摘要建立腦無復(fù)流模型并對灌注減低進(jìn)行多維度評價(jià)。方法利用激光散斑對比成像和雙光子活體成像，比較C57BL/6(n=16)和BALB/c小鼠(n=37)短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞，以及BALB/c小鼠缺血1h或1.5h灌注改變情況。結(jié)合激光散斑對比成像、低倍率和較高放大倍率的灌注腦片圖像，以及雙光子顯微鏡監(jiān)測紅細(xì)胞流速和流量對短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞后腦灌注下降進(jìn)行活體動(dòng)態(tài)以及全腦切片和微血管的評估。用微管相關(guān)蛋白2染色和行為學(xué)評分評估梗死面積和行為學(xué)缺損。結(jié)果在C57BL/6小鼠中，大腦中動(dòng)脈區(qū)域大多數(shù)毛細(xì)血管在缺血期間小鼠缺血1.5h后，24h后再通時(shí)的皮質(zhì)灌注減少至基線76.1%(與BALB/csham組89.0%相比減少，P=0.046),而缺血1h減少至79.9%,與BALB/csham組無明顯差異(P=0.299)。切片全腦灌注評估BALB/c小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h導(dǎo)致全腦灌注減少至75.1%(與BALB/csham組100%相比降低，P0.001),雙光子活體成像評估大腦中動(dòng)脈流域皮質(zhì)表面毛細(xì)血管血流在再通24h,紅細(xì)胞流速降至基線水平的50.3%(與BALB/csham組110.7%相比降低，P=0.010),紅細(xì)胞流量降至基線水平的38.9%(與BALB/csham組119.2%相比降有灌注的毛細(xì)血管占據(jù)的總體積分?jǐn)?shù)為0.0128±0.0018(與BALB/csham組0.0539±0.0055相比減少，P0.001)。微管相關(guān)蛋白2染色提示BALB/c小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h導(dǎo)致梗死面積占全腦面積約36%,行為學(xué)評分提示行為學(xué)缺損，評分升高至9分。BALB/c小鼠短暫性缺血1.5h導(dǎo)致明顯的腦灌注下降以及毛細(xì)約有一半的患者無法通過血管再通治療獲得良好神經(jīng)功能預(yù)后3,稱為無效再通。約有1/4的患者不能成功再灌注4。除責(zé)任血管再閉塞化5。無復(fù)流機(jī)制尚不清楚，還需進(jìn)一步的研究。既往研究中建立和評估腦無復(fù)流模型的方法各不相同?8,所用小鼠品系及造模方式和(Solarbio,SL038)和0.3%TritonX-100的0.1mol/LPBS中在室溫下封閉1h。然后一抗4℃下孵育過夜，用PBS/TritonX-100洗滌后，將切片與二抗在室溫下孵育1h。二抗是山羊抗兔AlexaFlour488 X-100清洗后，用抗熒光衰減封片劑(Solarbio,S2100)封片。通過激光共聚焦顯微鏡(LSM710;Zeiss,德國)獲得用于血管分析的Z-堆圖。MAP?染色的圖像用VectraPolaris1.2.5梗死面積的量化從前囟層面開始每隔7張腦片選取一張30μm厚切片用于評估梗死面積，使用ImageJ(1.53t版，美國NIH)計(jì)算MAP?陰性和全腦的面積。用梗死面積÷全腦面積，得到梗死面積與全腦的占比。1.2.6顱窗手術(shù)用顱骨鉆在運(yùn)動(dòng)感覺皮質(zhì)上方做一個(gè)直徑3mm顱骨窗(右側(cè)，距Bregma點(diǎn)-3.0mm,外側(cè)3.5～4.0mm)。其余暴露顱骨表面用牙科水泥封閉，并用牙科水泥將定制頭件固定在顱骨上。1.2.7雙光子成像觀察大腦中動(dòng)脈血流及測量微血管流速變化在雙光子成像前一天制作顱內(nèi)窗。在缺血前、缺血期間以及再通后2h和24h,使用配備有MaiTai雙光子激光器和20倍水浸物鏡的雙光子顯微鏡(LSM880,AxioExaminer;蔡司)進(jìn)行成像。顯微鏡由ZEN2011軟件(黑色版，蔡司，德國)控制，在測量過程中，小鼠固定在定制金屬板上，并如造模所述保持麻醉狀態(tài)。在成像前10min,從尾靜脈注射100μLRITC-葡聚糖，并用800nm激光激發(fā)，以觀察血管。血管的Z-堆記錄為512×512像素，幀掃描時(shí)間943.72ms,覆蓋約425μm×425μm×120μm的體積。此外，每個(gè)Z-堆記錄10幀。紅細(xì)胞的流速和流量通過線掃描獲得1,2000循環(huán)，幀掃描時(shí)間為1.84ms。1.2.8全腦灌注分析從前囟對應(yīng)腦平面開始，每7片腦切片選取一片30μm厚代表腦片，一共6片腦片，封片后用VectraImageJ(1.53t,美國國立衛(wèi)生研究院)軟件測量每個(gè)半腦切片的平均RITC-葡聚糖信號強(qiáng)度，并對其進(jìn)行偽彩色化。該信號可評估腦組1.2.9行為學(xué)評估行為學(xué)評估在再通后24h進(jìn)行，使用改良神經(jīng)功能評分(modifiedneurol的評分標(biāo)準(zhǔn)為0～18分(分?jǐn)?shù)越高代表損傷越嚴(yán)重):0分，正常；1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析及作圖采用GraphPadPrism(9.4.0版)。數(shù)據(jù)使用重復(fù)測量方差分析。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用Mann-Whitney檢驗(yàn)分析。檢2、結(jié)果2.1腦無復(fù)流模型的建立2.1.1C57BL/6sham組和C57BL/6tMCAO1h組多時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)差分析，發(fā)現(xiàn)組間(F=40.452,P0.001)、時(shí)間(F=73.712,校正PK0.001)、時(shí)間與組間(F=22.798,校正組皮質(zhì)灌注減少70.3%,而C57BL/6sham組減少11.3%。再通后2h,C57BL/6tMCAO1h組與C57BL/6sh(P0.001)。當(dāng)再通后24h時(shí)，兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>見圖1和表1。術(shù)前MCA閉塞再通2h再通24h術(shù)前顯示皮質(zhì)灌注情況Fig.1ScatteredrepresentativeimagesofMCA閉塞中BALB/etMCA01.5h1)與C57BL/6sham組比較.采用兩因素重復(fù)測量方差分析，P<0.05:2)與BALBesham組比較，采用兩因素重復(fù)測量方差分析，P<0.05:3)與C57BL/6大腦中動(dòng)脈主干遠(yuǎn)端的血流在缺血期間方向逆轉(zhuǎn)(圖2C大白箭頭指示),并且大腦中動(dòng)脈流域內(nèi)幾乎所有毛細(xì)血管血流仍然流動(dòng)。大腦細(xì)血管在再通后2h和24h后仍然阻塞。AMCA閉塞MCA閉塞再通2h再通24hCDMCA閉塞MCA閉塞再通2h再通24hDA,顱窗位置示意圖，黑色圓圈示意顱窗位置，覆蓋了右側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)。Fig.2Comparisonoftwo-photoninvivoimagingofbloodflowatmultipleti表圖。C和D分別展示了C57BL/6和BALB/c小鼠及再通2h和24h大腦中動(dòng)脈流域毛細(xì)血管的雙光子活體圖像。白位，標(biāo)尺為100μm。h組多時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)灌注對比激光散斑血流儀監(jiān)測B(P=0.046)。見表1、圖3。術(shù)前MCA閉塞再通2h再通24h斑代表圖，顯示皮質(zhì)灌注情況Fig.3Scatteredrepresentative2.1.4C57BL/6tMCAO1h組和BALB/ctMCAO1.5h組多時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)灌注對比表1可見C57BL/6tMCA01h組與BALB/ctMCA01.5h組腦血流量對比，腦血流實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用兩因素重復(fù)測量方差分析，發(fā)現(xiàn)組間(F=138.900,P0.001)、時(shí)間(F=88.026,校正P0.001)、時(shí)間與組間(F=49.680,校正P<0.001)存在交互效應(yīng)，故tMCAO1.5h組皮質(zhì)血流下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.999);再通2h后，兩組血流比較仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.129)。而再通24h時(shí)，兩C57BL/6tMCAO1h組在大腦中動(dòng)脈再通24h后皮質(zhì)腦血流量多降低20.2%。2.2BALB/c小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h導(dǎo)致腦無復(fù)流的2.2.1全腦切片灌注評估再通24h后，用全腦切片梗死側(cè)/對側(cè)羅丹明B異硫氰酸酯-葡腦灌注量減少至75.1%,而BALB/csham組腦灌注量為100%,兩組間DD術(shù)前MCA閉塞中BALB/c小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞1.活體灌注羅丹明B異硫氰酸酯-葡聚糖后全腦切片示意圖(偽彩),切片時(shí)間點(diǎn)為再通24h。B,定量A圖中假手術(shù)組及tMCAO1.5h組再灌24h的切片羅丹明B異硫氰酸酯-葡聚糖的平均熒光強(qiáng)度，計(jì)算斑血流監(jiān)測定量BALB/c小鼠假手術(shù)組和tMCA01.5h組感興趣區(qū)(圖1A中的方框所示意大腦中動(dòng)脈流域)多時(shí)間點(diǎn)的腦血流灌注值，計(jì)算為與基線的比值。每組數(shù)量n=5,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 (425μm×425μm×120μm),血流用靜脈注射的羅丹明B異硫氰酸酯-葡聚糖標(biāo)記(紅色)。F,E圖中Z-堆血管圖的Z軸最大密度投影 (比例尺100μm)。G,缺血前基線、大腦中動(dòng)脈閉塞術(shù)中、大腦中動(dòng)脈再通2h和大腦中動(dòng)脈再通24h血管圖的Z軸最大密度投影，白色小箭頭示意阻塞部位(比例尺100μm)。H、I,雙光子線性掃掃描)。J、K,定量大腦中動(dòng)脈閉塞術(shù)中、大腦中動(dòng)脈再通2h和大腦中動(dòng)脈再通24h紅細(xì)胞流速(J)和流量(K)與缺血前基線的比值(占基線水平的百分比)。每組數(shù)量n=5,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差Fig.4Decreasedcerebralbloodflowduetotransientmidd2.2.2激光散斑血流監(jiān)測2.2.3雙光子顯微鏡獲得的毛細(xì)血管Z-堆視頻和紅細(xì)胞流速流量雙光子成像位置及方位見圖4D~F,顱骨窗位置位于右側(cè)感覺運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)，成像范圍425μm×425μm×120μm。通2h后，仍有部分毛細(xì)血管血流阻滯(圖4G小白箭頭);紅細(xì)胞校正P=0.010)存在交互效應(yīng)，故進(jìn)行成對比較。紅細(xì)胞流量數(shù)據(jù)采間(F=5.501,校正P=0.010)、時(shí)間與組間(F=6.883,校正P=0.040)紅細(xì)胞流速恢復(fù)到基線水平的97.7%,而BALB/csham組為基線水平的111.9%,兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4J,P>0.999)。tMCAO1.5h組紅細(xì)胞流量恢復(fù)到基線水平的79.0%,BALB/csham組為基線水平的119.6%,兩組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4K,P=0.050)。當(dāng)再通后24h時(shí)，仍有部分毛細(xì)血管血流阻滯(圖4G小白箭頭),tMCAO1.5h組紅細(xì)胞流速降至基線水平的50.3%,BALB/csham組為基線水平的110.7%,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4J,P=0.010)。而tMCAO1.5h組紅細(xì)胞流量降至基線水平的38.9%,BALB/csham為基線水平的119.2%,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4K,P0.001)。2.2.4高放大倍數(shù)的免疫熒光染色切片灌注評估更高放大倍率的切片免疫熒光染色顯示，毛細(xì)血管大量阻塞(圖5C)。50μm厚的共聚焦顯微鏡成像Z-堆圖(212.45μm×212.45μm)管長度減少了約76%(BALB/csham組997μm±103μm,BALB/ctMCAO1.5h組241μm±33μm,t=7.016,P0.001),有灌注的毛細(xì)血管占據(jù)的總體積分?jǐn)?shù)也減少了約76%(BALB/csham組0.0539±0.0055,BALB/ctMCAO1.5h組0.0128±0.0018,t=7.122,P0.001,圖5D有灌注的毛細(xì)圖圖5BALB/c小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h導(dǎo)致腦微血管無復(fù)流A,MAP?染色顯示梗死區(qū)域(MAP?陰性區(qū)域),示意共聚焦成像所選明B異硫氰酸酯-葡聚糖(紅色)標(biāo)記的有灌注的血管、抗膠原-IV抗體(綠色)標(biāo)記所有的血管、羅丹明B異硫氰酸酯-葡聚糖和抗膠原-IV抗體的疊加，以及有灌注的血管的分析骨架(黃色)。比例尺50μm。D、E,假手術(shù)組、tMCA01.5h組再通24h的切片總的有灌注的毛細(xì)血管長度(D)和有灌注毛細(xì)血管體積占比(E)的比較。切片為共聚焦拍攝的50μm厚的Z-堆。每組小鼠數(shù)n=5,假手術(shù)組Z-堆圖數(shù)量為19,tMCAO1.5h組Z-堆圖數(shù)量為27。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，***P0.01,雙側(cè)t檢驗(yàn)。Fig.5Transientmiddlenocerebralmicrovascularre-flow2.2.5梗死面積和行為學(xué)評估用微管蛋白2染色來評估缺血再通24h后的梗死面積，結(jié)果顯示BALB/ctMCA01.5h組再通24h時(shí)梗死面積占全腦面積約36%(圖BALB/ctMCAO1.5h組再通24h時(shí)表現(xiàn)為中度行為學(xué)缺損，評分平均為9分(圖6C)。AABcerebralinfarctionandbehaviouraldefici本研究發(fā)現(xiàn)BALB/ctMCAO1.5h與既往研究中常用的C57BL/6tMCA01h相比更適合用于無復(fù)流模型的建立，它所導(dǎo)致的腦灌注量下降更為明顯，無論皮質(zhì)還是全腦灌注量均明顯下降。結(jié)合切片全腦灌注評估、激光散斑血流監(jiān)測活體評估皮質(zhì)腦血流量、雙光子活體成像評估大腦中動(dòng)脈流域皮質(zhì)表面毛細(xì)血管血流，以及高倍率切片成像評估毛細(xì)血管灌注對BALB/c小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞1.5h導(dǎo)致的腦灌注下降以及毛細(xì)血管無復(fù)流進(jìn)行多維度評估。本研究的數(shù)據(jù)提供了建立和評估腦無復(fù)流模型的合適條件，為后續(xù)腦無復(fù)流的動(dòng)物研既往研究中，短暫性遠(yuǎn)端或近端大腦中動(dòng)脈閉塞用于建立腦無復(fù)流模型。在短暫性遠(yuǎn)端大腦中動(dòng)脈閉塞中，用血栓阻塞大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端主干或外力阻斷大腦中動(dòng)脈8,15,然后靜脈注射阿替普酶溶栓7或松解外力實(shí)現(xiàn)再通。在短暫性近端大腦中動(dòng)脈閉塞中，用線栓阻塞大腦中動(dòng)脈。近年，急性缺血性卒中機(jī)械取栓術(shù)后出現(xiàn)無復(fù)流一直是熱點(diǎn)話題，而近端大腦中動(dòng)脈閉塞更接近臨床情況。因此，我們選擇了血管內(nèi)線栓阻塞大腦中動(dòng)脈來建立腦無復(fù)流模型。至于缺血時(shí)間，既往研究中從30min到2h不等，所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種也多樣，包括管內(nèi)線栓阻塞大腦中動(dòng)脈模型中，缺血少于1h會導(dǎo)致梗死體積不穩(wěn)定19。同時(shí)，無復(fù)流與較長的缺血時(shí)間有關(guān)20,但較長的缺血時(shí)間會最常用C57BL/6小鼠缺血1h6.8,103,因此我們首先嘗試了此條件。然而，我們發(fā)現(xiàn)再通24h時(shí)，激光散斑血流監(jiān)測顯示C57BL/6sham組和C57BL/6tMCAO1h組之間大腦中動(dòng)脈流域皮質(zhì)腦血流量無顯著差異(圖1和表1)。差，并且與C57BL/6相比，BALB/c小鼠側(cè)支代償較差25,可能更貼大腦中動(dòng)脈區(qū)域內(nèi)大多數(shù)毛細(xì)血管也是阻滯狀態(tài)，再通2h和24h時(shí)仍有部分毛細(xì)血管阻滯(圖2C、D)。所以BALB/c小鼠可能是更1h和1.5h組與BALB/csham組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，再通后2h缺血1h和1.5h組均導(dǎo)致大腦中動(dòng)脈流域皮質(zhì)腦血流量降低。然而，到再通后24h時(shí)，雖然BALB/ctMCA01h組腦血流量較BALB/csham組下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而BALB/ctMCAO1.5h組的腦血流量與BALB/csham組相比兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)。同再通24h時(shí)，皮質(zhì)腦血流量下降20.2%(表1)。因此，BALB/c小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞持續(xù)1.5h可能更適用于評價(jià)腦無復(fù)流現(xiàn)象。這與前期研究一致，該研究表明，當(dāng)近端大腦中動(dòng)脈閉塞時(shí)間超過1h,無復(fù)流的評估包括激光散斑血流監(jiān)測、激光多普勒、相位分辨光學(xué)相干斷層掃描、雙光子活體成像評估毛細(xì)血管停滯和流動(dòng)狀態(tài)、低倍全腦切片量化組織灌注、高放大倍數(shù)的圖像評估毛細(xì)血管阻滯和熒激光散斑血流監(jiān)測可以監(jiān)測整個(gè)表面血流量，并計(jì)算感興趣區(qū)的血流量。然而，檢測范圍僅限于表面，無法到達(dá)深層組織。相位分辨光學(xué)相干斷層掃描可以測量深度為幾百微米的皮質(zhì)