第1頁（共1頁）2026年高考生物模擬試卷必刷題——基因工程一．選擇題（共7小題）1．糞便無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)通過分析糞便中脫落腸道細(xì)胞的DNA來評(píng)估腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，具有無創(chuàng)便捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該檢測需采集糞便樣本，進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增等過程。下列敘述正確的是（）A．提取DNA時(shí)，研磨液經(jīng)過濾、離心后取上清液，再加入冷酒精 B．隨著PCR反應(yīng)進(jìn)行，DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸數(shù)量逐步減少 C．因糞便中的DNA均源于腸壁脫落細(xì)胞，因此該技術(shù)的靈敏度高 D．若檢測發(fā)現(xiàn)原癌基因并未突變，則可判斷該檢測者未得腸癌2．某研究小組以新鮮洋蔥為材料進(jìn)行“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)。操作流程如下：①組織搗碎后加入研磨液充分研磨；②過濾取濾液，置于4℃冰箱靜置分層；③取上清液加入等體積預(yù)冷的95%酒精；④離心后收集白色絮狀沉淀物；⑤取部分沉淀加NaCl溶解后進(jìn)行二苯胺鑒定。下列敘述正確的是（）A．步驟③中因?yàn)镈NA不溶于酒精而某些蛋白質(zhì)可溶，所以冷酒精可使DNA快速析出 B．步驟⑤鑒定時(shí)，直接取白色絮狀物與二苯胺混合，室溫下放置觀察顏色變化 C．若對提取物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，遷移距離越大的DNA片段分子量越大 D．步驟②靜置后DNA主要存在于沉淀中，需用高濃度NaCl溶液重新溶解3．不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法。加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物。PCR的最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。不對稱PCR的簡單過程如圖所示。假設(shè)模板DNA分子初始數(shù)量為a個(gè)，6次循環(huán)后開始擴(kuò)增產(chǎn)生ssDNA。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來設(shè)計(jì) B．據(jù)圖可知，最后大量獲得的ssDNA、與圖中甲鏈的堿基序列相同 C．上述過程中子鏈分別沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 D．因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離4．如圖甲、乙、丙分別是目的基因、質(zhì)粒載體、重組DNA（重組質(zhì)粒）的三個(gè)示意圖，限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ．要獲得理想的可表達(dá)目的基因的重組DNA，最佳的限制酶組合方式是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體5．科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，結(jié)果它的最適溫度提高了10～12℃。下列說法正確的是（）A．蛋白質(zhì)工程的目的是獲得滿足人類生產(chǎn)和生活需求的蛋白質(zhì) B．蛋白質(zhì)工程和基因工程的根本區(qū)別是操作對象的差異 C．蛋白質(zhì)工程在設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)的依據(jù)是現(xiàn)有基因的脫氧核苷酸序列 D．蛋白質(zhì)工程只能改造現(xiàn)有的蛋白質(zhì)而不能制造新的蛋白質(zhì)6．如圖為培育轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)人β﹣酪蛋白的流程圖，下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．過程①所用的人β﹣酪蛋白基因可從人cDNA文庫中獲得 B．過程①所用載體應(yīng)具備復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等 C．過程④得到的人β﹣酪蛋白可從山羊的乳汁中提取 D．過程④人β﹣酪蛋白基因在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯7．關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．在一定的pH下DNA帶上電荷，在電場中向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng) B．在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān) C．為避免外源DNA等因素的污染，微量離心管和槍頭在使用前必須消毒 D．凝膠中的DNA分子通過染色，可以在紫外燈下被檢測出來二．多選題（共1小題）（多選）8．基因工程在農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)等多方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，如圖表示利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白的兩條途徑。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．導(dǎo)入人血清白蛋白基因的綿羊受體細(xì)胞是乳腺細(xì)胞 B．利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法可將含有目的基因的重組質(zhì)粒整合到植物受體細(xì)胞的染色體DNA上 C．?dāng)U增目的基因時(shí)，利用耐高溫的DNA聚合酶從引物a、b的3′﹣端進(jìn)行子鏈合成 D．若某基因是從人的細(xì)胞內(nèi)提取mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的，則該基因中不含啟動(dòng)子序列三．解答題（共7小題）9．科研人員開發(fā)微生物細(xì)胞作為全細(xì)胞生物傳感器，可以高效檢測環(huán)境中的重金屬污染程度。（1）為構(gòu)建全細(xì)胞生物傳感器，需先構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要用到的酶有。圖1為基因表達(dá)載體的部分結(jié)構(gòu)，除啟動(dòng)子和目的基因外，表達(dá)載體還需具備的元件有、、復(fù)制原點(diǎn)。（2）要判斷Gfp基因是否正確連接到質(zhì)粒上，應(yīng)對待測質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳鑒定，選擇的引物是。據(jù)圖判斷，Gfp基因的轉(zhuǎn)錄模板鏈?zhǔn)擎湣＃?）圖2為重金屬全細(xì)胞微生物傳感器的生物識(shí)別與信號(hào)傳輸過程。據(jù)圖分析重金屬全細(xì)胞微生物傳感器檢測的原理是：結(jié)合重金屬后與啟動(dòng)子上游序列結(jié)合，并促進(jìn)啟動(dòng)子與結(jié)合，驅(qū)動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄，最后檢測以衡量環(huán)境中的重金屬含量。10．綠色熒光蛋白（GFP）是由238個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，在藍(lán)光誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)光，可用于直接觀察細(xì)胞中的活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)小組以質(zhì)粒pMUTIN﹣gfp+為模板擴(kuò)增gfp+基因，將其與質(zhì)粒pMV24構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMV24﹣gfp+，并在木葡糖酸醋桿菌中進(jìn)行表達(dá)，證明其可作為選擇標(biāo)記用于今后的研究，重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖所示。請回答下列問題：注：AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，EcoRⅠ、XbaⅠ、PvuⅡ表示三種限制酶。（1）利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，每個(gè)循環(huán)依次經(jīng)過三個(gè)階段，擴(kuò)增過程中需在緩沖液中添加一定濃度的Mg2+，Mg2+的作用是。（2）以質(zhì)粒pMUTIN﹣gfp+為模板擴(kuò)增gfp+基因時(shí)，應(yīng)當(dāng)在引物的（填“5′”或“3′”）端添加兩種限制酶的識(shí)別序列。用不同的限制酶切割目的基因和載體的原因是（答出兩點(diǎn)）。（3）重組質(zhì)粒上的AmpR基因是一種標(biāo)記基因，其作用是，AmpR基因能作為標(biāo)記基因的前提條件是木葡糖酸醋桿菌中（填“含有”或“不含”）AmpR基因。若要進(jìn)一步檢測重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，可以用限制酶切割重組質(zhì)粒，并用法分離不同的DNA片段。11．馬鈴薯塊莖在儲(chǔ)存中極易受損褐變發(fā)黑，導(dǎo)致其外觀、味道、安全性下降。多酚氧化酶PPO可催化酚類物質(zhì)形成褐色物質(zhì)，是導(dǎo)致褐變的關(guān)鍵酶。為培育抗褐化能力強(qiáng)，并符合基因安全的新品種，研究者構(gòu)建了目的基因StPPOi，表達(dá)產(chǎn)生與PPO基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNAi。將目的基因搭載在Gene—Deletor載體上（重組載體如圖1所示），通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，獲得PPO基因沉默的馬鈴薯植株。經(jīng)檢測鑒定，發(fā)現(xiàn)褐變指數(shù)下降了80.78%。提取馬鈴薯器官中的外源基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳分離（結(jié)果如圖2所示）。請回答下列問題。（1）在構(gòu)建的重組載體中，F(xiàn)LP基因的表達(dá)產(chǎn)物與酶的作用相似，均可以對DNA進(jìn)行切割；抗卡那霉素基因的作用是。（2）轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株塊莖在25℃、3天處理?xiàng)l件下，啟動(dòng)子可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)的產(chǎn)物可阻斷PPO基因的（填“轉(zhuǎn)錄”或“翻譯”），從而抑制PPO的合成。（3）轉(zhuǎn)基因食品相對于傳統(tǒng)食品，其有成本較低，農(nóng)藥使用量小，生產(chǎn)效率高等顯著優(yōu)勢，但是轉(zhuǎn)基因食品的安全性始終受到人們的質(zhì)疑。上述研究中可采用2℃、3天處理此新品種，獲得符合轉(zhuǎn)基因安全的馬鈴薯，理由是。12．為監(jiān)測、調(diào)控和利用細(xì)菌的葡萄糖代謝途徑，優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)過程，研究者嘗試通過基因工程技術(shù)構(gòu)建生物傳感器。（1）將GFP（綠色熒光蛋白）基因作為報(bào)告基因，構(gòu)建出基因表達(dá)載體（R），將其導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，應(yīng)先用處理大腸桿菌。（2）PE基因編碼的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。R作為生物傳感器，包括啟動(dòng)子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作過程如圖1、圖2。①據(jù)圖1、圖2可知，存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖通過E蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞中后被磷酸化，推測M蛋白，PE表達(dá)產(chǎn)物可使E蛋白重新磷酸化。②在周圍環(huán)境中葡萄糖存在狀態(tài)不同時(shí)，R均可監(jiān)測大腸桿菌的葡萄糖攝取狀態(tài)，請闡釋其工作原理。③在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)入R的大腸桿菌，分別在不同培養(yǎng)時(shí)間檢測和熒光強(qiáng)度。若結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)，則可確定該生物傳感器具有檢測可靠性。（3）在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸過程中，研究者利用R監(jiān)測大腸桿菌對葡萄糖的攝取，發(fā)現(xiàn)菌體攝入的葡萄糖偏多，因?yàn)榇x過程中形成了一些副產(chǎn)品，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高。已知大腸桿菌C基因編碼的蛋白C可結(jié)合啟動(dòng)子Pc，促進(jìn)RNA聚合酶也結(jié)合Pc；當(dāng)胞內(nèi)葡萄糖含量較高時(shí)，C蛋白無法結(jié)合Pec，Pc無法啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄。研究者將R的啟動(dòng)子P更換為啟動(dòng)子Pc，解決葡萄糖攝取偏多導(dǎo)致浪費(fèi)的問題。請?jiān)诒砀裰醒a(bǔ)充不同條件下，2個(gè)調(diào)控元件對R的精準(zhǔn)調(diào)控過程。“+”表示相應(yīng)蛋白結(jié)合、“﹣”表示相應(yīng)蛋白脫離。條件Pc中c蛋白的結(jié)合序列M蛋白的結(jié)合序列無葡萄糖++低濃度葡萄糖?。ⅲ邼舛绕咸烟洽＃ぃ?3．CRISPR/Cas9是一種基因編輯技術(shù)，科研人員對其進(jìn)行了一系列改造。（1）Cas9蛋白能與人工設(shè)計(jì)的sgRNA形成復(fù)合體（如圖1）。復(fù)合體中的sgRNA與目的基因按照原則特異性結(jié)合。復(fù)合體在sgRNA引導(dǎo)下結(jié)合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成雙鏈斷裂，細(xì)胞在修復(fù)斷裂的DNA時(shí)會(huì)隨機(jī)插入、刪除或替換部分堿基對，從而引發(fā)。（2）將編碼Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，與Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但與sgRNA結(jié)合等功能不變。構(gòu)建能夠表達(dá)dCas9的質(zhì)粒A，設(shè)計(jì)一系列與紅色熒光蛋白基因（RFP基因）上游不同部位結(jié)合的sgRNA序列（如圖2），并以此為依據(jù)構(gòu)建能表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒B，將質(zhì)粒A、B共同導(dǎo)入含有RFP基因的大腸桿菌，測定大腸桿菌紅色熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組的紅色熒光強(qiáng)度約為sgRNA3組的倍。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出：。（3）VP64蛋白可結(jié)合RNA聚合酶，激活基因的轉(zhuǎn)錄，但VP64蛋白無法識(shí)別或結(jié)合特定的DNA片段?？蒲腥藛T欲利用上述系統(tǒng)和VP64蛋白促進(jìn)特定基因表達(dá)，請?jiān)O(shè)計(jì)促進(jìn)細(xì)胞中已存在的基因X表達(dá)的方案。14．花青素是一種水溶性色素，屬于黃酮類化合物，具有多種養(yǎng)生功效。如圖是花青素合成酶基因（S）的cDNA（某種生物發(fā)育某個(gè)時(shí)期的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA）和Ti質(zhì)粒圖，科學(xué)家欲利用二者構(gòu)建基因表達(dá)載體，培育出花青素含量更高的藍(lán)莓?；卮鹣铝袉栴}：（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增S基因時(shí)，需要引物，引物是指，設(shè)計(jì)引物時(shí)引物的長度需要比計(jì)算出的長度長一些，原因是。（2）根據(jù)圖1和圖2分析，上述基因表達(dá)載體的構(gòu)建中應(yīng)選擇限制酶切割S基因的cDNA和Ti質(zhì)粒，其目的是。圖2Ti質(zhì)粒中的抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可用于。15．將含納豆激酶原基因的表達(dá)組件Pnis﹣aprN整合到乳酸菌的基因組上，即可構(gòu)建出食品級(jí)的基因工程菌，過程如圖。XhoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SphⅠ為限制酶，origin表示復(fù)制原點(diǎn)，amp為氨芐抗性基因，cm為氯霉素抗性基因。請回答下列問題：（1）圖1為載體pFY006的構(gòu)建過程：首先利用限制酶獲得質(zhì)粒pFY005上的HisH基因，為保證載體pFY004與HisH基因正確連接，擴(kuò)增HisH基因時(shí)，需在引物的（填3'或5'）端添加限制酶的識(shí)別序列。（2）圖2為載體pFY007，研究團(tuán)隊(duì)利用限制酶SphⅠ對載體pFYO06和pFY007進(jìn)行同源重組，將納豆激酶原基因的表達(dá)組件Pnis﹣aprN整合到載體pFYO006上，構(gòu)建出長度為4791bp的基因表達(dá)載體pFY008。為驗(yàn)證重組載體pFY008是否構(gòu)建成功，需利用限制酶，通過技術(shù)檢測酶切產(chǎn)物，得到大約bp的條帶，若此條帶大小與目的基因Pnis﹣aprN序列大小相符，則表明構(gòu)建成功。（3）當(dāng)pH值＜5.0時(shí)，納豆激酶迅速失活，乳酸菌發(fā)酵后培養(yǎng)基pH值往往為3～4，分泌到細(xì)胞外的納豆激酶可能失活。某科研團(tuán)隊(duì)欲利用蛋白質(zhì)工程來解決此問題，應(yīng)從出發(fā)，設(shè)計(jì)，推測應(yīng)有的氨基酸序列，找到并改變相對應(yīng)的或合成新的基因，從而獲得所需要的納豆激酶。

2026年高考生物模擬試卷必刷題——一．選擇題（共7小題）題號(hào)1234567答案AACDADC二．多選題（共1小題）題號(hào)8答案AB一．選擇題（共7小題）1．糞便無創(chuàng)DNA檢測技術(shù)通過分析糞便中脫落腸道細(xì)胞的DNA來評(píng)估腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，具有無創(chuàng)便捷、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該檢測需采集糞便樣本，進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增等過程。下列敘述正確的是（）A．提取DNA時(shí)，研磨液經(jīng)過濾、離心后取上清液，再加入冷酒精 B．隨著PCR反應(yīng)進(jìn)行，DNA聚合酶、引物、脫氧核苷酸數(shù)量逐步減少 C．因糞便中的DNA均源于腸壁脫落細(xì)胞，因此該技術(shù)的靈敏度高 D．若檢測發(fā)現(xiàn)原癌基因并未突變，則可判斷該檢測者未得腸癌【考點(diǎn)】DNA的粗提取與鑒定；DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定．【專題】正推法；PCR技術(shù)；理解能力．【答案】A【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。【解答】解：A、提取DNA時(shí)，需裂解細(xì)胞釋放DNA，離心后，除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)沉淀，DNA存在于上清液中，DNA不溶于酒精，加入冷酒精可使DNA析出，A正確；B、PCR反應(yīng)中，脫氧核苷酸和引物會(huì)被消耗而減少，但耐高溫的DNA聚合酶在反應(yīng)中不會(huì)被分解，數(shù)量不會(huì)“逐步減少”，B錯(cuò)誤；C、糞便中的DNA不僅來自腸壁脫落細(xì)胞，還可能包含腸道微生物或食物殘留的DNA，C錯(cuò)誤；D、癌癥發(fā)生是多個(gè)基因突變（如原癌基因和抑癌基因）共同作用的結(jié)果，僅原癌基因未突變不能排除癌癥可能，D錯(cuò)誤。故選：A。【點(diǎn)評(píng)】本題考查了DNA的提取好和PCR反應(yīng)的相關(guān)內(nèi)容，考查考生的理解和判斷能力，難度適中。2．某研究小組以新鮮洋蔥為材料進(jìn)行“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)。操作流程如下：①組織搗碎后加入研磨液充分研磨；②過濾取濾液，置于4℃冰箱靜置分層；③取上清液加入等體積預(yù)冷的95%酒精；④離心后收集白色絮狀沉淀物；⑤取部分沉淀加NaCl溶解后進(jìn)行二苯胺鑒定。下列敘述正確的是（）A．步驟③中因?yàn)镈NA不溶于酒精而某些蛋白質(zhì)可溶，所以冷酒精可使DNA快速析出 B．步驟⑤鑒定時(shí)，直接取白色絮狀物與二苯胺混合，室溫下放置觀察顏色變化 C．若對提取物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，遷移距離越大的DNA片段分子量越大 D．步驟②靜置后DNA主要存在于沉淀中，需用高濃度NaCl溶液重新溶解【考點(diǎn)】DNA的粗提取與鑒定．【專題】正推法；基因工程；理解能力．【答案】A【分析】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色?！窘獯稹拷猓篈、DNA不溶于酒精，而細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可溶于酒精，步驟③中使用預(yù)冷的95%酒精，可降低DNA的溶解度，同時(shí)抑制核酸酶活性以減少DNA降解，從而使DNA快速析出，A正確；B、鑒定DNA時(shí)，不能直接取白色絮狀沉淀物與二苯胺試劑混合，DNA需先溶解在2mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺試劑并沸水浴加熱，才能呈現(xiàn)藍(lán)色，B錯(cuò)誤；C、DNA分子在電場中向正極移動(dòng)，分子量越大的DNA片段，遷移速度越慢，遷移距離越小，C錯(cuò)誤；D、DNA在2mol/LNaCl溶液中溶解度較高，會(huì)溶解于濾液中，步驟②中濾液經(jīng)4℃靜置分層后，DNA主要存在于上清液中，而非沉淀，無需用高濃度NaCl溶液重新溶解，D錯(cuò)誤。故選：A?！军c(diǎn)評(píng)】本題主要考查DNA的粗提取與鑒定等知識(shí)點(diǎn)，意在考查學(xué)生對相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的理解和熟練應(yīng)用的能力。3．不對稱PCR是利用不等量的一對引物來產(chǎn)生大量單鏈DNA（ssDNA）的方法。加入的一對引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物。PCR的最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA），但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。不對稱PCR的簡單過程如圖所示。假設(shè)模板DNA分子初始數(shù)量為a個(gè)，6次循環(huán)后開始擴(kuò)增產(chǎn)生ssDNA。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來設(shè)計(jì) B．據(jù)圖可知，最后大量獲得的ssDNA、與圖中甲鏈的堿基序列相同 C．上述過程中子鏈分別沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸 D．因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離【考點(diǎn)】DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定．【專題】模式圖；PCR技術(shù)；理解能力．【答案】C【分析】PCR原理：在高溫作用下，打開DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4種游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈?！窘獯稹拷猓篈、PCR擴(kuò)增時(shí)需要已知目的基因兩側(cè)的堿基序列來設(shè)計(jì)引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)，A正確；B、非限制性引物是與乙鏈結(jié)合，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，B正確；C、擴(kuò)增時(shí)耐高溫DNA聚合酶將4種脫氧核苷酸連接至引物的3'端，C錯(cuò)誤；D、因?yàn)殡p鏈DNA和單鏈DNA的分子量大小不同，可通過電泳方法將其分離，因?yàn)殡娪镜脑硎歉鶕?jù)DNA相對分子量的大小設(shè)計(jì)的，D正確。故選：C?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定等相關(guān)知識(shí)，旨在考查考生的理解能力和獲取信息的能力，以及生命觀念、科學(xué)思維的核心素養(yǎng)。4．如圖甲、乙、丙分別是目的基因、質(zhì)粒載體、重組DNA（重組質(zhì)粒）的三個(gè)示意圖，限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ．要獲得理想的可表達(dá)目的基因的重組DNA，最佳的限制酶組合方式是（）A．用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體 B．用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體 C．用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體 D．用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】模式圖；基因工程．【答案】D【分析】1、用一種限制酶切割可能會(huì)導(dǎo)致目的基因與運(yùn)載體反向連接以及目的基因自身環(huán)化。2、解答本題時(shí)應(yīng)該根據(jù)圖中RNA聚合酶的移動(dòng)方向進(jìn)行判斷。【解答】解：A、只用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體可能會(huì)導(dǎo)致目的基因與運(yùn)載體反向連接以及目的基因自身環(huán)化，A錯(cuò)誤；B、根據(jù)重組DNA中RNA聚合酶的移動(dòng)方向可知，用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體會(huì)導(dǎo)致目的基因與運(yùn)載體連接后無法表達(dá)，B錯(cuò)誤；C、根據(jù)重組DNA中RNA聚合酶的移動(dòng)方向可知，用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體會(huì)導(dǎo)致目的基因與運(yùn)載體連接后無法表達(dá)，C錯(cuò)誤；D、用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體可得到丙圖所示重組DNA，且能正常表達(dá)，D正確。故選：D。【點(diǎn)評(píng)】本題結(jié)合圖解，考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，重點(diǎn)考查基因工程的操作工具，解答本題的關(guān)鍵是根據(jù)圖中限制酶切割位點(diǎn)及箭頭方向判斷。5．科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)將葡萄糖異構(gòu)酶的第138位甘氨酸用脯氨酸替代，結(jié)果它的最適溫度提高了10～12℃。下列說法正確的是（）A．蛋白質(zhì)工程的目的是獲得滿足人類生產(chǎn)和生活需求的蛋白質(zhì) B．蛋白質(zhì)工程和基因工程的根本區(qū)別是操作對象的差異 C．蛋白質(zhì)工程在設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)的依據(jù)是現(xiàn)有基因的脫氧核苷酸序列 D．蛋白質(zhì)工程只能改造現(xiàn)有的蛋白質(zhì)而不能制造新的蛋白質(zhì)【考點(diǎn)】蛋白質(zhì)工程基本原理．【專題】正推法；基因工程．【答案】A【分析】1、蛋白質(zhì)工程是通過修改基因或創(chuàng)造合成新基因來改變生物的遺傳和表達(dá)性狀，合成新的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)工程從屬于基因工程，蛋白質(zhì)工程是第二代基因工程。2、蛋白質(zhì)工程的過程為：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測應(yīng)有氨基酸序列→找到對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）?！窘獯稹拷猓篈、蛋白質(zhì)工程的實(shí)質(zhì)是定向改造或生產(chǎn)人類所需蛋白質(zhì)，故蛋白質(zhì)工程可以獲得滿足人類生產(chǎn)和生活需求的蛋白質(zhì)，A正確；B、蛋白質(zhì)工程和基因工程都要對基因進(jìn)行操作，其操作對象相同，B錯(cuò)誤；C、蛋白質(zhì)工程在設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)時(shí)的依據(jù)是預(yù)期的蛋白質(zhì)功能，C錯(cuò)誤；D、蛋白質(zhì)工程可以產(chǎn)生自然界中不存在的蛋白質(zhì)，能制造新的蛋白質(zhì)，D錯(cuò)誤。故選：A。【點(diǎn)評(píng)】本題主要考查蛋白質(zhì)工程的內(nèi)容，要求考生識(shí)記相關(guān)知識(shí)，并結(jié)合所學(xué)知識(shí)準(zhǔn)確答題。6．如圖為培育轉(zhuǎn)基因山羊生產(chǎn)人β﹣酪蛋白的流程圖，下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．過程①所用的人β﹣酪蛋白基因可從人cDNA文庫中獲得 B．過程①所用載體應(yīng)具備復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等 C．過程④得到的人β﹣酪蛋白可從山羊的乳汁中提取 D．過程④人β﹣酪蛋白基因在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】模式圖；基因工程．【答案】D【分析】根據(jù)題意和圖示分析可知：①過程表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，②表示胚胎移植，③表示胚胎分割移植，④表示人β﹣酪蛋白基因表達(dá)。【解答】解：A、過程①表示基因表達(dá)載體的構(gòu)建，所用的人β﹣酪蛋白基因可從人cDNA文庫中獲得，A正確；B、過程①所用載體應(yīng)具備復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等，B正確；C、過程④得到的人β﹣酪蛋白可從山羊的乳汁中提取，C正確；D、過程④人β﹣酪蛋白基因在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行翻譯，D錯(cuò)誤。故選：D?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、胚胎移植等相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生識(shí)圖能力和判斷能力，運(yùn)用所學(xué)知識(shí)綜合分析問題和解決問題的能力。7．關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA片段擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．在一定的pH下DNA帶上電荷，在電場中向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng) B．在凝膠中DNA分子的遷移速率與DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān) C．為避免外源DNA等因素的污染，微量離心管和槍頭在使用前必須消毒 D．凝膠中的DNA分子通過染色，可以在紫外燈下被檢測出來【考點(diǎn)】DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定．【專題】正推法；PCR技術(shù)；理解能力．【答案】C【分析】瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的原理主要基于DNA分子在電場作用下的遷移行為以及瓊脂糖凝膠的特性。【解答】解：A、DNA分子在pH高于其等電點(diǎn)的溶液中會(huì)帶上負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。此描述符合電泳原理，A正確；B、DNA在凝膠中的遷移速率與其分子量（大?。┏煞幢龋覙?gòu)象（如線狀、環(huán)狀、超螺旋）也會(huì)影響遷移速度，B正確；C、為避免外源DNA污染，實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管和槍頭需進(jìn)行滅菌處理（如高壓蒸汽滅菌），而非僅消毒。消毒無法徹底滅活所有微生物，C錯(cuò)誤；D、電泳后需用溴化乙錠（EB）等染色劑對DNA進(jìn)行染色，紫外燈下可觀察到熒光條帶，D正確；故選：C。【點(diǎn)評(píng)】本題考查瓊脂糖凝膠電泳的相關(guān)內(nèi)容，要求學(xué)生能結(jié)合所學(xué)知識(shí)正確作答。二．多選題（共1小題）（多選）8．基因工程在農(nóng)牧業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生和食品工業(yè)等多方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，如圖表示利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)人血清白蛋白的兩條途徑。下列敘述錯(cuò)誤的是（）A．導(dǎo)入人血清白蛋白基因的綿羊受體細(xì)胞是乳腺細(xì)胞 B．利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法可將含有目的基因的重組質(zhì)粒整合到植物受體細(xì)胞的染色體DNA上 C．?dāng)U增目的基因時(shí)，利用耐高溫的DNA聚合酶從引物a、b的3′﹣端進(jìn)行子鏈合成 D．若某基因是從人的細(xì)胞內(nèi)提取mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的，則該基因中不含啟動(dòng)子序列【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】正推法；基因工程；理解能力．【答案】AB【分析】將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞常用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T﹣DNA可整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。基因表達(dá)載體常包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因。標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來?！窘獯稹拷猓篈、導(dǎo)入人血清白蛋白基因的綿羊受體細(xì)胞不是乳腺細(xì)胞，而是受精卵或早期胚胎細(xì)胞，A錯(cuò)誤；B、農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T﹣DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上，根據(jù)農(nóng)桿菌的這一特點(diǎn)，將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T﹣DNA上，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以把目的基因的T﹣DNA整合到植物細(xì)胞中染色體的DNA上，B錯(cuò)誤；C、引物的延伸方向?yàn)?'端，擴(kuò)增目的基因時(shí)，利用耐高溫的DNA聚合酶從引物a、b的3'﹣端進(jìn)行子鏈合成，C正確；D、啟動(dòng)子是位于DNA上RNA聚合酶的結(jié)合部位，mRNA是由基因啟動(dòng)子后面的序列編碼而來的，若某基因是從人的細(xì)胞內(nèi)提取mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成的，則該基因中不含啟動(dòng)子序列，D正確。故選：AB?！军c(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程的相關(guān)內(nèi)容，要求考生能根據(jù)所學(xué)知識(shí)正確作答。三．解答題（共7小題）9．科研人員開發(fā)微生物細(xì)胞作為全細(xì)胞生物傳感器，可以高效檢測環(huán)境中的重金屬污染程度。（1）為構(gòu)建全細(xì)胞生物傳感器，需先構(gòu)建基因表達(dá)載體，需要用到的酶有限制酶和DNA連接酶。圖1為基因表達(dá)載體的部分結(jié)構(gòu)，除啟動(dòng)子和目的基因外，表達(dá)載體還需具備的元件有終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)。（2）要判斷Gfp基因是否正確連接到質(zhì)粒上，應(yīng)對待測質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增及電泳鑒定，選擇的引物是引物1和引物3。據(jù)圖判斷，Gfp基因的轉(zhuǎn)錄模板鏈?zhǔn)莃鏈。（3）圖2為重金屬全細(xì)胞微生物傳感器的生物識(shí)別與信號(hào)傳輸過程。據(jù)圖分析重金屬全細(xì)胞微生物傳感器檢測的原理是：轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合重金屬后與啟動(dòng)子上游序列結(jié)合，并促進(jìn)啟動(dòng)子與RNA聚合酶結(jié)合，驅(qū)動(dòng)目的基因的轉(zhuǎn)錄，最后檢測綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度以衡量環(huán)境中的重金屬含量?！究键c(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】圖文信息類簡答題；正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）限制酶和DNA連接酶；終止子；標(biāo)記基因（2）引物1和引物3；b（3）轉(zhuǎn)錄因子；RNA聚合酶；綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度【分析】PCR技術(shù)：（1）概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA的核酸合成技術(shù)。（2）原理：DNA復(fù)制。（3）前提條件：要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成一對引物。（4）條件：模板DNA、四種脫氧核苷酸、一對引物、耐高溫DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。（5）過程：高溫變性：DNA解旋過程（PCR擴(kuò)增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶，高溫條件下氫鍵可自動(dòng)解開）；低溫復(fù)性：引物結(jié)合到互補(bǔ)鏈DNA上；中溫延伸：合成子鏈。【解答】解：（1）構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)，需先用限制酶切割目的基因和載體，使其產(chǎn)生相同的黏性末端或平末端，再用DNA連接酶將兩者連接，因此所需酶為限制酶和DNA連接酶。基因表達(dá)載體的組成包括啟動(dòng)子、目的基因、復(fù)制原點(diǎn)、終止子和標(biāo)記基因。（2）為判斷Gfp基因是否正確連接到質(zhì)粒上，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，引物應(yīng)分別結(jié)合在目的基因（Gfp基因）的兩側(cè)。由圖1可知，引物1和引物3分別位于Gfp基因的兩側(cè)，故選擇的引物為引物1和引物3。轉(zhuǎn)錄時(shí)，RNA聚合酶沿DNA模板鏈的3′→5′方向移動(dòng)，合成mRNA的方向?yàn)?′→3′。根據(jù)圖1中啟動(dòng)子方向和引物位置，Gfp基因的轉(zhuǎn)錄模板鏈為b鏈。（3）根據(jù)圖2，重金屬全細(xì)胞微生物傳感器的檢測原理是：轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合重金屬后，與啟動(dòng)子上游序列結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，驅(qū)動(dòng)Gfp基因的轉(zhuǎn)錄，最終通過檢測綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度來衡量環(huán)境中的重金屬含量，因?yàn)橹亟饘贊舛扔绊戅D(zhuǎn)錄因子與重金屬的結(jié)合，從而影響綠色熒光蛋白的合成量及熒光強(qiáng)度。故答案為：（1）限制酶和DNA連接酶；終止子；標(biāo)記基因（2）引物1和引物3；b（3）轉(zhuǎn)錄因子；RNA聚合酶；綠色熒光蛋白的熒光強(qiáng)度【點(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，要求學(xué)生能運(yùn)用所學(xué)的知識(shí)正確作答。10．綠色熒光蛋白（GFP）是由238個(gè)氨基酸組成的單體蛋白，在藍(lán)光誘導(dǎo)下會(huì)發(fā)光，可用于直接觀察細(xì)胞中的活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)小組以質(zhì)粒pMUTIN﹣gfp+為模板擴(kuò)增gfp+基因，將其與質(zhì)粒pMV24構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMV24﹣gfp+，并在木葡糖酸醋桿菌中進(jìn)行表達(dá)，證明其可作為選擇標(biāo)記用于今后的研究，重組質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖所示。請回答下列問題：注：AmpR表示氨芐青霉素抗性基因，EcoRⅠ、XbaⅠ、PvuⅡ表示三種限制酶。（1）利用PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，每個(gè)循環(huán)依次經(jīng)過變性、復(fù)性、延伸三個(gè)階段，擴(kuò)增過程中需在緩沖液中添加一定濃度的Mg2+，Mg2+的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶。（2）以質(zhì)粒pMUTIN﹣gfp+為模板擴(kuò)增gfp+基因時(shí)，應(yīng)當(dāng)在引物的5′（填“5′”或“3′”）端添加EcoRⅠ、XbaⅠ兩種限制酶的識(shí)別序列。用不同的限制酶切割目的基因和載體的原因是防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化；防止目的基因反向連接到質(zhì)粒上（答出兩點(diǎn)）。（3）重組質(zhì)粒上的AmpR基因是一種標(biāo)記基因，其作用是便于重組DNA分子的篩選，AmpR基因能作為標(biāo)記基因的前提條件是木葡糖酸醋桿菌中不含（填“含有”或“不含”）AmpR基因。若要進(jìn)一步檢測重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，可以用限制酶切割重組質(zhì)粒，并用瓊脂糖凝膠電泳法分離不同的DNA片段?！究键c(diǎn)】DNA片段的擴(kuò)增與電泳鑒定；基因表達(dá)載體的構(gòu)建．【專題】圖文信息類簡答題；正推法；PCR技術(shù)；基因工程；解決問題能力．【答案】（1）變性、復(fù)性、延伸激活耐高溫的DNA聚合酶（2）5′EcoRⅠ、XbaⅠ防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化；防止目的基因反向連接到質(zhì)粒上（3）便于重組DNA分子的篩選不含瓊脂糖凝膠電泳【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的獲取。第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建。第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞。第四步：目的基因的檢測和表達(dá)。【解答】解：（1）PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的一次循環(huán)要經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三個(gè)階段，擴(kuò)增過程中需在緩沖液中添加一定濃度的Mg2+，Mg2+的作用是激活耐高溫的DNA聚合酶。（2）gfp+基因的兩側(cè)沒有相應(yīng)的限制酶切點(diǎn)，而DNA延伸的方向是5′端→3′端，因此要在5′端添加限制酶的識(shí)別序列。限制酶PruⅡ會(huì)破壞標(biāo)記基因，因此應(yīng)加入限制酶EcoRl和XbuI的識(shí)別序列。用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒的原因是防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化，防止目的基因反向連接到質(zhì)粒上。（3）根據(jù)圖示可知，標(biāo)記基因的作用是篩選含重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞，故受體細(xì)胞應(yīng)不含標(biāo)記基因，不具有相應(yīng)的抗性；實(shí)驗(yàn)室分離DNA片段的方法是瓊脂糖凝膠電泳。故答案為：（1）變性、復(fù)性、延伸激活耐高溫的DNA聚合酶（2）5′EcoRⅠ、XbaⅠ防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化；防止目的基因反向連接到質(zhì)粒上（3）便于重組DNA分子的篩選不含瓊脂糖凝膠電泳【點(diǎn)評(píng)】本題考查了基因工程的相關(guān)知識(shí)，考查了學(xué)生對相關(guān)知識(shí)的掌握程度和問題分析解答能力，難度中等。11．馬鈴薯塊莖在儲(chǔ)存中極易受損褐變發(fā)黑，導(dǎo)致其外觀、味道、安全性下降。多酚氧化酶PPO可催化酚類物質(zhì)形成褐色物質(zhì)，是導(dǎo)致褐變的關(guān)鍵酶。為培育抗褐化能力強(qiáng)，并符合基因安全的新品種，研究者構(gòu)建了目的基因StPPOi，表達(dá)產(chǎn)生與PPO基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNAi。將目的基因搭載在Gene—Deletor載體上（重組載體如圖1所示），通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，獲得PPO基因沉默的馬鈴薯植株。經(jīng)檢測鑒定，發(fā)現(xiàn)褐變指數(shù)下降了80.78%。提取馬鈴薯器官中的外源基因，經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳分離（結(jié)果如圖2所示）。請回答下列問題。（1）在構(gòu)建的重組載體中，F(xiàn)LP基因的表達(dá)產(chǎn)物與限制酶的作用相似，均可以對DNA進(jìn)行切割；抗卡那霉素基因的作用是便于重組DNA分子的篩選。（2）轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株塊莖在25℃、3天處理?xiàng)l件下，啟動(dòng)子Patatin可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，表達(dá)的產(chǎn)物可阻斷PPO基因的翻譯（填“轉(zhuǎn)錄”或“翻譯”），從而抑制PPO的合成。（3）轉(zhuǎn)基因食品相對于傳統(tǒng)食品，其有成本較低，農(nóng)藥使用量小，生產(chǎn)效率高等顯著優(yōu)勢，但是轉(zhuǎn)基因食品的安全性始終受到人們的質(zhì)疑。上述研究中可采用2℃、3天處理此新品種，獲得符合轉(zhuǎn)基因安全的馬鈴薯，理由是低溫使冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子PCL啟動(dòng)FLP基因的表達(dá)，產(chǎn)生重組酶FLP，F(xiàn)LP特異性識(shí)別切除兩個(gè)LF序列之間的外源基因?！究键c(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）限制便于重組DNA分子的篩選（2）Patatin翻譯（3）低溫使冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子PCL啟動(dòng)FLP基因的表達(dá)，產(chǎn)生重組酶FLP，F(xiàn)LP特異性識(shí)別切除兩個(gè)LF序列之間的外源基因【分析】基因工程：按照人們的意愿，把一種一種生物的某個(gè)基因提取出來，加以修飾，然后導(dǎo)入到另外一種生物的細(xì)胞中，定向的改造生物的遺傳性狀?！窘獯稹拷猓海?）限制酶能夠識(shí)別特定的DNA序列并在特定部位切割DNA，F(xiàn)LP基因的表達(dá)產(chǎn)物可以對DNA進(jìn)行切割，所以其作用與限制酶相似?？箍敲顾鼗蜃鳛闃?biāo)記基因，在基因工程中便于重組DNA分子的篩選，含有該基因的受體細(xì)胞能在含卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，從而篩選出含有重組載體的細(xì)胞。（2）從圖中可知，在25℃、3天處理?xiàng)l件下，啟動(dòng)子Patatin可以啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄。因?yàn)槟康幕騍epPO表達(dá)產(chǎn)生與P﹣PPO基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補(bǔ)的RNA，所以表達(dá)的產(chǎn)物可阻斷PPO基因的翻譯過程，使PPO基因不能合成相應(yīng)蛋白質(zhì)。（3）低溫（2℃、3天處理）時(shí)，冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子PCL啟動(dòng)FLP基因的表達(dá)，產(chǎn)生重組酶FLP，F(xiàn)LP能特異性識(shí)別并切除兩個(gè)FLP序列之間的外源基因，這樣就去除了轉(zhuǎn)基因過程中導(dǎo)入的外源基因，從而獲得符合轉(zhuǎn)基因安全的馬鈴薯。故答案為：（1）限制便于重組DNA分子的篩選（2）Patatin翻譯（3）低溫使冷誘導(dǎo)啟動(dòng)子PCL啟動(dòng)FLP基因的表達(dá)，產(chǎn)生重組酶FLP，F(xiàn)LP特異性識(shí)別切除兩個(gè)LF序列之間的外源基因【點(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生的識(shí)記能力和判斷能力，運(yùn)用所學(xué)知識(shí)綜合分析問題的能力是解答本題的關(guān)鍵。12．為監(jiān)測、調(diào)控和利用細(xì)菌的葡萄糖代謝途徑，優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)過程，研究者嘗試通過基因工程技術(shù)構(gòu)建生物傳感器。（1）將GFP（綠色熒光蛋白）基因作為報(bào)告基因，構(gòu)建出基因表達(dá)載體（R），將其導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，應(yīng)先用Ca2+處理大腸桿菌。（2）PE基因編碼的PE酶催化E蛋白磷酸化，磷酸化的E蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖后E蛋白去磷酸化。M蛋白是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子。R作為生物傳感器，包括啟動(dòng)子（P）、GFP基因和PE基因等元件，工作過程如圖1、圖2。①據(jù)圖1、圖2可知，存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖通過E蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞中后被磷酸化，推測M蛋白脫離啟動(dòng)子P，PE表達(dá)產(chǎn)物可使E蛋白重新磷酸化。②在周圍環(huán)境中葡萄糖存在狀態(tài)不同時(shí)，R均可監(jiān)測大腸桿菌的葡萄糖攝取狀態(tài)，請闡釋其工作原理存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞使M蛋白脫離啟動(dòng)子P，PE基因表達(dá)，產(chǎn)生熒光；無葡萄糖時(shí)，M蛋白結(jié)合啟動(dòng)子P，PE基因不表達(dá)，無熒光。③在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)入R的大腸桿菌，分別在不同培養(yǎng)時(shí)間檢測葡萄糖攝取量和熒光強(qiáng)度。若結(jié)果顯示二者呈正相關(guān)，則可確定該生物傳感器具有檢測可靠性。（3）在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸過程中，研究者利用R監(jiān)測大腸桿菌對葡萄糖的攝取，發(fā)現(xiàn)菌體攝入的葡萄糖偏多，因?yàn)榇x過程中形成了一些副產(chǎn)品，導(dǎo)致生產(chǎn)成本偏高。已知大腸桿菌C基因編碼的蛋白C可結(jié)合啟動(dòng)子Pc，促進(jìn)RNA聚合酶也結(jié)合Pc；當(dāng)胞內(nèi)葡萄糖含量較高時(shí)，C蛋白無法結(jié)合Pec，Pc無法啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄。研究者將R的啟動(dòng)子P更換為啟動(dòng)子Pc，解決葡萄糖攝取偏多導(dǎo)致浪費(fèi)的問題。請?jiān)诒砀裰醒a(bǔ)充不同條件下，2個(gè)調(diào)控元件對R的精準(zhǔn)調(diào)控過程。“+”表示相應(yīng)蛋白結(jié)合、“﹣”表示相應(yīng)蛋白脫離。條件Pc中c蛋白的結(jié)合序列M蛋白的結(jié)合序列無葡萄糖++低濃度葡萄糖ⅰ．+ⅱ．﹣高濃度葡萄糖ⅲ．﹣ⅳ．﹣【考點(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】圖文信息類簡答題；基因工程；解決問題能力．【答案】（1）Ca2+（2）脫離啟動(dòng)子P；存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞使M蛋白脫離啟動(dòng)子P，PE基因表達(dá)，產(chǎn)生熒光；無葡萄糖時(shí)，M蛋白結(jié)合啟動(dòng)子P，PE基因不表達(dá)，無熒光；葡萄糖攝取量（3）+；﹣；﹣；﹣【分析】基因工程的基本操作步驟1、目的基因的獲?。簭幕蚪M文庫或cDNA文庫篩選、PCR擴(kuò)增：設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增特定基因片段、人工合成：已知序列的短基因（如胰島素基因）。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：將目的基因與載體用限制酶切割后，通過DNA連接酶連接。3、將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞原核細(xì)胞（如大腸桿菌）：用Ca2+處理使其成為感受態(tài)細(xì)胞，吸收重組質(zhì)粒。真核細(xì)胞：顯微注射法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法。4、篩選與鑒定：抗性篩選、PCR鑒定、核酸雜交、表達(dá)產(chǎn)物檢測。【解答】解：（1）將GFP（綠色熒光蛋白）基因作為報(bào)告基因，構(gòu)建出基因表達(dá)載體（R），將其導(dǎo)入大腸桿菌時(shí)，應(yīng)先用Ca2+處理大腸桿菌。（2）①推測M蛋白的作用：當(dāng)存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖通過E蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞并被磷酸化，此時(shí)M蛋白與啟動(dòng)子P脫離。這是因?yàn)槠咸烟堑拇x產(chǎn)物可能改變了M蛋白的構(gòu)象或磷酸化狀態(tài)，使其失去對啟動(dòng)子的親和力，從而解除對PE基因和GFP基因的轉(zhuǎn)錄抑制。②生物傳感器的工作原理：無葡萄糖時(shí)M蛋白結(jié)合在啟動(dòng)子P上，抑制PE基因和GFP基因的轉(zhuǎn)錄，因此細(xì)胞不產(chǎn)生GFP，無熒光信號(hào)。有葡萄糖時(shí)葡萄糖通過E蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞并被磷酸化，導(dǎo)致M蛋白脫離啟動(dòng)子P。此時(shí)啟動(dòng)子P啟動(dòng)PE基因和GFP基因的轉(zhuǎn)錄，PE酶使E蛋白重新磷酸化以維持葡萄糖攝取，同時(shí)GFP表達(dá)產(chǎn)生熒光。熒光強(qiáng)度與葡萄糖攝取量正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)對葡萄糖攝取狀態(tài)的監(jiān)測。③驗(yàn)證生物傳感器可靠性的檢測指標(biāo)：在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)入R的大腸桿菌，分別在不同培養(yǎng)時(shí)間檢測葡萄糖消耗量和熒光強(qiáng)度。若二者呈正相關(guān)，則證明熒光信號(hào)可可靠反映葡萄糖攝取量。（3）調(diào)控機(jī)制解釋：低濃度葡萄糖時(shí)C蛋白仍能結(jié)合Pc（+），啟動(dòng)子Pc被激活；同時(shí)，葡萄糖的存在使M蛋白脫離啟動(dòng)子（﹣），PE基因和GFP基因高效表達(dá)，促進(jìn)葡萄糖攝取。高濃度葡萄糖抑制C蛋白與Pc的結(jié)合（﹣），啟動(dòng)子Pc活性降低；同時(shí)，M蛋白仍保持脫離狀態(tài)（﹣），但由于Pc失活，PE基因和GFP基因表達(dá)量下降，從而減少葡萄糖攝取，避免浪費(fèi)。這種雙調(diào)控機(jī)制使生物傳感器能根據(jù)葡萄糖濃度動(dòng)態(tài)調(diào)整基因表達(dá)，優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物的生產(chǎn)過程。故答案為：（1）Ca2+（2）脫離啟動(dòng)子P；存在葡萄糖時(shí)，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞使M蛋白脫離啟動(dòng)子P，PE基因表達(dá)，產(chǎn)生熒光；無葡萄糖時(shí)，M蛋白結(jié)合啟動(dòng)子P，PE基因不表達(dá)，無熒光；葡萄糖攝取量（3）+；﹣；﹣；﹣【點(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程的相關(guān)內(nèi)容，要求學(xué)生能運(yùn)用所學(xué)的知識(shí)正確作答。13．CRISPR/Cas9是一種基因編輯技術(shù)，科研人員對其進(jìn)行了一系列改造。（1）Cas9蛋白能與人工設(shè)計(jì)的sgRNA形成復(fù)合體（如圖1）。復(fù)合體中的sgRNA與目的基因按照堿基互補(bǔ)配對原則特異性結(jié)合。復(fù)合體在sgRNA引導(dǎo)下結(jié)合目的基因，Cas9蛋白切割目的基因造成雙鏈斷裂，細(xì)胞在修復(fù)斷裂的DNA時(shí)會(huì)隨機(jī)插入、刪除或替換部分堿基對，從而引發(fā)基因突變。（2）將編碼Cas9蛋白的基因改造后形成新基因dCas9，與Cas9蛋白相比，dCas9蛋白失去剪切活性，但與sgRNA結(jié)合等功能不變。構(gòu)建能夠表達(dá)dCas9的質(zhì)粒A，設(shè)計(jì)一系列與紅色熒光蛋白基因（RFP基因）上游不同部位結(jié)合的sgRNA序列（如圖2），并以此為依據(jù)構(gòu)建能表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒B，將質(zhì)粒A、B共同導(dǎo)入含有RFP基因的大腸桿菌，測定大腸桿菌紅色熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組的紅色熒光強(qiáng)度約為sgRNA3組的100倍。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以得出：dCas9能抑制基因表達(dá)，sgRNA的結(jié)合位置距RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)越近，對基因表達(dá)的抑制作用越強(qiáng)。（3）VP64蛋白可結(jié)合RNA聚合酶，激活基因的轉(zhuǎn)錄，但VP64蛋白無法識(shí)別或結(jié)合特定的DNA片段?？蒲腥藛T欲利用上述系統(tǒng)和VP64蛋白促進(jìn)特定基因表達(dá)，請?jiān)O(shè)計(jì)促進(jìn)細(xì)胞中已存在的基因X表達(dá)的方案。根據(jù)X基因的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)上游序列設(shè)計(jì)sgRNA，合成相應(yīng)基因并構(gòu)建基因表達(dá)載體；構(gòu)建dCas9﹣VP64的融合蛋白表達(dá)載體；將上述表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞?！究键c(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】圖文信息類簡答題；正推法；基因工程；解決問題能力．【答案】（1）堿基互補(bǔ)配對基因突變（2）100dCas9能抑制基因表達(dá)，sgRNA的結(jié)合位置距RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)越近，對基因表達(dá)的抑制作用越強(qiáng)（3）根據(jù)X基因的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)上游序列設(shè)計(jì)sgRNA，合成相應(yīng)基因并構(gòu)建基因表達(dá)載體；構(gòu)建dCas9﹣VP64的融合蛋白表達(dá)載體；將上述表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞【分析】1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)是利用該基因表達(dá)系統(tǒng)中的引導(dǎo)RNA能識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，從而引導(dǎo)Cas9蛋白結(jié)合到相應(yīng)位置并剪切DNA，最終實(shí)現(xiàn)對靶基因序列的編輯。2、基因工程技術(shù)的基本步驟：（1）目的基因的獲取：方法有從基因文庫中獲取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。（2）基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。（3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是感受態(tài)細(xì)胞法。（4）目的基因的檢測與鑒定：分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因﹣﹣DNA分子雜交技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA﹣﹣分子雜交技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)﹣﹣抗原﹣抗體雜交技術(shù)。個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓海?）sCRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術(shù)中的gRNA可通過堿基互補(bǔ)配對原則與目的基因特異性結(jié)合，進(jìn)而特異性的識(shí)別目的基因；然后隨機(jī)插入、刪除或替換部分堿基將導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)的改變，因此屬于基因突變。（2）由圖3柱形圖可知，對照組的紅色熒光強(qiáng)度相對值為1000，sgRNA3組的熒光強(qiáng)度相對值約為10，故對照組的紅色熒光強(qiáng)度約為sgRNA3組的1000÷10＝100倍。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，sgRNA1組和對照組的熒光強(qiáng)度相對值相同，sgRNA2組和sgRNA3組的熒光強(qiáng)度降低，說明sgRNA距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)越近，抑制目的基因表達(dá)作用越強(qiáng)。（3）VP64蛋白可結(jié)合RNA聚合酶，激活基因的轉(zhuǎn)錄，但VP64蛋白無法識(shí)別或結(jié)合特定的DNA片段，而sgRNA具有識(shí)別作用，因此可根據(jù)基因X的序列設(shè)計(jì)sgRNA，使其能識(shí)別X基因的RNA聚合酶識(shí)別序列，讓VP64蛋白與該sgRNA結(jié)合形成復(fù)合體。故答案為：（1）堿基互補(bǔ)配對基因突變（2）100dCas9能抑制基因表達(dá)，sgRNA的結(jié)合位置距RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)越近，對基因表達(dá)的抑制作用越強(qiáng)（3）根據(jù)X基因的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)上游序列設(shè)計(jì)sgRNA，合成相應(yīng)基因并構(gòu)建基因表達(dá)載體；構(gòu)建dCas9﹣VP64的融合蛋白表達(dá)載體；將上述表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞【點(diǎn)評(píng)】本題主要考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，意在考查考生識(shí)圖能力和理解所學(xué)知識(shí)的要點(diǎn)，把握知識(shí)間的內(nèi)在聯(lián)系的能力。14．花青素是一種水溶性色素，屬于黃酮類化合物，具有多種養(yǎng)生功效。如圖是花青素合成酶基因（S）的cDNA（某種生物發(fā)育某個(gè)時(shí)期的mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的互補(bǔ)DNA）和Ti質(zhì)粒圖，科學(xué)家欲利用二者構(gòu)建基因表達(dá)載體，培育出花青素含量更高的藍(lán)莓?；卮鹣铝袉栴}：（1）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增S基因時(shí)，需要引物，引物是指一小段能與DNA母鏈的部分堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸，設(shè)計(jì)引物時(shí)引物的長度需要比計(jì)算出的長度長一些，原因是為了降低非特異性結(jié)合。（2）根據(jù)圖1和圖2分析，上述基因表達(dá)載體的構(gòu)建中應(yīng)選擇限制酶XbaⅠ、HindⅢ切割S基因的cDNA和Ti質(zhì)粒，其目的是保證目的基因（S基因）與載體正向連接，從而提高重組效率。圖2Ti質(zhì)粒中的抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可用于篩選含有基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞?！究键c(diǎn)】基因工程的操作過程綜合．【專題】圖文信息類簡答題；正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）一小段能與DNA母鏈的部分堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸為了降低非特異性結(jié)合（2）XbaⅠ、HindⅢ保證目的基因（S基因）與載體正向連接，從而提高重組效率篩選含有基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：1、目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是鈣離子處理法。4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因——PCR檢測等技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——PCR檢測等技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原—抗體雜交技術(shù)。（2）個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓海?）DNA復(fù)制時(shí)需要引物才能進(jìn)行子鏈的延伸，引物是一段能與DNA母鏈的部分堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸。設(shè)計(jì)引物時(shí)引物的長度要比計(jì)算出的長一些，是為了降低非特異性結(jié)合，因?yàn)橐镞^短，特異性差，容易與其他部位結(jié)合。（2）花青素合成酶基因（基因S）為目的基因，構(gòu)建基因表達(dá)載體時(shí)選擇限制酶，要保證不破壞目的基因和標(biāo)記基因，所以圖中應(yīng)選擇限制酶XhoⅠ、HindⅢ，目的是保證目的基因與運(yùn)載體正確連接，從而提高重組效率。Ti質(zhì)粒中的抗生素抗性基因作為標(biāo)記基因，可用于篩選含基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞，通過在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)受體細(xì)胞，能存活的就是含有重組質(zhì)粒（含標(biāo)記基因）的細(xì)胞。故答案為：（1）一小段能與DNA母鏈的部分堿基序列互補(bǔ)配對的短單鏈核酸為了降低非特異性結(jié)合（2）XbaⅠ、HindⅢ保證目的基因（S基因）與載體正向連接，從而提高重組效率篩選含有基因表達(dá)載體的受體細(xì)胞【點(diǎn)評(píng)】本題考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，難度適中，要求考生理解識(shí)記有關(guān)技術(shù)的原理及操作步驟，能夠結(jié)合題中信息靈活運(yùn)用所學(xué)知識(shí)分析作答。15．將含納豆激酶原基因的表達(dá)組件Pnis﹣aprN整合到乳酸菌的基因組上，即可構(gòu)建出食品級(jí)的基因工程菌，過程如圖。XhoⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、BamHⅠ、SphⅠ為限制酶，origin表示復(fù)制原點(diǎn)，amp為氨芐抗性基因，cm為氯霉素抗性基因。請回答下列問題：（1）圖1為載體pFY006的構(gòu)建過程：首先利用限制酶BamHⅠ獲得質(zhì)粒pFY005上的HisH基因，為保證載體pFY004與HisH基因正確連接，擴(kuò)增HisH基因時(shí)，需在引物的5'（填3'或5'）端添加限制酶HindⅢ和EcoRⅠ的識(shí)別序列。（2）圖2為載體pFY007，研究團(tuán)隊(duì)利用限制酶SphⅠ對載體pFYO06和pFY007進(jìn)行同源重組，將納豆激酶原基因的表達(dá)組件Pnis﹣aprN整合到載體pFYO006上，構(gòu)建出長度為4791bp的基因表達(dá)載體pFY008。為驗(yàn)證重組載體pFY008是否構(gòu)建成功，需利用限制酶SphⅠ，通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測酶切產(chǎn)物，得到大約1484bp的條帶，若此條帶大小與目的基因Pnis﹣aprN序列大小相符，則表明構(gòu)建成功。（3）當(dāng)pH值＜5.0時(shí)，納豆激酶迅速失活，乳酸菌發(fā)酵后培養(yǎng)基pH值往往為3～4，分泌到細(xì)胞外的納豆激酶可能失活。某科研團(tuán)隊(duì)欲利用蛋白質(zhì)工程來解決此問題，應(yīng)從預(yù)期的納豆激酶的功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的納豆激酶的結(jié)構(gòu)，推測應(yīng)有的氨基酸序列，找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列或合成新的基因，從而獲得所需要的納豆激酶?！究键c(diǎn)】蛋白質(zhì)工程基本原理；基因工程的操作過程綜合．【專題】正推法；基因工程；理解能力．【答案】（1）BamHⅠ；5'；HindⅢ和EcoRⅠ（2）SphⅠ；瓊脂糖凝膠電泳；1484（3）預(yù)期的納豆激酶的功能；預(yù)期的納豆激酶的結(jié)構(gòu)；脫氧核苷酸序列【分析】基因工程技術(shù)的基本步驟：1、目的基因的獲?。悍椒ㄓ袕幕蛭膸熘蝎@取、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增和人工合成。2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建：是基因工程的核心步驟，基因表達(dá)載體包括目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞：根據(jù)受體細(xì)胞不同，導(dǎo)入的方法也不一樣。將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法；將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最有效的方法是顯微注射法；將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞的方法是鈣離子處理法。4、目的基因的檢測與鑒定：（1）分子水平上的檢測：①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA是否插入目的基因——PCR檢測等技術(shù)；②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA——PCR檢測等技術(shù)；③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)——抗原—抗體雜交技術(shù)。（2）個(gè)體水平上的鑒定：抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等?！窘獯稹拷猓海?）據(jù)圖可知，質(zhì)粒pFY005上的HisH基因的上游和下游均有BamHⅠ的酶切位點(diǎn)，因此，要獲得質(zhì)粒pFY005上的HisH基因需用限制酶BamHⅠ切割。分析圖1中重組質(zhì)粒，HisH基因的上游、下游分別有EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位點(diǎn)，而SphⅠ的酶切位點(diǎn)位于基因內(nèi)部，因此，為保證載體pFY004與HisH基因正確連接，需在擴(kuò)增HisH基因的引物對的5'端加上限制酶HindⅢ和EcoRⅠ的序列。（2）利用限制酶SphⅠ對載體pFYO06和pFY007進(jìn)行同源重組，構(gòu)建出長度為4791bp的基因表達(dá)載體pFY008，驗(yàn)證重組載體pFY008是否構(gòu)建成功，可用限制酶SphⅠ切割。通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測酶切產(chǎn)物，基因表達(dá)載體pFY008長度是4791bp，pFY006的長度是3307bp，二者之間的差值即目的基因的大小，4791﹣3307＝1484bp；因此，若得到1484bp左右的條帶，條帶大小與目的基因Pnis﹣aprN基本相符，則表明構(gòu)建成功。（3）根據(jù)蛋白質(zhì)工程的一般技術(shù)流程，要利用蛋白質(zhì)工程解決題述問題，需從預(yù)期的納豆激酶功能出發(fā)，設(shè)計(jì)預(yù)期的納豆激酶的結(jié)構(gòu)，并推測應(yīng)有的氨基酸序列，再找到并改變相對應(yīng)的脫氧核苷酸序列（或合成新基因），從而獲得所需的納豆激酶。故答案為：（1）BamHⅠ；5'；HindⅢ和EcoRⅠ（2）SphⅠ；瓊脂糖凝膠電泳；1484（3）預(yù)期的納豆激酶的功能；預(yù)期的納豆激酶的結(jié)構(gòu)；脫氧核苷酸序列【點(diǎn)評(píng)】本題結(jié)合實(shí)際應(yīng)用情境考查基因工程的相關(guān)知識(shí)，難度適中，要求學(xué)生掌握相關(guān)的基礎(chǔ)知識(shí)，并能夠靈活運(yùn)用所學(xué)知識(shí)分析、解決實(shí)際問題。

考點(diǎn)卡片1．DNA的粗提取與鑒定【知識(shí)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)】DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色?！久}方向】下列有關(guān)“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，正確的是（）A．植物材料需先用洗滌劑破壞細(xì)胞壁再吸水漲破，釋放DNAB．在新鮮豬血中加入適量的檸檬酸鈉，混合均勻后離心取血細(xì)胞液C．在含有DNA的2mol/L的氯化鈉溶液中加入蒸餾水，攪拌出現(xiàn)絲狀物后停止加水D．鑒定DNA時(shí)，將絲狀物溶解于2mol/L的氯化鈉溶液中，再加入二苯胺試劑進(jìn)行沸水浴分析：DNA粗提取和鑒定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白質(zhì)等其他成分在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)溶于酒精；DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性。（2）DNA的鑒定：在沸水浴的條件下，DNA遇二苯胺會(huì)被染成藍(lán)色。解答：A、植物材料需先用洗滌劑破壞細(xì)胞膜，再吸水漲破，釋放DNA，A錯(cuò)誤；B、哺乳動(dòng)物（豬血）成熟的紅細(xì)胞沒有DNA，不能用于提取DNA，在新鮮雞血中加入適量的檸檬酸鈉，目的是防止血液凝固，混合均勻后離心，取血細(xì)胞的沉淀物，B錯(cuò)誤；C、在含有DNA的2mol/L的氯化鈉溶液中加入蒸餾水，NaCl的濃度逐漸降低，DNA析出，待絲狀物不再增加后停止加水，C錯(cuò)誤；D、鑒定DNA時(shí)，將絲狀物溶解于水中，再加入二苯胺試劑進(jìn)行沸水浴，出現(xiàn)藍(lán)色，D正確。故選：D。點(diǎn)評(píng)：本題主要考查的是DNA的粗提取與鑒定的相關(guān)知識(shí)，意在考查學(xué)生對基礎(chǔ)知識(shí)的理解掌握，難度適中。【解題思路點(diǎn)撥】掌握DNA的粗提取與鑒定的相關(guān)知識(shí)是解題的關(guān)鍵。2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建【知識(shí)點(diǎn)的認(rèn)識(shí)】構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程：首先用一定的限制酶切割載體，使它出現(xiàn)一個(gè)切口；然后用同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個(gè)重組DNA分子?！久}方向】構(gòu)建基因表達(dá)載體的過程是基因