TUNEL染色技術(shù)操作流程詳解細胞凋亡作為細胞程序性死亡的核心過程，其檢測在腫瘤病理、發(fā)育生物學及藥物研發(fā)等領(lǐng)域具有關(guān)鍵價值。TUNEL（TerminaldeoxynucleotidyltransferasedUTPnickendlabeling）染色技術(shù)通過原位標記DNA斷裂的3’-OH末端，為凋亡細胞的可視化分析提供了可靠手段。本文將從樣本處理、試劑操作到結(jié)果判讀，系統(tǒng)解析TUNEL染色的標準化流程，助力科研與臨床實踐中精準的凋亡分析。一、樣本準備：適配不同類型的實驗材料TUNEL染色適用于石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片及組織芯片等樣本，需根據(jù)材料特性優(yōu)化前處理步驟：（一）石蠟包埋組織切片1.脫蠟與水化：將切片置于二甲苯中（兩次，各10分鐘）脫蠟，經(jīng)梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）依次浸泡（各5分鐘）至蒸餾水，完成水化。2.通透處理：滴加蛋白酶K工作液（20μg/ml，可根據(jù)組織類型調(diào)整濃度），37℃孵育15~30分鐘（如肝、腎組織可縮短至10分鐘，腫瘤組織延長至30分鐘），PBS沖洗終止反應（3次，每次5分鐘）。（二）冰凍組織切片1.固定：新鮮冰凍切片（厚度5~10μm）立即用4%多聚甲醛（PFA）固定30分鐘（室溫），PBS沖洗（3次，每次5分鐘）。2.通透：0.1%TritonX-100（PBS配制）室溫孵育10分鐘，PBS沖洗（3次）。（三）細胞爬片/貼壁細胞1.固定：4%PFA室溫固定15~20分鐘，PBS沖洗（3次）。2.通透：0.1%TritonX-100室溫孵育5分鐘（懸浮細胞可先離心涂片），PBS沖洗（3次）。二、試劑配制：精準把控反應體系TUNEL檢測試劑盒通常包含TdT酶液、dUTP標記液（熒光或地高辛標記）、平衡緩沖液及洗滌液。操作前需注意：1.反應液現(xiàn)配現(xiàn)用：根據(jù)樣本數(shù)量，按比例混合TdT酶與dUTP標記液（如1μl酶+49μl標記液，適配1個樣本），輕柔混勻后避光保存（冰上操作）。2.陰性/陽性對照設(shè)置：陰性對照：用PBS替代TdT酶液，其余步驟相同；陽性對照：DNaseI（10U/μl）37℃處理樣本10分鐘，誘導DNA斷裂后進行染色。三、染色流程：標準化操作保障結(jié)果可靠性（一）平衡與反應孵育1.滴加平衡緩沖液（試劑盒配套），室溫孵育10分鐘，棄液（無需沖洗）。2.滴加新鮮配制的TUNEL反應液，覆蓋樣本區(qū)域，37℃避光孵育60分鐘（細胞樣本可縮短至30分鐘，組織樣本延長至90分鐘，具體參考試劑盒說明書）。（二）終止與復染1.終止反應：PBS沖洗樣本3次（每次5分鐘），去除未結(jié)合的反應液。2.核復染：熒光檢測：滴加DAPI染液（1:1000稀釋），室溫避光孵育5分鐘，PBS沖洗；明場檢測：蘇木精復染（滴加工作液1~2分鐘），自來水返藍，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹膠封片。（三）封片與保存熒光樣本需用抗淬滅封片劑封片（避免熒光淬滅），明場樣本用中性樹膠封片。封片后避光干燥，4℃短期保存或-20℃長期保存。四、結(jié)果判讀：從信號特征到定量分析（一）熒光顯微鏡觀察凋亡細胞：細胞核呈現(xiàn)特異性熒光（如FITC標記為綠色，Cy3標記為紅色），形態(tài)可呈固縮、碎裂狀；正常細胞：僅DAPI（藍色）或蘇木精（藍色）染色，無熒光信號。（二）定量分析1.手動計數(shù)：隨機選取5個高倍視野（×400），統(tǒng)計陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值，計算凋亡率；2.圖像分析軟件：如ImageJ，通過“ColorThreshold”功能識別熒光信號，自動統(tǒng)計陽性面積與總核面積的比例。五、關(guān)鍵注意事項與常見問題解決（一）操作關(guān)鍵點1.固定及時性：樣本離體后需立即固定，避免缺血/缺氧導致的自發(fā)凋亡；2.避光操作：dUTP標記液對光敏感，全程需用錫箔紙包裹容器；3.試劑新鮮度：TdT酶活性易受溫度影響，需-20℃避光保存，避免反復凍融。（二）常見問題及對策問題表現(xiàn)可能原因解決方法--------------------------------------------------------------------------背景熒光過高通透過度/試劑污染縮短通透時間，更換新鮮試劑陽性信號微弱孵育時間不足/酶失活延長孵育時間，重新配制反應液非特異性染色復染液濃度過高降低復染液濃度，縮短孵育時間結(jié)語TUNEL染色技術(shù)的核心在于精準控制DNA斷裂標記的特異性