核心考點(diǎn)DAY08《基因工程》-2（核酸和PCR）專題01.遺傳物質(zhì)（做題時(shí)注意：對(duì)象）（1）生物界（所有生物）：因?yàn)榻^大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是DNA,所以說DNA是主要的遺傳物質(zhì)。（2）具體生物：其遺傳物質(zhì)是DNA或RNA。(只能是一種)原核生物（如細(xì)菌）的遺傳物質(zhì)是DNA，真核生物的遺傳物質(zhì)是RNA，T2噬菌體的遺傳物質(zhì)是DNA。煙草花葉病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。HIV病毒的遺傳物質(zhì)是RNA。02.基因：通常是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。（1）以DNA為遺傳物質(zhì)的生物，基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。（2）以RNA為遺傳物質(zhì)的生物，基因是有遺傳效應(yīng)的DNA片段。03.DNA的結(jié)構(gòu)：（1）一個(gè)雙鏈DNA分子(鏈狀)具有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，而環(huán)狀DNA分子具有0個(gè)游離的磷酸基團(tuán)。1個(gè)脫氧核糖與1或2個(gè)磷酸基團(tuán)連接。（2）氫鍵的形成不需要酶，但斷裂需解旋酶或高溫加熱處理。（3）G—C堿基對(duì)比例越大，DNA熱穩(wěn)定性越穩(wěn)定。（4）相鄰的堿基在DNA分子的一條單鏈中通過—脫氧核糖—磷酸—脫氧核糖—相連接，互補(bǔ)的堿基在DNA的雙鏈之間通過相連接。（5）下圖表示DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)化形式，其中①是磷酸二酯鍵，②是氫鍵。解旋酶作用于②部位，限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶作用于①部。（6）核苷酸04.DNA的復(fù)制和PCR技術(shù)DNA復(fù)制PCR技術(shù)原理DNA半保留復(fù)制解旋解旋酶高溫場(chǎng)所（真核）主要在細(xì)胞核，也在葉綠體、線粒體。細(xì)胞外（在PCR儀中）酶解旋酶、普通的DNA聚合酶耐高溫DNA聚合酶（Taq酶）合成子鏈在引物基礎(chǔ)上，一條鏈連續(xù)合成；另一條鏈不連續(xù)合成，再由DNA連接酶連接。分別從兩條鏈的3′端開始延伸，都是（連續(xù)/不連續(xù)）合成。過程邊解旋邊復(fù)制變性→復(fù)性→延伸產(chǎn)物完整DNADNA片段（兩個(gè)引物之間的DNA片段）溫度細(xì)胞內(nèi)溫和條件需控制溫度，在較（高/低）溫度下引物RNADNA原料脫氧核苷酸（或dNTP）dNTP焦磷酸dNTP焦磷酸子鏈子鏈DNA復(fù)制模板鏈DNA復(fù)制模板鏈DNA復(fù)制：半保留復(fù)制、雙向復(fù)制、多起點(diǎn)復(fù)制、DNA復(fù)制：半保留復(fù)制、雙向復(fù)制、多起點(diǎn)復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制（1）引物：一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸（選擇性必修3P77）（2）自然界中的DNA復(fù)制和PCR為什么都需要引物？原因是：DNA聚合酶：能夠從引物的3′（3′/5′）端開始連接脫氧核苷酸，子鏈的延伸方向?yàn)?′→3′?！綝NA聚合酶只能將單個(gè)的dNTP連接到已有片段（引物）的3′端。】（3）真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。（4）在PCR過程中實(shí)際加入的為dNTP(dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。（故PCR過程中不用另外加入能量）（5）PCR（可以/不可以）擴(kuò)增mRNA嗎？原因是：不可以直接擴(kuò)增mRNA,需將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（選擇性必修3P79）（6）PCR技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)：PCR技術(shù)是擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA片段。需將人工構(gòu)建的限制酶識(shí)別序列添加到引物的端（填:“5′”、“3′”）例1.（2022，山東，節(jié)選）(2)引物用PCR技術(shù)將DNA分子中的A1片段進(jìn)行擴(kuò)增，設(shè)計(jì)了引物Ⅰ、Ⅱ，其連接部位如圖所示，X為某限制酶識(shí)別序列。擴(kuò)增后得到的絕大部分DNA片段是圖中的（）【答案】D【解析】PCR技術(shù)是擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA片段。故選D例2.（2025屆高三調(diào)研卷·廣州零模卷，T21節(jié)選）（3）采用單酶切后進(jìn)行連接反應(yīng)，T啟動(dòng)子容易出現(xiàn)正向連接（圖中箭頭向右，目的基因正常轉(zhuǎn)錄）和反向連接（圖中箭頭向左，目的基因無法轉(zhuǎn)錄）兩種情況。選用引物（填序號(hào)）進(jìn)行擴(kuò)增可以鑒定出正向連接的情況，原因是?！敬鸢浮恳铫俸鸵铫?或“引物②和引物④”)

正向連接時(shí)使用引物①和引物③進(jìn)行PCR可獲得預(yù)期產(chǎn)物，反向連接無法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。（8）PCR過程中，延伸時(shí)需要加入兩種引物，原因是:DNA是反向平行的雙鏈，DNA聚合酶只能從引物3′端延伸DNA鏈，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增。05.PCR技術(shù)專題Ⅰ.PCR技術(shù)“引物”歸類分析（1）引物的設(shè)計(jì)：兩種引物的要求：①引物自身不能環(huán)化。②兩種引物之間不能堿基互補(bǔ)配對(duì)。③引物長(zhǎng)度不宜過短，防止引物與DNA隨機(jī)結(jié)合，導(dǎo)致引物的特異性下降。例3.(經(jīng)典高考題節(jié)選)設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，而造成引物自連。同理也要避免引物之間的互補(bǔ)。復(fù)性溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同且G、C含量高的引物需要設(shè)定更高的復(fù)性溫度。例4.(2020·山東，25節(jié)選)（1）通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性的擴(kuò)增出Wx基因的cDNA，原因是引物是根據(jù)Wx基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結(jié)合)。(2)科學(xué)設(shè)計(jì)引物是PCR能否成功的關(guān)鍵，若引物的堿基過多或引物的G、C含量過高，會(huì)造成PCR的效率偏低，收獲的目的基因較少，原因是引物與模板鏈結(jié)合過于緊密，變性時(shí)引物不易與模板鏈脫離(影響變性)。若對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)或多個(gè)條帶，從引物角度分析，原因可能是引物過短導(dǎo)致引物的特異性下降。(2024·山東，5)制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴(kuò)增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標(biāo)記的dATP)的反應(yīng)管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA。已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，且在本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針的反應(yīng)管有()A.①②B.②③C.①④D.③④【答案】D【解析】制備熒光標(biāo)記的DNA探針時(shí)，需要模板、引物、DNA聚合酶等，①試管中的兩種單鏈能錯(cuò)位配對(duì)，但是配對(duì)后伸出來的游離的單鏈?zhǔn)?′末端，因缺乏模板，無法利用原料進(jìn)行延伸，因此不能得到帶有熒光標(biāo)記的DNA探針，①不符合題意；③試管中的兩種單鏈可以錯(cuò)位局部配對(duì)，配對(duì)后伸出來的游離單鏈?zhǔn)?′端，是可以彼此提供模板和引物，并且利用堿基被熒光標(biāo)記的dATP進(jìn)行延伸的，③符合題意；②和④試管加的都是1種單鏈DNA，試管中存在兩種可能：一是這條單鏈的3′端回折與自身一部分堿基配對(duì)，從而作為引物和模板，即，但是配對(duì)區(qū)只有5個(gè)堿基對(duì)，即使經(jīng)過延伸最終只有8個(gè)堿基對(duì)，與題中“本實(shí)驗(yàn)的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的雙鏈DNA區(qū)”這句話相矛盾；二是加入適量同種單鏈，2條相同單鏈之間可以反向互補(bǔ)配對(duì)成雙鏈區(qū)。對(duì)于②試管，配對(duì)后：，配對(duì)區(qū)大于9個(gè)堿基對(duì)，但因伸出來的模板鏈堿基是AGA，導(dǎo)致延伸時(shí)堿基被熒光標(biāo)記的dATP無法摻入到子鏈合成中去，因此②不符合題意；對(duì)于④試管，配對(duì)后：，配對(duì)區(qū)大于9個(gè)堿基對(duì)，且伸出來的模板鏈堿基是TTC，堿基被熒光標(biāo)記的dATP必然可以摻入到子鏈合成中去，④符合題意。綜上，故選D。（2）引物的修飾例6.(2022·山東，25節(jié)選)某種類型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過影響這一過程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－PΔ。PΔ是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或PΔ的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或PΔ的功能。①為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是能與P基因模板鏈3′端的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸，為使PCR產(chǎn)物能被限制酶切割，需在引物上添加相應(yīng)的限制酶識(shí)別序列，該限制酶識(shí)別序列應(yīng)添加在引物的______(填“3′端”或“5′端”)。②PCR擴(kuò)增得到的P基因經(jīng)酶切連接插入載體后，與編碼FLAG的序列形成一個(gè)融合基因，如圖所示，其中“ATGTGCA”為P基因編碼鏈起始序列。將該重組載體導(dǎo)入細(xì)胞后，融合基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同。據(jù)圖分析，出現(xiàn)該問題的原因P基因編碼鏈的第一個(gè)堿基與EcoRⅠ識(shí)別序列的最后兩個(gè)堿基編碼一個(gè)氨基酸，導(dǎo)致mRNA的密碼子被錯(cuò)位讀取。修改擴(kuò)增P基因時(shí)使用的帶有EcoRⅠ識(shí)別序列的引物來解決該問題，具體修改方案是在引物中的EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基?！窘馕觥咳诤匣蜣D(zhuǎn)錄出的mRNA序列正確，翻譯出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正確，但P基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與P不同，說明P基因翻譯時(shí)出錯(cuò)。由圖可看出，在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中，限制酶識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的最后兩個(gè)堿基與P基因?qū)?yīng)的第一個(gè)堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，導(dǎo)致讀碼框改變，翻譯出的氨基酸序列改變，可通過在EcoRⅠ識(shí)別序列3′端添加1個(gè)堿基，使其堿基數(shù)目加上FLAG的堿基數(shù)目為3的倍數(shù)，這樣能保證P基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA上的讀碼框不改變，能夠正常翻譯。（3）引物的結(jié)合方向例7.如圖為X蛋白的部分基因序列，所示序列為引物結(jié)合的部分，據(jù)圖分析：擴(kuò)增X蛋白基因所需的引物序列是5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′；5′-TGATCTACGGCTTACA-3′?！窘馕觥繒鴮懸镄蛄?，一般從引物的5′端向3′端書寫，避免誤判。圖中位于上方的模板鏈5′端磷酸基團(tuán)在左側(cè)，3′端羥基在右側(cè)，可知與上方模板鏈配對(duì)的引物5′端在右側(cè)，3′端在左側(cè)，引物序列為5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推測(cè)另外一條引物的序列。（4）引物的選擇例8.（2023·山東）科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J－V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(1)與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是RNA聚合酶。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有復(fù)制原點(diǎn)、標(biāo)記基因(答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F1和R2(或F2和R1)。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的________(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了J－V5融合蛋白，條帶2所檢出的蛋白________(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的?！窘馕觥?2)據(jù)圖甲可知，引物F1與R2或F2與R1結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測(cè)為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F1和R2或F2和R1。b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3′→5′，非模板鏈(a鏈)是5′→3′；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5′→3′，引物延伸的方向也是5′→3′，所以引物結(jié)合的單鏈延伸方向是3′→5′；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?′→5′的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平。分析題圖可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體檢測(cè)后，均有條帶1，說明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了J－V5融合蛋白。用抗J蛋白抗體檢測(cè)后，出現(xiàn)條帶2，而用抗V5抗體檢測(cè)后，沒有出現(xiàn)條帶2，說明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。例9.（2025?浙江，1月）3-磷酸甘油脫氫酶（GPD）是酵母細(xì)胞中甘油合成的關(guān)鍵酶。利用某假絲酵母菌株為材料，克隆具有高效催化效率的3-磷酸甘油脫氫酶的基因（Gpd）。采用的方案是：先通過第1次PCR擴(kuò)增出該基因的中間部分，再通過第2次PCR分別擴(kuò)增出該基因的兩側(cè)，經(jīng)拼接獲得完整基因的序列，如圖所示，回答下列問題：

(1)分析不同物種的GPD蛋白序列，確定蛋白質(zhì)上相同的氨基酸區(qū)段，依據(jù)這些氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子序列，確定DNA序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)1對(duì)引物。以該菌株基因組DNA為模板進(jìn)行第1次PCR，利用瓊脂糖凝膠電泳分離并純化DNA片段，進(jìn)一步測(cè)定PCR產(chǎn)物的序列。在制備PCR反應(yīng)體系時(shí)，每次用微量移液器吸取不同試劑前，需要確認(rèn)或調(diào)整刻度和量程，還需要更換微量移液器的槍頭。(2)若在上述PCR擴(kuò)增結(jié)果中，除獲得一條陽性條帶外，還出現(xiàn)了另外一條條帶，不可能的原因是C。A．DNA模板被其他酵母細(xì)胞的基因組DNA污染B．每個(gè)引物與DNA模板存在2個(gè)配對(duì)結(jié)合位點(diǎn)C．在基因組中Gpd基因有2個(gè)拷貝D．在基因組中存在1個(gè)與Gpd基因序列高度相似的其他基因(3)為獲得完整的Gpd基因，分別用限制性核酸內(nèi)切酶PstⅠ和SalⅠ單酶切基因組DNA后，各自用DNA連接酶連接形成環(huán)形DNA，再用苯酚-氯仿抽提除去雜質(zhì)，最后加入冷卻的95%酒精沉淀環(huán)形DNA。根據(jù)第一次PCR產(chǎn)物測(cè)定獲得的序列，重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以環(huán)形DNA為模板進(jìn)行第二次PCR，最后進(jìn)行測(cè)序。用于第二次PCR的一對(duì)引物，其序列應(yīng)是DNA鏈上的（A．P1和P2

B．P3和P4C．P1和P4D．P2和P3）。根據(jù)測(cè)序結(jié)果拼接獲得完整的Gpd基因序列，其中的啟動(dòng)子和終止子具有調(diào)控功能。(4)為確定克隆獲得的Gpd基因的準(zhǔn)確性，可將獲得的基因序列與已建立的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。將Gpd基因的編碼區(qū)與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)利用釀酒酵母高效合成甘油的目的?！窘馕觥浚?）分析不同物種的GPD蛋白序列，確定蛋白質(zhì)上相同的氨基酸區(qū)段，依據(jù)這些氨基酸所對(duì)應(yīng)的密碼子，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)，確定DNA序列，進(jìn)而設(shè)計(jì)1對(duì)引物?？赏ㄟ^瓊脂糖凝膠電泳分離并純化目標(biāo)DNA片段。在制備PCR反應(yīng)體系時(shí)，每次用微量移液器吸取不同試劑前，需要更換微量移液器的槍頭，以避免交叉污染。（2）A、DNA模板被其他酵母細(xì)胞的基因組DNA污染，可能擴(kuò)增出其他DNA，從而出現(xiàn)另外一條條帶，A不符合題意；B、每個(gè)引物與DNA模板存在2個(gè)配對(duì)結(jié)合位點(diǎn)，從而擴(kuò)增出不同的DNA片段，從而出現(xiàn)另外一條條帶，B不符合題意；C、在基因組中Gpd基因有2個(gè)拷貝，擴(kuò)增出的DNA是相同DNA，電泳時(shí)只會(huì)出現(xiàn)一個(gè)條帶，C符合題意；D、在基因組中存在1個(gè)與Gpd基因序列高度相似的其他基因，可能將相似的基因擴(kuò)增出來，從而出現(xiàn)另外一條條帶，D不符合題意。故選C。（3）DNA在冷的95%乙醇中溶解度較低，可通過將酶切后的DNA經(jīng)苯酚-氯仿抽提除去雜質(zhì)，在加入冷的95%乙醇中沉淀，得到環(huán)形DNA。因?yàn)橐颬1與P2的序列從左向右為5’→3’，與圖中下邊的DNA鏈部分序互補(bǔ)配對(duì)，引物P3與P4的序列從左向右為3’→5’，與圖中上邊的DNA鏈部分序互補(bǔ)配對(duì)。以環(huán)形DNA為模板進(jìn)行第二次PCR時(shí)，應(yīng)選擇對(duì)已知序列反向，但對(duì)未知序列卻是相向的引物，即P1和P4，從而得以擴(kuò)增出未知序列。啟動(dòng)子可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，終止子可終止轉(zhuǎn)錄，即啟動(dòng)子和終止子具有調(diào)控功能。（4）為確定克隆獲得的Gpd基因的準(zhǔn)確性，可將獲得的基因序列與已建立的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比，若二者相同，則說明克隆獲得的Gpd基因準(zhǔn)確。將Gpd基因的編碼區(qū)與表達(dá)載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母細(xì)胞中，使之進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)利用釀酒酵母高效合成甘油的目的。（5）引物的數(shù)量計(jì)算①已知引物1及引物2之間的序列為目的序列，若引物與DNA的結(jié)合位點(diǎn)如右圖所示，在第1輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條單鏈等長(zhǎng)的目的片段。選擇性必修3P78,圖3-5②已知引物1及引物2之間的序列為目的序列，若引物與DNA的結(jié)合位點(diǎn)如右圖所示，在第2輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條單鏈等長(zhǎng)的目的片段。③已知引物1及引物2之間的序列為目的序列，若引物與DNA的結(jié)合位點(diǎn)如下圖所示，在第3輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條單鏈等長(zhǎng)的目的片段。一個(gè)DNA分子n次擴(kuò)增，A.子代DNA分子中等長(zhǎng)鏈的DNA分子數(shù)為2n-2n個(gè)；B.子代DNA分子中不等長(zhǎng)鏈的DNA分子數(shù)為2n個(gè)；C.子代DNA分子中含模板鏈DNA分子數(shù)為2個(gè)；D.子代DNA分子中含引物A(或B)的DNA分子數(shù)為2n-1個(gè)；E.復(fù)制過程中共需引物2n+1-2個(gè)；F.第n次復(fù)制需要引物2n個(gè)。Ⅱ.PCR產(chǎn)物鑒定——瓊脂糖凝膠電泳DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就是電泳。PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來。(2024·黑吉遼，7)關(guān)于采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物的實(shí)驗(yàn)，下列敘述正確的是(A)A.瓊脂糖凝膠濃度的選擇需考慮待分離DNA片段的大小瓊脂糖B.凝膠載樣緩沖液中指示劑的作用是指瓊脂糖Lane1:DL2000DNAMarkerLane2:gfp基因PCR對(duì)照Lane1:DL2000DNAMarkerLane2:gfp基因PCR對(duì)照Lane3-6:各組PCR樣品綠色熒光蛋白(gfp)基因相對(duì)分子質(zhì)量量為750bp左右C.在同一電場(chǎng)作用下，DNA片段越長(zhǎng)，向負(fù)極遷移速率越快D.瓊脂糖凝膠中的DNA分子可在紫光燈下被檢測(cè)出來【解析】瓊脂糖凝膠的濃度會(huì)影響DNA分子在凝膠中的遷移率和分辨率，瓊脂糖凝膠的濃度通常是根據(jù)所需分離的DNA片段大小來選擇的。對(duì)于較大的DNA片段，比如基因組DNA或質(zhì)粒DNA，通常選擇較低濃度的瓊脂糖凝膠，因?yàn)樗鼈冃枰蟮目讖絹碛行нw移；而對(duì)于較小的DNA片段，比如PCR產(chǎn)物或酶切片段，則需要選擇較高濃度的瓊脂糖凝膠，以提供更好的分辨率和分離效果，A正確；凝膠載樣緩沖液中指示劑只是指示電泳進(jìn)度，當(dāng)指示劑前沿接近凝膠邊緣時(shí)，則停止電泳，它不能指示DNA分子的具體位置，B錯(cuò)誤；DNA片段的遷移速率與其大小成反比，即DNA片段越長(zhǎng)，遷移速率越慢，DNA遷移方向?yàn)閺呢?fù)極向正極，C錯(cuò)誤；瓊脂糖凝膠中的DNA分子與其中的核酸染料結(jié)合后，可在波長(zhǎng)為300nm的紫外燈下被檢測(cè)出來，D錯(cuò)誤。Ⅲ.PCR技術(shù)的應(yīng)用(1)利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式例10.為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖中A所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是乙和丙。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是目的基因反向連接?！窘馕觥咳鐖DA所示，如果用引物乙和丙，若正確連接則會(huì)產(chǎn)生350bp片段，反向連接則不會(huì)出現(xiàn)；同理，若用引物甲和丙，無論正向連接還是反向連接均會(huì)產(chǎn)生450bp片段。根據(jù)圖B進(jìn)行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向連接會(huì)擴(kuò)增出400bp片段。(2)利用重疊延伸PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變例11.如圖為利用重疊延伸PCR的方法在蛋白a基因中部引入定點(diǎn)突變(A/T堿基對(duì)變?yōu)镚/C)的過程。該過程需設(shè)計(jì)四種引物，其中引物A、D與蛋白a基因的兩端完全配對(duì)，引物B、C雖與蛋白a基因中部配對(duì)，但在欲引入突變的位置替換為突變后的堿基。通過多次獨(dú)立的PCR達(dá)到目的。下列說法不正確的是(B)A.PCR1所用引物應(yīng)為引物A和BB.PCR2至PCR4依次以PCR1至PCR3的產(chǎn)物為模板C.PCR3無需額外加入引物D.PCR4的作用是大量擴(kuò)增突變基因【解析】引物與模板的3′端結(jié)合，由圖PCR1的產(chǎn)物可知，PCR1所用引物應(yīng)為引物A和B，A正確；由圖可知，PCR1和PCR2均以原始DNA為模板，PCR3以PCR1和PCR2的產(chǎn)物為模板，PCR4以PCR3的產(chǎn)物為模板，B錯(cuò)誤；由圖可知，兩條鏈互為模板和引物，故PCR3無需額外加入引物，C正確；PCR4的作用是大量擴(kuò)增突變基因，得到大量的新的蛋白a基因，D正確。(3)利用重疊延伸PCR技術(shù)構(gòu)造融合基因例12.融合PCR技術(shù)是采用具有互補(bǔ)末端的引物，將不同來源的擴(kuò)增片段連接起來的方法，其過程如圖1所示。圖2是中間載體1和中間載體2(利用融合PCR技術(shù)構(gòu)建成)構(gòu)建成葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體示意圖(限制酶酶切位點(diǎn)標(biāo)注于載體外側(cè))，葉綠體定點(diǎn)整合表達(dá)載體通過與葉綠體基因的同源重組，將目的基因整合于葉綠體DNA上的特定位點(diǎn)上。請(qǐng)據(jù)圖回答下列問題：(1)圖1第一階段中PCR至少進(jìn)行2次循環(huán)，才能獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA，第二階段中引物2與引物3部分堿基的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。(2)若通過融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設(shè)計(jì)8種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有6種。(3)圖2中需使用SpeⅠ、SalⅠ(填限制酶)和DNA連接酶將兩中間載體構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體，途中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)?！窘馕觥浚?）分析圖1可知，在第一階段中，利用PCR技術(shù)進(jìn)行第一次擴(kuò)增(循環(huán))，得到的含有引物2、引物3的產(chǎn)物，其DNA雙鏈不等長(zhǎng)，該產(chǎn)物繼續(xù)進(jìn)行第二次擴(kuò)增(循環(huán))，才能獲得雙鏈等長(zhǎng)的DNA。第二階段中引物2與引物3部分堿基的互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系使得兩DNA能成功“搭橋”連接起來。（2）圖1顯示：通過融合PCR技術(shù)，每一次將兩個(gè)DNA片段拼接起來，需要4個(gè)引物，其中有2個(gè)起著“搭橋”作用。依此類推，若通過融合PCR技術(shù)將啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、目的基因、終止子拼接起來，需要設(shè)計(jì)8種引物，其中能夠起著“搭橋”作用的引物有6種。(3)圖2顯示：?jiǎn)?dòng)子和終止子的兩端分別有SpeⅠ和SalⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，葉綠體同源重組基因1與2之間也存在SpeⅠ和SalⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，因此圖2中需使用SpeⅠ、SalⅠ和DNA連接酶將兩中間載體構(gòu)建成定點(diǎn)整合表達(dá)載體，圖中定點(diǎn)整合表達(dá)載體上未標(biāo)出的結(jié)構(gòu)是復(fù)制原點(diǎn)。(4)利用反向PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列例13.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)。請(qǐng)據(jù)圖回答問題：(1)如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是②④(從表格引物①②③④中選擇，填編號(hào))。(2)對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是B。A.5′-AACTATGCG－－－－－－AGCCCTT-3′B.5′-AATTCCATG－－－－－－CTGAATT-3′C.5′-GCAATGCGT－－－－－－TCGGGAA-3′D.5′-TTGATACGC－－－－－－CGAGTAC-3′【解析】(1)由于已知序列的外側(cè)是未知序列(如圖中待擴(kuò)增的未知序列)，因此無法設(shè)計(jì)引物。若要分析出已知序列兩側(cè)的未知序列，設(shè)計(jì)引物是關(guān)鍵，可以采用反向PCR技術(shù)。反向PCR的操作步驟可以分為兩步。第一步是連接成環(huán)，即用限制酶切割DNA，用DNA連接酶將其連接成環(huán)，即圖中Ⅰ酶切和Ⅱ連接過程。第二步是反向擴(kuò)增，即根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以環(huán)狀DNA兩條鏈為模板，從已知序列向未知序列方向進(jìn)行反向擴(kuò)增，利用TaqDNA聚合酶無法將DNA連接成環(huán)的特點(diǎn)，得到鏈狀DNA，即圖中Ⅲ擴(kuò)增過程。采用反向PCR擴(kuò)增未知序列，又因子鏈的延伸方向從5′→3′，可根據(jù)已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和3′-CGTTACGCATCGGAGA-′5，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)PCR引物是5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′和5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，(2)對(duì)產(chǎn)物測(cè)序，得到片段F的完整序列，因?yàn)槠蜦是被限制酶EcoRⅠ剪切的兩端，所以5′端應(yīng)該是AATTC，對(duì)應(yīng)F片段的開頭，故選B。例14.（2023·浙江）某研究小組利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將綠色熒光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如圖甲所示。實(shí)驗(yàn)得到能正常表達(dá)兩種蛋白質(zhì)的雜合子雌雄小鼠各1只，交配以期獲得Gata3-GFP基因純合子小鼠。為了鑒定交配獲得的4只新生小鼠的基因型，設(shè)計(jì)了引物1和引物2用于PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖乙所示。下列敘述正確的是（B）A．Gata3基因的啟動(dòng)子無法控制GFP基因的表達(dá)B．翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白C．2號(hào)條帶的小鼠是野生型，4號(hào)條帶的小鼠是Gata3-GFP基因純合子D．若用引物1和引物3進(jìn)行PCR，能更好地區(qū)分雜合子和純合子(5)實(shí)時(shí)熒光定量PCR【解析】A、分析圖中可知，啟動(dòng)子在左側(cè)，GFP基因整合Gata3基因的右側(cè)，啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后，可以使GEP基因轉(zhuǎn)錄，Gata3基因的啟動(dòng)子能控制GFP基因的表達(dá)，A錯(cuò)誤；B、因啟動(dòng)子在左側(cè)，轉(zhuǎn)錄的方向向右，合成的mRNA從左向右為5′→3′，剛好是翻譯的方向，所以翻譯時(shí)先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正確；C、整合GFP基因后，核酸片段變長(zhǎng)，2號(hào)個(gè)體只有大片段，所以是Gata3-GFP基因純合子，4號(hào)個(gè)體只有小片段，是野生型，C錯(cuò)誤；D、用引物1和引物3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小差異較小，無法較好的區(qū)分片段，D錯(cuò)誤。故選B。例15.實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)稱qPCR，靈敏度高特異性好，是目前檢測(cè)微小殘留病變的常用方法。將標(biāo)有熒光素的Taqman探針與待測(cè)樣本DNA混合后，在變性、復(fù)性、延伸的熱循環(huán)中，與待測(cè)樣本DNA配對(duì)結(jié)合的Taqman探針被Taq酶切斷，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒光(如圖所示)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度增加，通過實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(該值與待測(cè)樣本中目的基因的個(gè)數(shù)呈負(fù)相關(guān))。下列有關(guān)敘述正確的是(A)A.每個(gè)模板DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)B.做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成1種引物和1種Taqman探針C.在反應(yīng)過程中，需要細(xì)胞中的ATP為新鏈的合成提供能量D.熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明含有的病變的概率越小【解析】DNA分子為反向平行的兩條鏈，每條鏈都含有1個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，則一個(gè)DNA分子含有2個(gè)游離的磷酸基團(tuán)，A正確；做qPCR之前，需要先根據(jù)目的基因的核苷酸序列合成1對(duì)引物和1種Taqman探針，B錯(cuò)誤；在反應(yīng)過程中，dNTP為新鏈的合成提供能量，C錯(cuò)誤；若熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)，經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)越少，說明擴(kuò)增次數(shù)越少，說明更多的熒光探針與目的基因進(jìn)行了堿基互補(bǔ)配對(duì)，可推測(cè)獲得的核酸產(chǎn)物中含有病變的概率越大，D錯(cuò)誤。(6)“雙脫氧法”基因測(cè)序雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)缺乏PCR延伸所需的3′-OH，因此每當(dāng)DNA鏈加入分子ddNTP時(shí)，延伸便終止。(2)每一次DNA測(cè)序是由4個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)組成的，4個(gè)PCR反應(yīng)體系均加入模板、引物、dNTP、DNA聚合酶，唯一不同的是4個(gè)反應(yīng)體系分別加入不同的含有標(biāo)記的ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP。(3)PCR反應(yīng)后，在反應(yīng)體系中就形成了大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的DNA片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離出來，得到放射性同位素自顯影條帶，依據(jù)電泳條帶讀取DNA雙鏈的堿基序列。例16.(雙選)(2024·湖南，15)最早的雙脫氧測(cè)序法是在PCR反應(yīng)體系中，分別再加入一種少量的雙脫氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子鏈延伸時(shí)，雙脫氧核苷三磷酸也遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，以加入ddATP的體系為例：若配對(duì)的為ddATP，延伸終止；若配對(duì)的為脫氧腺苷三磷酸(dATP)，繼續(xù)延伸；PCR產(chǎn)物變性后電泳檢測(cè)。通過該方法測(cè)序某疾病患者及對(duì)照個(gè)體的一段序列，結(jié)果如圖所示。下列敘述正確的是（AC）A.上述PCR反應(yīng)體系中只加入一種引物B.電泳時(shí)產(chǎn)物的片段越小，遷移速率越慢C.5′-CTACCCGTGAT-3′為對(duì)照個(gè)體的一段序列D.患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)镚【解析】利用雙脫氧測(cè)序法時(shí)，PCR反應(yīng)體系中加入的模板是待測(cè)的單鏈DNA，故只需加入一種引物，A正確；電泳時(shí)，產(chǎn)物的DNA片段越大，形成的阻力越大，遷移速率越慢，B錯(cuò)誤；根據(jù)題圖可知，對(duì)照個(gè)體PCR子鏈的測(cè)序結(jié)果為5′-CTACCCGTGAT-3′，該序列與對(duì)照個(gè)體雙鏈DNA分子中模板鏈的互補(bǔ)鏈的序列相同，患者為5′-CTACCTGTGAT-3′，對(duì)比可知，患者該段序列中某位點(diǎn)的堿基C突變?yōu)門，C正確，D錯(cuò)誤。(7)不對(duì)稱PCR例17.(2025·廣州市三模)不對(duì)稱PCR是利用不等量的一對(duì)引物來產(chǎn)生大量單DNA(ssDNA)的方法。加入的一對(duì)引物中含量較少的被稱為限制性引物，含量較多的被稱為非限制性引物。PCR的最初的若干次循環(huán)中，其擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA(dsDNA)，但當(dāng)限制性引物消耗完后，就會(huì)產(chǎn)生大量的ssDNA。不對(duì)稱PCR的簡(jiǎn)單過程如圖所示。假設(shè)模板DNA分子初始數(shù)量為a個(gè)，6次循環(huán)后開始擴(kuò)增產(chǎn)生ssDNA。下列敘述錯(cuò)誤的是(C)。A.限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)B.據(jù)圖可知，最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列相同C.上述過程中子鏈分別沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸D.該不對(duì)稱PCR過程中需要(26?1)a個(gè)限制性引物【解析】

PCR擴(kuò)增時(shí)需要已知目的基因兩側(cè)的堿基序列來設(shè)計(jì)引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依據(jù)模板DNA的堿基序列來設(shè)計(jì)，A正確；當(dāng)限制性引物的濃度降低，甚至基本耗盡時(shí)，雙鏈DNA的合成速率顯著下降，此時(shí)非限制性引物將繼續(xù)引導(dǎo)單鏈DNA的合成，非限制性引物與乙鏈結(jié)合，故反應(yīng)的最后階段只產(chǎn)生初始DNA中一條鏈的拷貝（非限制性引物引導(dǎo)合成的單鏈），最后大量獲得的ssDNA與圖中甲鏈的堿基序列一致，B正確；擴(kuò)增時(shí)耐高溫的DNA聚合酶將4種脫氧核苷酸連接至引物的3′端，C錯(cuò)誤；PCR擴(kuò)增時(shí)引物是新子鏈的一部分，假設(shè)模板DNA分子初始數(shù)量為a個(gè)，6次循環(huán)后產(chǎn)生26個(gè)DNA分子，因此該不對(duì)稱PCR過程中需要(26?1)a個(gè)限制性引物，D正確。（8）大引物PCR注：基本原理是通過兩個(gè)端