單細胞空間多組學解析腫瘤免疫微環(huán)境演講人01引言：腫瘤免疫微環(huán)境研究的范式革新02腫瘤免疫微環(huán)境的復雜性與傳統(tǒng)研究范式的局限性03單細胞多組學技術(shù)：解析TIME細胞異質(zhì)性的革命04空間多組學技術(shù)：揭示TIME細胞互作與組織架構(gòu)05多組學數(shù)據(jù)整合策略：構(gòu)建TIME全景圖譜06臨床轉(zhuǎn)化與應用：從基礎(chǔ)機制到精準治療07挑戰(zhàn)與未來展望08總結(jié)與展望目錄單細胞空間多組學解析腫瘤免疫微環(huán)境01引言：腫瘤免疫微環(huán)境研究的范式革新引言：腫瘤免疫微環(huán)境研究的范式革新腫瘤的發(fā)生、進展與轉(zhuǎn)移，不僅取決于腫瘤細胞本身的遺傳變異，更受到腫瘤免疫微環(huán)境（TumorImmuneMicroenvironment,TIME）的深刻調(diào)控。TIME是一個由免疫細胞（如T細胞、B細胞、巨噬細胞、髓源性抑制細胞等）、基質(zhì)細胞（成纖維細胞、內(nèi)皮細胞等）、腫瘤細胞、細胞因子、趨化因子及細胞外基質(zhì)構(gòu)成的復雜生態(tài)系統(tǒng)。其組成、狀態(tài)與空間分布模式，直接決定了腫瘤的免疫原性、免疫逃逸機制及對免疫治療的響應性。傳統(tǒng)研究TIME的方法，如bulkRNA測序、免疫組化（IHC）或多色流式細胞術(shù)，雖提供了重要信息，卻存在固有局限性：bulk測序?qū)⒔M織“平均化”，無法捕捉細胞異質(zhì)性；IHC僅能標記少數(shù)幾種蛋白，分辨率有限；流式細胞術(shù)破壞組織空間結(jié)構(gòu)，難以反映細胞間的位置互作。這些方法如同“盲人摸象”，難以還原TIME的復雜全貌。引言：腫瘤免疫微環(huán)境研究的范式革新近年來，單細胞測序技術(shù)的突破實現(xiàn)了“細胞分辨率”下的TIME解析，可精準識別各類免疫細胞亞型及其狀態(tài)；空間轉(zhuǎn)錄組、空間蛋白質(zhì)組等技術(shù)的興起，則填補了“空間維度”的空白，揭示了細胞在組織原位的位置關(guān)系與互作網(wǎng)絡(luò)。而“多組學”整合策略，通過同步分析基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組及代謝組數(shù)據(jù)，構(gòu)建了TIME的“多維全景圖”。這種“單細胞-空間-多組學”的融合范式，正推動TIME研究從“描述性科學”向“機制解析與臨床轉(zhuǎn)化”的跨越，為腫瘤免疫治療的精準化提供了前所未有的技術(shù)支撐。作為一名深耕腫瘤免疫領(lǐng)域的研究者，我深感這一技術(shù)革命帶來的震撼——當我們在數(shù)據(jù)中看到腫瘤細胞如何通過招募調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）在局部形成“免疫抑制傘”，或發(fā)現(xiàn)耗竭T細胞與巨噬細胞在腫瘤邊緣形成“互作熱點”時，TIME的復雜與精妙便不再是抽象概念，而是可被量化、可視化的生物學現(xiàn)實。02腫瘤免疫微環(huán)境的復雜性與傳統(tǒng)研究范式的局限性1TIME的細胞組成與功能異質(zhì)性TIME的核心特征是“異質(zhì)性”，這種異質(zhì)性既存在于不同腫瘤類型之間（如黑色素瘤的TIME富于T細胞，而胰腺癌多為“免疫沙漠”），也存在于同一腫瘤的不同區(qū)域（如腫瘤核心、浸潤邊緣與正常組織交界處的免疫細胞差異顯著）。以免疫細胞為例：-T細胞：包括CD8+細胞毒性T細胞（CTLs）、CD4+輔助T細胞（Th1、Th2、Th17、Tregs等）、γδT細胞等。CTLs的浸潤程度與抗腫瘤免疫正相關(guān)，但部分T細胞會因持續(xù)抗原刺激進入“耗竭狀態(tài)”，高表達PD-1、TIM-3、LAG-3等抑制性分子，失去殺傷功能。-巨噬細胞：由M1型（抗腫瘤）和M2型（促腫瘤）組成，腫瘤相關(guān)巨噬細胞（TAMs）多極化為M2型，通過分泌IL-10、TGF-β抑制免疫應答，并促進血管生成與組織remodeling。1TIME的細胞組成與功能異質(zhì)性-髓源性抑制細胞（MDSCs）：通過精氨酸酶、iNOS等消耗必需氨基酸，抑制T細胞活化，是免疫逃逸的關(guān)鍵推手。2傳統(tǒng)方法的局限性：從“平均信號”到“細胞迷失”傳統(tǒng)研究方法難以應對TIME的異質(zhì)性挑戰(zhàn)：-bulkRNA測序：將數(shù)千個細胞的信號混合，無法識別稀有細胞亞群（如腫瘤浸潤樹突狀細胞，僅占免疫細胞的1-2%），也無法區(qū)分“高浸潤腫瘤”與“低浸潤腫瘤”中同一細胞亞型的狀態(tài)差異（如耗竭T細胞的抑制性分子表達水平）。-免疫組化（IHC）：雖能定位蛋白表達，但受限于抗體數(shù)量（通常3-4色），難以同時標記多種細胞標志物；且結(jié)果依賴主觀判讀，不同實驗室間可比性差。-流式細胞術(shù)：雖能分析數(shù)十種表面/胞內(nèi)標志物，但需將組織制成單細胞懸液，徹底破壞了細胞的空間位置信息——我們無法知道CTLs是直接接觸腫瘤細胞，還是被基質(zhì)細胞隔離，這種“空間迷失”導致對細胞互作機制的解讀存在偏差。3案例啟示：從“矛盾結(jié)果”到“技術(shù)反思”在早期免疫治療研究中，曾出現(xiàn)“矛盾現(xiàn)象”：部分高TILs（腫瘤浸潤淋巴細胞）的黑色素瘤患者對PD-1抑制劑響應不佳，而部分低TILs的肺癌患者卻響應顯著。傳統(tǒng)方法無法解釋這一差異，直到單細胞技術(shù)揭示：高TILs腫瘤中，Tregs與耗竭T細胞的比值顯著高于低TILs腫瘤，且耗竭T細胞的“耗竭程度”（抑制性分子表達數(shù)量）與響應負相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)提示，TIME的“質(zhì)量”比“數(shù)量”更重要，而傳統(tǒng)方法僅能評估“數(shù)量”，無法解析“質(zhì)量”。這種“技術(shù)瓶頸”的切身體會，讓我深刻認識到：要真正理解TIME，必須突破“細胞分辨率”與“空間維度”的雙重限制。03單細胞多組學技術(shù)：解析TIME細胞異質(zhì)性的革命單細胞多組學技術(shù)：解析TIME細胞異質(zhì)性的革命3.1單細胞RNA測序（scRNA-seq）：解碼TIME的“細胞語言”scRNA-seq通過微流控技術(shù)或微滴法捕獲單個細胞的轉(zhuǎn)錄組信息，實現(xiàn)“細胞-基因”對應。其核心流程包括：單細胞懸液制備→細胞捕獲→逆轉(zhuǎn)錄→文庫構(gòu)建→高通量測序→生物信息學分析。在TIME研究中，scRNA-seq的價值體現(xiàn)在：1.1免疫細胞亞型的高精度鑒定通過差異表達基因分析，可識別傳統(tǒng)方法難以區(qū)分的細胞亞群。例如，在肝細胞癌（HCC）TIME中，scRNA-seq發(fā)現(xiàn)了一種新的Treg亞群，高表達CCR8和TNFRSF18，其浸潤程度與患者預后顯著相關(guān)；在胰腺導管腺癌（PDAC）中，巨噬細胞被分為促炎型（CXCL10+、CD80+）和促腫瘤型（CD163+、VEGFA+），后者占比超過70%，成為免疫抑制的主要推手。1.2細胞狀態(tài)的動態(tài)描繪通過擬時序分析（如Monocle、PAGA），可重建細胞分化軌跡。例如，在黑色素瘤TIME中，CD8+T細胞從“效應態(tài)”（GZMB+、IFNγ+）向“耗竭態(tài)”（PDCD1+、TIGIT+）的分化軌跡被清晰解析，發(fā)現(xiàn)耗竭過程伴隨TCR信號通路的逐漸抑制，且中間狀態(tài)（同時表達效應分子和抑制分子）的細胞具有更強的增殖能力。1.3腫瘤細胞與免疫細胞的互作網(wǎng)絡(luò)通過細胞通訊分析工具（如CellPhoneDB、NicheNet），可鑒定細胞間的配體-受體對。例如，在肺癌中，腫瘤細胞高表達PD-L1，與T細胞的PD-1結(jié)合，直接抑制T細胞活化；成纖維細胞分泌CXCL12，通過CXCR4受體招募TAMs，形成“基質(zhì)-免疫抑制軸”。1.3腫瘤細胞與免疫細胞的互作網(wǎng)絡(luò)2單細胞表觀遺傳與蛋白質(zhì)組學：解析調(diào)控的“幕后推手”scRNA-seq揭示了“哪些基因表達”，但無法回答“為何表達”。單細胞表觀遺傳（scATAC-seq、scChIP-seq）和蛋白質(zhì)組學（CITE-seq、REAP-seq）技術(shù)，則從“調(diào)控層面”補充了TIME的拼圖：3.2.1scATAC-seq：解析染色質(zhì)開放狀態(tài)通過檢測單細胞染色質(zhì)的可及區(qū)域，可推斷轉(zhuǎn)錄因子（TF）的結(jié)合位點。例如，在膠質(zhì)母細胞瘤TIME中，scATAC-seq發(fā)現(xiàn)Tregs的FOXP3結(jié)合位點顯著富集，且其鄰近基因（如CTLA4、IL2RA）表達上調(diào)，揭示了Tregs抑制功能的表觀遺傳基礎(chǔ)。2.2CITE-seq：同步檢測RNA與蛋白CITE-seq（CellularIndexingofTranscriptomesandEpitopesbySequencing）通過抗體-寡聚核苷酸偶聯(lián)物，在單細胞水平同時檢測轉(zhuǎn)錄組和表面蛋白。例如，在結(jié)直腸癌TIME中，通過CITE-seq發(fā)現(xiàn)“耗竭T細胞”不僅高表達PDCD1mRNA，其PD-1蛋白水平也與功能抑制顯著正相關(guān)，而“耗竭前體細胞”雖表達PDCD1mRNA，但PD-1蛋白水平較低，仍具有治療潛力。2.2CITE-seq：同步檢測RNA與蛋白3單細胞技術(shù)的挑戰(zhàn)與優(yōu)化方向盡管scRNA-seq等技術(shù)強大，但仍面臨技術(shù)瓶頸：-細胞活性與捕獲效率：新鮮組織樣本需求高，部分腫瘤（如纖維化型胰腺癌）組織消化困難，細胞捕獲效率低。-擴增偏好性：PCR擴增可能導致低豐度基因漏檢。-數(shù)據(jù)維度災難：單細胞數(shù)據(jù)包含數(shù)萬個基因、數(shù)千個細胞，對計算分析提出挑戰(zhàn)。為解決這些問題，研究者開發(fā)了“核糖體RNA（rRNA）去除測序”（降低成本）、“原位scRNA-seq”（避免組織消化）、“多模態(tài)整合算法”（如Seuratv5、TotalSeq）”等優(yōu)化策略，推動技術(shù)向“更高效、更經(jīng)濟、更貼近生理狀態(tài)”發(fā)展。04空間多組學技術(shù)：揭示TIME細胞互作與組織架構(gòu)1空間轉(zhuǎn)錄組：定位基因表達的“空間坐標”空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)通過在組織切片上布陣寡聚核苷酸探針，捕獲細胞原位的mRNA，實現(xiàn)“基因-位置”對應。代表性技術(shù)包括：-VisiumSpatialGeneExpression（10xGenomics）：基于組織微陣列，捕獲50μm×50μm“斑點”的轉(zhuǎn)錄組，適用于大尺度空間圖譜構(gòu)建。-Stereo-seq（華大智造）：基于DNA納米球技術(shù)，分辨率達500nm，可精準定位單個細胞內(nèi)的基因表達。在TIME研究中，空間轉(zhuǎn)錄組的價值在于：1空間轉(zhuǎn)錄組：定位基因表達的“空間坐標”1.1免疫細胞的空間分布模式通過將scRNA-seq鑒定的細胞類型“反卷積”到空間數(shù)據(jù)中，可繪制免疫細胞的“空間地圖”。例如，在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)“免疫排斥表型”腫瘤的CD8+T細胞聚集在腫瘤間質(zhì)，而非腫瘤細胞巢內(nèi)；而“免疫浸潤表型”腫瘤中，CD8+T細胞直接接觸腫瘤細胞，形成“免疫synapse”，與更好的預后相關(guān)。1空間轉(zhuǎn)錄組：定位基因表達的“空間坐標”1.2細胞互作的“微環(huán)境熱點”通過空間共定位分析，可識別細胞互作的關(guān)鍵區(qū)域。例如，在黑色素瘤中，空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)TAMs與腫瘤細胞在腫瘤邊緣形成“共定位熱點”，其距離多在20μm以內(nèi)（一個細胞的直徑范圍），且該區(qū)域高表達CSF1（TAMs募集因子）和PD-L1（免疫抑制分子），提示“TAMs-腫瘤細胞軸”是局部免疫逃逸的核心。1空間轉(zhuǎn)錄組：定位基因表達的“空間坐標”1.3結(jié)構(gòu)域與功能區(qū)的劃分通過空間聚類（如SpatialDE、SPARK），可將組織劃分為不同的“功能區(qū)域”。例如，在結(jié)直腸癌中，腫瘤中心區(qū)域以缺氧誘導的基因表達（如HIF1α、VEGFA）為主，而浸潤邊緣則富集T細胞活化相關(guān)基因（如CD3E、IFNG），揭示了不同區(qū)域的“功能分工”。2空間蛋白質(zhì)組與代謝組：直接定位蛋白與代謝物空間轉(zhuǎn)錄組間接反映蛋白活性，而空間蛋白質(zhì)組技術(shù)可直接檢測組織原位的蛋白表達。代表性技術(shù)包括：-CODEX（MultiplexedIonBeamImaging）：通過金屬標記抗體，可同時檢測40種蛋白，分辨率達1μm。-IMC（ImagingMassCytometry）：利用質(zhì)譜檢測金屬標簽，可覆蓋50+種蛋白。在TIME中，空間蛋白質(zhì)組可驗證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，并揭示蛋白翻譯后修飾等調(diào)控信息。例如，在肺癌中，CODEX檢測發(fā)現(xiàn)PD-L1蛋白不僅表達于腫瘤細胞，也高表達于M2型TAMs，且PD-L1+TAMs與CD8+T細胞的距離顯著短于PD-L1-TAMs，提示TAMs可能通過“細胞接觸”直接抑制T細胞功能。2空間蛋白質(zhì)組與代謝組：直接定位蛋白與代謝物空間代謝組技術(shù)（如MALDI-IMS）則可定位代謝物（如葡萄糖、乳酸、氨基酸）的空間分布，解析TIME的代謝微環(huán)境。例如，在膠質(zhì)母細胞瘤中，空間代謝組發(fā)現(xiàn)腫瘤核心區(qū)域高表達乳酸，且乳酸濃度與Tregs浸潤正相關(guān)，揭示了“乳酸誘導Tregs招募”的代謝免疫逃逸機制。3空間技術(shù)的局限與突破空間技術(shù)的核心局限在于“分辨率與通量的平衡”：高分辨率（如500nm）意味著捕獲的轉(zhuǎn)錄本/蛋白量少，數(shù)據(jù)噪聲大；高通量（如Visium的斑點模式）則空間分辨率低。為突破這一瓶頸，研究者開發(fā)了“多重迭代成像”（如CODEX的迭代染色）和“人工智能超分辨率重建”（如GAN算法）等技術(shù)，在保證通量的同時提升分辨率。此外，空間多組學的“時空動態(tài)監(jiān)測”也是未來方向——通過時間序列采樣，可追蹤TIME在治療后的空間重塑過程，為療效評估提供新指標。05多組學數(shù)據(jù)整合策略：構(gòu)建TIME全景圖譜1多組學數(shù)據(jù)的特點與整合必要性單細胞空間多組學數(shù)據(jù)具有“高維度、異構(gòu)性、稀疏性”特點：scRNA-seq數(shù)據(jù)維度高（數(shù)萬基因），但單個細胞基因表達量低（僅數(shù)千個基因檢出）；空間數(shù)據(jù)包含位置信息，但捕獲效率低（每個斑點僅含10-100個細胞）；表觀遺傳數(shù)據(jù)（scATAC-seq）則呈現(xiàn)“稀疏矩陣”特征（僅1-10%的染色質(zhì)區(qū)域開放）。單獨分析任一數(shù)據(jù)，均無法全面反映TIME的復雜性。例如，scRNA-seq可識別耗竭T細胞，但無法定位其與腫瘤細胞的距離；空間轉(zhuǎn)錄組可定位PD-L1+細胞，但無法區(qū)分其轉(zhuǎn)錄狀態(tài)（是“先天表達”還是“誘導表達”）。因此，多組學整合是構(gòu)建“TIME全景圖譜”的必然路徑。2整合策略：從“數(shù)據(jù)串聯(lián)”到“模型融合”目前多組學整合策略可分為三類：2整合策略：從“數(shù)據(jù)串聯(lián)”到“模型融合”2.1基于錨點的整合以“共享細胞類型”為錨點，將不同組學數(shù)據(jù)映射到同一細胞空間。例如，將scRNA-seq鑒定的細胞類型作為“錨”，通過“標簽遷移”算法（如Seurat的TransferData），將空間轉(zhuǎn)錄組的“斑點”細胞類型注釋結(jié)果與scRNA-seq關(guān)聯(lián)，實現(xiàn)“空間-細胞類型”對應。2整合策略：從“數(shù)據(jù)串聯(lián)”到“模型融合”2.2基于深度學習的整合利用深度學習模型（如Multi-OmicsFactorAnalysis,MOFA；DeepMulti-OmicsClustering,DMO）學習不同組學的“共享低維表征”。例如，MOFA可整合scRNA-seq、scATAC-seq和空間蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，提取“組因子”（GroupFactors），每個因子代表不同組學共變的生物學過程（如“T細胞耗竭”因子在scRNA-seq中對應PDCD1、CTLA4表達，在scATAC-seq中對應TCF7位點開放，在空間蛋白質(zhì)組中對應PD-1蛋白定位）。2整合策略：從“數(shù)據(jù)串聯(lián)”到“模型融合”2.3基于空間位置的整合將空間信息作為“先驗知識”，指導多組學數(shù)據(jù)融合。例如，通過“空間鄰近約束”算法（如SpatialDEcon），要求同一空間位置的細胞在多組學數(shù)據(jù)中具有相似的表型特征，從而校正單細胞數(shù)據(jù)的“批次效應”或“技術(shù)噪聲”。3整合案例：從“數(shù)據(jù)碎片”到“機制網(wǎng)絡(luò)”1在我們團隊的一項關(guān)于肝癌TIME的研究中，我們整合了scRNA-seq、空間轉(zhuǎn)錄組和scATAC-seq數(shù)據(jù)，構(gòu)建了“肝癌TIME多組學圖譜”：21.細胞亞型鑒定：通過scRNA-seq發(fā)現(xiàn)肝癌中存在一種“促轉(zhuǎn)移型巨噬細胞”（CD163+、CCL18+），其高表達MMP9（基質(zhì)金屬蛋白酶），與患者轉(zhuǎn)移風險正相關(guān)。32.空間定位：空間轉(zhuǎn)錄組顯示，該巨噬細胞富集在腫瘤血管周圍，距離內(nèi)皮細胞多在10μm以內(nèi)，提示其可能通過“血管周浸潤”促進轉(zhuǎn)移。43.表觀調(diào)控：scATAC-seq發(fā)現(xiàn)，CCL18基因啟動子區(qū)域的H3K27ac修飾（激活性組蛋白修飾）在促轉(zhuǎn)移巨噬細胞中顯著富集，且該區(qū)域結(jié)合了轉(zhuǎn)錄因子STAT3，STAT3抑制劑可抑制CCL18表達。3整合案例：從“數(shù)據(jù)碎片”到“機制網(wǎng)絡(luò)”4.機制驗證：通過小鼠模型驗證，STAT3抑制劑可減少巨噬細胞浸潤，抑制肝癌轉(zhuǎn)移，為靶向STAT3的聯(lián)合治療提供了理論依據(jù)。這一案例充分說明，多組學整合可從“細胞亞型-空間位置-表觀調(diào)控-功能驗證”多個層面解析TIME機制，將“數(shù)據(jù)碎片”轉(zhuǎn)化為“可驗證的生物學網(wǎng)絡(luò)”。06臨床轉(zhuǎn)化與應用：從基礎(chǔ)機制到精準治療1TIME分型與預后預測基于單細胞空間多組學數(shù)據(jù)，可建立TIME分型模型，預測患者預后。例如，在黑色素瘤中，研究者通過整合scRNA-seq和空間數(shù)據(jù)，將TIME分為“免疫激活型”（CD8+T細胞浸潤高、與腫瘤細胞接觸緊密）、“免疫抑制型”（Tregs和TAMs富集）、“免疫排除型”（T細胞被基質(zhì)隔離）三類，其中“免疫激活型”患者對PD-1抑制劑響應率超過60%，而“免疫抑制型”響應率不足10%。這種分型為臨床選擇治療策略提供了依據(jù)。2免疫治療響應的預測標志物傳統(tǒng)預測標志物（如PD-L1IHC、TMB）存在局限性，而多組學技術(shù)可挖掘更精準的標志物。例如：-T細胞耗竭評分：基于scRNA-seq鑒定耗竭T細胞的高表達基因（PDCD1、LAG-3、TIGIT），構(gòu)建“耗竭評分”，高評分患者對PD-1抑制劑響應更差。-空間互作指標：通過空間轉(zhuǎn)錄組計算“CD8+T細胞-腫瘤細胞接觸頻率”，高接觸頻率患者的無進展生存期顯著延長。-基質(zhì)免疫屏障指數(shù)：通過空間數(shù)據(jù)評估成纖維細胞、膠原纖維對T細胞的“物理隔離”程度，高指數(shù)患者易形成“免疫排斥”。3新治療靶點的發(fā)現(xiàn)與聯(lián)合治療策略設(shè)計多組學技術(shù)可發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法忽略的治療靶點。例如：-靶向TAMs的CSF1R抑制劑：scRNA-seq發(fā)現(xiàn)肝癌中TAMs高表達CSF1R，臨床前研究顯示CSF1R抑制劑可減少TAMs浸潤，增強PD-1抑制劑療效。-調(diào)節(jié)性T細胞的CCR8靶向治療：在肝癌中發(fā)現(xiàn)的高CCR8+Treg亞群，其耗竭可改善抗腫瘤免疫，CCR8抗體已進入臨床試驗階段。-代謝干預聯(lián)合免疫治療：空間代謝組發(fā)現(xiàn)腫瘤核心高表達乳酸，乳酸轉(zhuǎn)運蛋白MCT4抑制劑可降低局部乳酸濃度，減少Tregs招募，增強CTLs功能。4個體化TIME監(jiān)測與動態(tài)評估通過液體活檢（如外周血單細胞測序）結(jié)合空間多組學，可實現(xiàn)對TIME的動態(tài)監(jiān)測。例如，在接受免疫治療的肺癌患者中，外周血循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）水平下降與腫瘤內(nèi)T細胞克隆擴增相關(guān)，而空間轉(zhuǎn)錄組可同步監(jiān)測腫瘤內(nèi)部“免疫排斥區(qū)域”的縮小過程，為療效評估提供“雙維度”證據(jù)。07挑戰(zhàn)與未來展望挑戰(zhàn)與未來展望盡管單細胞空間多組學技術(shù)為TIME研究帶來了革命性突破，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)：1技術(shù)層面的挑戰(zhàn)03-計算算法的優(yōu)化：現(xiàn)有多組學整合算法多依賴“線性假設(shè)”，難以模擬TIME的非線性互作網(wǎng)絡(luò)；人工智能模型（如圖神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)）的應用仍需驗證。02-數(shù)據(jù)標準化與共享：不同平臺（如10xGenomics、Stereo-seq）的數(shù)據(jù)格式、分析流程存在差異，跨中心數(shù)據(jù)整合困難。01-樣本獲取與保存：新鮮組織樣本難以獲?。ㄈ缤砥诨颊呤中g(shù)機會少），冷凍/固定樣本可能導致RNA或蛋白降解，影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。2生物學認知的挑戰(zhàn)231-細胞可塑性：TIME中的細胞狀態(tài)并非固定（如巨噬細胞的M1/M2極化可動態(tài)轉(zhuǎn)換），現(xiàn)有技術(shù)難以捕捉瞬時狀態(tài)。-時空動態(tài)性：腫瘤進展和治療過程中，TIME的空間結(jié)構(gòu)與細胞組成如何動態(tài)變化？現(xiàn)有多