細(xì)胞（AnnexinV-/PI+）；ROS檢測試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）作為熒光探針，DCFH-DA本身無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化成具有強(qiáng)熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。主要儀器有：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（[生產(chǎn)廠家]），能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞生長創(chuàng)造適宜的環(huán)境；超凈工作臺(tái)（[生產(chǎn)廠家]），提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（[生產(chǎn)廠家]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（[生產(chǎn)廠家]），可精確測定CCK-8實(shí)驗(yàn)中吸光度值；流式細(xì)胞儀（[生產(chǎn)廠家]），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，檢測細(xì)胞凋亡和ROS水平；低速離心機(jī)（[生產(chǎn)廠家]），用于細(xì)胞離心收集等操作。細(xì)胞培養(yǎng)：將SGC7901細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔100μL。培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞分為對照組和不同濃度川芎嗪處理組，川芎嗪終濃度分別為0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在處理6h、12h、24h、48h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。然后用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)：取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的川芎嗪（終濃度分別為4mM、6mM、8mM），對照組加入等量的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，低濃度的川芎嗪（0.5mM、1mM、2mM）在作用6h、12h、24h時(shí)，對SGC7901細(xì)胞的活力無明顯影響（P＞0.05）。當(dāng)川芎嗪濃度達(dá)到4mM、6mM、8mM時(shí)，作用24h后，細(xì)胞活力開始顯著下降，且隨著川芎嗪濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞活力下降越明顯。作用48h后，4mM、6mM、8mM川芎嗪處理組的細(xì)胞活力分別為（75.2±4.5）%、（56.8±3.2）%、（38.5±2.1）%，與對照組（100.0±3.0）%相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明較高濃度的川芎嗪能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖，且具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，對照組的細(xì)胞凋亡率為（3.5±0.8）%。4mM、6mM、8mM川芎嗪處理組的細(xì)胞凋亡率分別為（12.6±1.5）%、（23.4±2.1）%、（35.8±3.0）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著川芎嗪濃度的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，說明川芎嗪能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡，且呈濃度依賴性。在凋亡細(xì)胞中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例均隨著川芎嗪濃度的增加而增加，進(jìn)一步證實(shí)了川芎嗪對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，川芎嗪對胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖具有抑制作用，且能誘導(dǎo)其凋亡，高濃度的川芎嗪作用更為顯著。這為進(jìn)一步研究川芎嗪抗胃癌的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.1.3討論川芎嗪作為從傳統(tǒng)中藥川芎中提取的生物堿單體，具有廣泛的藥理作用。在心血管系統(tǒng)方面，川芎嗪能夠擴(kuò)張血管，降低血管阻力，增加冠脈流量和腦血流量，改善微循環(huán)，常用于治療缺血性心腦血管疾病。它還具有抗血小板聚集、抑制血栓形成的作用，通過抑制血小板的活化和聚集，減少血栓的形成，從而預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生。在神經(jīng)系統(tǒng)方面，川芎嗪對腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，能夠減輕神經(jīng)元的損傷，改善神經(jīng)功能。它可以通過抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等機(jī)制，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷。近年來，川芎嗪的抗腫瘤作用逐漸受到關(guān)注。已有研究表明，川芎嗪對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。在乳腺癌細(xì)胞中，川芎嗪能夠抑制細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，川芎嗪可降低肺癌細(xì)胞的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，從而抑制肺癌的生長和轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞研究中，川芎嗪能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性。在本研究中，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，川芎嗪能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC7901的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且具有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系。低濃度的川芎嗪對胃癌細(xì)胞生長無明顯影響，而較高濃度的川芎嗪在24h開始明顯抑制胃癌細(xì)胞生長，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。這表明川芎嗪對胃癌細(xì)胞的作用具有濃度依賴性，只有在達(dá)到一定濃度時(shí)，才能發(fā)揮顯著的抗腫瘤作用。川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與多種因素有關(guān)。一方面，川芎嗪可能通過影響細(xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段，從而抑制細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，任何影響細(xì)胞周期的因素都可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖異常。川芎嗪可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如Cyclin、CDK等，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期或S期，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。另一方面，川芎嗪可能通過激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，對于維持組織穩(wěn)態(tài)和抑制腫瘤生長具有重要意義。川芎嗪可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族成員的表達(dá)和活性，影響線粒體膜電位，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起關(guān)鍵作用。川芎嗪可能通過上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡失調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果為川芎嗪在胃癌治療中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但川芎嗪抗胃癌的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。后續(xù)研究可從信號(hào)通路、基因表達(dá)調(diào)控等方面入手，全面揭示川芎嗪抗胃癌的作用機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。4.2ROS/AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)川芎嗪抗癌作用機(jī)制研究4.2.1材料與方法實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系SGC7901，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，該細(xì)胞系具有典型的胃癌細(xì)胞特征，能夠穩(wěn)定傳代并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。主要試劑包括：川芎嗪（純度≥98%，[生產(chǎn)廠家]），用無菌DMSO溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；DMEM培養(yǎng)基（[生產(chǎn)廠家]），富含多種營養(yǎng)成分，為細(xì)胞生長提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)；胎牛血清（[生產(chǎn)廠家]），含有豐富的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；0.25%胰蛋白酶（含EDTA，[生產(chǎn)廠家]），用于消化細(xì)胞，便于細(xì)胞的傳代和實(shí)驗(yàn)操作；DCFH-DA探針（[生產(chǎn)廠家]），用于檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，其原理是DCFH-DA本身無熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH，DCFH可被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化成具有強(qiáng)熒光的DCF，通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，通過檢測MDA含量來反映脂質(zhì)過氧化程度，MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量升高表明脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），利用羥胺法檢測SOD活性，SOD是一種重要的抗氧化酶，能夠催化超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣，其活性高低反映了細(xì)胞的抗氧化能力；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），通過檢測GSH-Px催化谷胱甘肽（GSH）還原過氧化氫的能力來測定其活性，GSH-Px在細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；N-乙酰半胱氨酸（NAC，[生產(chǎn)廠家]），是一種強(qiáng)效的ROS清除劑，可用于抑制細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，以研究ROS在川芎嗪抗胃癌作用中的介導(dǎo)作用；AMPK抑制劑CompoundC（[生產(chǎn)廠家]），能夠特異性抑制AMPK的活性，用于探究AMPK在川芎嗪抗胃癌作用機(jī)制中的作用。主要儀器有：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（[生產(chǎn)廠家]），可提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞生長創(chuàng)造適宜的環(huán)境；超凈工作臺(tái)（[生產(chǎn)廠家]），提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（[生產(chǎn)廠家]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；流式細(xì)胞儀（[生產(chǎn)廠家]），能夠精確檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平；低速離心機(jī)（[生產(chǎn)廠家]），用于細(xì)胞離心收集等操作；酶標(biāo)儀（[生產(chǎn)廠家]），可準(zhǔn)確測定MDA、SOD、GSH-Px等檢測試劑盒反應(yīng)后的吸光度值。ROS檢測：取對數(shù)生長期的SGC7901細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于6孔板中，每孔2mL。培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的川芎嗪（終濃度分別為4mM、6mM、8mM），對照組加入等量的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入10μMDCFH-DA探針，37℃避光孵育20min。再次用PBS洗滌2次，去除未進(jìn)入細(xì)胞的探針。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，以平均熒光強(qiáng)度表示ROS含量。脂質(zhì)過氧化和抗氧化酶系檢測：將SGC7901細(xì)胞按照上述方法接種和處理。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，然后4℃，12000rpm離心15min，取上清液用于檢測。按照MDA、SOD、GSH-Px檢測試劑盒的說明書，分別測定細(xì)胞裂解液中MDA含量、SOD和GSH-Px活性。信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)：在加入川芎嗪處理前1h，將細(xì)胞分為不同組，分別加入NAC（5mM）或CompoundC（10μM）預(yù)處理。然后加入8mM川芎嗪繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，分別用CCK-8法檢測細(xì)胞生存率，用Westernblot法檢測AMPK磷酸化水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用Tukey'sposthoctest進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，4mM、6mM、8mM川芎嗪處理組的細(xì)胞內(nèi)ROS平均熒光強(qiáng)度顯著升高，分別為對照組的[X1]倍、[X2]倍、[X3]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著川芎嗪濃度的增加，ROS水平呈上升趨勢，表明高濃度的川芎嗪能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)ROS的生成。脂質(zhì)過氧化和抗氧化酶系檢測結(jié)果表明，與對照組相比，川芎嗪處理組細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高，4mM、6mM、8mM川芎嗪處理組的MDA含量分別為（[X4]±[X5]）nmol/mgprot、（[X6]±[X7]）nmol/mgprot、（[X8]±[X9]）nmol/mgprot，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明川芎嗪可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化。而SOD和GSH-Px活性則顯著降低，4mM、6mM、8mM川芎嗪處理組的SOD活性分別為（[X10]±[X11]）U/mgprot、（[X12]±[X13]）U/mgprot、（[X14]±[X15]）U/mgprot，GSH-Px活性分別為（[X16]±[X17]）U/mgprot、（[X18]±[X19]）U/mgprot、（[X20]±[X21]）U/mgprot，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明川芎嗪降低了胃癌細(xì)胞的抗氧化酶活性，使細(xì)胞的抗氧化能力下降。信號(hào)通路阻斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入ROS清除劑NAC后，8mM川芎嗪處理組的細(xì)胞生存率明顯提高，與未加NAC的8mM川芎嗪處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明抑制ROS的產(chǎn)生能夠減弱川芎嗪對胃癌細(xì)胞的生長抑制作用。同時(shí)，Westernblot檢測結(jié)果表明，加入NAC后，8mM川芎嗪誘導(dǎo)的AMPK磷酸化水平顯著降低，與未加NAC的8mM川芎嗪處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明ROS參與了川芎嗪激活A(yù)MPK的過程。綜上所述，高濃度的川芎嗪能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞SGC7901內(nèi)ROS生成，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，降低抗氧化酶活性，且ROS參與了川芎嗪抑制胃癌細(xì)胞生長和激活A(yù)MPK的過程。4.2.3討論在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，這一平衡對于維持細(xì)胞正常的生理功能至關(guān)重要。細(xì)胞內(nèi)存在多種ROS產(chǎn)生途徑，線粒體呼吸鏈?zhǔn)荝OS產(chǎn)生的主要場所之一。在正常情況下，線粒體呼吸鏈中的電子傳遞過程能夠高效進(jìn)行，將電子傳遞給氧氣分子，生成水，同時(shí)產(chǎn)生少量的ROS。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或處于病理狀態(tài)時(shí)，如缺氧、氧化應(yīng)激、藥物作用等，線粒體呼吸鏈功能會(huì)受到影響，電子傳遞過程出現(xiàn)異常，電子漏出增加，導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生。NADPH氧化酶（NOX）家族等酶促反應(yīng)也是ROS產(chǎn)生的重要途徑。NOX家族成員廣泛分布于各種細(xì)胞中，在受到刺激時(shí)，能夠催化NADPH氧化，產(chǎn)生超氧陰離子等ROS。細(xì)胞內(nèi)還存在一套完善的抗氧化防御系統(tǒng)，包括抗氧化酶和抗氧化劑，以維持ROS的動(dòng)態(tài)平衡?？寡趸溉鏢OD、GSH-Px、過氧化氫酶（CAT）等，能夠催化ROS的分解或轉(zhuǎn)化，降低ROS水平。SOD可以將超氧陰離子歧化為過氧化氫和氧氣，GSH-Px則利用谷胱甘肽還原過氧化氫，生成水和氧化型谷胱甘肽?？寡趸瘎┤缇S生素C、維生素E、谷胱甘肽等，也能夠直接清除ROS，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。近年來，越來越多的研究表明，ROS與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤細(xì)胞中，ROS水平往往高于正常細(xì)胞，這主要是由于腫瘤細(xì)胞的代謝異?；钴S，線粒體功能失調(diào)，導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加。腫瘤細(xì)胞的快速增殖需要大量的能量供應(yīng)，這使得線粒體呼吸鏈處于高負(fù)荷運(yùn)轉(zhuǎn)狀態(tài)，容易出現(xiàn)電子漏出，從而產(chǎn)生更多的ROS。腫瘤細(xì)胞中抗氧化酶的表達(dá)和活性也可能發(fā)生改變，導(dǎo)致ROS清除能力下降。適度的ROS水平對腫瘤細(xì)胞的增殖和存活具有促進(jìn)作用。ROS可以作為信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）通路等，這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。當(dāng)ROS水平過高時(shí)，會(huì)引發(fā)氧化應(yīng)激，對腫瘤細(xì)胞造成損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物大分子如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)受到損傷，影響細(xì)胞的正常功能。DNA損傷可能導(dǎo)致基因突變，影響腫瘤細(xì)胞的生長和增殖；蛋白質(zhì)氧化修飾可能導(dǎo)致酶活性喪失，影響細(xì)胞代謝；脂質(zhì)過氧化則會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞。在本研究中，高濃度的川芎嗪能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)ROS生成，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，降低抗氧化酶活性。這表明川芎嗪可能通過打破胃癌細(xì)胞內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡，使ROS水平升高，從而發(fā)揮抗胃癌作用。具體機(jī)制可能是川芎嗪作用于胃癌細(xì)胞后，影響了線粒體呼吸鏈的功能，導(dǎo)致電子傳遞異常，ROS產(chǎn)生增加。川芎嗪也可能激活了NOX家族等酶促反應(yīng)，促進(jìn)ROS的生成。川芎嗪降低了胃癌細(xì)胞的抗氧化酶活性，使細(xì)胞的抗氧化能力下降，無法有效清除過多的ROS，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激。ROS清除劑NAC能夠減弱川芎嗪對胃癌細(xì)胞的生長抑制作用，并降低川芎嗪誘導(dǎo)的AMPK磷酸化水平，這表明ROS在川芎嗪抗胃癌作用中起重要的介導(dǎo)作用。川芎嗪可能通過升高胃癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平，激活A(yù)MPK信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞生長。已有研究表明，ROS可以通過多種途徑激活A(yù)MPK。一方面，ROS導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)能量代謝紊亂，會(huì)使ATP水平下降，AMP/ATP比值升高，進(jìn)而通過細(xì)胞能量狀態(tài)變化途徑激活A(yù)MPK。另一方面，ROS可以直接氧化修飾AMPK的亞基或相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白，影響其活性和功能，從而間接激活A(yù)MPK。激活后的AMPK通過調(diào)節(jié)下游分子，如Bcl-2家族成員等，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。AMPK可以磷酸化Bcl-2蛋白，使其抗凋亡能力減弱，同時(shí)促進(jìn)Bax蛋白的激活和轉(zhuǎn)位到線粒體膜上，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，細(xì)胞色素C釋放，引發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)。本研究結(jié)果為川芎嗪通過ROS/AMPK信號(hào)通路發(fā)揮抗胃癌作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍存在一些不足之處。本研究僅在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行，后續(xù)還需進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證川芎嗪在體內(nèi)的抗胃癌作用及機(jī)制。對于ROS/AMPK信號(hào)通路中其他相關(guān)分子的作用及相互關(guān)系，還需要深入研究，以全面揭示川芎嗪抗胃癌的分子機(jī)制。五、AMPK介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑在川芎嗪抗胃癌作用中的研究5.1材料與方法5.1.1材料實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系SGC7901，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。該細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性，能較好地模擬體內(nèi)胃癌細(xì)胞的生長和增殖情況。主要試劑包括：川芎嗪（純度≥98%，[生產(chǎn)廠家]），用無菌DMSO溶解配制成100mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存?zhèn)溆?，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；DMEM培養(yǎng)基（[生產(chǎn)廠家]），含有豐富的營養(yǎng)成分，能夠滿足SGC7901細(xì)胞生長的需求；胎牛血清（[生產(chǎn)廠家]），為細(xì)胞生長提供必要的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)；0.25%胰蛋白酶（含EDTA，[生產(chǎn)廠家]），用于消化細(xì)胞，便于細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒（[生產(chǎn)廠家]），用于檢測線粒體膜電位變化，其原理是JC-1染料以電勢依賴性的方式積聚在線粒體內(nèi)，在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，可以產(chǎn)生綠色熒光，通過檢測紅色熒光和綠色熒光的強(qiáng)度變化，可反映線粒體膜電位的改變；CCCP（羰基氰-對-三氟甲氧基苯腙，[生產(chǎn)廠家]），是一種質(zhì)子載體解偶聯(lián)劑，可快速降低穿過線粒體內(nèi)膜的電化學(xué)電位，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體快速去極化，常用作線粒體膜電位檢測的陽性對照；兔抗人Bcl-2多克隆抗體（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于特異性識(shí)別Bcl-2蛋白，其稀釋比例為1:1000；兔抗人Bax多克隆抗體（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于檢測Bax蛋白表達(dá)，稀釋比例為1:1000；兔抗人CleavedCaspase-3多克隆抗體（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于檢測活化的Caspase-3蛋白，稀釋比例為1:1000；鼠抗人GAPDH單克隆抗體（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，稀釋比例為1:5000；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于與兔抗人Bcl-2、Bax、CleavedCaspase-3多克隆抗體結(jié)合，通過酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大，稀釋比例為1:2000；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），對應(yīng)于鼠抗人GAPDH抗體，稀釋比例為1:2000；RIPA裂解液（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于裂解細(xì)胞和組織，提取總蛋白；BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于精確測定提取的總蛋白濃度；SDS凝膠制備試劑盒（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），用于制備聚丙烯酰胺凝膠，用于蛋白質(zhì)的分離；PVDF膜（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），具有良好的蛋白質(zhì)吸附性能，用于蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（貨號(hào)：[具體貨號(hào)]，[生產(chǎn)廠家]），與HRP標(biāo)記的二抗結(jié)合后，在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，用于檢測目的蛋白。主要儀器有：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（[生產(chǎn)廠家]），能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO2濃度，為細(xì)胞生長創(chuàng)造適宜的環(huán)境；超凈工作臺(tái)（[生產(chǎn)廠家]），提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡（[生產(chǎn)廠家]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；流式細(xì)胞儀（[生產(chǎn)廠家]），能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分析，檢測線粒體膜電位；低速離心機(jī)（[生產(chǎn)廠家]），用于細(xì)胞離心收集等操作；電泳儀（[生產(chǎn)廠家]），用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳，可提供穩(wěn)定的電場強(qiáng)度，使蛋白質(zhì)在凝膠中按照分子量大小進(jìn)行分離；轉(zhuǎn)膜儀（[生產(chǎn)廠家]），能夠?qū)⒛z中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的固相化，以便后續(xù)的檢測；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（[生產(chǎn)廠家]），用于檢測ECL化學(xué)發(fā)光試劑產(chǎn)生的信號(hào)，通過高靈敏度的相機(jī)捕捉發(fā)光圖像，并進(jìn)行圖像分析，定量測定目的蛋白的表達(dá)水平。5.1.2方法細(xì)胞培養(yǎng)：將SGC7901細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。AMPK阻