臨床檢驗(yàn)“生化反應(yīng)曲線”要點(diǎn)生化反應(yīng)曲線是整個生化反應(yīng)過程的記錄，通過查看反應(yīng)曲線我們可以知道這個結(jié)果是否可靠，也可以發(fā)現(xiàn)一些儀器故障（試劑針加樣不足、沖洗機(jī)構(gòu)沖洗問題），也能提醒我們光源燈能量不足（俗稱，換燈泡），還能查看速率法項(xiàng)目是不是底物耗盡。那么，到底怎么去看生化反應(yīng)曲線呢？生化反應(yīng)曲線基礎(chǔ)理論分光光度儀原理，運(yùn)用的是朗伯-比爾定律：A=KbcA為吸光度，K為摩爾吸光系數(shù)，它與吸光物質(zhì)的性質(zhì)及入射光的波長λ有關(guān)，c為吸光物質(zhì)的濃度，單位為mol/L，b為吸收層厚度，單位為cm。Lambert-Beer定律適合于任何均勻非散射的介質(zhì)，當(dāng)相應(yīng)的比色杯每一次通過光路系統(tǒng)時(shí)，光路系統(tǒng)會測量并記錄下相應(yīng)的吸光度。光路系統(tǒng)可以測量后分光后12個波長的相應(yīng)吸光度。常用波長:340,376,415,450,480,505,546,570,600,660,700,800nm，多數(shù)檢測項(xiàng)目都使用雙波長檢測方法。（可去除干擾物對檢測結(jié)果的影響）全自動生化分析儀常用的方法：終點(diǎn)法和速率法01終點(diǎn)法被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)終點(diǎn)吸光度的大小求出被測物濃度，稱為終點(diǎn)法（一點(diǎn)終點(diǎn)法、兩點(diǎn)終點(diǎn)法）。該法稱為平衡法更為恰當(dāng)。從時(shí)間-吸光度曲線來看，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化。終點(diǎn)法參數(shù)設(shè)置簡單，反應(yīng)時(shí)間一般較長，精密度較好。［一點(diǎn)終點(diǎn)法］：在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)選擇一個終點(diǎn)吸光度值，用于計(jì)算結(jié)果。結(jié)果計(jì)算公式：待測物濃度CU=（待測吸光度AU－試劑空白吸光度AB）×K

K為校準(zhǔn)系數(shù)

［兩點(diǎn)終點(diǎn)法］：在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時(shí)，選擇第一個吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個吸光度，此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果。02連續(xù)監(jiān)測法（速率法）是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時(shí)，連續(xù)選取時(shí)間-吸光度曲線中線性期（各兩點(diǎn)間吸光度差值相等）的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（ΔA/min）計(jì)算結(jié)果?？梢源_定線性期并計(jì)算ΔA/min，根據(jù)此值再準(zhǔn)確地計(jì)算酶活性，因而使自動生化分析儀在酶活性測定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測法也可用于測定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測定的代謝物。酶活性（U/L）＝ΔA/min×理論（或校準(zhǔn)）K值。代謝物濃度CU=ΔA/min×校準(zhǔn)K值。

反應(yīng)曲線是什么？炒菜，應(yīng)該大家都會吧？其實(shí)，生化項(xiàng)目的檢測過程跟炒菜比較相似，炒菜的基本流程是：放油→放菜→放鹽。如果每隔18秒，對菜的味道進(jìn)行打分并記錄，再把各個點(diǎn)連接繪成一條曲線的話，炒菜的反應(yīng)曲線大致是這樣的，見下圖：如果只是把油→菜→鹽，按順序放進(jìn)鍋里，這一鍋菜應(yīng)該是沒法吃的，對吧？至少得在放油、菜、鹽的時(shí)候用鍋鏟攪拌混勻一下，對吧？于是炒菜的反應(yīng)曲線變成了這樣，見下圖：那么，對應(yīng)的生化項(xiàng)目檢測

(以奧林巴斯AU系列為例)

是這樣的：首先，儀器會向反應(yīng)杯加入試劑1(R1)；緊接著加入樣本(S)，攪拌混勻；3分鐘后加入試劑2(R2)，攪拌混勻。在這個過程中，儀器會每隔18秒測試一次吸光度并記錄，總共28(0-27)個點(diǎn)，然后連接成線，就是我們所看到的反應(yīng)曲線，見下圖：

所以，反應(yīng)曲線是項(xiàng)目檢測整個過程的記錄，相當(dāng)于是一個靜態(tài)的錄像。反應(yīng)曲線怎么看？在整個檢測過程中，試劑1(R1)、樣本(S)、試劑2(R2)加入以及攪拌的時(shí)間點(diǎn)都是固定的。我們知道了反應(yīng)曲線是怎么來的之后，需要知道什么樣的曲線算正常。一般正常的反應(yīng)曲線：比較平滑，無明顯的跳點(diǎn)加入R2前后吸光度會發(fā)生明顯的變化

(低濃度樣本除外)終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線，會有一段曲線的吸光度基本無變化速率法的反應(yīng)曲線，基本成一條直線

(兩點(diǎn)速率法除外)生化的反應(yīng)曲線可以分為終點(diǎn)法和速率法兩大類，以下列舉了一些正常的反應(yīng)曲線供參考：

01終點(diǎn)法的反應(yīng)曲線：反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)后反應(yīng)混合物的吸光度不再變化

(R1主要用于消除干擾，R2加入之后，反應(yīng)啟動)，就像你炒好的菜在一段時(shí)間內(nèi)味道是不變的。如下圖：

02

速率法的反應(yīng)曲線隨著反應(yīng)的進(jìn)行，吸光度越來越大，但速率保持不變，R2之后基本成一條直線，無明顯跳點(diǎn)

(兩點(diǎn)速率法除外)，如下圖：注：上圖在加入R2之前為虛線，是因?yàn)镽1+S的體積小于儀器要求的最低的反應(yīng)總體積。我們在看反應(yīng)曲線的時(shí)候，眼里是一條曲線，腦袋里面浮現(xiàn)的應(yīng)該是整個的檢測過程，去還原儀器的動作，分析從什么時(shí)候吸光度突然變得異常。你可以想象成這盤菜是怎么炒出來的。反應(yīng)曲線有什么用，什么時(shí)候用得著？01結(jié)果出現(xiàn)負(fù)值(終點(diǎn)法項(xiàng)目)a.反應(yīng)曲線有可能是一條直線，樣本或R2有可能沒有加入；b.R2加入之前的吸光度比加入后還高，試劑1和試劑2位置放反或者嚴(yán)重脂血標(biāo)本。02結(jié)果明顯偏低(速率法項(xiàng)目)反應(yīng)曲線可能變成了類似于終點(diǎn)法的曲線，也就是我們通常說的底物耗盡，需要稀釋重測。03試劑過期或污染、攪拌棒破損、攜帶污染以及沖洗站滴水也會在反應(yīng)曲線上有所體現(xiàn)。04在結(jié)果比較可疑的情況下，可以調(diào)出反應(yīng)曲線看看是否正常，有助于找出問題所在。

［注意事項(xiàng)］不同廠家或型號的儀器，加入樣本和試劑的順序可能不同，比如，日立是S+R1+R2。部分儀器橫坐標(biāo)是直接用時(shí)間表示，比如貝克曼LX/Dxc系列用的是秒，另外LX/Dxc系列的加樣順序有可能是R1+S+R2或者R1+R2+S。部分儀器沒有把各個點(diǎn)連接起來，所以看到的是由點(diǎn)組成的曲線?？捶磻?yīng)曲線時(shí)，注意縱坐標(biāo)的刻度，就像遠(yuǎn)看是美女，近看就不一定了。5.反應(yīng)曲線界面還可以看到很多的信息，比如：光電校正、試劑空白、定標(biāo)的時(shí)間以及每一點(diǎn)的吸光度，這些都會有助于判斷結(jié)果異常的原因。所以，你應(yīng)該已經(jīng)意識到，當(dāng)有人問為什么某項(xiàng)目的結(jié)果偏低、不正常時(shí)，僅憑一個結(jié)果是很難判斷的。常見正常反應(yīng)曲線簡易圖［終點(diǎn)法］［速率法］［固定時(shí)間法］常見異常反應(yīng)曲線［比色杯異常］［攪拌棒問題］［沖洗站問題］［底物耗盡］如何避免底物耗盡帶來的誤差？一方面，在審核報(bào)告時(shí)，要綜合考慮整張報(bào)告單各個項(xiàng)目的結(jié)果，對有疑問或者矛盾的項(xiàng)目結(jié)果，要查看反應(yīng)曲線，并及時(shí)與臨床醫(yī)生溝通，結(jié)合病人的情況評估檢測報(bào)告是否存在偏差。另一方面，可以借助生化儀上面自帶的參數(shù)設(shè)置，設(shè)置好底物耗盡的相關(guān)參數(shù)，讓儀器自動報(bào)警。由于不同廠家的儀器所給定的參數(shù)不同，底物耗盡的參數(shù)大概分兩種：

1.線性度：一般廠家設(shè)定的線性度為15%，其含義就是所有檢測點(diǎn)的OD值與理想擬合曲線的線性相關(guān)度要在15%之內(nèi)，超出這個范圍就是超限，儀器對此結(jié)果就會報(bào)警。以圖2為例，反應(yīng)階段讀取的曲線是b-c-d，而最后計(jì)算的曲線是b-d，明顯可以看出c點(diǎn)遠(yuǎn)離了b-d直線，c點(diǎn)附近讀取的吸光度都偏離大于15%，儀器會報(bào)警。個人意見，15%的線性度有些大，最好設(shè)置在10%以內(nèi)，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.吸光度限值或者反應(yīng)界限：也就是單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化（上升或下降）不能超過多少，或者初始反應(yīng)的曲線斜