T/YNSOZTechnicalregulationforrapiddetectionofwildanimaladenovirusesbasedon2025-12-02發(fā)布 2 2 2 3 3 3 5 6 8 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。1野生動(dòng)物腺病毒納米孔測序快速鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了野生動(dòng)物樣本中腺病毒納米孔測序鑒定技GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和GB/T40974核酸樣本質(zhì)LY/T2360陸生野生動(dòng)物疫病危害性等級(jí)劃分GB/T40458用于病原微生物高通量檢測的核酸提取技GB/T27025檢測和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力管理和科研等目的人工馴養(yǎng)但尚未形成明顯遺傳變異的無包膜的雙鏈DNA病毒，直徑為90～100nm的顆粒，基因組是線性雙鏈DNA，長度約為26～483.3將提取或純化的基因組雙鏈DNA，經(jīng)修復(fù)連接測序接頭后磁珠純化完成文庫的構(gòu)建，從而實(shí)現(xiàn)在納米孔測序nanoporesequ2病毒DNA序列分析viralDNAse通過納米孔測序儀對(duì)病毒DNA進(jìn)行測序，得到的DNA序列與已知病毒序列數(shù)據(jù)庫比對(duì)來確定病毒利用計(jì)算機(jī)算法和程序，確定兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的相似性及在未經(jīng)過任何生物信息學(xué)校正的情況下，單次DNA或RNA分子穿過納米孔時(shí)，其序列被正確識(shí)別AdV：腺病毒（adenovirus）DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）RNA：核糖核酸（ribonucleicaRNaseI：核糖核酸酶I（ribonucleaseI）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction）5野生動(dòng)物腺病毒納米孔測序快速鑒定試驗(yàn)步驟a)核酸提取應(yīng)保證核酸的完整性。排除其他分子，如蛋白質(zhì)、多糖、脂類、有機(jī)溶劑等的污染，b)基因組DNA提取可使用磁珠法或等效的核酸提取試劑盒。核酸提取試劑c)滿足試驗(yàn)要求的DNA樣本應(yīng)到文庫質(zhì)量檢測合格的條件。病毒DNA文庫的核酸濃度宜≥2ng/μL，核酸總量宜≥25ng。c)納米孔測序的特點(diǎn)是對(duì)文庫片段長度沒有限制，長短片段都可測b)根據(jù)納米孔基因測序儀控制軟件使用說明書實(shí)現(xiàn)測序控制。內(nèi)容包括但不限于去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)、接頭序列等。合格測序數(shù)據(jù)應(yīng)滿足以下條件：單次測序準(zhǔn)確率≥5.4病毒種類鑒定及全基因組信息獲取5.4.1野生動(dòng)物病毒參考基因組數(shù)據(jù)庫5.4.2野生動(dòng)物病毒基因組序列比對(duì)及a)采用我們自主開發(fā)的基于野生動(dòng)物病毒參考基因組數(shù)據(jù)庫的實(shí)時(shí)序列鑒定平臺(tái)快速準(zhǔn)確地分列被測序輸出后，自動(dòng)啟動(dòng)通用系列對(duì)比程序minimap2與參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比提取已鑒定為同種病毒的納米孔測序短片段堿基對(duì)讀數(shù)到以該種病提取已鑒定為同種病毒的納米孔測序短片段堿基對(duì)讀數(shù)到以該種病毒命名的f有參拼接當(dāng)前測序儀生成的原始?jí)A基系列片段，可以拼接到的最長片段堿基對(duì)讀數(shù)。以該最長片段堿基對(duì)讀數(shù)為參考序列，對(duì)總的測序原始?jí)A基再次比對(duì)，以發(fā)現(xiàn)漏掉的與數(shù)據(jù)再次拼接，以獲得當(dāng)前樣本的基因組序列。若樣本來源物種已知，將宿主基因組合并至數(shù)據(jù)5.4.4統(tǒng)計(jì)陰性樣本、陽性對(duì)照樣本和待測樣本的測序深度、基因組覆蓋率的占比，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)本標(biāo)準(zhǔn)使用的實(shí)時(shí)序列鑒定平臺(tái)構(gòu)建使用方法見參B.1.3PCR儀滅菌工作溫度：105～138℃；滅菌時(shí)間預(yù)置范圍：1～480min。8C.1.2.1裝有全血或咽拭子、肛），C.2.2.2將96深孔板放入核酸提取儀中，裝上磁棒套，確認(rèn)磁棒套安裝到位。C.2.2.3按表C.1程序編輯，進(jìn)行自動(dòng)化提取?？墒褂闷渌刃Мa(chǎn)品，按對(duì)應(yīng)說明書進(jìn)行程9步驟槽位)))1208-21403304-4404-5524-663072008-用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具D.2.3瞬時(shí)離心后，將離心管置于磁力架上，待溶液澄清后（約2～3min吸棄上清。D.2.6將管內(nèi)殘存的液體徹底吸棄，開蓋靜置直到磁珠表面無光澤（3～5min）。D.4.2瞬時(shí)離心后，將離心管置于磁力架上，待磁珠完全吸附后，使用核酸蛋白定量儀檢測純化后的文庫濃度，文庫濃度宜≥2ng/μL，文庫總量≥25ng。以QDSV3.0測序試劑盒為例制備測序體系。給E.1.1將導(dǎo)通連接物、通緩沖液、測序反應(yīng)緩E.1.2揭開測序芯片封口膜，順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)閥門約90°直至碰觸限位，使用200μL量程的移液槍插入棄去）。隨后使用200μL量程的移液槍槍尖插入加樣口，緩慢勻速將導(dǎo)通緩沖液加入取一個(gè)新的離心管，按照下表中制備上機(jī)體系，上機(jī)核酸總量≥25ng。再次揭開測序芯片封口膜，順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)閥門約90°直至碰觸限位，將70μL步驟E.2.1獲得的混合體系緩慢勻速加入測序芯片直至槍頭末端有少許液體殘留（避免引入氣泡逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)閥門約以納米孔基因測序儀QNome-3841的控制軟件在下載鏈接：/Shade-Stalker/RealTimeIdentification中說明。F.2.1根據(jù)上述程序下載鏈接頁面中提供的運(yùn)行環(huán)境文件下載方式，下載運(yùn)行環(huán)境文件F.2.2根據(jù)上述程序下載鏈接頁面中提供的比對(duì)參考數(shù)據(jù)庫下載方式，下載比對(duì)參考數(shù)據(jù)庫文件），`source